Summary
Presentato qui è un protocollo che utilizza uno stadio di microscopio a temperatura controllata che consente di montare un contenitore campione su un microscopio verticale.
Abstract
I campioni sono di solito collocati su uno stadio al microscopio orizzontale per l'osservazione microscopica. Tuttavia, per osservare l'influenza della gravità su un campione o sul comportamento a galla, è necessario rendere verticale lo stadio del microscopio. Per raggiungere questo obiettivo, è stato ideato un microscopio invertito laterale inclinato di 90 gradi. Per osservare i campioni con questo microscopio, i contenitori campione come piatti Petri o vetrini di vetro devono essere fissati allo stadio verticalmente. È stato sviluppato ed è descritto qui un dispositivo in grado di proteggere i contenitori campione in posizione in uno stadio di microscopio verticale. L'attacco di questo dispositivo allo stadio consente l'osservazione della dinamica del campione nel piano verticale. La capacità di regolare la temperatura utilizzando un riscaldatore in gomma siliconica permette anche l'osservazione di comportamenti campione dipendenti dalla temperatura. Inoltre, i dati sulla temperatura vengono trasferiti a un server Internet. Le impostazioni di temperatura e il monitoraggio dei log possono essere controllati in remoto da un PC o uno smartphone.
Introduction
La microscopia ottica è una tecnica utilizzata per aumentare i dettagli osservabili attraverso l'ingrandimento di un campione con lenti e luce visibile. Nella microscopia ottica, la luce viene diretta su un campione, quindi la luce trasmessa, riflessa o fluorescente viene catturata dalle lenti di ingrandimento per l'osservazione. Sono disponibili vari tipi di microscopio che differiscono nella progettazione per ospitare diversi usi e metodi di osservazione. I diversi disegni includono un microscopio verticale, che è strutturato per illuminare un campione dal basso per l'osservazione dall'alto, e un microscopio invertito, che illumina il campione dall'alto per l'osservazione dal basso. I microscopi in posizione verticale sono il design più comune e ampiamente utilizzato. I microscopi invertiti sono spesso usati per osservare campioni che non possono consentire a una lente vicina in lontananza dall'alto, come le cellule coltivate aderenti al fondo di un contenitore. Molti gruppi di ricerca hanno riportato osservazioni in una vasta gamma di campi utilizzando microscopi invertiti1,2,3,4,5,6,7. Sono stati sviluppati anche molti dispositivi aggiuntivi che sfruttano le caratteristiche dei microscopi invertiti8,9,10,11,12,13 .
Attualmente, in tutti i progetti di microscopio convenzionali, lo stadio del microscopio è orizzontale ed è quindi inadatto per l'osservazione di campioni che producono movimento nel piano verticale, (a causa della gravità, della galleggiabilità, del movimento, ecc.). Per rendere possibili queste osservazioni, lo stadio del microscopio e il percorso della luce devono essere ruotati in verticale. Lo stadio verticale è necessario per montare verticalmente vetrini di vetro o contenitori campione come un piatto Petri sul palco. Per risolvere questo problema, è già stato ideato un microscopio invertito laterale inclinato di 90 gradi. Tuttavia, l'attaccamento di campioni con nastro adesivo o altri adesivi non produce la necessaria immobilità a lungo termine. Descritto qui è un dispositivo che può raggiungere la stabilità necessaria. Questo dispositivo consente l'osservazione nel tempo di movimento del campione nel piano verticale. Il montaggio di un riscaldatore in gomma in silicio ha anche permesso di osservare l'influenza della variazione di temperatura sul comportamento del campione. I dati di temperatura vengono trasferiti a un server Internet tramite Wi-Fi e le impostazioni di temperatura e il monitoraggio dei log possono essere controllati in remoto da un PC o uno smartphone. A nostra conoscenza, lo stadio collegato a un microscopio inclinato lateralmente inclinato di 90 gradi non è ancora stato riportato in studi precedenti.
Lo stadio del microscopio è composto da tre piastre di alluminio. La piastra di alluminio centrale è montata sulla piastra di alluminio inferiore che si attacca allo stage. La gomma in silicone contenente il sensore di temperatura è attaccata tra le piastre di alluminio medio e superiore. I elastici vengono utilizzati per apporre il campione. Gli artigli sono attaccati nei quattro punti sinistro e destro della piastra di alluminio superiore per fissare gli elastici. Il circuito di controllo del regolatore di temperatura riceve un segnale dal sensore di temperatura incorporato in gomma siliconica e modula la potenza elettrica con il metodo di modulazione della larghezza dell'impulso (PWM). La temperatura può essere gradualmente aumentata a 50 gradi centigradi in incrementi di 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Questo dispositivo è utile per le applicazioni in cui i movimenti del campione verticale possono essere dipendenti dalla temperatura.
La presente relazione fornisce esempi di effetti di temperatura sul fenomeno fluttuante delle diatomee. Come esempi di studi di osservazione delle diatomee, sono state riportate misurazioni della velocità di sedimentazione degli ammassi cellulari, delle analisi del movimento, degli studi di struttura ultrafine, ecc. , 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23.La gravità specifica delle diatomee che galleggiano nell'acqua con organismi fotosintetici è leggermente superiore a quella dell'acqua, quindi tendono ad affondare; tuttavia, si alzeranno se si verifica anche una leggera convezione. Per studiare questo fenomeno, un vetrino viene apposto verticalmente a uno stadio al microscopio e si osservano gli effetti dell'aumento della temperatura sul movimento verticale della diatoma.
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Protocol
1. Progettazione
- Fabbricazione di piastre in alluminio
- Tagliare un foro di 101 mm al centro di una piastra di alluminio di dimensioni 150 mm x 200 mm x 2 mm da utilizzare come piastra all'avanguardia con una macchina di elaborazione laser. Claws macchina in otto punti per apporre due elastici attraverso la lunghezza, o due attraverso la larghezza di questa piastra (vedere Figura supplementare 1A e Figura supplementare 2A).
- Tagliare un foro di 130 mm al centro di un altro piatto di alluminio da 150 mm x 200 mm x 5 mm da utilizzare come lastra superiore centrale con una macchina di elaborazione laser. Macchina otto tacche per attaccare elastici in due punti attraverso la lunghezza, o due attraverso la larghezza di questa piastra (vedere Figura supplementare 1B e figura supplementare 2B).
- Tagliare un foro di 130 mm al centro di una piastra di alluminio da 150 mm x 200 mm x 4 mm da utilizzare come la piastra inferiore centrale con una macchina di elaborazione laser (vedere Figura supplementare 1C e Figura supplementare 2C).
- Tagliare un foro di 30 mm al centro di una piastra di alluminio da 150 mm x 200 mm x 1,5 mm da utilizzare come piastra di base (vedere Figura supplementare 1D e Figura supplementare 2D).
- Fabbricazione di due piedistalli in alluminio
- Tagliare un foro di 30 mm al centro della piastra di alluminio (100 mm di diametro, spessore di 3 mm) e fare una tacca da un lato con le dimensioni 42 mm di larghezza x 30 mm di profondità (vedi Figura supplementare 3A).
- Tagliare un foro di 30 mm al centro della piastra in una piastra di alluminio (100 mm di diametro, spessore di 4 mm) e praticare tre fori da 3 mm situati a 25 mm dal centro, distanziati di 120 gradi l'uno dall'altro (vedere Figura supplementare 3B).
- Fabbricazione di tre pressati disco di sughero
- Tagliare un foro di 20 mm al centro del disco di sughero premuto (100 mm di diametro, 2 mm di spessore) con una macchina per il taglio del getto d'acqua. Fare un taglio 42 mm di profondità x 30 mm, quindi un taglio largo 4 mm x 5 mm di profondità (vedere Figura supplementare 4A).
- Tagliare un foro di 20 mm al centro del disco di sughero premuto di dimensioni di 100 mm di diametro, 1 mm di spessore con una macchina di taglio a getto d'acqua. Fare un taglio 42 mm in x 30 mm di profondità, un taglio largo 4 mm x 40 mm di profondità (vedere Figura supplementare 4B).
- Tagliare una lastra di sughero pressata da un disco di 100 mm di diametro con una larghezza di 42 mm e una profondità di 30 mm. Sono necessari due fogli di spessore di 1 mm e un foglio di spessore di 2 mm (vedere Figura supplementare 4C).
- Fabbricazione di riscaldatore in gomma siliconica
- Fabbricare un riscaldatore utilizzando un disco di 100 mm di diametro di 2,5 mm di gomma di silicio con filo Nichrome incorporato e tagliare un foro di 20 mm al centro del disco (vedere Figura supplementare 5).
- Assemblare le parti descritte nei passaggi da 1.1 a 1.4 impilandoli come illustrato nella figura supplementare 6.
- Per costruire una fase di microscopio, fare riferimento alla figura supplementare 6, sezione trasversale della fase del microscopio.
Fissare 
e 
, poi e con viti. Fissare 
e con viti. Fissare 
e , 
e 
, 
e , e e e con adesivo.
Fissare 
e 
, poi e con viti. 
e con viti. 
e 
, 
e , e e e con adesivo.2. Contorni di progettazione hardware
- Preparare un "circuito di alimentazione e programmazione" come illustrato nella figura supplementare 7. Alimentazione 12 V DC al controller riscaldatore dal terminale J4 collegato all'adattatore AC. Diminuire la tensione da 12 V DC a 3,3 V DC per l'alimentazione del circuito utilizzando un regolatore perché la tensione di alimentazione della CPU è 3,3 V DC.
NOTA: USB 1 è un terminale per 5 V DC e segnale seriale del PC di sviluppo. Anche se 5 V DC non è essenziale, viene utilizzato come fonte di alimentazione per programmare la CPU. Questo è anche convertito a 3.3 V DC dal regolatore. J1 è un terminale di segnale di controllo al momento della programmazione. Questo circuito è ospitato nel caso del controller illustrato nella figura supplementare 8. - Preparare un "circuito di controllo del riscaldatore" come mostrato nella Figura supplementare 7. Passare a 12 V DC con Q5 (canale P MOS FET) e fornirlo al riscaldatore. Q5 è un elemento di commutazione che controlla 12 V DC con PWM per regolare la quantità di energia fornita al riscaldatore.
NOTA: Il circuito include un LED per confermare visivamente che la tensione viene fornita al riscaldatore. Questo segnale di azionamento (HEATER_C) è un segnale PWM dalla CPU. Quando viene rilevato un segnale di surriscaldamento dal circuito di protezione, il segnale BREAKER passa a LOW e il funzionamento del MOS-FET si arresta. Questo circuito è ospitato nel caso del controller illustrato nella figura supplementare 8. - Preparare un "circuito di connessione per l'unità di riscaldamento" come illustrato nella figura 7 supplementare. Installare un connettore USB per la connessione con la sezione riscaldatore.
NOTA: questo circuito è ospitato nel caso del controller illustrato nella figura supplementare 8. - Preparare un "circuito del connettore per il sensore di temperatura" come illustrato nella figura supplementare 7. Montare il connettore (Euroblock recipiente 2P) per collegare il sensore di temperatura.
NOTA: questo circuito è ospitato nel caso del controller illustrato nella figura supplementare 8. - Per un "convertitore A/D" come illustrato nella figura supplementare 7, utilizzare ADS 1015 come dispositivo di conversione AD.
NOTA: il dispositivo di conversione AD converte i valori del sensore di temperatura e surriscalda il sensore di rilevamento da tensione a valori digitali. Si tratta di un dispositivo di conversione AD multiplexer a 12 bit ed è connesso alla CPU con l'interfaccia I2C. Questo circuito è ospitato nel caso del controller illustrato nella figura supplementare 8. - Effettuare un "circuito di protezione" come illustrato nella figura supplementare 7 collegando il segnale del sensore di rilevamento del surriscaldamento (OHS) all'ingresso invertimento dell'amplificatore OP. Confrontare questo segnale con la tensione del resistore trimmer collegato all'ingresso non invertente.
- Assicurarsi che quando la tensione diventa inferiore alla tensione del resistore trimmer, l'uscita dell'amplificatore OP diventa HIGH, il transistor NPN collegato Q2 si accende e il segnale BREAKER diventa LOW.
- Assicurarsi che allo stesso tempo, Q4 si accende e l'indicatore di surriscaldamento collegato LED D6 si accende.
NOTA: questo circuito è ospitato nel caso del controller illustrato nella figura supplementare 8.
- Per una "sezione di visualizzazione" come illustrato nella figurasupplementare 7, utilizzare 192 x 64 punti per OLED. Connettersi con la CPU tramite l'interfaccia I2C.
- Reimpostare l'OLED separando il GND dell'OLED con il segnale CPU IO0 utilizzando un transistor NPN Q1 collegato al GND dell'OLED.
NOTA: Questo OLED visualizza vari tipi di informazioni. Questo circuito è ospitato nel caso del controller illustrato nella figura supplementare 8.
- Reimpostare l'OLED separando il GND dell'OLED con il segnale CPU IO0 utilizzando un transistor NPN Q1 collegato al GND dell'OLED.
- Per un "LED & rotary encoder con interruttore di spinta" in Supplemental Figure 7, montare un encoder rotante con saldatura che funziona come un interruttore di spinta e incorpora due LED.
- Collegare un LED al VCC per l'uso come LED di alimentazione. L'altro è collegato alla CPU per l'uso come indicatore durante il funzionamento del riscaldatore.
- Utilizzare un contatto di commutazione push per il riscaldatore START/STOP collegato alla CPU. Collegare le uscite A e B dell'encoder rotante al set di input IO nell'interrupt DELLA CPU.
NOTA: questo circuito è ospitato nel caso del controller illustrato nella figura supplementare 8.
- Per la CPU in Supplemental Figure 7, utilizzare la CPU di WROOM - 02D.
- Output da IO12, IO13 all'"unità di visualizzazione" perché l'interfaccia del display è standard I2C. Collegare IO0 a "unità di visualizzazione" e ripristinare l'OLED.
- Collegare IO15 a "unità di controllo del riscaldatore" e controllare l'alimentazione fornita al riscaldatore dall'uscita PWM.
- Collegare IO2 a "LED & rotary encoder con interruttore di spinta" e accendere il LED START. Collegare IO4 e IO14 a "LED & rotary encoder con interruttore di spinta" e ricevere i segnali (REA e REB) dall'encoder rotante per determinare la temperatura impostata. Collegare IO5 a "LED & rotary encoder con interruttore di spinta" e avviare / arrestare il riscaldatore.
3. Struttura di progettazione del software
- Utilizzare Arduino CORE per WROOM - 02D per la CPU come controller per questo sistema.
NOTA: come dispositivi di ingresso, vengono utilizzati l'interruttore di avvio/arresto, l'encoder rotante, il sensore di temperatura (tetrgamore). Come dispositivi di output, vengono utilizzati un LED, un display a caratteri (OLED) e un riscaldatore. Il dispositivo di comunicazione utilizza il Wi-Fi. - Struttura dell'operazione
- Rilevare il funzionamento dell'encoder rotante come mostrato nell'encoder LED e rotativo con l'interruttore di spinta in Supplemental Figure 7, memorizzarlo come temperatura impostata e visualizzarlo sull'OLED. Impostare il terminale di ingresso della CPU a cui i terminali di fase REA e REB sono collegati come terminale di ingresso di interrupt ed elaborare la rotazione (avanti e indietro) dell'encoder rotante per interrupt. Impostarlo su 1 per la rotazione in avanti e su -1 per la rotazione inversa. Scrivere la temperatura impostata nella variabile globale e utilizzarla per il controllo della temperatura del riscaldatore. Allo stesso tempo, aggiornare la visualizzazione della temperatura impostata dell'OLED.
- Identificare l'avvio e l'arresto da parte dell'iO CPU 5 tramite l'opzione start/stop (SW-S) come illustrato nella CPU di Supplemental Figure 7. Lo stato dell'opzione di avvio/arresto è un processo di interrupt del timer ogni 50 ms.
NOTA: Poiché l'interruttore è un interruttore momentaneo, inverte lo stato di avvio/arresto quando viene premuto e rilasciato. Questo stato viene archiviato nella variabile globale. - Utilizzare un tègamo per il sensore di temperatura. Leggere i valori misurati dal sensore di esempio (fare riferimento a "circuito del connettore per la connessione del riscaldatore" nella figura supplementare 7) nella CPU dopo il convertitore A/D (fare riferimento a "convertitore A/D" nella figura supplementare 7). Fornire la corrente al riscaldatore attivando la porta IO15 nella "CPU" della figura supplementare 7.
NOTA: esistono due tipi di sensori di temperatura. Uno viene utilizzato per misurare la temperatura del campione e controllare il riscaldatore sulla temperatura impostata, e l'altro è collegato a un riscaldatore e utilizzato per la prevenzione del calore. Collegare il tintergamo a 3,3 V tramite un resistore e registrare il cambiamento di resistenza come un cambiamento di tensione. Rimuovere un disturbo con il metodo della media mobile. - Utilizzare un tègamo per il sensore di temperatura di prevenzione della temperatura. Il rilevamento del surriscaldamento viene eseguito utilizzando un termografo (R2) ("circuito del connettore per la connessione del riscaldatore" nella figura supplementare 7) e quando viene superato il valore impostato, la corrente del riscaldatore viene spenta ("circuito di protezione" nella figura supplementare 7).
NOTA: Questo sensore è incorporato in un circuito e non attraverso la CPU. Questo sensore è indipendente dalla CPU e confrontato con il valore di resistenza impostato dal trimmer del resistore da un amplificatore differenziale in modo analogico. Quando rileva che la temperatura ha superato il valore impostato, interviene nell'interruttore FET, che controlla la corrente al riscaldatore e arresta con la cautela l'alimentazione corrente. Lo scopo è quello di evitare che la temperatura del riscaldatore superi un certo livello anche in una situazione in cui la CPU non funziona correttamente. - Accendere il LED nell'"encoder LED e rotante con interruttore push" della figura supplementare 7 dalla CPU (nella "CPU" di Supplemental Figure 7), quando l'apparecchiatura è in funzione.
- Visualizzare la temperatura impostata e il valore misurato su OLED nella "sezione di visualizzazione" della figura supplementare 7 della CPU (nella "CPU "di Figura supplementare 7).
- Guidare l'interruttore FET nel "circuito di controllo del riscaldatore" di Supplemental Figure 7 con PWM dalla CPU per controllare il riscaldatore.
- Controllare il riscaldatore tramite PID, in base alle temperature misurate acquisite dal sensore di temperatura. Utilizzare la libreria pid_v1.h di Arduino per l'elaborazione PID.
NOTA: la CPU calibra il tempo, comunica con il server, trasmette i dati e riceve istruzioni dal server. Quando la temperatura del sensore supera la temperatura impostata, la corrente del riscaldatore viene impostata su 0 e l'overshoot viene soppresso. - Utilizzare la funzione di connessione Wi-Fi integrata della CPU e connettersi a Internet. Trasmissione impostare la temperatura, temperatura del riscaldatore, ecc al server designato da Wi-Fi.
4. Configurazione del sistema
- Costruire il sistema secondo Supplemental Figure 9.
- Equipaggia un Wi-Fi con il controller.
- Utilizzare un tetrgamo come sensore per la misurazione della temperatura. Collegare il filo del tetrgamo al terminale "SENSOR" sulla custodia del controller. Ricevere il segnale di temperatura misurato dal tetrgamo.
- Collegare uno stadio al microscopio che incorpora il riscaldatore di gomma e il "HEATER" della custodia del controller con un cavo dedicato. Controllare la corrente sul riscaldatore di gomma.
- Modificare la temperatura impostata con la manopola sul controller.
NOTA: il monitoraggio del registro della temperatura, l'impostazione della temperatura può essere azionata in remoto da un PC o uno smartphone. - Trasferire la temperatura misurata, impostare le informazioni sulla temperatura e sull'ora durante la misurazione dal controller al server tramite Internet. Il tempo del ciclo di misurazione dei dati è di 5 s e il tempo di ciclo per il trasferimento dei dati al server è di 1 min.
- Accedere al server dal lato del controller a intervalli regolari e trasferire i dati di misurazione memorizzati nella CPU del controller al server per l'analisi e la grafica.
- Fare riferimento al materiale supplementare per informazioni su come utilizzare il server.
5. Progettazione del microscopio invertito lateralmente
- Fissare due piastre di alluminio di 15 mm di spessore verticale con viti per creare un supporto di base.
- Fissare un jig (un punto) alla parte orizzontale del supporto di base.
- Posizionare la parte dello stadio del microscopio verticalmente, attaccare le maschere (due punti) alla parte verticale del supporto di base e fissare il fondo del microscopio al supporto di base.
- Fissare lo stadio del microscopio con le viti.
6. Metodo di funzionamento
NOTA: Qui, il campione utilizzato è una miscela di Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution mezzo di coltura liquida, metasilicato di sodio, vitamine e acqua sterile. 800 l di questo campione è diluito in 10 mL di mezzo di acqua dolce.
- Metodo di osservazione
- Iniettate 1.000 l del campione preparato in una camera di vetro self-made.
NOTA: La camera di vetro auto-made dispone due bicchieri da scivolo in parallelo e li fissa con un adesivo. Un piatto Petri normale ha un grande spessore e le cellule fuoriescono nella direzione di profondità nella camera, rendendo difficile osservare con un microscopio. Per evitare questo, viene fatta la camera con una piccola direzione di profondità, che consente di impedire alle cellule di fuggire nella direzione di profondità nella camera. Un adesivo in resina epossidica curabile a bassa temperatura viene utilizzato per legare intorno al vetro per evitare che il campione cada dalla camera. - Collegare una videocamera preparata separatamente al microscopio. Collegare una videocamera utilizzando l'adattatore lente dedicato al microscopio e riprendere il campione.
- Utilizzare un microscopio con un oculare 10x e un obiettivo 200x.
- Fissare lo stadio del microscopio verticale a un microscopio in quattro posizioni con viti da 4 mm.
NOTA: Fare riferimento alla figura supplementare 1A e alla figura supplementare 2A per i disegni di progettazione di lastre di alluminio. In questo esperimento, è stato utilizzato un microscopio invertito. Questo è stato inclinato di 90 gradi, e lo stadio del microscopio fabbricato è stato apposto con viti. Fare riferimento alla figura 1. - Fissare il campione con due elastici utilizzando i quattro artigli realizzati longitudinalmente. Posizionare un campione su uno stadio al microscopio perpendicolare alla superficie del terreno.
- Impostare la temperatura a 40 gradi centigradi con il controller illustrato nella figura supplementare 8. Ruotare la manopola del controller per impostare la temperatura. Controllare la temperatura impostata sul display. Premere la manopola per avviare il controllo della temperatura e il LED blu si illuminerà. Premere nuovamente la manopola per spegnere il LED e interrompere il controllo della temperatura.
NOTA: la temperatura misurata viene visualizzata in tempo reale e il riscaldatore viene controllato per raggiungere la temperatura impostata. Quando il controllo della temperatura inizia, il LED blu si illumina e rimane così mentre il riscaldatore è in funzione. Quando il riscaldatore si surriscalda, il LED rosso si illumina e il riscaldatore si arresta automaticamente. - Fare riferimento a "Manuale dell'operazione del server" nelle informazioni aggiuntive per il funzionamento del server.
NOTA: è necessario un server per l'archiviazione dei dati. Il database del server utilizza My-SQL.
- Iniettate 1.000 l del campione preparato in una camera di vetro self-made.
7. Misurazione della distribuzione della temperatura superficiale del riscaldatore di gomma
- Misurare la distribuzione della temperatura superficiale del riscaldatore di gomma con la termografia per verificare l'uniformità della temperatura.
- Fissare lo stadio del microscopio che incorpora vaun riscaldatore in gomma con un supporto.
- Modificare la temperatura di impostazione della superficie del riscaldatore di gomma a 35 gradi centigradi, 45 gradi centigradi, 55 e 65 gradi centigradi e misurare in base alla termografia dalla parte anteriore (fare riferimento alla figura supplementare 10).
8. Test di risposta alla temperatura
- Iniziare il controllo della temperatura impostando la temperatura impostata sul campione su 30 gradi centigradi. Attendere fino a quando il valore di misura raggiunge i 30 gradi centigradi e si stabilizza. Aumentare la temperatura preimpostata di 5 gradi centigradi da 30 a 50 gradi centigradi e attendere che il valore misurato si stabilizzi seguendo la rispettiva temperatura preimpostata.
- Diminuire la temperatura preimpostata di 5 gradi centigradi da 50 a 30 gradi centigradi e rilevare la capacità di tracciamento del valore misurato.
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Representative Results
La figura 2 mostra la distribuzione della temperatura del riscaldatore di gomma. La temperatura superficiale del riscaldatore di gomma era uniforme ad ogni temperatura. La figura 3 mostra la reattività della temperatura misurata per impostare le variazioni di temperatura. La linea arancione indica la temperatura impostata e la linea blu indica il cambiamento della temperatura del campione. Il superamento del valore misurato per la modifica dell'impostazione è piccolo e il monitoraggio è rapido.
Le cellule diatomee sono state osservate per fornire un esempio specifico dell'uso di questo dispositivo. L'analisi della traiettoria delle cellule diatomee mobili è un approccio utile per valutare la motilità delle cellule diatomee. Tuttavia, anche se un normale microscopio invertito osserva il campione orizzontalmente, non è adatto per l'osservazione dell'influenza della gravità o del movimento fluttuante nella direzione verticale.
In questo esperimento, lo stadio del microscopio con il regolatore della temperatura è stato collegato a un microscopio invertito che era stato ruotato di 90 gradi. Il movimento verticale delle diatomee dipendente dalla temperatura è stato registrato con successo. Con questo metodo, il locus del movimento verticale delle diatomee è stato rilevato come illustrato nella Figura 4. Come risultato dell'osservazione con 100 individui di diatomee, la velocità media era di 7,01 m/s a temperatura ambiente e di 470,1 s/s a 40 gradi centigradi. Gli effetti della convezione termica sul fenomeno fluttuante verticale delle cellule diatomesono sono stati visualizzati mediante osservazione diretta.
Figura 1: Fotografia del dispositivo fissato allo stadio del microscopio. Aspetto del dispositivo fissato allo stadio del microscopio. Il dispositivo è fissato allo stadio del microscopio con quattro viti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Distribuzione della temperatura del riscaldatore di gomma. La distribuzione del riscaldatore di gomma misurata dalla termografia. La temperatura del riscaldatore è stata modificata passo dopo la temperatura ambiente a 35 gradi centigradi, 45 gradi centigradi, 55 gradi centigradi e 65 gradi centigradi. La temperatura è stata distribuita uniformemente sul riscaldatore ad ogni temperatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: reattività del segnale di temperatura. Questo mostra la risposta quando la temperatura impostata viene aumentata da 30 a 50 gradi centigradi e abbassata da 50 a 30 gradi centigradi. La temperatura impostata è stata modificata in incrementi di 5 gradi centigradi. Nello stato stabilità, la temperatura misurata si trova all'interno di 1,5 gradi centigradi del valore impostato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il locus del movimento della diatoma. Sono state tracciate le traiettorie verticali del movimento delle diatomee a causa dei cambiamenti di temperatura. Le linee blu mostrano le traiettorie delle celle diatomea a 25 gradi centigradi per 27,06 s e a 40 gradi centigradi per 0,2 s. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura supplementare 1: Disegno di disegno di piastre in alluminio (con dimensioni). (A) La piastra è spessa 2 mm x 150 mm di larghezza x 200 mm di lunghezza, con un foro centrato di 101 mm di diametro per consentire l'inserimento del riscaldatore di gomma. Ogni bordo della piastra ha due artigli lavorati a cui gli elastici possono essere attaccati per fissare i campioni sul palco. Per collegare questo stadio verticale a un microscopio con viti da 4 mm, i fori a vite da 4,2 mm vengono forati in quattro posizioni simmetricamente che circondano il foro centrale. (B) La piastra è spessa 5 mm x 150 mm di larghezza x 200 mm di lunghezza, con un foro centrato di 130 mm di diametro. Posizioni di tacche di macchina per abbinare le posizioni degli artigli sulla piastra di prima linea per consentire l'attaccamento di elastici di fissaggio del campione attraverso il palco. Per l'attaccamento dello stadio a un microscopio, quattro fori a vite da 4,2 mm vengono praticati in posizioni corrispondenti a quelli nella piastra di prima linea. (C) La piastra è spessa 4 mm x 150 mm di larghezza x 200 mm di lunghezza, con un foro centrato di 130 mm di diametro. Una campata di 30 mm viene tagliata fuori dal centro della faccia destra di 200 mm della piastra, alla profondità del foro centrale. Questo scopo del cut-out è quello di consentire l'attacco del connettore riscaldatore sul lato destro. Nelle stesse posizioni della piastra di primalinea, quattro fori a vite da 4,2 mm vengono forati per l'attaccamento dello stadio a un microscopio. (D) La piastra è spessa 1,5 mm x 150 mm di larghezza x 200 mm di lunghezza, con un foro centrato di 30 mm di diametro. Nelle stesse posizioni della piastra di primalinea, quattro fori a vite da 4,2 mm vengono forati per l'attaccamento dello stadio a un microscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 2: Disegno di disegno di piastre in alluminio (senza dimensioni). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 3: Disegno di disegno di piedistalli in alluminio. (A) Da installare sul lato superiore: il diametro è di 100 mm, lo spessore è di 3 mm. Un foro di 30 mm viene forato al centro e un ritaglio di 42 mm di larghezza x 30 mm di profondità viene realizzato su un lato. (B) Da installare sul lato inferiore: il diametro è di 100 mm, lo spessore è di 4 mm. Un foro di 30 mm di diametro viene forato al centro e tre fori da 3 mm sono stati posizionati a 120 gradi l'uno dall'altro ad una distanza di 25 mm dal centro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 4: Disegno di disegno di dischi di sughero premuti. (A) Da installare sul lato superiore tra il riscaldatore in gomma di silicio e il piedistallo superiore in alluminio: il diametro è di 100 mm, lo spessore è di 2 mm. Un foro di 20 mm viene forato al centro e due tagli (42 mm di larghezza x 30 mm di profondità, 4 mm di larghezza x 40 mm) sono realizzati ad angolo retto l'uno rispetto all'altro nei lati del disco. (B) Da installare sul lato inferiore tra il riscaldatore in gomma di silicio e il piedistallo inferiore in alluminio: il diametro è 100 mm, lo spessore è 1 mm. Un foro di 20 mm di diametro viene forato al centro. (C) Questo supporto è largo 42 mm e profondo 30 mm e tagliato dalla circonferenza di un disco di 100 mm di diametro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 5: Specifica del riscaldatore in gomma siliconica. Il diametro è di 100 mm e lo spessore è 2,5 mm. Un foro di 20 mm di diametro viene forato al centro. L'alimentatore è 12 V, con capacità di carico di 18 W. Il riscaldatore è costituito da filo Nichrome, con un filo di piombo collegato all'elettrodo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 6: Sezione trasversale dello stadio del microscopio. Questa è una vista sezionale dello stadio del microscopio. Il piedistallo in alluminio è collegato alla piastra di alluminio posteriore e il riscaldatore di gomma è installato sulla superficie più esterna. Il tappo spremuto è installato per l'isolamento tra il riscaldatore di gomma e piedistallo in alluminio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 7: Dettagli del diagramma del circuito. Ciò indica il circuito costruito nel controller. Il diagramma del circuito è diviso in nove parti in base alle singole funzioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 8: Disegno di progettazione della custodia del controller in plastica. Le dimensioni sono 143,9 mm di lunghezza x 85,3 mm di profondità x 25 mm di larghezza. La manopola di impostazione della temperatura, la lampada di funzionamento/surriscaldamento e l'indicatore si trovano sulla custodia del controller di plastica. La temperatura può essere impostata mentre si guarda l'indicatore ruotando la manopola impostata. Spingendo questa manopola si avvia il controller di temperatura. La temperatura misurata viene visualizzata in tempo reale e il riscaldatore viene controllato in modo che raggiunga e mantenga la temperatura impostata. Quando il controller di temperatura è acceso, il LED blu si illumina e rimane illuminato mentre il riscaldatore è in funzione. Quando il riscaldatore si surriscalda, il LED rosso si accende e il riscaldatore si arresta automaticamente. Premendo di nuovo la manopola del controller di temperatura, la si fermerà. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 9: Configurazione del sistema. Lo stadio del microscopio con un controller incorporato è collegato al riscaldatore in gomma con un cavo dedicato. Vengono ricevuti segnali di temperatura del campione misurati e la corrente al riscaldatore di gomma viene trasmessa dal controller. I segnali misurati dal controller vengono inviati in modalità wireless al server tramite il router Internet. Il server compila i dati di misurazione per l'analisi e la creazione di grafici. Il monitoraggio del registro della temperatura e le impostazioni della temperatura possono essere controllate in remoto tramite PC o smartphone. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 10: Misurazione della distribuzione della temperatura per termografia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'analisi della traiettoria delle cellule diatomea mobili è un approccio utile per valutare la motilità delle diatomee. Tuttavia, mentre un normale microscopio invertito osserva i campioni orizzontalmente, non è adatto per osservazioni dell'influenza della gravità o del movimento fluttuante nella direzione verticale. Sviluppato e descritto qui è uno stadio di microscopio verticale con controllo della temperatura e collegato a un microscopio invertito, che è stato ruotato di 90 gradi. Questa fase del microscopio con controllo della temperatura consente l'osservazione del movimento verticale dipendente dalla temperatura delle cellule diatomiche.
Un passaggio critico all'interno del protocollo è la progettazione del circuito del controller. È stato implementato un circuito di demolizione per garantire la sicurezza. Quando il sensore viene scollegato dal campione o il microcontrollore non funziona correttamente, la corrente del riscaldatore viene interrotta da un circuito diverso dal microcontrollore.
Poiché il sistema di controllo ha adottato il sistema PID per controllare la corrente del riscaldatore, è necessaria una tecnica per trovare il parametro ottimale del PID. Rispetto al metodo esistente, il funzionamento e il monitoraggio a distanza sono possibili dalla funzione Wi-Fi, dalla raccolta dei dati su un server e dalla funzione di impostazione della temperatura. Poiché la struttura della parte dello stadio collegata al microscopio è complicata, la semplificazione di questa struttura garantisce uno studio futuro.
Questa apparecchiatura utilizza un riscaldatore per aumentare la temperatura, ma il raffreddamento non è alimentato; pertanto, la temperatura impostata non può essere al di sotto della temperatura ambiente. Il raffreddamento dei campioni a temperature inferiori a quella ambiente richiederà un complicato dispositivo di raffreddamento, che è in esame per il lavoro futuro.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori non hanno riconoscimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30? | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A - MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM - selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields - A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
- Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
- Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates - potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion - An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
