Summary
ここで提示される、サンプル容器を縦の顕微鏡に取付けることを可能にする温度制御された顕微鏡段階を使用するプロトコルである。
Abstract
サンプルは通常、顕微鏡観察のために水平顕微鏡ステージに置かれます。しかし、試料に対する重力の影響を観察したり、浮遊挙動を研究したりするためには、顕微鏡ステージを垂直にする必要がある。これを達成するために、90°によって傾いた横逆反転顕微鏡が考案された。この顕微鏡でサンプルを観察するには、ペトリ皿やガラススライドなどのサンプル容器を垂直にステージに固定する必要があります。縦型顕微鏡ステージ上でサンプル容器を固定できる装置を開発し、ここに記載する。ステージへのこの装置の付属品は縦の平面のサンプルダイナミクスの観察を可能にする。シリコーンゴムヒーターを使用して温度を調節する機能はまた温度依存的なサンプルの行動の観察を可能にする。さらに、温度データはインターネットサーバーに転送されます。温度設定やログ監視は、PCやスマートフォンからリモートで制御することができます。
Introduction
光学顕微鏡は、レンズと可視光でサンプルの拡大を介して観察可能な詳細を増加させるために使用される技術です。光学顕微鏡では、光はサンプルに向けられ、その後、観察のための拡大レンズによって透過、反射、または蛍光光を捕捉されます。様々な用途や観察方法に対応するため、設計が異なる様々なタイプの顕微鏡をご用意しています。異なる設計には、上から観察するために下からサンプルを照らす直立顕微鏡と、下から観察するために上からサンプルを照らす反転顕微鏡が含まれます。直立した顕微鏡は最も一般的で広く使用されている設計である。反転顕微鏡は、容器の底部に付着した培養細胞など、上から近い距離でレンズを観察するためによく使用されます。多くの研究グループは、反転顕微鏡1、2、3、4、5、6、7を用いて広範囲の分野での観測を報告している。反転顕微鏡8、9、10、11、12、13の特徴を利用する多くの追加の装置はまた開発された.
現在、すべての従来の顕微鏡設計において、顕微鏡ステージは水平であるため、垂直面で動きを生み出すサンプルの観察には適していません(重力、浮力、運動などによる)。これらの観察を可能にするためには、顕微鏡の段階と光路を垂直に回転させる必要があります。垂直段階は、ガラススライドやペトリ皿などのサンプル容器をステージに垂直に取り付ける必要があります。これに対処するために、90°で傾いた横逆反転顕微鏡はすでに考案されている。しかし、テープやその他の接着剤でサンプルを取り付けることで、必要な長期的な不動は生じません。ここで説明する装置は、必要な安定性を達成できる装置である。この装置は縦の平面のサンプルの動きの時間の間の観察を可能にする。シリコンゴムヒーターの取り付けにより、温度変動が試料挙動に及ぼす影響を観察することも可能になりました。温度データはWi-Fiでインターネットサーバーに転送され、温度設定やログ監視はPCやスマートフォンから遠隔操作できます。我々の知るところでは、90°傾いた横方向に傾いた顕微鏡に取り付けられた段階は、これまでの研究ではまだ報告されていない。
顕微鏡段階は3つのアルミニウム版から成っている。中央のアルミニウム版はステージに付す下部アルミニウム版に取付けられる。温度センサを含むシリコーンゴムは、中央と上部のアルミニウム板の間に取り付けられています。ゴムバンドは、サンプルを接着するために使用されます。上部アルミ板の左右4点に爪を取り付け、ゴムバンドを固定します。温度レギュレータの制御回路は、シリコーンゴムに埋め込まれた温度センサから信号を受信し、パルス幅変調(PWM)方式で電力を調節します。温度は1°C単位で50°Cに徐々に増加させることができる。この装置は縦のサンプル動きが温度に依存するかもしれない適用にとって有用である。
このレポートは、珪藻土の浮遊現象に対する温度影響の例を示す。珪藻土観測研究の例として、細胞クラスターの堆積速度の測定、運動解析、超微細構造研究などが14、15、16、17件報告されている。,18歳,19歳,20歳,21歳,22歳,23.光合成生物と水に浮かぶ珪藻の比重は水の比重よりもわずかに高いので、沈む傾向があります。ただし、わずかな対流が発生している場合は上昇します。この現象を研究するために、ガラススライドを顕微鏡ステージに垂直に貼り付け、温度上昇が珪藻土垂直運動に及ぼす影響を観察する。
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Protocol
1. デザイン
- アルミ板の製作
- 寸法150mm x 200mm x 2mmのアルミ板の中央に101mmの穴を開け、レーザー加工機で最前線のプレートとして使用します。8点の機械爪は、長さ2つのゴムバンドを長さに貼り付けるか、このプレートの幅全体に2つ貼り付けます(補足図1Aおよび補足図2Aを参照)。
- レーザー加工機で中央のアッパープレートとして使用する別の150 mm x 200 mm x 5 mm アルミニウムプレートの中央に 130 mm の穴を開けます。長さ2点、またはこのプレートの幅を横切る2点でゴムバンドを取り付けるための機械8ノッチ(補足図1Bおよび補足図2Bを参照)。
- レーザー加工機で中央下部板として使用する150mm x 200 mm x 4 mmアルミニウム板の中央に130mmの穴を開けます(補足図1Cおよび補足図2Cを参照)。
- ベースプレートとして使用する150 mm x 200 mm x 1.5 mm アルミニウムプレートの中央に 30 mm の穴を開けます (補足図 1Dおよび補足図 2D を参照)。
- 2つのアルミニウム台座の製造
- アルミ板の中央に30mmの穴(直径100mm、厚さ3mm)を切り、片面から42mm×奥行き30mmの寸法でノッチを作ります(補足図3A参照)。
- アルミ板でプレートの中央に30mmの穴を開け(直径100mm、厚さ4mm)、中心から25mm位置する3つの3mm穴をドリルし、互いに120°間隔をあけた(補足図3Bを参照)。
- 3つの押されたコルクディスクの製造
- 押されたコルクディスクの中央に20mmの穴(直径100mm、厚さ2mm)をウォータージェット切断機で切断します。1 つのカット 42 mm x 30 mm の深さに、次に 1 つのカット 4 mm 幅 x 5 mm の深さ (補足図 4A を参照)。
- 寸法100mm直径100mm、水ジェット切断機で厚さ1mmの押し込みコルクディスクの中央に20mmの穴を開けます。42 mm の幅 x 30 mm の深さ、カット 4 mm 幅 x 40 mm の深さにカットを行います (補足図 4Bを参照)。
- 42 mm 幅および 30 mm の深さの 100 mm 直径ディスクから押し込んだコルクプレートを切断します。厚さ1mm、厚さ2枚の2枚、厚さ2mmの1枚が必要です(補足図4C参照)。
- シリコーンゴムヒーターの製造
- ニクロムワイヤーを内蔵した厚さ2.5mmのシリコンゴムの直径100mmディスクを使用してヒーターを製作し、ディスクの中央に20mmの穴を開けます(補足図5参照)。
- 補足図 6に示すように、手順 1.1 ~ 1.4 で説明するパーツを組み立てます。
- 顕微鏡ステージを構築するには、顕微鏡段階の補助図6、断面を参照してください。そして、ネジで
固定
し、。 
固定し、
ネジで。固定し、、、、、、
および、および、および接着剤
で。
固定
し、。 
固定
ネジで。固定
および、
で。2. ハードウェア設計の概要
- 補足図 7に示すように、「電源およびプログラミング回路」を準備します。ACアダプターに接続されている J4 端子からヒーター コントローラに 12 V DC を供給します。CPU電源電圧は3.3V DCであるため、レギュレータを使用して回路電源の電圧を12V DCから3.3V DCに下げてください。
注:USB 1は、開発PCの5V DCとシリアル信号のための端子です。5 V DC は必須ではありませんが、CPU をプログラムする電源として使用されます。これはまた、レギュレータによって3.3 V DCに変換されます。J1は、プログラミング時の制御信号端末である。この回路は、補足図8に示すコントローラケースに収容されています。 - 補足図7に示すように、「ヒーター制御回路」を準備する。Q5(PチャンネルMOS FET)で12V DCに切り替え、ヒーターに供給します。Q5 は、PWM を使用して 12 V DC を制御し、ヒーターに供給される電力量を調整するスイッチングエレメントです。
注:回路には、電圧がヒーターに供給されていることを視覚的に確認するためのLEDが含まれています。このドライブ信号(HEATER_C)はCPUからのPWM信号です。保護回路によって過熱信号が検出されると、BREAKER信号はLOWに切り替わり、MOS-FETの動作は停止します。この回路は、補足図8に示すコントローラケースに収容されています。 - 補足図 7に示すように、「ヒーターユニット用コネクタ回路」を準備します。ヒーターセクションに接続するためのUSBコネクタを取り付けます。
注: この回路は、補足図 8に示すコントローラ ケースに収容されています。 - 補足図 7に示すように、「温度センサー用コネクタ回路」を準備します。コネクタ(ユーロブロックレセプタクル2P)を取り付け、温度センサーを接続します。
注: この回路は、補足図 8に示すコントローラ ケースに収容されています。 - 補足図 7に示す「A/D コンバータ」の場合は、AD 変換装置として ADS 1015 を使用します。
注:AD変換デバイスは、温度センサと過熱検出センサの値を電圧からデジタル値に変換します。これは12ビットマルチプレクサAD変換デバイスで、I2Cインターフェースを使用してCPUに接続されています。この回路は、補足図8に示すコントローラケースに収容されています。 - OPアンプの反転入力に過熱検出センサ(OHS)信号を接続して、補足図7に示すように「保護回路」を作ります。この信号を、非反転入力に接続されたトリマー抵抗の電圧と比較します。
- トリマー抵抗の電圧よりも電圧が低くなると、OPアンプの出力が高くなり、接続されたNPNトランジスタQ2がオンになり、BREAKER信号がLOWになります。
- 同時に、Q4がオンになり、接続されたオーバーヒートインジケータLED D6が点灯することを確認します。
注: この回路は、補足図 8に示すコントローラ ケースに収容されています。
- 補足図 7に示す「表示セクション」の場合は、OLED に 192 x 64 ドットを使用します。I2C インターフェイスを介して CPU と接続します。
- OLEDのGNDに接続されたNPNトランジスタQ1を使用して、CPU信号IO0でOLEDのGNDを分離してOLEDをリセットします。
注: この OLED にはさまざまな種類の情報が表示されます。この回路は、補足図8に示すコントローラケースに収容されています。
- OLEDのGNDに接続されたNPNトランジスタQ1を使用して、CPU信号IO0でOLEDのGNDを分離してOLEDをリセットします。
- 補足図7の「LED&ロータリーエンコーダ」では、プッシュスイッチとして機能し、2つのLEDを内蔵したはんだでロータリーエンコーダを取り付けます。
- 電源 LED として使用するために、1 つの LED を VCC に接続します。もう一つは、ヒーター操作中にインジケータとして使用するためにCPUに接続されています。
- CPUに接続されているヒーターのSTART/STOPには、プッシュスイッチの端を使用します。ロータリーエンコーダのA出力とB出力をCPU割り込み時に設定したIO入力に接続します。
注: この回路は、補足図 8に示すコントローラ ケースに収容されています。
- 補足図 7の CPU の場合は、WROOM - 02D の CPU を使用します。
- ディスプレイのインターフェースがI2C規格であるため、IO12、IO13から「表示ユニット」への出力。IO0を「ディスプレイユニット」に接続し、OLEDをリセットします。
- IO15を「ヒーター制御ユニット」に接続し、PWM出力によってヒーターに供給される電力を制御します。
- IO2を「プッシュスイッチ付きLED&ロータリーエンコーダ」に接続し、START LEDを点灯します。IO4とIO14を「プッシュスイッチ付きLED&ロータリーエンコーダ」に接続し、ロータリーエンコーダから信号(REAおよびREB)を受信して設定温度を決定します。IO5を「プッシュスイッチ付きLED&ロータリーエンコーダ」に接続し、ヒーターを起動/停止します。
3. ソフトウェア設計の概要
- このシステムのコントローラとして、CPU用のArduino CORE - 02Dを使用します。
注:入力デバイスとして、スタート/ストップスイッチ、ロータリーエンコーダ、温度センサ(サーミスタ)が使用されます。出力デバイスとして、LED、文字ディスプレイ(OLED)、ヒーターが使用されます。通信デバイスはWi-Fiを使用しています。 - 操作の概要
- LED&ロータリーエンコーダに示すように、補足図7のプッシュスイッチでロータリーエンコーダの動作を検出し、設定温度として保存し、OLEDに表示します。フェーズ端子REAとREBが割り込み入力端子として接続されているCPUの入力端子を設定し、割り込みによりロータリーエンコーダの回転(前方および逆)を処理します。前方回転の場合は +1、逆回転の場合は -1 に設定します。設定温度をグローバル変数に書き込み、ヒーター温度制御に使用します。同時に、OLEDの設定温度表示を更新します。
- 補足図 7の CPU に示すように、開始/停止スイッチ (SW-S) によって CPU IO 5 による開始と停止を識別します。スタート/ストップ スイッチの状態は、50 ミリ秒ごとにタイマー割り込み処理です。
注: スイッチは一時的なスイッチであるため、プッシュおよびリリース時に開始/停止の状態が反転します。この状態はグローバル変数に格納されます。 - 温度センサーにはサーミスタを使用します。サンプルセンサーから測定値を読み取ります (補足図 7の「ヒーター接続用コネクタ回路」」を参照)。. 補足図 7の "CPU" の IO15 ポートをオンにして、ヒーターに電流を供給します。
注:温度センサーには2種類あります。一方は試料の温度を測定し、設定温度でヒーターを制御し、もう1つはヒーターに取り付けられ、熱防止に使用されます。抵抗を介してサーミスタを3.3Vに接続し、電圧の変化として抵抗の変化を記録します。移動平均法でノイズを除去します。 - 温度防止温度センサーにはサーミスタを使用してください。過熱検出は、サーミスタ(R2)(補足図7の「ヒーター接続用コネクタ回路」)を使用して行い、設定値を超えるとヒーター電流が遮断されます(補足図7の「保護回路」)。
注:このセンサーは、CPUを介してではなく、回路に組み込まれています。このセンサはCPUから独立しており、アナログ方式で差動アンプによって抵抗トリマーによって設定された抵抗値と比較されます。温度が設定値を超えたことを検出すると、FET スイッチに介入してヒーターへの電流を制御し、電流供給を強制的に停止します。CPUが正常に動作しない場合でも、ヒーターの温度が一定のレベルを超えないようにすることを目的としています。 - CPU(補足図7の「CPU」)で、機器が動作中の場合は、補足図7の「プッシュスイッチ付きLED&ロータリーエンコーダ」のLEDをオンにします。
- 設定温度と測定値をCPUで補足図7の「表示部」に表示します(補足図7の「CPU」)。
- CPUからPWMを使用して補足図7の「ヒーター制御回路」でFETスイッチを駆動し、ヒーターを制御します。
- 温度センサーによって得られた測定された温度に基づいて、PIDによってヒーターを制御します。PID 処理には Arduino の pid_v1.h ライブラリを使用します。
注: CPU は時刻のキャリブレーション、サーバーとの通信、データの送信、およびサーバーからの命令の受信を行います。センサー温度が設定温度を超えると、ヒーターへの電流が0に設定され、オーバーシュートが抑制されます。 - CPUの内蔵Wi-Fi接続機能を使用し、インターネットに接続します。送信温度、ヒーター温度などをWi-Fiで指定サーバーに設定します。
4. システム構成
- 補足図 9に従ってシステムを構築します。
- コントローラーに Wi-Fi を装備します。
- 温度測定用のセンサーとしてサーミスタを使用してください。サーミスタワイヤーをコントローラーケースの「SENSOR」端子に接続します。サーミスタで測定した温度信号を受信します。
- ゴムヒーターとコントローラーケースの「HEATER」を組み込んだ顕微鏡ステージを専用ケーブルで接続します。ゴムヒーターへの電流を制御します。
- コントローラーのノブで設定温度を変更します。
注:温度ログ監視、温度設定は、PCやスマートフォンからリモートで操作することができます。 - 測定時の測定温度、設定温度、時間情報を、計測時にコントローラからインターネット経由でサーバーに転送します。データ測定サイクル時間は5sで、サーバーへのデータ転送のサイクル時間は1分です。
- 一定の間隔でコントローラ側からサーバーにアクセスし、コントローラの CPU に保存されている測定データを分析およびグラフ化のためにサーバーに転送します。
- サーバーの操作方法については、補足資料を参照してください。
5. 横反転顕微鏡の設計
- 厚さ15mmのアルミ板2枚をネジで垂直に固定し、基本マウントを作成します。
- ベースマウントの水平部分に治具(1箇所)を取り付けます。
- 顕微鏡ステージ部分を垂直に置き、治具(2箇所)をベーススタンドの垂直部分に取り付け、顕微鏡の底部をベーススタンドに固定します。
- 顕微鏡の段階をネジで固定します。
6. 操作方法
注:ここで使用されるサンプルは、大胆な改変基底淡水栄養溶液液体培地、メタシエートナトリウム、ビタミン、および滅菌水の混合物である。この試料の800μLは、淡水培地の10mLで希釈される。
- 観察方法
- 自作のガラス室に1,000 μLの調製サンプルを注入します。
注:自作のガラス室は平行に2つのスライドガラスを配置し、接着剤でそれらを固定します。通常のペトリ皿は厚さが大きく、細胞は室内の深さ方向に逃げ出し、顕微鏡で観察することは困難です。これを防ぐために、小さな深度方向を有するチャンバが作られ、チャンバ内の深さ方向に細胞が逃げ出すことを防止することができる。低温硬化性エポキシ樹脂接着剤は、チャンバからのサンプルの落下を防ぐためにガラスの周りに接着するために使用されます。 - 別用意のビデオカメラを顕微鏡に取り付けます。顕微鏡専用のレンズアダプターを使用してビデオカメラを接続し、サンプルを撮影します。
- 10倍の眼鏡と200倍の目的を持つ顕微鏡を使用してください。
- 垂直顕微鏡ステージを4mmネジで4箇所の顕微鏡に取り付けます。
注:アルミ板の設計図面については、補足図1Aおよび補足図2Aを参照してください。この実験では、反転顕微鏡を用いた。これは90°で傾け、作製された顕微鏡段階はねじと付けた。図1を参照してください。 - 縦に作られた4本の爪を使用して、2つのゴムバンドでサンプルを固定します。サンプルを地表に垂直な顕微鏡ステージに配置します。
- 補足図 8に示すコントローラを使用して、温度を 40 °C に設定します。コントローラーのノブを回して温度を設定します。ディスプレイの設定温度を確認します。ノブを押して温度調節を開始すると、青色のLEDが点灯します。ノブをもう一度押してLEDをオフにし、温度制御を停止します。
注:測定された温度はリアルタイムで表示され、ヒーターは設定された温度に達するように制御されます。温度制御が開始されると、青色のLEDが点灯し、ヒーターが作動している間は点灯したままになります。ヒーターがオーバーヒートすると、赤色のLEDが点灯し、ヒーターが自動的に停止します。 - サーバー操作の補足情報については、「サーバー操作マニュアル」を参照してください。
注: データストレージ用のサーバーが必要です。サーバーのデータベースは My-SQL を使用します。
- 自作のガラス室に1,000 μLの調製サンプルを注入します。
7. ゴムヒーターの表面温度分布の測定
- サーモグラフィーによるゴムヒーター表面温度の分布を測定し、温度の均一性を確認します。
- ゴムヒーターをスタンドに組み込んだ顕微鏡ステージを取り付けます。
- ゴムヒーター表面の設定温度を35°C、45°C、55°C、65°Cに変更し、正面からサーモグラフィーで測定します(補足図10参照)。
8. 温度応答試験
- サンプル設定温度を30°Cに設定して温度調節を開始します。測定値が30°Cに達し、安定するまで待ちます。プリセット温度を30°Cから50°Cに5°Cずつ段階的に上げ、それぞれのプリセット温度に従って測定値が安定するまで待ちます。
- 予め設定された温度を5°Cから5°Cから30°Cに下げ、測定値の追跡能力を検出します。
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Representative Results
図2はゴムヒーターの温度分布を示す。ゴムヒーターの表面温度は、各温度で均一であった。図3は、温度変化を設定するための測定温度の応答性を示す。オレンジ色の線は設定温度を示し、青い線はサンプル温度の変化を示します。設定変更に対する測定値のオーバーシュートは小さく、トラッキングが速いです。
珪藻土細胞は、この装置の使用の具体的な例を提供するために観察された。移動珪藻土細胞の軌道解析は、珪藻土細胞の運動性を評価するのに有用なアプローチである。しかし、通常の反転顕微鏡は試料を水平に観察するが、重力や浮動の影響を垂直方向に観察するには適していない。
この実験では、温度コントローラを用いた顕微鏡ステージを90°回転させた反転顕微鏡に取り付けた。珪藻土の温度依存的な垂直運動が正常に記録された。この方法では、図4に示すように、珪藻土の垂直運動の軌跡を検出した。100個の珪藻土を観察した結果、平均速度は室温で7.01μm/s、40°Cで470.1μm/sであった。熱対流が珪藻土細胞の垂直浮動現象に及ぼす影響を直接観察により可視化した。
図1:顕微鏡段階に固定した装置の写真。顕微鏡段階に固定された装置の出現。装置は4つのねじが付いている顕微鏡段階に固定される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ゴムヒーターの温度分布サーモグラフィーで測定したゴムヒーターの分布。ヒーラ温度を周囲温度から35°C、45°C、55°C、65°Cに段階的に変更した。温度は、各温度でヒーター全体に均一に分布しました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:温度信号の応答性。これは、設定温度を30°Cから50°Cに上げ、50°Cから30°Cに下げた場合の応答を示す。設定温度を5°C単位で変化させた。安定した状態では、測定温度は設定値の±1.5°C以内である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:珪藻土運動の軌跡。温度変化による珪藻土運動の垂直軌道がプロットされている。青い線は27.06 sの25 °Cで、0.2 sのための40 °Cで珪藻土細胞の軌道を示し、この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。
補足図 1: アルミニウムプレートの図面を設計します(寸法付き)。(A) プレートは厚さ2mm×幅150mm×幅200mmで、中央に101mm径の穴を開け、ゴムヒーターの挿入が可能です。各プレートエッジには、ゴムバンドを取り付け、ステージ上の安全なサンプルに取り付けることができます2本の加工された爪があります。この垂直ステージを4mmネジ付きの顕微鏡に取り付けるため、4.2mmのネジ穴を中央穴を対称的に取り囲む4箇所で掘削します。(B) プレートは厚さ5mm×幅150mm×長さ200mmで、中央に130mmの直径の穴が付いています。最先端のプレート上の爪の位置を一致させる機械ノッチの位置は、ステージ全体でサンプル固定ゴムバンドの取り付けを可能にします。顕微鏡への段階の取り付けのために、4つの4.2 mmのねじ穴は最前線の版のものと一致する位置で掘削される。(C) プレートは厚さ4mm×幅150mm×長さ200mm、中央に130mmの直径の穴があります。プレートの右200mm面の中心から中央の穴の深さまで30mmのスパンを切り取ります。カットアウトのこの目的は、右側のヒーターコネクタの取り付けを可能にすることです。最前線の版と同じ位置で、4つの4.2 mmのねじ穴は顕微鏡に段階の付着のために掘削される。(D) プレートは厚さ1.5mm×幅150mm×長さ200mmで、中央に30mmの直径の穴が付いています。最前線の版と同じ位置で、4つの4.2 mmのねじ穴は顕微鏡に段階の付着のために掘削される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 2: アルミニウムプレートの図面を設計します(寸法なし)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図3:アルミ台座のデザイン図。(A)上面に取り付ける場合:直径は100mm、厚さは3mmです。中央に直径30mmの穴を開け、片側に幅42mm×奥行き30mmの切り抜きが可能です。(B) 下側に取り付ける場合:直径は100mm、厚さは4mmです。30mm径の穴を中央に掘削し、中心から25mmの距離で3つの3つのmm穴を120°で互いに配置しました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図4:押されたコルクディスクの設計図。(A) シリコンゴムヒーターと上部アルミ台座の間の上側に設置する場合:直径は100mm、厚さは2mmです。20mm径の穴を中央に掘削し、2つのカット(幅42mm×奥行き30mm、幅4mm×40mm)をディスクの側面で互いに直角に作ります。(B) シリコンゴムヒーターと下部アルミ台座の間の下側に設置する場合:直径は100mm、厚さは1mmです。直径20mmの穴が中央に穴あけされています。(C) このサポートは幅42mm×奥行き30mmで、直径100mmのディスクの周囲から切り取ります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図5:シリコーンゴムヒーターの仕様。直径は100mm、厚さは2.5mmです。直径20mmの穴が中央に穴あけされています。電源は12Vで、18Wの積載量です。ヒーターは、電極に接続されたリード線で、ニクロムワイヤで構成されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図6:顕微鏡段階の断面。これは顕微鏡段階の断面図である。アルミ製の台座は背面のアルミ板に取り付けられ、最も外側にはゴムヒーターが取り付けられています。押されたコルクはゴムヒーターおよびアルミニウム台座間の絶縁のために取付けられる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図7:回路図の詳細。これは、コントローラに組み込まれた回路を示します。回路図は、個々の機能に応じて9つの部分に分かれています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図8:プラスチックコントローラケースの図面を設計します。外形寸法は長さ143.9mm×奥行き85.3mm×幅25mm。温度設定ノブ、操作/過熱ランプ、およびインジケータは、プラスチックコントローラケースに配置されています。設定ノブを回すことでインジケーターを見ながら温度を設定できます。このノブを押すと、温度コントローラが起動します。測定温度はリアルタイムで表示され、ヒーターは設定温度に達し、保持できるように制御されます。温度コントローラをオンにすると、青色のLEDが点灯し、ヒーターの動作中も点灯したままになります。ヒーターが過熱すると、赤色のLEDがオンになり、ヒーターが自動的に停止します。温度コントローラノブをもう一度押すと停止します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 9: システム構成。組み込まれたコントローラーが付いている顕微鏡の段階は専用ケーブルが付いているゴムヒーターに接続される。測定されたサンプル温度信号を受信し、ゴムヒーターへの電流がコントローラによって送信されます。コントローラからの測定された信号は、インターネットルータを介して無線でサーバに送信されます。サーバーは、分析とグラフ作成用の測定データをコンパイルします。温度ログの監視と温度設定は、PCやスマートフォンを介してリモートで制御することができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図10:サーモグラフィーによる温度分布測定。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
移動珪藻土細胞の軌道解析は、珪藻土運動性を評価するのに有用なアプローチである。しかし、通常の反転顕微鏡はサンプルを水平に観察しますが、重力や垂直方向の浮遊運動の影響の観測には適していません。ここで開発され、説明されている温度制御と垂直顕微鏡段階であり、90°によって回転された反転顕微鏡に取り付けられている。温度制御が付いているこの顕微鏡段階は珪藻土細胞の温度依存的な縦の動きの観察を可能にする。
プロトコル内の重要なステップは、コントローラ回路設計です。安全を確保するため、ブレーカ回路を実装。センサがサンプルから切断されたり、マイクロコントローラが正常に動作しない場合、ヒーターへの電流はマイクロコントローラとは異なる回路によって遮断されます。
制御システムは、ヒータの電流を制御するためにPIDシステムを採用しているので、PIDの最適なパラメータを見つける技術が必要です。従来の方法と比較して、Wi-Fi機能、サーバー上のデータ収集、温度設定機能により、遠隔操作・監視が可能です。顕微鏡に取り付けられたステージ部分の構造が複雑なため、この構造の簡素化は将来の研究を保証します。
この装置は温度を上げるためにヒーターを使用するが、冷却は動力を与えられていない。したがって、設定温度を室温以下にすることはできません。室温より低い温度にサンプルを冷却するには、複雑な冷却装置が必要であり、将来の作業のために検討されています。
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Disclosures
著者は開示する競合を持っていません。
Acknowledgments
著者は謝辞を持っていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30? | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A - MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM - selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields - A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
- Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
- Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates - potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion - An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
