Summary
这里介绍的是一个协议，用于从高密度镀电神经元中神经祖细胞中富集的神经球的自发生成。在同一实验中，当神经元以较低的密度被镀层时，该协议也会导致长期原发性大鼠神经元培养。
Abstract
初级神经元培养是神经科学领域必不可少的技术。为了获得对大脑的更深层次的机械洞察力，必须有一个强大的体外模型，可用于各种神经生物学研究。虽然原始神经元培养（即长期海马文化）为科学家提供了模型，但它还不能完全代表大脑网络的复杂性。在这些限制之后，一个新的模型出现了使用神经球，这与脑组织有更密切的相似之处。本协议描述了从胚胎第14-16天斯普拉格道利大鼠胚胎中分离出来的混合皮质和海马神经元的高密度和低密度的电镀。这允许产生神经球和长期初级神经元培养作为两个独立的平台进行进一步研究。这个过程非常简单且经济高效，因为它最大限度地减少了以前被认为对神经元培养至关重要的几个步骤和试剂。这是一个强大的协议，具有最低要求，可以执行与可实现的结果，并进一步用于与神经科学相关的各种研究。
Introduction
大脑是神经元和非神经元细胞的复杂回路。多年来，科学家们一直试图深入了解这种复杂的机器。为此，神经科学家最初利用各种转化的神经基细胞系进行调查。然而，这些克隆细胞系无法形成强突触连接和适当的斧子或树突，转移了科学兴趣的主要神经元培养1，2。原始神经元文化最令人兴奋的方面是，它创造了观察和操纵活神经元的机会3。此外，与神经组织相比，它不太复杂，因此成为研究各种神经元蛋白质的功能和传输的理想候选者。最近，显微镜、基因组学和蛋白质组学领域的一些发展为神经科学家创造了利用神经元培养的新机会。
初级文化使神经科学家能够探索神经发育背后的分子机制，分析各种神经信号通路，并发展对突触的更连贯的理解。虽然许多方法已经报告了来自主神经元的培养物（主要来自海马起源5，6，7），但具有化学定义的介质的统一协议是，使神经元的长期培养仍然需要。然而，在低密度下镀层的神经元最常被观察到，这些神经元不能长期存活，这可能是由于缺乏营养支持8，而营养支持是由相邻的神经元和胶质细胞提供的。一些方法甚至建议与胶质细胞共同培养主神经元，其中胶质细胞用作第9层的供料层。然而，胶质细胞由于过度生长而引起许多问题，有时会覆盖神经元的生长。因此，考虑到上述问题，需要一种更简单、更具成本效益的初级神经培养方案，神经生物学家和神经化学家都可以用于研究。
初级神经元文化本质上是一种二维文化形式，并不代表大脑的可塑性、空间完整性或异质性。这就产生了一个更可信的3D模型，称为神经球11，12的需要。神经球为神经科学家提供一个新颖的平台，与真正的、体内的大脑更相似。神经球是富含神经干细胞（NSC）、神经祖细胞（NPC）、神经元和星形细胞的非粘附性3D细胞簇。它们是神经干细胞和神经祖细胞分离的极好来源，可用于研究各种神经元和非神经元谱系的分化。同样，使用先前报告的协议产生的神经圈培养物的变异性对制定统一的神经圈培养方案14构成了障碍。
本手稿提出了一个协议，通过从混合皮质和海马培养中交替细胞电镀密度，可以生成 2D 和 3D 平台。据观察，在7天内，自由浮动的神经球是从从E14-E16斯普拉格道利大鼠胚胎中分离出来的高密度镀层神经元中获得的，这些神经元在进一步培养后，通过径向胶质状的延伸形成桥梁和互连。同样，在低密度镀层神经元中，通过每周两次改变维持介质，可以维持长达30天的主要神经元培养。
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Protocol
涉及动物的所有实验程序都经印度化学生物学研究所的机构动物伦理委员会（IICB/AEC/会议/2018/1年4月）批准。
1. 试剂和介质制备
- 聚D-莱辛（PDL）溶液：在去离子水中以0.1mg/mL的浓度制备PDL溶液，并储存在4°C中，直到使用。
- 分离介质：至1 L的无菌、过滤脱离子水，在相应浓度中结合以下组分：氯化钠（8毫克/升）、氯化钾（0.4毫克/升L）、磷酸钾单基（0.06毫克/升）、D-葡萄糖（1毫克/升）磷酸钠二基（0.479毫克/升，和1 M HEPES [4-（2-羟基）-1-烟酸乙酸;10 mM]。涡旋所有组件，以帮助适当的混合和存储在4°C，直到使用。
注：在解索过程中，但在室温（RT）下，使用冷冰形式的解散介质进行清洗和其他用途。 - 电镀介质：电镀介质包括：最小必需介质（MEM）Eagle与Earle的平衡盐溶液（BSS;88.4%），D-葡萄糖（0.6%），马血清（10%）和青霉素/链霉素（1%）。将组件组合成各自的比率，并在无菌条件下在发动机罩内执行该过程。
注：始终使用新鲜制备的电镀介质，以避免任何组件降解。 - 维持介质：在各自的比率中结合以下组合来制备维持介质：神经巴基培养基（97%）、0.5 mM商业获得的谷氨酰胺样品、B27无血清补充剂（2%）和青霉素/链霉素（1%）。将组件组合成各自的比率，并在无菌条件下在发动机罩内执行该过程。确保所有部件都新鲜准备。
2. 准备盖玻片
- 取一个直径为 12 mm 的圆形玻璃盖玻片，并将其浸泡在 1 M 盐酸 （HCl） 中 4 小时。
- 使用一对钳子将盖玻片转移到蒸馏水中，轻轻旋转以完全去除酸。
- 将洗过的盖玻片转移到含有 100% 乙醇的烧杯中进行额外一轮清洁。
- 在使用盖玻片之前，将它们放在纸巾上，在层罩中干燥。
3. 为神经元培养制备多D-莱辛涂层板
- 取两个 24 孔板：一个用于高密度电镀，另一个用于低密度电镀。仅在层罩内打开无菌包。
- 转移 24 个孔板中的 12 mm 无菌玻璃盖玻片。
- 将 300 μL 的 PDL 溶液（0.1 mg/mL 在去离子水中）倒入每口井中，使其完全覆盖盖玻片表面。
- 用铝箔包裹板材，防止干燥，并放在CO2孵化器中过夜。
- 第二天（电镀前），吸出PDL溶液，用300μL无菌脱离子水正确清洗两到三次。
- 加入200 μL新鲜制备的电镀介质，将板体返回到培养箱，直到电镀。
4. 胎儿的切除和斩首
注：在高压灭菌器中，在121°C（15 psi）下，用铝箔包装的所有手术器械消毒30分钟。这包括一对钝端剪刀、钳子、细钳子、两把细剪刀和一把动脉钳，用于整个过程。
- 对于生成神经元和神经球，使用时间怀孕的斯普拉格道利大鼠，用阴道塞检测标记为 E0 标记这一天。
注： 必须在 E14-E16 之间执行区域性。 - 在养殖日，将无菌玻璃石化板放在冰上，用冷汉克的平衡盐溶液（HBSS）填充。
- 麻醉E14-E16怀孕大鼠，注射90毫克氯胺酮/千克体重和10毫克木氨酸/千克的腹肌内（即p.），然后通过进行宫颈脱位来牺牲。
注：大鼠也可以安乐死过量的五巴比妥或过量氯胺酮与木兰辛或安定。 - 通过喷洒 70% 乙醇对大坝的腹部进行消毒，并使用无菌钳和一把钝端剪刀在腹部区域进行 V 形切口。
- 用冷HBSS溶液小心地在Petri板上取胚胎囊。
注意：不要使用与皮肤相同的钳子和剪刀，因为这将污染内脏器官。对内脏使用另一套剪刀/钳子。 - 将胚胎从新鲜、寒冷的哈佛心囊中取走。
- 用无菌剪刀头斩首。
5. 去除大脑和用海马切除皮层
- 出发前，用冷、无菌的 HBSS 填充 90 mm 无菌培养皿。
- 使用无菌、钝端敷料钳将头转移到无菌的盘子中。
- 在立体显微镜下，用无菌、锯齿状的钳子将头部从鼻孔区域抱住，并通过切开皮肤和头骨来取出大脑。
- 在 HBSS 溶液中以同样的方式收集所有胚胎大脑。
- 通过按住脑干从半球和中脑去除所有脑筋。
- 小心地去除完整的半球，类似于蘑菇帽，包含海马和皮层。
- 在含有10 mL解结介质的15 mL锥形管中收集包含皮层和完整海马的半球。
6. 皮质和海马组织分裂为单神经元
- 允许收集的组织稳定下来，吸出分离介质，在其中留下5%-10%的介质。
- 向组织添加10 mL的新鲜解散介质，并重复步骤6.1两次。
- 加入4.5 mL的解毒介质和0.5 mL的0.25%（1x）胰蛋白酶EDTA（乙烯二胺四乙酸酯）溶液。
- 将组织保持在37°C的培养箱中20分钟，以便继续消化。
- 吸气介质，连续向消化组织添加10 mL解散和电镀介质。
- 允许消化的组织稳定下来，吸出分离介质。加入 2.5 mL 的电镀介质，倒入 90 mm 无菌盘的底座中。
- 使用 1，000 μL 移液器尖端对盘角底的消化组织进行三聚，以占据最小体积。
- 通过获得细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器，不包括任何组织块。
- 使用锥蓝色染料排除方法确定活细胞的密度，并计算自动细胞计数器中的细胞数。
- 对于试青染料排除方法，采用10μL的细胞悬浮液和10μL的0.4%锥体蓝色染色，彻底混合，并在一次性室幻灯片的两个封闭腔室之一中加入10μL的混合物。
- 将含有混合物的幻灯片插入细胞计数器并获取读数。
注：锥形蓝色染料排除方法基于以下原则：活细胞（由于其完整的膜）将排除锥形蓝色染料，因此将显示一个清晰的细胞质，与一个不可行的细胞相比，它很容易占据锥形蓝色，并在颜色15.
- 稀释在两个单独管中，每个电镀介质含有30 mL，用于高密度的1.5 x 105个细胞/mL和20，000个单元/mL的低密度取用的细胞数量。
- 从每个孔中吸出先前添加的电镀介质，并将分散在每个孔的电镀介质中的500μL电池板。
- 之后，在37°C和5%CO2下将板返回到培养箱4小时。
- 电镀后4小时在显微镜下检查细胞是否粘附。
- 如果两个板中的细胞适当粘附，用500μL的新鲜维持介质替换每个孔中的培养基，并在37°C下孵育。
- 通过每周2次改变维持培养基，培养这些神经元在低密度下生长30天。
- 将高密度镀电神经元转移到超低附着板，使神经球在相同的维持介质中培养。
- 通过用重要的标记物对神经元和神经球进行免疫染色，从而描述神经元和神经球。对于免疫细胞化学，首先在板上使用4%甲醛修复细胞/神经球30分钟，然后用0.1%非离子洗涤剂渗透细胞10分钟。
- 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中加入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的原抗体（抗Tuj1、GFAP、O4、tau）和神经球（抗Nestin、GFAP、Tuj1），并在4°C16孵育过夜。
注：Tuj1（III类+-图布林）和tau是主要神经元的正标记，而GFAP（胶质纤维酸性蛋白）和O4（寡核苷酸标记物）是主要神经元的负标记17，18。在神经球的情况下，Tuj1，GFAP和Nestin都作为积极标记19，20。 - 第二天，用PBS清洗细胞一次或两次，并在PBS中加入适当的二级抗体，在RT浓度为1：600时，2小时。
注：根据添加的主要抗体的宿主种类选择抗小鼠或抗兔子二级抗体。应记住，二级抗体必须与适合荧光显微镜用途的荧光衍生物结合使用。 - 用PBS再次清洗细胞一次或两次。
- 使用 Hoechst 33258（1 mg/mL 在去离子水中的库存溶液）对细胞进行核染色。从库存溶液中制备 0.1% 的 Hoechst 溶液，并将其添加到细胞中。
- 用0.1%的Hoechst溶液孵育细胞30分钟，然后用PBS再次清洗。
- 在幻灯片上添加 20 μL PBS（或安装介质），并缓慢地将包含染色细胞的盖玻片安装在包含 PBS 的幻灯片区域上。用二丁基苯甲酸聚苯乙烯二甲苯 （DPX） 密封盖玻片的边缘。
- 以 10 倍和 40 倍的放大倍率在显微镜下对固定细胞进行成像。
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Representative Results
在该协议中，阐明了一种简单的策略，即从两个不同的神经筛选平台获得可变细胞电镀密度。图1A，B分别说明了高密度和低密度电镀细胞中神经元电镀4小时后细胞的依从性。在观察如图1所示的神经元的正确附着性时，电镀介质被每个井中的维护介质所取代，从而在37°C时返回到培养箱。在高密度镀层神经元中观察到更多的细胞附着性。在电镀24小时后，高密度和低密度镀层神经元都显示出精细的神经元延伸和突触互连，如图2A，B所示的差分干涉对比度（DIC）图像。
在图3A中，表示培养中7天后低密度镀层神经元的相对比图像。在这里，神经元已经开发了一个精心设计的突触网络，由树突状分支组成。这些神经元可以通过每3天改变一次维持培养基，随着更复杂的神经元网络的发展而进一步维持长达30天。在图3B，C， 免疫细胞化学染色执行通过染色与神经元标记 Tuj1 （分化神经元的标记）21和 Tau （斧头标记） 22 揭示低密度培养神经元的神经元性质，分别。图 3B中的红色表示 Tuj1 染色的存在，图 3C中的绿色表示主神经元的斧头中的染色。神经元文化的纯度通过无标记的星形细胞GFAP（图3D）和寡核苷酸酯的O4（图3E）显示。以蓝色显示的核被Hoechst 33258所污染。
如图4A、B、C、D所示，7天后的高密度镀层神经元以自发神经球的形成为标志。8-10天后，在神经球之间观察到由径向胶质状延伸构成的不同桥梁，如图4E所示。神经球富含NPC，共同表达标记内斯丁和图伊123。神经质显示内斯坦和图伊的阳性染色，如图524所示。 以蓝色显示的核被Hoechst 33258所污染。这些神经球可以通过在超低附着板中培养来维持数周。在图6中，评估了培养约30天的神经元的寿命，并使用常规MTT[3-（4，5-二甲基硫磷-2-yl）-2，5-二苯基甲二甲二甲二甲二甲二甲二苯-溴化]测定，在±5天的间隔内测量细胞活力。发现神经元在30天的培养后表现出90%以上的生存能力。
接下来，评估了高密度和低密度种子培养物中的星形细胞百分比。由于这种方法主要针对培养神经元，因此评估此方法是否支持神经元比非神经元细胞（尤其是星形细胞）的优先生长非常重要。在神经球形成高密度种子培养物中观察到一组星形细胞的存在，图7A中以GFAP染色的绿色标记;然而，与Tuj1（红色）染色的神经元群相比，观察到的显著较少。图7B中的定量数据也重申了这一点，其中17%的细胞是GFAP表达的，而Tuj1表达细胞中83%的细胞群是GFAP表达的。
星形种群也通过GFAP染色调查，与低密度种子细胞的神经元群（Tuj1染色）相比，连续7天。虽然在7天内未观察到细胞总数有显著差异，但由于播种率低，星形细胞种群也观察到非常低（几乎没有或非常低的GFAP染色），大多数是神经元种群（非常如图 8A所示，高 Tuj1 表达式）。
如图8B所示，定量分析是通过计算在细胞Sens软件的帮助下通过显微镜获得的星形细胞和神经元的组成进行的，最初只观察到了+2%-3%的星形细胞群。由于缺乏合适的介质和营养来支持其生长，这些星形细胞种群也随着时间的推移而慢慢消亡，而在最佳因素和介质的存在下，神经元迅速接管了整个文化。
如图9所示，由于NPC的存在，神经球也表达出大量的星形细胞，其标志是GFAP染色的强绿色信号以及更强的Tuj1信号。最后，为了观察这些神经球是否随着时间的推移而膨胀，在1周的高密度培养后，此时小神经球开始形成，少数在超低附着板中转移，并且每5天监测一次，长达5次15天
还使用钙素AM（绿色）和碘化钠（红色）进行活/死细胞测定，以检查细胞的健康状况。据观察，膨胀的神经球表现出大量的绿色荧光，没有红色染色，表明在培养中至少15天内没有在神经球中发生死亡，如图10A所示。如图10B所示，神经球在培养中每5天观察到大量扩张，最多15天。为了绘制表示神经球体积（每个时间点）最终增加的线图，研究了50个神经球，并使用了它们的平均值来推导每个时间点的神经球体积。
图 1：4小时电镀后细胞附着性表示。（A） 高密度镀层神经元中的细胞依从性.（B） 低密度镀层神经元的细胞依从性.（A，B）中的刻度条为200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：电镀24小时后神经元的细胞形态。（A） 高密度镀层神经元的细胞形态.（B） 低密度镀层神经元的细胞形态。（A、B）中的刻度条表示20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:7天后低密度镀层神经元的形态和表征。（A） 神经元的相对比图像显示广泛发芽.比例尺表示200μm。叠加图像显示神经元蛋白质（B）Tuj1（红色）和（C）tau（绿色）的表达。Immnunotot化学清楚地显示非神经蛋白 （D ） GFAP（绿色） 和 （E） O4 （红色） 中无染色。核被沾染了Hoechst 33258（蓝色）。（B、C、D、E）中的刻度条表示20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:7天后在高密度镀层神经元中形成神经球。（A-D）在培养中从高密度镀层神经元中自发产生神经球7天后。 （E） 在两个新形成的神经球之间形成径向胶质延伸，如黑色箭头所示。比例尺（A、B、C、D、E）代表200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:获得的神经球的特征。神经球的叠加图像显示神经元蛋白Tuj1（红色）和神经干细胞标记Nestin（绿色）的表达，表示NPC丰富的人群。核被染色与霍赫斯特33258（蓝色）。比例尺表示20μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6: 原发神经元的细胞活力。条形图表示主要神经元的细胞活力，使用 MTT 测定以 5 天为间隔评估长达 30 天。错误栏表示值的 SD （\p < 0.05）。请点击此处查看此图的较大版本。
图 7：神经球形成高密度培养特征与神经元标记Tuj1和星形细胞标记GFAP。a） 图像显示高密度种子细胞（在DIC模式下），生成表达GFAP（星形细胞）和Tuj1（神经元）的神经细胞。核被用Hoechst 33258染色。比例尺表示20μm （B） 条形图表示在神经圈中产生高密度细胞的Tuj1表达细胞和GFAP表达细胞的百分比。错误栏表示 SD （\p < 0.05）。请点击此处查看此图的较大版本。
图 8：低密度镀层细胞的表征，用于原发神经元培养，具有神经元标记Tuj1和星形细胞标记GFAP，持续长达7天。a） 图像显示四个不同通道（即DIC、蓝色通道[指示Hoechst 33258指示核染色]、绿色通道[GFAP染色]和红色通道[Tuj1染色]）连续7天的低密度种子细胞。比例条表示20μm.（B）条形图表示Tuj1表达细胞与低密度种子细胞中GFAP表达细胞的百分比百分比，用于初级神经元培养7天。错误栏表示 SD （\p < 0.05）。请点击此处查看此图的较大版本。
图 9：利用GFAP和Tuj1对获得的神经球进行免疫染色。获得的神经球的图像是 （A） 在 DIC 模式下， （B） 核染色使用 Hoechst 33258， （C） 星形细胞标记 GFAP （绿色） 和 （D） 神经元标记 Tuj1 （红色）.比例尺表示20μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 10：15天内神经球的生长和活/死细胞测定。（A） 图像显示在 DIC 模式下，神经球以 5 天的间隔在 15 天内生长，以及其染色与钙质 AM（绿色表示活细胞）和 PI（碘化钠表示死细胞）。比例尺表示20μm （B） 图形表示在低粘附板中生长的神经球的大小增加，以5天为间隔在15天内生长。错误栏代表SD。请点击这里查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议描述了如何通过改变主神经元的细胞电镀密度，获得两个可变神经元平台。虽然这是一个简单的方法，但必须仔细执行每个步骤才能达到预期的结果。其他以前的方法要么报告长期原发神经元培养或神经圈培养。大多数主要神经元培养协议都涉及海马神经元的培养3-5周，但大多数已经失败，因为神经元死亡和枯萎，由于失去连接。该协议的另一个优点是，神经元可以培养，而无需任何胶质进料层，从而保持神经元的纯度。
但是，必须仔细遵循几个关键步骤才能获得预期的结果。首先，在整个过程中保持无菌状态是绝对必要的。建议在开始前用70%的酒精在层罩中执行大多数步骤，并预先清洁所有板、器械和手术工具;否则，由于细菌和真菌的污染，失败的可能性更大。其次，分离E14-16胚胎很重要;因此，阴道塞检测步骤应仔细执行。随着胚胎日的增加，非神经元细胞污染的可能性就越大。完全去除半球的脑皮对于减少非神经细胞对培养的干扰至关重要。电镀和维护介质都必须对所有组件进行全新准备，因为每个组件都起着至关重要的作用。另一个必须牢记的因素是，获得的主要神经元必须通过每周改变维持培养基2倍来维持，以便扩散神经元的营养供应保持不变。
虽然尚未尝试，但稍作修改的该协议在小鼠胚胎神经元中可能也很有用。如果不需要的神经元或神经球没有按照此技术获得，则有一些故障排除提示可能会有所帮助。为了保持组织活力，解剖必须在冰冷的HBSS中进行。解剖也可以在冰冷的克雷布斯缓冲器中进行，而不是HBSS缓冲液。快速进行解剖是维持组织生存能力的关键。使用10倍胰蛋白酶将导致组织过度消化。因此，10倍胰蛋白酶-EDTA溶液在消化前应稀释至解脱缓冲液中的1倍。应不惜一切代价避免在细胞中添加冰冷的介质，导致冻震，而在达到RT后应使用介质。最重要的是，盖玻片应始终涂有PDL，否则神经元不会附着在盖玻片上。在进行三聚步骤时出现任何困难（即组织消化不当），可以通过添加 0.5 mL 的 1% DNase 进行 10 分钟的消化。如果遇到非神经元细胞的高污染，应添加+5 μM细胞氨酸（阿拉辛）以防止非神经元细胞的生长。
尽管该技术具有多种优点，但存在一些限制。众所周知，这种技术自发地产生神经球（虽然，触发分子机制尚不清楚）;然而，关于这种技术仍然存在的含糊不清，如形成的神经球的确切大小和形成足够数量的神经球所需的确切天数。主要是，大小是问题所在。尽管已经观察到神经球的体积随时间而膨胀，但获得的初始神经球的大小是可变的。虽然很有用，但它很难执行同步研究。这种神经圈生成协议与其他协议的区别是它的稳健性和简单性。早先报道的培养和繁殖神经病的规程需要特殊的介质要求和培养条件，但该协议中不需要。在这些先前报道的协议中，那些希望产生神经球的人几乎没有任何统一性。
总体而言，该协议描述了一个独特的策略，通过简单地改变从E14-E16 Sprague Dawley大鼠胚胎分离的主要神经元的细胞电镀密度，生成2D和3D神经元平台。与其他方法相比，此方法具有成本效益，因为它可以通过简单的设置执行，并且需要的试剂和步骤要少得多。它可以为神经科学家提供各种感兴趣的应用。这可用作各种神经治疗线索的筛查平台，观察各种神经元货运蛋白的作用，研究许多神经退行性疾病的细胞通路，以及许多其他应用。神经球可以进一步用于筛选各种神经区分剂和研究体外神经发育的早期阶段25，26。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢CSIR-IICB动物设施。G. D. 感谢ICMR、J.K.和V.G.感谢DST Inspire，D.M.感谢印度DBT的奖学金。S. G. 请确认 SERB （EMR/2015/002230） 印度提供财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
References
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