Summary
여기에 제시된 것은 고밀도 도금 뉴런으로부터 신경 전구 세포에서 농축된 신경구의 자발적인 생성을 위한 프로토콜이다. 동일한 실험 동안, 뉴런은 낮은 밀도에서 도금 될 때, 프로토콜은 또한 장기간된 기본 쥐 신경 배양 결과.
Abstract
1 차적인 신경 문화는 신경 과학의 필드에 있는 필수적인 기술입니다. 두뇌에 더 깊은 기계론적 통찰력을 얻으려면, 각종 신경생물학 연구 결과를 위해 이용될 수 있는 강력한 시험관내 모형이 필수적입니다. 비록 기본 신경 문화 (즉, 장기 해 마 문화) 모델 과학자를 제공 했습니다., 그것은 아직 완전히 뇌 네트워크의 복잡성을 대표 하지 않습니다. 이러한 한계의 여파로, 새로운 모델은 신경 구를 사용하여 등장했다, 이는 뇌 조직에 가까운 유사성을 곰. 본 프로토콜은 배아일 14-16 스프라그 다울리 래트의 배아로부터 분리된 혼합 된 피질 및 해마 뉴런의 높고 낮은 밀도의 도금을 기술한다. 이것은 추가 연구를 수행하기 위하여 2개의 독립적인 적인 단자로 신경구 및 장기 1 차적인 신경 문화의 생성을 허용합니다. 이 과정은 매우 간단 하 고 비용 효율적인, 그것은 여러 단계를 최소화 하 고 시약 이전에 신경 문화에 대 한 필수적인 것으로 간주. 이것은 달성 가능한 결과로 수행 될 수 있고 신경 과학과 관련된 다양한 연구에 더 많이 사용될 수있는 최소한의 요구 사항을 가진 강력한 프로토콜입니다.
Introduction
뇌는 신경 세포와 비 신경 세포의 복잡 한 회로. 수년 동안 과학자들은 이 복잡한 기계에 대한 통찰력을 얻기 위해 노력해 왔습니다. 이렇게 하기 위하여는, 신경 과학자는 처음에 조사를 위한 각종 변형된 신경 기지를 둔 세포주에 의지했습니다. 그러나, 이러한 클론 세포주무능력은 강한 시냅스 연결과 적절한 축산 또는 모수석을 형성하는 데 1차뉴런 배양에 대한 과학적 관심을 1,2로이동시켰다. 1 차적인 신경 문화의 가장 흥미로운 양상은 살아있는 신경세포를 관찰하고 조작할 수 있는 기회를 만든다는 것입니다3. 또한, 그것은 신경 조직에 비해 덜 복잡 한, 기능 및 다양 한 신경 단백질의 전송을 공부 하기 위한 이상적인 후보. 최근, 현미경 검사법, 유전체학 및 프로테오믹스 분야의 여러 발전은 신경 과학자들이 신경 문화를 악용할 수 있는 새로운 기회를 창출했습니다4.
1 차적인 문화는 신경 발달의 뒤에 분자 기계장치를 탐구하고, 각종 신경 신호 통로를 분석하고, 시냅스의 더 일관된 이해를 개발하는 신경과학자를 허용했습니다. 여러 가지 방법이 1차 뉴런으로부터의 배양을 보고했지만(대부분 해마기원5,6,7),뉴런의 장기 배양을 가능하게 하는 화학적으로 정의된 배지를 가진 통합 프로토콜은 여전히 필요합니다. 그러나, 저밀도에서 도금된 뉴런은 인접 한 뉴런 및 신경교 세포에 의해 제공되는 영양 지지부 8의 부족으로 인해 장기적으로 생존하지 못하는 가장 자주 관찰된다. 일부 방법은 심지어 신경교 세포를 가진 1 차적인 신경세포의 공동 배양제안했습니다, 여기서 신경교세포는 피더 층 9로 이용됩니다. 그러나, 신경교 세포는 때때로 신경 성장10을재정의하는 그들의 자라난 때문에 많은 문제를 제기합니다. 따라서, 위의 문제를 고려, 간단 하 고 더 비용 효율적인 기본 신경 문화 프로토콜 필요, 조사에 대 한 신경 생물학자와 신경 화학자 모두에 의해 사용할 수 있는.
1 차적인 신경 문화는 본질적으로 2D 문화의 한 형태이고 두뇌의 가소성, 공간 무결성, 또는 이질성을 나타내지 않습니다. 이것은 신경구11,12에게불린 더 믿을 수 있는 3D 모형을 위한 필요를 초래했습니다. 신경구는 신경 과학자에게 새로운 플랫폼을 제시, 실제에 가까운 유사, 생체 내 뇌13. 신경구는 신경 줄기 세포 (NSC), 신경 전구 세포 (NPC), 뉴런 및 성상 세포가 풍부한 세포의 비 부착 3D 클러스터입니다. 그들은 신경 줄기 세포와 신경 전구 세포의 격리에 대 한 훌륭한 소스, 다양 한 신경 및 비 신경 계보로 분화를 공부 하는 데 사용할 수 있는. 다시, 이전에 보고된 프로토콜을 사용하여 생성된 신경구 배양 내의 가변성은 통합된신경구 배양 프로토콜(14)의 제형에 장벽을 제시한다.
이 원고는 혼합 된 피질 및 해마 배양으로부터 세포 도금 밀도를 번갈아 가며 2D 및 3D 플랫폼을 모두 생성 할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 그것은 이내 7 일 자유 부동 신경구는 E14-E16 Sprague Dawley 쥐 배아에서 분리된 고밀도 도금 뉴런에서 얻어진다는 것을 관찰됩니다, 이는 추가 문화에 따라, 방사형 신경교와 같은 확장을 통해 다리와 상호 연결을 형성합니다. 유사하게, 저밀도 도금 뉴런에서, 최대 30일 동안 유지될 수 있는 1차 뉴런 배양은 일주일에 두 번 유지 배지를 변경함으로써 수득된다.
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Protocol
동물과 관련된 모든 실험 절차는 CSIR-인도 화학 생물학 연구소의 기관 동물 윤리위원회 (IICB / AEC / 회의 / 4 월 / 2018 / 1)에 의해 승인되었습니다.
1. 시약 및 미디어 준비
- 폴리-D-리신(PDL) 용액: 탈이온수에서 0.1 mg/mL의 농도로 PDL 용액을 준비하고 사용할 때까지 4°C에 보관하십시오.
- 해리 매체: 멸균, 여과 된 탈이온수 1 L에 염화 나트륨 (8 mg / mL), 염화 칼륨 (0.4 mg / mL), 칼륨 인산 염 모노 베이직 (0.06 mg / mL), D-글루코스 (1 mg / mL), 나트륨 인산염 디베이직 (0.479 mg / mL), 및 1 M HEPES [4-(2-하이드록세틸)-1-피페라진에설포닉 산; 10 mM]. 모든 성분을 소용돌이로 적절히 혼합하고 사용할 때까지 4°C에 보관한다.
참고: 해리 시에는 얼음-차가운 형태로 해리 배지를 사용하지만 실온(RT)에서는 세척 및 기타 용도로 사용하십시오. - 도금 매체: 도금 매체는 다음과 같은 것으로 구성됩니다: 최소 필수 배지 (MEM) 이글의 얼의 균형 잡힌 소금 용액 (BSS; 88.4%), D-포도당 (0.6%), 말 혈청 (10%), 페니실린/연쇄상 구균 (1%). 구성 요소를 각각의 비율로 결합하고 멸균 조건하에서 후드 내부의 절차를 수행합니다.
참고: 모든 성분의 열화를 방지하기 위해 항상 신선하게 준비된 도금 매체를 사용하십시오. - 유지 매체: 신경기재(97%), 0.5 mM 상업적으로 얻은 글루타민 샘플, B27 혈청 프리 보충제(2%), 페니실린/스트렙토마이신(1%)의 각각 비율로 다음을 결합하여 유지 매체를 준비한다. 구성 요소를 각각의 비율로 결합하고 멸균 조건하에서 후드 내부의 절차를 수행합니다. 모든 구성 요소가 새로 준비되었는지 확인하십시오.
2. 커버립준비
- 직경 12mm의 둥근 유리 커버슬립을 가지고 4시간 동안 1M 염산(HCl)에 담가 둡니다.
- 한 쌍의 집게를 사용하여 증류수에 덮개를 옮기고 산을 완전히 제거하기 위해 부드럽게 돌십시오.
- 100% 에탄올이 함유된 비커에서 세척된 커버슬립을 추가로 세척합니다.
- 커버립을 사용하기 전에 티슈 페이퍼에 보관하여 층상 후드에서 잘 건조시십시오.
3. 뉴런 배양용 폴리-D-리신 코팅 플레이트 준비
- 24 개의 웰 플레이트를 가져 가라 : 고밀도 도금용과 저밀도 도금용 다른 플레이트. 멸균 패킷은 층상 후드 내부에서만 엽니다.
- 24 웰 플레이트에 12mm의 멸균 유리 커버립을 옮김을 옮김.
- 300 μL의 PDL 용액(탈이온수에서 0.1 mg/mL)을 각 우물에 부어 커버슬립의 표면을 완전히 덮습니다.
- 건조를 방지하고 CO2 인큐베이터에 밤새 보관하기 위해 알루미늄 호일로 플레이트를 감싸십시오.
- 다음날(도금 전) PDL 용액을 흡인하고 300 μL의 멸균 탈이온수로 2~3회 제대로 세척한다.
- 갓 제조된 도금 매체 200 μL을 추가하고 도금될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 되돌려 보냅니다.
4. 태아의 제거 및 참수
참고: 알루미늄 호일에 포장된 모든 수술 기구를 121°C(15psi)의 오토클레이브에서 30분 동안 소독하십시오. 여기에는 한 쌍의 무딘 말단 가위, 집게, 미세 집게, 2 개의 미세 가위 및 전체 절차에 대한 하나의 동맥 집게가 포함됩니다.
- 뉴런과 신경구를 생성하기 위해, 시간 적 임신 한 Sprague Dawley 쥐를 사용하고 질 플러그 검출을 E0로 하루를 표시하십시오.
참고: E14-E16 간에 문화권이 수행되어야 합니다. - 문화의 날에멸균 유리 페트리 플레이트를 얼음 위에 놓고 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)으로 채웁니다.
- E14-E16 임신 한 쥐를 복강 내 (즉)의 체외 (즉)로 마취시키고 체중 90 mg의 케타민 / kg과 10 mg의 자일라진 / kg을 주입 한 다음 자궁 경부 탈구를 수행하여 희생하십시오.
참고: 쥐는 또한 자일라진 또는 다이아제팜과 함께 펜토바르비탈또는 케타민과 과다 복용하여 안락사시킬 수 있습니다. - 70% 에탄올을 분사하여 댐의 복부를 살균하고 멸균 집게와 무딘 끝 가위를 사용하여 복부 부위에 V 자른자를 만듭니다.
- 차가운 HBSS 용액으로 페트리 플레이트에 조심스럽게 배아 주머니를 가져 가라.
참고 : 내부 장기를 오염시킬 수 있기 때문에 피부에 방금 사용 된 것과 동일한 집게와 가위를 사용하지 마십시오. 내부 장기에 다른 가위/집게 세트를 사용합니다. - 신선하고 차가운 HBSS에서 배아 주머니에서 배아를 꺼내십시오.
- 멸균 가위로 머리를 참수하십시오.
5. 해마와 피질의 뇌와 해부제거
- 시작하기 전에 차갑고 멸균된 HBSS로 90mm 멸균 페트리 접시를 채우소서.
- 멸균, 무딘 종료 드레싱 집게를 사용하여 멸균 접시에 머리를 전송합니다.
- 스테레오 현미경 에서, 멸균, 톱니 모양의 집게와 주전자 영역에서 머리를 잡고 피부와 두개골을 열어 절단하여 뇌를 제거합니다.
- HBSS 용액에서 동일한 방식으로 모든 배아 뇌를 수집합니다.
- 뇌간을 잡고 반구와 중뇌에서 모든 수막을 제거합니다.
- 조심스럽게 해마와 피질을 포함하는 버섯 모자를 닮은 그대로 반구를 제거합니다.
- 10 mL의 해리 배지를 포함하는 15 mL 원엽 관에서 피질 및 손상되지 않은 해마를 포함하는 반구를 수집합니다.
6. 피질 과 해마 조직을 단일 뉴런으로 해리
- 수집 된 조직이 정착하고 해리 매체를 흡인하게하여 배지의 5 %-10 %를 남깁니다.
- 조직에 신선한 해리 배지 10 mL를 추가하고 6.1 단계를 두 번 반복합니다.
- 해리 배지 4.5 mL과 0.25% (1x) 트립신 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세테이트) 용액을 추가하십시오.
- 소화가 진행될 수 있도록 조직을 인큐베이터에 37°C에서 20분 동안 유지한다.
- 배지를 흡인하고 소화된 조직에 연속적으로 해리 및 도금 배지10 mL를 첨가한다.
- 소화 된 조직이 정착하고 해리 배지를 흡인할 수 있도록하십시오. 도금 매체 2.5 mL를 추가하고 90mm 멸균 접시의 베이스에 부어.
- 1,000 μL 파이펫 팁을 사용하여 접시의 코너 베이스에 있는 소화된 조직을 최소한의 부피를 차지하도록 삼중화한다.
- 얻어진 세포 현탁액을 조직의 덩어리를 제외한 70 μm 세포 스트레이너를 통과한다.
- trypan 청색 염료 배제 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 밀도를 결정하고 자동화된 세포 카운터에서 셀 수를 계산합니다.
- 트라이판 블루 염료 배제 방법의 경우, 셀 현탁액의 10 μL 및 0.4% 트라이판 블루 얼룩의 10 μL을 취하고, 철저하게 혼합하고, 일회용 챔버 슬라이드의 두 개의 동봉된 챔버 중 하나에 혼합물의 10 μL을 첨가한다.
- 혼합물을 포함하는 슬라이드를 셀 카운터에 삽입하고 판독값을 얻습니다.
참고 : 트라이판 블루 염료 배제 방법은 살아있는 세포 (그대로 막으로 인해)가 trypan 파란색 염료를 배제하고 따라서 쉽게 트립팬 블루를 차지하고 파란색으로 나타나는 실행 불가능한 세포에 비해 명확한 세포질이 표시된다는 원리를 기반으로합니다. 색상15.
- 도금 배지각각 30 mL를 함유하는 두 개의 분리된 튜브에서 저밀도를 위해 플레이트 1.5 x 105 셀/mL및 저밀도20,000 셀/mL에 얻어진 셀수를 희석한다.
- 이전에 첨가된 도금 배지를 각각의 웰 및 플레이트 500 μL의 도금 배지에 분산하여 각 웰에 도금 배지에 분산하였다.
- 그 후 플레이트를 37°C및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이터로 되돌린후.
- 도금 후 현미경 4시간 하에서 순응도를 검사합니다.
- 두 플레이트에 세포의 적절한 순응도가 있는 경우, 각 우물의 배지를 500 μL의 신선한 유지 보수 배지로 교체하고 37°C에서 배양한다.
- 이러한 뉴런을 30일 동안 저밀도로 성장시켜 유지 매체를 주당 2회 변경하여 배양하였다.
- 동일한 유지 보수 배지에서 고밀도 도금 뉴런으로부터 얻어진 신경구를 초저 부착 판으로 이송하여 배양한다.
- 뉴런과 신경구를 중요한 마커로 면역으로 염색하여 특성화합니다. 면역 세포 화학의 경우, 먼저 플레이트 자체에서 30 분 동안 4 % 포름 알데히드를 사용하여 세포 / 신경 구를 수정 한 다음 0.1 % 비 이온 성 세제로 세포를 10 분 동안 투과시하십시오.
- 인산완충식염수(PBS)에서 뉴런(anti-Tuj1, GFAP, O4, 타우) 및 신경구(anti-Nestin, GFAP, Tuj1)에 대한 1차 항체를 1:300 농도에서 첨가하고 4°C16에서밤새 배양한다.
참고: Tuj1(클래스 III β-tubulin) 및 타우는 1차 뉴런에 대한 양성 마커이며, GFAP(신경교섬유 산성 단백질) 및 O4(올리고엔드로시테 마커)는 1차 뉴런에 대한 음성 마커(17,18)이다. 신경구의 경우, Tuj1, GFAP 및 네스테틴은 모두19,20의 양성 마커역할을 한다. - 다음날, PBS로 세포를 한두 번 세척하고 2 시간 동안 RT에서 1:600 농도에서 PBS에 적절한 이차 항체를 추가하십시오.
참고: 항마우스 또는 항-토끼 이차 항체는 첨가된 1차 항체의 숙주 종에 따라 선택된다. 이차 항체는 형광 현미경 검사법 목적에 적합한 형광 유도체에 공액되어야한다는 것을 명심해야합니다. - 한 두 번 PBS로 세포를 다시 씻으십시오.
- Hoechst 33258 (탈이온수에서 1 mg / mL 스톡 솔루션)으로 세포의 핵 염색을 수행하십시오. 스톡 솔루션에서 PBS에서 0.1% Hoechst 솔루션을 준비하고 셀에 추가합니다.
- 세포를 0.1 % Hoechst 용액으로 30 분 동안 배양 한 다음 PBS로 다시 씻으십시오.
- 슬라이드에 20 μL PBS(또는 장착 매체)를 추가하고 염색된 셀이 포함된 커버슬립을 PBS를 포함하는 슬라이드 영역에 천천히 장착합니다. 디부틸프탈레이트 폴리스티렌 자일렌(DPX)으로 커버슬립의 여백을 밀봉합니다.
- 10x 및 40x 배율로 현미경으로 고정 된 세포의 이미징을 수행합니다.
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Representative Results
이 프로토콜에서는, 2개의 다른 신경 검열 단자에서 가변 세포 도금 밀도가 얻어지는 간단한 전략이 해명되었습니다. 도 1A,B는 각각 고밀도 및 저밀도 도금 세포에서 뉴런을 도금한 후 4시간 후에 세포의 순응도를 나타낸다. 도1에 도시된 바와 같이 뉴런의 적절한 순응도를 관찰함에 따라, 도금 배지는 각각의 웰에서 유지 보수 배지로 대체되었고, 이에 따라 37°C에서 인큐베이터로 복귀하였다. 비교적 더 많은 세포 순도가 고밀도 도금 뉴런에서 관찰되었다. 도금의 24시간 후, 고밀도 및 저밀도 도금 뉴런모두 도 2A,B에서 차동 간섭 대비(DIC) 이미지에서관찰된 바와 같이 정교한 뉴런 확장 및 시냅스 상호 연결을 보였다.
도3A에서, 배양 7일 후 저밀도 도금 뉴런의 위상 대비 이미지가 표현된다. 여기에서, 뉴런은 수지상 가지로 구성된 정교한 시냅스 네트워크를 개발했습니다. 이러한 뉴런은 보다 복잡한 뉴런 네트워크의 발달과 함께 3일마다 유지 매체를 변경하여 최대 30일 동안 더 유지될 수 있다. 도 3B에서,C,면역세포화학적 염색은 뉴런 마커 Tuj1(분화 뉴런의 마커)(21) 및 타우(축세포의 마커)(22)로 염색함으로써 저밀도 배양 뉴런의 뉴런 특성을 밝히기 위해 수행되었다. 각각. 도 3B의 붉은색은 Tuj1 염색의 존재를 나타내고, 도 3C에서 녹색은 1차 뉴런의 축축에 염색을 나타낸다. 신경 배양의 순도는 성상세포의 GFAP에 대한 비뉴런 마커의 염색의 부재에 의해 도시된다(도3D)및 올리고엔드로시트의 O4(도3E). 청색으로 표시된 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다.
7일 후 고밀도 도금 뉴런은 도 4A,B,C,D에서 관찰된바와 같이 자발적인 신경구의 형성에 의해 표시된다. 8-10일 후, 도 4E에서볼 수 있듯이, 확장과 같은 방사형 신경교로 구성된 뚜렷한 교량이 신경구 사이에서 관찰되었다. 신경구는 NPC를 풍부하게 부여했다, 이는 코익스프레스 마커 네스테틴과 Tuj123. 그림 524와같이 신경스페이더는 네스테틴과 투지의 양성 염색을 보여줍니다. 청색으로 표시된 핵은 Hoechst 33258로 염색되었다. 이 신경구는 초저 부착 판에서 배양하여 몇 주 동안 유지될 수 있습니다. 도6에서, 약 30일 동안 배양된 뉴런의 수명을 평가하고, 세포 생존력을 기존 MTT[3-(4-5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-디페닐테틀라졸륨 브로마이드] 분석법을 사용하여 ~5일 간격으로 측정하였다. 뉴런은 30일 후에도 생존율 90% 이상을 보였다는 것을 발견하였다.
다음으로, 고밀도 및 저밀도 종자 배양물에서 성상세포의 백분율을 평가하였다. 이 방법론은 주로 뉴런을 배양하는 것을 목표로하기 때문에,이 방법은 비 신경 세포, 특히 성상 세포에 대한 뉴런의 우선 성장을 지원하는지 여부를 평가하는 것이 중요했습니다. 성상 세포의 인구의 존재는 도 7A에서GFAP 염색의 녹색 색상으로 표시된 신경구 형성 고밀도 종자 배양에서 관찰되었다; 하지만, Tuj1 (빨강)-스테인드 뉴런 인구에 비해 현저히 적게 관찰되었다. 이것은 또한 Tuj1 발현 세포에 있는 인구의 83%에 비교된 세포의 ~17% 인구가 GFAP 발현된 그림 7B에있는 정량적인 데이터에 의해 재확인되었습니다.
성상 세포 집단은 또한 GFAP 염색을 통해 조사되었다, 저밀도 종자 세포에서 신경 인구에 비해 (Tuj1 염색), 에 대한 7 연속 일. 비록 총 세포 수에 상당한 차이가 7 일의 과정 동안 관찰 되지 않았다, 낮은 파종으로 인해, 성상 세포 인구또한 매우 낮은 것으로 관찰 되었다 (거의 없음 또는 매우 낮은 GFAP 염색), 대부분 되 고 신경 인구 (매우 도 8A에서관찰된 바와 같이 높은 Tuj1 발현)
도 8B에도시된 바와 같이, 정량적 분석은 세포세포의 도움으로 현미경검사를 통해 얻은 성상세포 및 뉴런의 집단을 계수함으로써 수행되었으며, 성상세포 집단의 ~2%-3%만이 처음에 관찰되었다. 그것의 성장을 지원 하기 위해 적당 한 매체와 영양소의 부족으로 인해, 성상 세포의이 인구는 또한 천천히 시간이 지남에 따라 멸망, 최적의 요인 및 미디어의 존재에 반면, 뉴런 신속 하 게 전체 문화를 인수.
도9에 도시된 바와 같이, NPC의 존재로 인해, 신경구는 또한 더 강한 Tuj1 신호와 함께 GFAP 염색의 강한 녹색 신호에 의해 표시된 성상 세포의 다량을 발현하는 것을 관찰되었다. 마지막으로, 이러한 신경구가 시간이 지남에 따라 확장되었는지 여부를 관찰하기 위해, 고밀도 문화의 1 주 후, 작은 신경구가 형성되기 시작한 시점에서, 몇몇은 초저 부착 판으로 옮겨졌고 그들의 성장은 최대 5 일마다 모니터링되었습니다. 15 일.
살아있는/죽은 세포 분석법은 또한 세포의 건강을 확인하기 위하여 calcein AM (녹색) 및 프로피듐 요오드화물 (빨강)를 사용하여 수행되었습니다. 팽창하는 신경구는 도 10A에제시된 바와 같이, 배양에서 적어도 15일 동안 신경구에서 발생하는 사망이 없음을 나타내는 적색 염색없이 다량의 녹색 형광을 나타냈다. 도 10B에도시된 바와 같이, 최대 15일 동안 배양에서 5일마다 신경구의 부피가 큰 팽창을 관찰하였다. 신경구의 부피(각 시간대)의 최종 증가를 나타내는 선 그래프를 플롯하기 위해 50개의 신경구를 연구하고 각 시간대에서 신경구 체적을 도출하는 데 평균을 사용했습니다.
그림 1 : 도금 4시간 후 세포 순응도 표현. (A) 고밀도 도금 뉴런의 세포 준수. (B) 저밀도 도금 뉴런의 세포 준수. (A,B)의 배율 막대는 200 μm입니다.
그림 2 : 도금 24시간 후 뉴런의 세포 형태. (A) 고밀도 도금 뉴런의 세포 형태. (B) 저밀도 도금 뉴런의 세포 형태. (A, B)의 배율 막대는 20 μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 7 일 후 저밀도 도금 뉴런의 형태 및 특성. (a) 광범위한 발아를 보여주는 뉴런의 위상 대비 이미지. 스케일 바는 200 μm. 뉴런 단백질(B)Tuj1(적색)과 (C) 타우(green)에 대한 발현을 나타내는 오버레이 이미지를 나타낸다. 임누노세포화학은 비신경성 단백질(D) GFAP(녹색)및 (E) O4(적색)에서 얼룩의 부재를 명확하게 나타냈다. 핵은 Hoechst 33258 (파란색)으로 염색하였다. (B, C, D, E)의 배율 막대는 20 μm를 나타냅니다.
그림 4 : 7 일 후 고밀도 도금 뉴런에서 신경 구의 형성. (A-D) 고밀도 도금 뉴런으로부터 배양7일 후 자발적으로 생성된 신경구. (E) 검은 색 화살표로 표시된 두 개의 새로 형성 된 신경 구 사이의 방사형 신경교와 같은 확장의 형성. (A, B, C, D, E)의 배율 막대는 200 μm를 나타냅니다.
그림 5 : 얻어진 신경구의 특성화. 신경 단백질 Tuj1(적색) 및 신경 줄기세포 마커 네스테틴(녹색)에 대한 발현을 나타내는 신경구의 중첩 이미지는 NPC가 풍부한 집단을 나타낸다. 핵은 Hoechst 33258 (파란색)으로 염색되었습니다. 배율 막대는 20 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 1 차적인 뉴런의 세포 생존. 막대 그래프는 5일 간격으로 최대 30일 동안 MTT 분석기를 사용하여 평가된 1차 뉴런의 세포 생존 가능성을 나타낸다. 오류 막대는 값의 SD를 나타냅니다(*p< 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 신경구 형성 고밀도 배양체의 특성화와 뉴런 마커 Tuj1 및 성상 세포 마커 GFAP. (A) 이미지는 GFAP(성상세포)와 Tuj1(뉴런의 경우)을 모두 발현하는 신경psheres를 생성하는 고밀도 시드 세포(DIC 모드)를 보여줍니다. 핵은 Hoechst 33258로 염색되었다. 스케일 바는 20 μm을 나타낸다. (B) 바 그래프는 고밀도 세포를 생성하는 신경구에서 Tuj1 발현 세포 및 GFAP 발현 세포의 집단의 백분율을 나타낸다. 오류 막대는 SD(*p&0.05)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 뉴런 마커 Tuj1 및 성상 세포 마커 GFAP를 지속적으로 7일까지 연속하여 1차 뉴런 배양용 저밀도 도금 세포의 특성화. (A) 이미지는 4개의 상이한 채널(즉, DIC, 블루 채널[Hoechst 33258에 의한 핵 염색을 나타낸다]] 및 녹색 채널 [GFAP 염색], 및 적색 채널[Tuj1 염색])에서 저밀도 시드 세포를 7일 연속으로 나타낸다. 스케일 바는 20 μm을 나타낸다. (B) 막대 그래프는 7일 동안 1차 뉴런 배양에 대한 저밀도 시드 세포에서 GFAP 발현 세포의 투지1 발현 세포의 모집단비율을 나타낸다. 오류 막대는 SD(*p&0.05)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 : GFAP 및 Tuj1을 통해 얻은 신경구의 면역 염색. 얻어진 신경구의 이미지는 (A) DIC 모드에서, (B) 핵 염색호흐트 33258,(C)성상세포 마커 GFAP(녹색) 및 (D) 뉴런 마커 Tuj1(적색)을 사용한다. 배율 막대는 20 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 : 15일 이상 신경구의 성장과 살아있는/죽은 세포 분석. (A) 이미지는 DIC 모드에서 5일 간격으로 15일 동안 신경구의 성장과 칼세인 AM(녹색은 살아있는 세포를 나타냄) 및 PI(적색의 프로피듐 요오드화물)로 염색한 것을 나타낸다. 스케일 바는 20 μm을 나타낸다. (B) 그래프는 5일 간격으로 15일 동안 낮은 순도 플레이트에서 자란 신경구의 크기증가를 나타낸다. 오류 표시줄은 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 1차 뉴런의 세포 도금 밀도를 변경함으로써, 2개의 가변 뉴런 플랫폼이 수득되는 방법을 설명한다. 이것은 간단한 방법이지만 원하는 결과를 얻으려면 각 단계를 세심하게 수행해야합니다. 다른 이전 방법 중 장기 기본 신경 문화 또는 신경 구 배양 보고. 대부분의 기본 신경 문화 프로토콜에 대 한 해 마 뉴런의 배양을 포함 했다 3-5 주, 하지만 대부분 실패, 뉴런 죽고 연결의 손실로 인해 멀리 시들어. 프로토콜의 또 다른 장점은 신경 세포가 신경 교인 피더 층에 대한 필요없이 배양 될 수 있다는 것입니다, 따라서 뉴런의 순도를 유지.
그러나 원하는 결과를 얻으려면 몇 가지 중요한 단계를 신중하게 따라야 합니다. 첫째, 전체 멸균 상태를 유지하는 것은 절대적으로 필요하다. 시작하기 전에 70 %의 알코올로 모든 슬래브, 악기 및 수술 도구를 미리 청소할뿐만 아니라 층상 후드에서 대부분의 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 박테리아와 곰팡이에 의한 오염으로 인한 실패 가능성이 더 높습니다. 다음으로, E14-16 배아를 분리하는 것이 중요합니다. 따라서 질 플러그 검출 단계는 신중하게 수행되어야합니다. 배아의 날이 증가함에 따라, 더 높은 기회는 비 신경 세포에 의한 오염의 입니다. 반구에서 수막의 완전한 제거는 비 신경 세포에 의한 배양에 있는 간섭을 감소시키기 위하여 극단적으로 중요합니다. 모든 부품이 필수적인 역할을 하기 때문에 도금 및 유지 보수 매체는 모든 구성 요소로 신선하게 제조되어야 합니다. 염두에 두어야 할 또 다른 요인은 증식 하는 뉴런에 영양 공급 일정 하 게 유지 되도록 유지 보수 매체를 일주일에 2 배 변경 하 여 얻은 기본 뉴런 유지 해야 합니다.
비록 아직 시도되지 않았지만, 약간의 변형이 있는 이 프로토콜은 마우스 배아 뉴런에서도 유용할 수 있다. 원하는 뉴런 또는 신경 구가이 기술에 따라 얻을 수 없는 경우 도움이 될 수 있는 몇 가지 문제 해결 팁이 있습니다. 조직을 생존 할 수 있도록해주려면 얼음으로 차가운 HBSS에서 해부를 수행해야합니다. 해부는 또한 HBSS 버퍼 대신 얼음 차가운 Krebs 버퍼에서 수행 될 수있다. 빨리 해부를 수행하는 것은 조직 생존력을 유지하는 열쇠입니다. 10 x 트립신의 사용은 조직의 과소화로 이어질 것입니다. 따라서, 10x 트립신-EDTA 용액은 소화 전에 해리 완충액에서 1x로 희석되어야 한다. 동결 충격을 유도하는 세포에 얼음 차가운 매체를 첨가하면 모든 비용을 피해야하며 RT에 도달 한 후에는 매체를 대신 사용해야합니다. 가장 중요한 것은, 커버 립은 항상 PDL로 코팅되어야하며, 그렇지 않으면 뉴런은 커버 립에 부착되지 않습니다. 삼각 단계(즉, 조직이 제대로 소화되지 않음)를 수행하는 동안 어떤 어려움이 있는 경우, 소화는 10분 동안 1%의 DNase의 0.5 mL를 첨가하여 수행될 수 있다. 비 신경 세포에 의한 오염도가 높은 경우, ~5 μM 시토신 아라비노시드 (araC)를 첨가하여 비 신경 세포의 성장을 방지해야합니다.
여러 장점에도 불구하고이 기술은 몇 가지 제한을 겪습니다. 이 기술은 자발적으로 신경 구를 생성하는 것으로 알려져 있습니다 (비록, 발동 분자 메커니즘은 알려져 있지 않습니다); 그러나, 이 기술에 관하여 몇몇 모호성은 형성된 신경구의 정확한 크기 및 신경구의 충분한 수를 형성하는 것을 요구된 일의 정확한 수와 같은 남아 있습니다. 대부분 크기가 문제입니다. 시간이 지남에 따라 신경구가 부피가 확장되는 것이 관찰되었지만, 얻은 초기 신경구는 다양한 크기입니다. 유용하지만 동기화된 스터디를 수행하기가 어렵습니다. 이 신경구 생성 프로토콜을 다른 프로토콜과 구별하는 것은 견고함과 단순성입니다. 특별한 매체 요구 사항 및 문화 조건을 요구하는 neuropheres의 배양 그리고 전파를 위한 이전에 보고된 프로토콜이 있습니다, 어느 것도 이 프로토콜에서 요구되지 않습니다. 이 이전에 보고된 프로토콜에서는, 신경구를 생성하기 위하여 찾고 있는 사람들을 위한 거의 어떤 균일도 없습니다.
전반적으로, 이 프로토콜은 E14-E16 Sprague Dawley 랫트의 배아로부터 분리된 1차 뉴런의 세포 도금 밀도를 단순히 변경함으로써 2D 및 3D 뉴런 플랫폼의 생성을 위한 독특한 전략을 설명합니다. 이 방법은 간단한 설정으로 수행 할 수 있으며 훨씬 적은 시약 및 단계가 필요하기 때문에 다른 방법에 비해 비용 효율적입니다. 그것은 신경 과학자에 대 한 관심의 다양 한 응용 프로그램을 제공할 수 있습니다. 이것은 각종 신경 치료 지도대를 위한 검열 단자로, 각종 신경 화물 단백질의 역할을 관찰하고, 많은 신경 퇴행성 질병에 있는 세포 통로의 조사, 및 많은 그밖 응용으로 이용될 수 있습니다. 신경구는 체외25,26에서신경발달의 초기단계를 연구하고 다양한 신경분화제의 스크리닝을 위해 더 많이 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 CSIR-IICB 동물 시설에 감사드립니다. G. D. 감사 ICMR, J. K. 및 V. G. DST 영감 감사, D. M. 그들의 동료에 대 한 인도 DBT 감사. S. G. 친절 하게 SERB (EMR/2015/002230) 재정 지원을 제공 하는 인도를 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
References
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