Transkription start webbplats mappning med Super-low ingång Carrier-CAGE

Summary

Cap analys av Gene Expression (CAGE) är en metod för genombred kvantitativ kart läggning av mRNA 5 ' ändar för att fånga RNA-polymeras II transkription start platser vid en enda-nukleotid upplösning. Detta arbete beskriver en låg-input (SLIC-CAGE) protokoll för generering av högkvalitativa bibliotek med nanogram-mängder av totalt RNA.

Abstract

Cap analys av gen uttryck (CAGE) är en metod som används för singel-nukleotid upplösning detektion av RNA-polymeras II transkription start platser (TSSs). Noggrann detektering av TSSs förbättrar identifieringen och upptäckten av centrala initiativtagare. Dessutom kan aktiva förstärkare detekteras genom signaturer för dubbelriktad transkription initiering. Beskrev här är en protokoll för utförande toppen-låg insatsen bärare-bur (skära upp i skivor-bur). Denna SLIC-anpassning av CAGE-protokollet minimerar RNA-förluster genom att artificiellt öka RNA-mängden genom användning av en in vitro-transkriberad RNA-bärar blandning som läggs till i urvalet av intresse, vilket möjliggör biblioteks beredning från nanogram-mängder av totalt RNA (dvs. tusentals celler). Bäraren imiterar den förväntade fördelningen av DNA-biblioteksfragmentlängden och eliminerar därmed fördomar som kan orsakas av överflödet av ett homogent transport företag. I protokollets sista stadier tas bäraren bort genom nedbrytning med homing-slutonukleaser och mål biblioteket förstärks. Mål provet biblioteket är skyddat från nedbrytning, eftersom homing endonuclease erkännande platser är långa (mellan 18 och 27 BP), vilket gör sannolikheten för deras existens i eukaryota genomar mycket låg. resultatet är ett DNA-bibliotek redo för nästa generations sekvensering. Alla steg i protokollet, upp till sekvensering, kan slutföras inom 6 dagar. Transport ören förberedelse kräver en hel arbets dag; den kan dock beredas i stora kvantiteter och hållas fryst vid-80 ° c. En gång sekvenserade, läser kan bearbetas för att få genombred singel-nukleotid upplösning TSSs. TSSs kan användas för Core promotor eller förstärkare upptäckt, ger insikt i gen reglering. När aggregerad till initiativtagare, kan data också användas för 5 '-centrerad uttryck profilering.

Introduction

Cap analys av gen uttryck (CAGE) är en metod som används för Single-nucleotide resolution genom-wide kart läggning av RNA-polymeras II transkription start platser (TSSs)¹. Dess kvantitativa karaktär tillåter också 5 '-End centrerad uttryck profilering. Regioner som omger Tsss (ca 40 BP uppströms och nedströms) är centrala initiativtagare och representerar den fysiska platsen där RNA-polymeras II och allmänna transkriptionsfaktorer binder (granskat tidigare^2,3). Information om exakta platser för TSSs kan användas för att identifiera kärn Promotorn och för att övervaka Promotorns dynamik. Dessutom, som aktiva förstärkare uppvisar signaturer för dubbelriktad transkription, kan CAGE data också användas för förstärkare upptäckt och övervakning av förstärkare dynamik⁴. CAGE metodik har nyligen ökat i popularitet på grund av dess breda tillämpning och användning i hög profil forsknings projekt som ENCODE⁵, modencode⁶, och fantom projekt⁷. Dessutom har TSS-information också visat sig vara viktig för att särskilja frisk och sjuk vävnad, eftersom sjukdomsspecifika TSSs kan användas för diagnostiska ändamål⁸.

Även om flera metoder för TSS-mappning finns tillgängliga (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-capping), har vi och andra nyligen visat att CAGE är den mest objektiva metoden för att fånga sanna TSSs med det minsta antalet falska positiva identifieringar^{9 , 10}. den nyligen Cage protokoll, NAnT-icage¹¹, är den mest objektiva protokoll för TSS profilering, eftersom det undviker att skära fragment till korta Taggar med restriktionsenzymer och inte använder PCR-förstärkning. En begränsning av nAnT-iCAGE-protokollet är kravet på en stor mängd utgångs material (t. ex. 5 μg totalt RNA för varje prov). För att besvara specifika, biologiskt relevanta frågor är det ofta omöjligt att få så stora mängder utgångs material (t. ex. för FACS-sorterade celler eller tidiga embryonala stadier). Slutligen, om nAnT-iCAGE är framgångs rik, endast 1-2 ng av DNA-bibliotek material finns från varje prov, vilket begränsar uppnåeliga sekvensering djup.

För att möjliggöra TSS profilering med endast nanogram av totalt RNA, har vi nyligen utvecklat Super-low input Carrier-CAGE¹⁰ (SLIC-Cage, figur 1). Skära upp i skivor-bur behöver bara 10 ng av räkna samman RNA till få hög invecklad bibliotek. Vårt protokoll förlitar sig på den omsorgsfullt utformade syntetiska RNA bärare läggas till RNA av intresse för att uppnå totalt 5 μg av RNA-material. Den syntetiska bäraren härmar målet DNA-bibliotek i längd distribution för att undvika eventuella fördomar som kan orsakas av homogena molekyler i överskott. Sekvensen av bäraren är baserad på sekvensen av Escherichia coli leucyl-tRNA synt Etas genen (tabell 1) av två skäl. Först, eventuella överblivna av bäraren i det slutliga biblioteket, även om sekvenserade, kommer inte att mappa till en eukaryotisk genomet. För det andra, som E. coli är en mesofil art, dess hushållninggener är optimerade för det temperatur område som lämpar sig för SLIC-Cage. Bärvågen sekvensen är också inbäddad med homing endonuclease erkännande platser för att möjliggöra specifik nedbrytning av DNA som härrör från bärare RNA-molekyler. Målet, exempel-härledda bibliotek förblir intakt, eftersom homing endonuclease erkännande platser är långa (I-CeuI = 27 BP; I-SceI = 18 BP) och statistiskt sett osannolikt att påträffas i eukaryota genom. Efter specifik nedbrytning av bäraren och avlägsnande av fragment av storlek uteslutning, mål biblioteket är PCR förstärks och redo för nästa generations sekvensering. Beroende på utgångs RNA-mängden (1-100 ng) förväntas mellan 13-18 PCR-amplifiering cykler krävas. Den slutliga mängden DNA per varje prov varierar mellan 5-50 ng, vilket ger tillräckligt med material för mycket djup sekvensering. Vid användning av endast 1-2 ng av totalt RNA kan sanna TSSs detekteras; biblioteken förväntas dock vara av lägre komplexitet. Slutligen, som SLIC-CAGE är baserad på nAnT-iCAGE protokoll¹¹, det möjliggör multiplexering av upp till åtta prover före sekvensering.

Protocol

1. förberedelse av flyg bolaget

1. Beredning av DNA-mallar för in vitro-transkription
   1. Förbered PCR-blandningen för varje PCR-mall genom att kombinera 41 μL vatten, 20 μL 5x HF-buffert, 8 μL 2,5 mM dNTPs, 10 μL av en unik framåtprimer (PCR_GN5_f1, tabell 2; primrar löses upp och späds i vatten) , 10 μL 2 ng/μL mallplasmid som innehåller den syntetiska bärar genen och 1 μL Phusion-polymeras. Blanda PCR-blandningen med pipettering. En mastermix för alla 10 mallar kan förberedas på en gång (Förbered för 11 reaktioner).
   2. Tillsätt 90 μL av PCR-blandningen till 10 μL av varje 10 μM omvänd primer (PCR_N6_r1-R10, tabell 2). Blanda med pipettering.
   3. PCR förstärker mallarna med hjälp av följande program: 98 ° c för 60 s, (98 ° c i 10 s, 50 ° c i 30 s, 72 ° c i 30 s) 35 cykler, 72 ° c i 10 min, håll vid 4 ° c.
   4. Gel rening av PCR-amplifierade DNA-mallar
      1. Förbered en 1% AGA ros gel (låg smält AGA ros rekommenderas).
      2. För att minska volymen, koncentrera PCR-reaktionsblandningar från 100 μL till 20 μL total volym med hjälp av vakuum koncentratorn vid en låg medels temperatur (30 – 40 ° c).
      3. Tillsätt 6 μL av 6x laddnings färg ämne, blanda väl och lasta på gelen. Kör elektrofores för 30 min i 1x TAE buffert vid den spänning som är lämplig för den använda elektrofores tanken (5-10 V/cm). Parallellt köra en 100 BP eller 1 000 BP DNA stege.
      4. Med en ren skalpell, punkts katter på gel skivorna som innehåller mål-PCR-produkten. Undvik överskott AGA ros gel. Rena PCR-produkterna med en gel extraktionssats (enligt tillverkarens anvisningar).
         Anmärkning: A260/A230-kvoterna för DNA som Isoler ATS från Aga ros-geler är vanligt vis låga (0,1 – 0,3). Förväntade mål produkter och sido produkter visas i figur 2A. Förväntad avkastning från 100 μL PCR-reaktioner är 1,2 – 3 μg. reaktionerna kan skalas upp för att få en högre avkastning.
2. In vitro-transkription av bärar molekyler
   1. Transkribera bärar-RNA in vitro med T7 RNA-polymeras enligt tillverkarens anvisningar. Ställ in 10 – 20 μL reaktioner (rekommenderat kit finns i material tabell).
   2. Renar in vitro-transkriberat RNA med ett RNA-renings-kit. Ställ in DNA-nedbrytning i lösning med hjälp av DNase i efter tillverkarens standard instruktioner, och eluera RNA i 50 μL vatten. För att öka elutionavkastningen, lämna vattnet i kolonnen i 5 min före centrifugering.
      Anmärkning: Var noga med att inte överskrida den maximala bindnings kapaciteten för kolumnerna (i satsen som nämns i material tabellen, är kapaciteten upp till 100 μg). Den förväntade avkastningen från PCR-mallarna 1 – 10 (1 KBP till 200 BP i längd) är 25 – 50 μg från 10 μL in vitro-transkriptionsreaktioner. Reaktioner kan skalas upp för att få ett större lager av bärare molekyler.
3. Begränsning av in vitro-transkriberade bärare RNA-molekyler
   1. Förbered tak blandningen genom att kombinera 2 μL 10x-kapningsbuffert, 1 μL 10 mM GTP, 1 μL 2 mM SAM (nyligen utspätt) och 1 μL vaccinia-kapnings enzym per bärar-RNA.
   2. Blanda upp till 10 μg av varje bärar molekyl i 15 μL av total volym och denaturera i 10 min vid 65 ° c. Placera på isen omedelbart för att förhindra sekundära struktur bildning.
   3. Blanda det denaturerade bärar-RNA med 5 μL av tak blandningen och inkubera i 1 h vid 37 ° c.
   4. Rena begränsade RNA-molekyler med ett RNA-renings-kit – Följ tillverkarens rengörings protokoll. Elute RNA i 30 μL vatten. För att öka elutionavkastningen, lämna vattnet i kolonnen i 5 min före centrifugering.
      Anmärkning: Mät koncentrationen med mikrovolymspektrofotometern. Förväntat A260/A280-förhållande är > 2 och A260/A230 är > 2. Observera att för vissa RNA-prover kan A260/A230 vara mellan 1,3 – 2. Förväntad avkastning vid användning av 10 μg icke-utjämnat RNA är 9 – 10 μg av utjämnat RNA.
4. Förbered blandningen av den utjämnade och icke-utjämnade bäraren genom att kombinera de belopp som beskrivs i tabell 3. Blanda väl genom att snärta röret och mät koncentrationen med mikrovolymspektrofotometern.
   Anmärkning: Om en högre koncentration av transport ören krävs för att passa in i den omvända transkriptionsreaktionen (se nedan) kan transport örens blandning koncentreras med hjälp av vakuum koncentratorn vid låg medelhög temperatur (30-35 ° c) tills den önskade koncentrationen uppnåtts. Steg 2 – 14 ändras från standard protokollet nAnT-iCAGE rapporterat av Murata et al.¹¹

2. omvänd transkription

1. Kombinera 1 μL av RT-primern (2,5 mM TCT-N6 upplöst i vatten, för sekvens se tilläggs tabell 1), 10 ng av totalt RNA av intresse och 4 990 ng av bärar blandningen (tabell 3) i 10 μl av den totala volymen i en lågbindande PCR-platta. Blanda genom att snärta röret.
   Anmärkning: Om provets RNA är för utspätt för omvänd transkription (se nedan), kombinera det med lämplig mängd av bäraren, koncentrera med hjälp av vakuum koncentratorn till 9 μL total volym och tillsätt 1 μL av RT-primern. Lägga till bäraren Earl, att nå 5 μg RNA totalt förhindrar prov förlust.
2. Värm blandningen från steg 2,1 vid 65 ° c i 5 min, och placera på isen omedelbart för att förhindra renaturation.
3. Förbered den omvända transkriptionen (RT).
   1. För varje prov kombinera 6,1 μL vatten (RNase-och DNase-Free), 7,6 μL av 5x första-Strands-buffert, 1,9 μL 0,1 M DTT, 1 μL 10 mM dNTPs, 7,6 μL trehalose/sorbitol-blandning (se recept i Murata et al.¹¹) och 3,8 μl av rekommenderat omvänt transkriptas (se < c 6 > material tabell). Blanda väl genom att snärta röret.
4. Tillsätt 28 μL av RT-blandningen i PCR-röret med 10 μL RNA, bärare och RT-primern (total volym 38 μL). Blanda väl med pipettering.
   Anmärkning: Blandningen är mycket trög flytande på grund av trehalose/sorbitol. Blanda tills synligt homogent.
5. Inkubera i en termisk Cycler med hjälp av följande program: 25 ° c i 30 s, 50 ° c för 60 min och håll vid 4 ° c.
6. Rening av cDNA: RNA-hybrider med magnet pärlor från SPRI
   1. Tillsätt 68,4 μL av de rekommenderade RNAse-och DNase-fria SPRI-pärlorna (se material tabell) till 38 ΜL av RT-blandningen (pärlor till prov förhållande 1.8:1). Blanda väl genom pipettering och inkubera i 5 min vid rums temperatur (RT).
   2. Separera pärlorna på ett magnetiskt stativ i 5 min. Kassera supernatanten och tvätta pärlorna två gånger med 200 μL 70% etanol (nypreparerade).
      Anmärkning: Etanolen tillsätts till pärlorna utan att blanda och medan röret är på magnet stativet. Den tillsatta etanolen avlägsnas omedelbart. Försiktighet bör iakttas för att inte förlora några pärlor under tvättar eftersom det kan leda till prov förlust.
   3. Medan röret är fortfarande på magnet stativet, ta bort alla spår av etanol. Droppar av etanol kan avlägsnas och skjutas ut ur röret med hjälp av en P10 pipett. Låt inte pärlorna torka.
   4. Tillsätt 42 μL vatten som förvärmd vid 37 ° c till pärlorna och eluera provet genom att Pipettera upp och ner 60x.
      Anmärkning: Var noga med att inte orsaka skum bildning genom att Pipettera eftersom det kan orsaka förlust av pärlor (dvs. bundet prov) i skummet.
   5. Inkubera vid 37 ° c i 5 min utan lock för att tillåta avdunstning av spår mängder etanol.
   6. Separera pärlorna på ett magnetiskt stativ i 5 min och överför supernatanten till en ny tallrik.
      Anmärkning: Försök att hämta alla supernatanten för att förhindra prov förlust samtidigt undvika pärla carryover. Använd P10-pipetten för att få de sista prov dropparna.

3. oxidering

1. Tillsätt 2 μL 1 M NaOAc (pH 4,5) i den renade RT-reaktionen. Blanda genom pipettering, tillsätt 2 μL 250 mM NaIO₄ och blanda igen.
2. Inkubera på is för 45 min. Täck plattan med aluminiumfolie för att undvika ljus.
3. Tillsätt 16 μL Tris-HCl (pH 8,5) i oxidations blandningen för att neutralisera pH-värdet.
4. Rena oxiderade cDNA: RNA-hybrider med magnet pärlor från SPRI. Tillsätt 108 μL av SPRI-kulor till 60 μL oxidations blandningen (1.8:1 pärlor till prov förhållande). Upprepa reningen enligt anvisningarna i steg 2.6.1 – 2.6.6. Elute med 42 μL vatten förvärmd till 37 ° c.
   Anmärkning: Förbered nyligen 250 mM NaIO₄ genom att tillsätta 18,7 μl vatten per 1 mg naio₄. NaIO₄ är ljus känsligt; Förvara därför lösningen i ett rör täckt med aluminiumfolie eller i ett ljus beständigt rör.

4. biotinylering

1. Tillsätt 4 μL 1 M NaOAc (pH 6,0) i röret som innehåller det renade oxiderade provet och blanda genom pipettering.
2. Tillsätt 4 μL 10 mM biotin lösning, blanda genom pipettering och inkubera i 2 h vid 23 ° c i en termisk Cycler för att undvika ljus.
   Anmärkning: Förbered biotin lösningen genom att blanda 50 mg biotin med 13,5 mL av DMSO. Använd Ali kvoter för engångsbruk och frys vid-80 ° c.
3. Rena biotinylated cDNA: RNA-hybrider med hjälp av magnetiska SPRI-pärlor. Tillsätt 12 μL 2-propanol och blanda med pipettering. Tillsätt 108 μL SPRI-pärlor (1,8:1 kulor till prov kvoten) och upprepa reningen enligt anvisningarna i steg 2.6.1 – 2.6.6. Elute med 42 μL vatten förvärmd vid 37 ° c.
   Anmärkning: Protokollet kan pausas här, och prover frysta vid-80 ° c.

5. RNase jag Duppslutning

1. Förbered RNase jag blanda genom att blanda 4,5 μL av 10x RNase jag buffert med 0,5 μL av RNase I (10 U/μL) per varje prov. Blanda med pipettering.
2. Tillsätt 5 μL av blandningen till varje renat prov (45 μL totalt). Blanda genom pipettering och inkubera i 30 min vid 37 ° c.

6. beredning av Streptavidin pärlor

1. För varje prov, blanda 30 μl av streptividin pärlor flyt gödsel med 0,38 μl 20 mg/ml tRNA. Inkubera på is i 30 min och blanda var 5 min genom att snärta röret.
   Anmärkning: Suspendera streptividin pärlor flyt gödsel väl före pipettering genom att snärta flaskan. TRNA-lösningen ska förberedas enligt Murata et al.¹¹
2. Separera pärlorna på magnet stativet i 2 – 3 min. ta bort supernatanten.
3. Tvätta pärlorna genom att omsuspendera i 15 μL buffert A. separera pärlorna på det magnetiska stativet i 2 – 3 min och ta bort supernatanten. Upprepa tvätt och ta bort supernatanten.
4. Omsuspendera pärlorna i 105 μL buffert A och tillsätt 0,19 μL 20 mg/mL tRNA. Blanda väl med pipettering.
   Anmärkning: Pärlorna ska beredas färska före användning. Börja beredning av pärlorna under RNase I mat smältningen. För flera prover förbereda pärlorna tillsammans i ett enda rör.

7. keps-fångst

1. Exempel bindning
   1. Tillsätt 105 μl av preparerade streptividin-kulor till 45 μl av det RNase i-behandlade provet. Blanda väl genom pipettering och inkubera vid 37 ° c i 30 min. Blanda genom att Pipettera var 10 min.
   2. Separera pärlorna på magnet stativet i 2 – 3 min. ta bort supernatanten.
2. Tvätt pärlor
   1. Tillsätt 150 μL tvättbuffert A och omsuspendera pärlorna genom pipettering. Separera pärlorna på magnet stativet i 2 – 3 min och ta bort supernatanten.
   2. Tillsätt 150 μL av tvättbufferten B och resuspendera pärlorna genom pipettering. Separera pärlorna på magnet stativet i 2 – 3 min och ta bort supernatanten.
   3. Tillsätt 150 μL tvättbuffert C och resuspendera pärlorna genom pipettering. Separera pärlorna på magnet stativet i 2 – 3 min och ta bort supernatanten.
      Anmärkning: Buffertarna B och C ska förvärmas till 37 ° c. Recept för tvättbuffertar A, B och C är som beskrivs i Murata et al.¹¹
3. cDNA-release
   1. Förbered 1x RNase jag buffert genom att blanda 58,5 μL vatten med 6,5 μL 10x RNase jag buffert.
   2. Omsuspendera pärlorna i 35 μL 1x RNase jag buffert. Inkubera vid 95 ° c i 5 min och överför direkt på isen i 2 minuter för att förhindra återkoppling av cDNA. Håll locken under överföring till is som de kan pop-off på grund av trycket byggs upp.
   3. Separera pärlorna i 2 – 3 min på ett magnetiskt stativ och överför supernatanten till en ny tallrik.
   4. Omsuspendera pärlorna i 30 μL 1x RNase jag buffert. Separera pärlorna på det magnetiska stativet i 2 – 3 min och överför supernatanten till den tidigare insamlade supernatanten (den totala volymen av eluerat cDNA bör vara ca 65 μL).

8. RNA avlägsnande av RNase H och RNase I mat smältningen

1. Per prov, kombinera 2,4 μL vatten, 0,5 μL av 10x RNase jag buffert, 0,1 μL av RNase H, och 2 μL av RNase I.
2. Tillsätt 5 μL av blandningen till 65 μL av det släppta cDNA-provet och blanda med pipettering. Inkubera vid 37 ° c i 15 min och håll vid 4 ° c.
3. Rena cDNA från RNase digestionsmix med magnet pärlor från SPRI. Tillsätt 126 μL SPRI-pärlor till 70 μL nedbrytnings reaktion och blanda genom pipettering. Följ renings steg som beskrivs för SPRI pärlor rening i 2.6.1-2.6.6. Elute med 42 μL vatten förvärmd vid 37 ° c enligt beskrivningen.
4. Förbered RNase jag blanda genom att kombinera 4,5 μL av 10x RNase jag buffert och 0,5 μL av RNase I.
5. Tillsätt 5 μL av RNase-blandningen till 40 μL av det renade cDNA-provet. Blanda genom pipettering och inkubera vid 37 ° c i 30 min. Håll vid 4 ° c.
6. Rengör provet med hjälp av de magnetiska SPRI-pärlorna. Tillsätt 81 μL SPRI-pärlor till 45 μL nedbrytnings reaktion och blanda genom pipettering. Följ renings steg som beskrivs för SPRI pärlor rening i 2.6.1-2.6.6. Elute med 42 μL vatten enligt beskrivningen.

9. ligation av 5 ' Linker

1. Koncentrera det renade cDNA-provet till 4 μL med hjälp av vakuum kon centra torn. Håll temperaturen vid 30 – 35 ° c. Testa volymen med hjälp av en pipett. Om provet har torkat till fullständighet, lös genom att tillsätta 4 μL vatten.
   Anmärkning: Det är bättre att undvika torkning till fullständighet för att förhindra prov förlust.
2. Inkubera det koncentrerade provet vid 95 ° c i 5 min och placera omedelbart på isen i 2 minuter för att förhindra renaturering. Håll locken vid överföring av rören som locken kan pop-off på grund av tryck uppbyggnad.
3. Inkubera 4 μL av 2,5 μM 5 ' länkare vid 55 ° c i 5 min och omedelbart placera på is i 2 min för att förhindra renaturation.
4. Blanda 4 μL av 2,5 μM 5 '-länkaren med 4 μL av provet.
   Anmärkning: Den 5-länkaren bör förberedas enligt tilläggs tabell 2, tilläggs tabell 3, tilläggs tabell 4och tilläggs tabell 5. Späd den 10 μM 5 ' länkaren till en 2,5 μM koncentration med 100 mM NaCl före användning.
5. Tillsätt 16 μL av ligationspremixen (se material tabell) till den blandade 5-länkaren och provet och blanda väl med pipettering. Inkubera vid 16 ° c i 16 timmar.
6. Rengör ligationsblandningen med de magnetiska SPRI-pärlorna. Tillsätt 43,2 μL SPRI-pärlor och följ stegen 2.6.1 – 2.6.6. Elute enligt beskrivningen med 42 μL vatten förvärmd vid 37 ° c.
7. Upprepa reningen i steg 9,6 genom att tillsätta 72 μL av SPRI-pärlorna till den överförda supernatanten (1.8:1 pärlor till prov förhållande).
   Obs: 5 ' Linkers innehåller streckkoder som tillåter sammanslagning av upp till åtta prover före sekvensering (åtta trinucleotide streckkoder finns tillgängliga, som beskrivs i Murata et al.¹¹ och kompletterande tabell 1).

10. ligation av 3 ' Linker

1. Koncentrera det renade provet till 4 μL med hjälp av vakuum koncentratorn enligt beskrivningen i steg 9,1.
2. Inkubera det koncentrerade provet vid 95 ° c i 5 min och placera omedelbart på isen i 2 minuter för att förhindra renaturering. Håll locken vid överföring av rören som locken kan dyka upp på grund av tryck uppbyggnad.
3. Inkubera 4 μL av 2,5 μM 3 ' länkare vid 65 ° c i 5 min och omedelbart placera på is i 2 min för att förhindra renaturation.
4. Tillsätt 4 μL av 2,5 μM 3: s länkare till 4 μL av det koncentrerade provet.
5. Tillsätt 16 μL av ligationspremixen och blanda väl med pipettering. Inkubera vid 16 ° c i 16 timmar.
6. Rengör ligationsblandningen med de magnetiska SPRI-pärlorna. Tillsätt 43,2 μL SPRI-pärlor och följ stegen 2.6.1 – 2.6.6. Elute enligt beskrivningen med 42 μL vatten förvärmd till 37 ° c.
   Anmärkning: 3-länkaren bör förberedas enligt tilläggs tabellerna 6 och tilläggs tabell 7. Späd den 10 μM 3 ' länkaren till en 2,5 μM koncentration med 100 mM NaCl.

11. defosforylering

1. Förbered SAP mix genom att kombinera 4 μL vatten, 5 μL 10x SAP buffert, och 1 μL av SAP-enzym.
2. Tillsätt 10 μL av SAP-blandningen till det renade ligatprovet (total volym 50 μL) och inkubera i termocykleren med följande program: 37 ° c i 30 min, 65 ° c i 15 minuter och håll vid 4 ° c.

12. nedbrytning av 3 ' Linker övre strand med uracil specifikt excision enzym

1. Tillsätt 2 μL uracil-specifikt excisionsenzymer (se material tabell) till det defosforylerade provet, blanda genom pipettering och inkubera i termocyklaren med hjälp av följande program: 37 ° c i 30 min, 95 ° c i 5 min, och omedelbart placera på is i 2 min till förhindra återglödgning av den fragmenterade övre strängen.
2. Rengör reaktions blandningen genom att tillsätta 93,6 μL av de magnetiska SPRI-pärlorna till 52 μl blandningen och blanda väl med pipettering. Upprepa renings steg 2.6.1 – 2.6.6. Elute med 42 μL vatten förvärmd vid 37 ° c enligt beskrivningen.

13. andra strand syntesen

1. Förbered den andra strängen syntes blandning (volymerna uttrycks per prov) genom att kombinera 5 μl av 10x DNA-polymeras reaktionsbuffert, 2 μl vatten, 1 μl 10 mm dNTPs, 1 μl 50 μM nAnT-icage andra strängen primer (sekvens finns i tillägg tabell 1) och 1 μl av D NA-Exonuklease-bristfällig polymeras (se rekommenderat polymeras i material tabell).
2. Tillsätt 10 μL av blandningen till det renade provet och blanda väl med pipettering (total volym är 50 μL). Inkubera i termocyklaren med hjälp av följande program: 95 ° c i 5 min, 55 ° c i 5 min, 72 ° c under 30 minuter och håll vid 4 ° c.

14. nedbrytning av andra strand syntes primer med hjälp av Exonuclease I

1. Tillsätt 1 μL av Exonuklease I till den andra strängen syntes blandningen. Blanda väl genom pipettering och inkubera vid 37 ° c i 30 minuter följt av anläggning vid 4 ° c.
2. Rena dubbelsträngat DNA genom att tillsätta 91,8 μL av de magnetiska SPRI-pärlorna till 51 μL av Exonuklease I-behandlat prov. Upprepa renings steg som beskrivs i 2.6.1 – 2.6.6. och eluera med 42 μl vatten förvärmd till 37 ° c enligt beskrivningen.
3. Koncentrera provet med hjälp av vakuum koncentratorn till 15 μL enligt beskrivningen i steg 9,1.

15. kvalitets-och kvantitetskontroll

1. Använd 1 μL av de koncentrerade proverna och kör ett DNA-chip med hög känslighet på en DNA-kvalitetsanalysator. Förväntad profil/kvantitet presenteras i figur 3.

16. första omgången av Carrier nedbrytning

1. Förbered nedbrytnings blandningen genom att kombinera 2 μL vatten, 2 μL av 10x-restriktionsbuffert, 1 μL i-SceI och 1 μL i-CeuI.
2. Tillsätt 6 μL av nedbrytnings blandningen till 14 μL av det koncentrerade provet och blanda genom pipettering. Inkubera vid 37 ° c i 3 timmar följt av 20 min avaktivering vid 65 ° c och håll vid 4 ° c.
3. Rena nedbrytnings mixen med hjälp av de magnetiska SPRI-pärlorna. Tillsätt 5 μL vatten för att öka nedbrytnings Blandingens volym och tillsätt 45 μL SPRI-pärlor (1,8:1 pärlor till prov förhållande). Upprepa reningen enligt anvisningarna i steg 2.6.1 – 2.6.6. och eluera med 42 μl vatten förvärmd till 37 ° c.
4. Koncentrera det elräknade provet från 42 μL till 20 μL av den totala volymen enligt beskrivningen i steg 9,1.

17. kontroll av nedbrytnings nivån och bestämning av antalet PCR-Amplifieringscykler

1. Förbered qPCR mix för att förstärka hela bibliotek (adaptermix). Kombinera 3,8 μL vatten, 5 μL qPCR premix (2x), 0,1 μL 10 μM adaptor_f1 primer (5 '-AATGATACGGCGACCACCGA-3 ') och 0,1 μL 10 μM adaptor_r1 primer (5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ') för varje prov (se material tabell för Rekommenderad QPCR premix).
2. Kombinera 9 μL qPCR-adapterblandning med 1 μL prov från steg 16,4 och blanda väl med pipettering.
3. Förbered qPCR-blandningen för att förstärka DNA som härrör från bäraren (bärar blandning). Kombinera 3,8 μL vatten, 5 μL qPCR premix (2x), 0,1 μl 10 μM carrier_f1 primer (5 '-GCGGCAGCGTTCGCTATAAC-3 ') och 0,1 μL 10 μM adaptor_r1 primer för varje prov
4. Kombinera 9 μL av qPCR-bärar blandningen med 1 μL av provet från steg 16,4 och blanda väl med pipettering.
5. Ställ in qPCR-program: 95 ° c i 3 min (95 ° c för 20 s, 60 ° c i 20 s, 72 ° c i 2 min) upprepad 40x, följt av instrumentspecifik denatureringskurva (65 – 95 ° c) och håll vid 4 ° c.
   Anmärkning: Förbered en negativ kontroll genom att ersätta provet med vatten.

18. PCR-amplifiering av mål biblioteket

1. Bered PCR-förstärknings blandningen genom att kombinera 6 μL vatten, 0,5 μL 10 μM adaptor_f1 primer, 0,5 μL 10 μM adaptor_r1 primer och 25 μL PCR-premix (2x). Blanda med pipettering (se material tabell för Rekommenderad PCR-premix).
2. Tillsätt 32 μL av PCR-blandningen till 18 μL av provet från steg 16,4. Blanda grundligt med pipettering.
3. Ställ in PCR-amplifieringen: 95 ° c i 3 min, (98 ° c för 20 s, 60 ° c i 15 s, 72 ° c i 2 min) 12-18 cykler, 72 ° c i 2 min och håll vid 4 ° c.
   Anmärkning: Det exakta antalet PCR-cykler bestäms av qPCR-resultaten och motsvarar det CT-värde som erhålls med adapterns primer-blandning (antalet PCR-cykler är lika med CT-värdet).
4. Rengör det förstärkta provet genom att tillsätta 90 μL av de magnetiska SPRI-pärlorna till 50 μL av det förstärkta provet och blanda grundligt med pipettering. Upprepa renings stegen som beskrivs i steg 2.6.1 – 2.6.6. och eluera provet med 42 μL vatten enligt beskrivningen.

19. andra omgången av Carrier nedbrytning

1. Upprepa steg 16.1 – 16.3.
2. Rena nedbrytnings mixen med hjälp av de magnetiska SPRI-pärlorna. Tillsätt 10 μL vatten i provet för att öka volymen och blanda med 30 μL SPRI-pärlor (1:1 pärlor till prov förhållande). Upprepa reningen enligt anvisningarna i steg 2.6.1 – 2.6.6. och eluera med 42 μl vatten förvärmd vid 37 ° c enligt beskrivningen.
3. Koncentrera det eluerade provet från 42 μL till 30 μL av den totala volymen.

20. Val av biblioteks storlek

1. Blanda 24 μL av de magnetiska SPRI-pärlorna med 30 μL av provet från steg 19,3. (0.8:1 kulor till prov förhållande). Upprepa renings stegen som beskrivs i steg 2.6.1 – 2.6.6. och eluera provet i 42 μL vatten enligt beskrivningen.
2. Koncentrera provet till cirka 14 μL enligt beskrivningen i steg 9,1.

21. kvalitets kontroll

1. Bedömning av storleks fördelning
   1. Kör 1 μL av provet på DNA-chip med hög känslighet. Förväntat resultat presenteras i figur 4.
      Anmärkning: Om fragment som är kortare än 200 BP är synliga (se exempel i figur 4a, C), bör storleks val (steg 20.1 – 20.2) upprepas tills de korta fragmenten avlägsnas (figur 4b, D). Vanligt vis är en extra omgång av storleks val tillräckligt. Om antalet korta fragment är allvarligt (som i figur 4c) bör förhållandet mellan pärlorna och proverna sänkas till 0,6:1.
2. Kvalitets kontroll av bärar nedbrytning
   1. Upprepa steg 17.1 – 17,5.
      Anmärkning: Beroende på den koncentration av biblioteken som uppskattas i HS DNA-chip (region analys) måste proverna spädas före qPCR. Använd 0,5 μL av provet för att undvika prov förlust och späd 100 – 500x i vatten (späd till 1 – 20 PG/μL slutlig koncentration). Förväntad skillnad mellan CT-värden som erhålls med adapter och bärar blandning är 5 – 10.
3. Kvantifiering av biblioteket
   1. Bered den arbetande utspädningen av lambda DNA-standarden genom att blanda 20 μL av 100 lambdasendna-standarden med 980 μL 1x TE (Bered genom spädning av 20x TE som tillhandahålls i DNA-kvantifieringssatsen). Spädning av lambda-DNA kan förvaras vid-20 ° c.
   2. Bered standard serie utspädningar av lambda DNA genom att blanda den utspädda lambda-standarden och 1x TE enligt tilläggs tabell 8.
      Anmärkning: För högre noggrannhet, rekommenderas att lägga till 100 μL 1x TE buffert till alla rör och ta bort 1x TE volym som krävs per volym av den utspädda lambda som skall tillsättas. Använd inte mer än 1 μL av biblioteket. användning av 384 väl plattor för denna mätning rekommenderas.

Representative Results

Denna rapport beskriver det fullständiga SLIC-CAGE-protokollet för att erhålla sekvenserings färdiga bibliotek från nanogram av start totalt RNA-material (figur 1). För att erhålla den syntetiska RNA-bärar blandningen måste först PCR-bärar mallar förberedas och gelrenas för att eliminera PCR-sidoprodukter (figur 2A). Varje PCR-mall (totalt tio) produceras med hjälp av en vanlig forward, men en annan omvänd primer (tabell 2), vilket leder till olika längder av PCR-mallen för att möjliggöra storleks variation hos syntetiska RNA-bärare. När de har renats används PCR-mallar för in vitro-transkription av bärar molekylerna. En enda RNA-bärar produkt förväntas om mallarna är gel-renade (se representativ gel-analys i figur 2b). Beredning av transport ören kan skalas upp beroende på behov, och när beredd, blandad och fryst vid-80 ° c för framtida bruk.

Med hjälp av den rekommenderade minimala mängden prov totalt RNA (10 ng) kombinerat med 16-18 cykler av PCR-förstärkning, hög komplexitet SLIC-CAGE bibliotek kan uppnås. Antal PCR-cykler som krävs för att förstärka det slutliga biblioteket beror i hög grad på mängden av det totala indata-RNA som används (det förväntade antalet cykler presenteras i tabell 4).

Efter den första omgången av nedbrytning, i qPCR-resultat (steg 17), är den förväntade skillnaden mellan CT-värden som erhålls med adaptor_f1 eller carrier_f1 primer 1-2, med CT-värden erhållna med adaptor_f1 lägre än med carrier_f1.

Fördelningen av fragment längder i det slutliga biblioteket är mellan 200-2000 BP med den genomsnittliga fragmentstorleken på 700-900 BP (baserat på region analys med hjälp av Bioanalyzer program vara, figur 4b, D). Kortare fragment, som visas i figur 4a, C, måste tas bort med ytterligare storleks rundor-uteslutning (steg 20-21). Dessa korta fragment är PCR-amplifiering artefakter och inte mål biblioteket. Observera att kortare fragment klustret bättre på sekvensering flöde celler och kan orsaka problem med sekvensering.

Den förväntade mängden biblioteks material som erhålls per prov är mellan 5-50 ng. Betydligt lägre belopp är ett tecken på prov förlust under protokollet. Om den erhållna låga kvantiteten är tillräcklig för sekvensering (2-3 ng av de poolade biblioteken behövs), kan biblioteken vara av lägre komplexitet (se nedan).

Beroende på sekvenserings maskinen kan antalet bibliotek som läses in på flödes cellen behöva optimeras. Med hjälp av en Illumina HiSeq 2500, lastning 8-12 pM SLIC-CAGE bibliotek ger i genomsnitt 150-200 miljoner läser, med > 80% läser passerar kvalitet poäng Q30 som tröskel.

De erhållna läsningar mappas sedan till referengenomet [för 50 BP läsningar, Bowtie2¹² kan användas med standard parametrar som tillåter noll Miss matchningar per frö sekvens (22 BP)]. Förväntad kart effektivitet beror på det totala RNA-inmatningsbeloppet och presenteras i tabell 5. De unikt mappade läsningar kan sedan läsas in i R grafisk och statistisk dator miljö¹³ och bearbetas med cager (bioconductor paket¹⁴). Paketet vinjett är lätt att följa och förklarar arbets flödet och bearbetning av mappade data i detalj. En lätt visuell kontroll av bibliotekets komplexitet är fördelningen av Promotorns bredd, eftersom låg komplexitet bibliotek kommer att ha artificiellt smala initiativtagare (figur 5a, SLIC-Cage bibliotek härrör från 1 ng av totalt RNA, för detaljer se tidigare publikation¹⁰). Hur... än, jämn den låg-invecklad skära upp i skivor-bur bibliotek tillåta identifieringen av sann CTSSs, med betydlig exakthet än alternativ metoderna för låg/medels Tor-insatsen TSS kart läggande (Figur 5b, C).

I figur 1: Stegen i SLIC-Cage-protokollet. Prov-RNA blandas med RNA-bärar blandningen för att uppnå 5 μg totalt RNA-material. cDNA syntetiseras genom omvänd transkription och locket oxideras med natriumperiodate. Oxidation gör det möjligt att fästa biotin på locket med biotin hydrazid. Biotin blir knuten till mRNA ' s 3 ′ End, eftersom det också oxideras med natriumperiodate. För att eliminera biotin från mRNA: cDNA hybrider med ofullständigt syntetiserade cDNA och från 3 ′ ändarna av mRNA, proverna behandlas med RNase I. cDNA som nådde 5 ′ slutet av mRNA väljs sedan av affinitet rening på streptividin magnetiska pärlor ( lock-svällning). Efter release av cDNA, 5 ′-och 3 ′-Linkers är ligated. De biblioteks molekyler som kommer från bäraren bryts ned med hjälp av I-SceI-och I-CeuI-homing-slutonukleaser och fragmenten avlägsnas med magnet pärlor från SPRI. Biblioteket är sedan PCR Amplified. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: representativ gel analys av bärare PCR-mallar och bärare in vitro-utskrifter. (A) bärare PCR-mallar före gel rening: den första brunnen innehåller 1 KBP markör, följt av bärare PCR mallar 1, 1-10. (B) bärare in vitro-utskrifter: den första brunnen innehåller 1 KBP markör, följt av bärare avskrifter 1-10. Carrier avskrifter denaturerades genom upphettning i 5 min vid 95 ° c före lastning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: representativ DNA-kvalitet (hög känslighet DNA-chip) spår av SLIC-Cage före första omgången av bärare nedbrytning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: representativ DNA-kvalitet (hög känslighet DNA-chip) spår av SLIC-Cage bibliotek efter PCR-förstärkning. (A) SLIC-Cage-bibliotek som kräver ytterligare storleks val för avlägsnande av korta fragment. (B) skära upp i skivor-bur bibliotek efter storlek-utväljande Använd ande 0.6 x spri pärlor till prov förhållande. (C) skära upp i skivor-bur bibliotek av sänka produktionen belopp så pass behöver storlek-val för flyttande av kort fragment. (D) skära upp i skivor-bur bibliotek av sänka produktionen belopp efter storlek-utväljande Använd ande 0.6:1 spri pärlor till prov förhållande. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Validering av SLIC-Cage-bibliotek. (A) distribution av taggen kluster interquantile bredder i SLIC-Cage bibliotek beredda från 1, 5, eller 10 ng av S. cerevisiae totalt RNA, och i NAnT-icage biblioteket beredd från 5 μg S. cerevisiae totalt RNA. En hög mängd smala tag kluster i 1 ng SLIC-CAGE biblioteket visar sin låga komplexitet. (B) Roc kurvor för CTSS identifiering i S. cerevisiae SLIC-Cage bibliotek. Alla S. cerevisiae NAnT-icage ctsss användes som en sann uppsättning. (C) Roc kurvor för CTSS-identifiering i S. cerevisiae nanocage bibliotek. Alla S. cerevisiae NAnT-icage ctsss användes som en sann uppsättning. Jämförelse av ROC kurvor visar att SLIC-CAGE kraftigt överträffar nanoCAGE i CTSS identifiering. Data från ArrayExpress E-MTAB-6519 användes. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: sekvens av bäraren syntetiska genen. I-SceI platser är fet och kursiv i lila, och I-CeuI erkännanden platser är gröna. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Bärare	omvänd primer 5 '-3 '		PCR-produktens längd/BP
1	PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT		1034
2	PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC		966
3	PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG		889
4	PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT		821
5	PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC		744
6	PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA		676
7	PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC		599
8	PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC		531
9	PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG		454
10	PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA		386
	* Forward primer är densamma för alla bärare mallar. Understruken är T7-Promotorns sekvens. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA

Tabell 2: grund färger för amplifiering av bärar mal len. Framåtprimer är densamma för alla transportmallar. Understruken är T7-Promotorns sekvens. PCR_GN5_f1: Taatacgactcactatagnnnnncagcgttcgcta. Med olika omvänd primers, tillverkas PCR-mallar och därmed bärare RNAs av olik längd.

Bärare	Längd	icke-utjämnade/μg	begränsat/μg
1	1034	3,96	0,45
2	966	8,36	0,95
3	889	4,4	0,5
4	821	6,6	0,75
5	744	4,4	0,5
6	676	3,08	0,35
7	599	4,4	0,5
8	531	3,96	0,45
9	454	2,64	0,3
10	386	2,2	0,25

Tabell 3: RNA-bärar blandning. Totalt 49 μg av bärar blandningen 0,3-1 KBP: icke-utjämnade = 44 μg, utjämnade = 5 μg.

Totalt RNA-ingång/ng	PCR-cykler
1 ng till	18
2 ng till	17
5 ng till	16
10 ng till	15-16
25 ng till	14-15
50 till	13-15
100 till	12-14

I tabell 4: Förväntat antal PCR-cykler i beroende av provets totala RNA-ingång. Ungefärligt antal cykler är baserat på experiment som utförs med Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, och mus Musculus totala RNA.

Totalt RNA-ingång/ng	% totalt kartlagd	% unikt kartlagd	% transportör
1 ng till	30	20-30	30
2 ng till	60	20-50	10
5 ng till	60-70	40-60	5-10
10 ng till	60-70	40-60	5-10
25 ng till	65-80	40-70	0-5
50 till	65-80	40-70	0-3
100 till	70-85	40-70	0-2

Tabell 5: förväntad kart effektivitet och beroende av totalt RNA-invärde. Ungefärliga siffror presenteras och baseras på experiment som utförs med Saccharomyces cerevisiae och mus MUSCULUS totala RNA.

Discussion

För framgångs rik skära upp i skivor-bur bibliotek förberedelserna, det er kritisk till använda låg-bindande spets och rören till hindra prov förlust på grund av prov adsorption. I alla steg som involverar hämtning av supernatanten bör du återställa entiresample-volymen. Eftersom protokollet har flera steg, kommer kontinuerlig prov förlust leda till misslyckade bibliotek.

Om bur (nAnT-iCAGE) har inte blitt utfört rutinmässigt, den er bäst till prov skära upp i skivor-bur med olik insatsen beloppen (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) om samma räkna samman RNA prov och jämföra med nAnT-iCAGE bibliotek så pass är beredd Använd ande 5 μg av räkna samman RNA. Om den nAnT-iCAGE bibliotek är misslyckad (mindre en 0.5-1 ng om DNA bibliotek skaffat per prov), skära upp i skivor-bur är osannolikt till verk, och prov förlust nödvändigt vis till vara reducera.

Ett viktigt steg för att säkerställa hög kvalitet bibliotek saknar icke-utjämnade försämrat RNA eller rRNA är Cap-fångst som beskrivs i avsnitt 7. Det är mycket viktigt att streptividin-pärlorna grundligt återsuspenderas i tvättbuffertar och att tvättbuffertarna avlägsnas innan de fortsätter till nästa tvättsteg eller eluering av cDNA.

Om resultaten från qPCR efter den första omgången av bärare nedbrytning visar ingen skillnad mellan användning av adaptor_f1 och carrier_f1 primers, fortsätter protokollet rekommenderas fortfarande. Om det efter den andra omgången av bärare nedbrytning, skillnaden i CT-värden är mindre än fem, en tredje omgång bärare nedbrytning rekommenderas. Vi har aldrig funnit en tredje omgång av nedbrytning behövs, och om det inträffar, det rekommenderas att ersätta homing endonuclease bestånd.

Ytterligare omgångar med PCR-förstärkning kan läggas till protokollet om det slutliga beloppet för det bibliotek som erhålls inte är tillräckligt för sekvensering. PCR-förstärkning kan sedan ställas in med minimalt antal amplifieringscykler som behövs för att ge tillräckligt med material för sekvensering, med beaktande av prov förlust som inte kan undvikas vid storleks val. Rening eller storleks val med hjälp av SPRI magnetiska pärlor bör sedan utföras tills alla små (< 200 BP) fragment avlägsnas (om det behövs, Använd 0,6:1 pärlor till provet ratio), och biblioteket bör kvantifieras med Picogreen.

Bibliotek kan ordnas i enslutsläge eller ihopparad. Med hjälp av Parade-end sekvensering, information om transkription ISO former kan erhållas. Dessutom, som omvänd transkription utförs med hjälp av en slumpmässig primer (tct-n₆, N₆ är en slumpmässig hexamer), information från sekvenserade 3 '-End kan användas som unika molekyl ära identifierare (Umi) för att komprimera PCR dubbletter. Eftersom ett måttligt antal PCR-amplifieringscykler används (upp till 18), har användningen av UMIs tidigare befunnits vara onödig.

Som kärnan i protokollet förlitar sig på nAnT-iCAGE¹¹, SLIC-Cage använder åtta streckkoder. Multiplexering av mer än åtta prover stöds därför för närvarande inte. Dessutom, båda skära upp i skivor-bur och nAnT-iCAGE är inte passande för erövrare RNAs kortare än 200 BP, så protokollen är planerat på flytta Linkers och PCR artefakt igenom storlek-uteslutandet med AMPure XP pärlor.

Skära upp i skivor-bur är den bara opartisk låg-insatsen enkel-nukleotid beslutsamhet metod för kart läggande transkription inledande börja tomten Använd ande nanogram av räkna samman RNA material. Alternativa metoder förlitar sig på mallen växling aktivitet omvänt transkriptase till streckkod utjämnat RNA i stället för Cap-svällning (t. ex. NanoCAGE¹⁵ och NanoPARE¹⁶). På grund av mall växling, dessa metoder uppvisar sekvens-specifika fördomar i Tsss upptäckt, vilket leder till ökat antal falska positiva Tsss och minskat antal sanna Tsss^9,10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-propanol, Bioultra, for molecular biology, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	59304-100ML-F	Used in RNAclean XP purification.
3' linkers			Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3'linkers is described in the supplementary of this protocol.
5' linkers			Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5'linkers is described in the supplementary of this protocol.
Agencourt AMPure XP, 60 mL	Beckman Coulter	A63881	Purification of DNA
Agencourt RNAClean XP Kit	Beckman Coulter	A63987	Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.
Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips	Axygen (available through Corning)	PCR-0208-CP-C	Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).
Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps	Axygen (available through Corning)	PCR-02CP-C	Caps for PCR plates.
Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube	Axygen (available through Corning)	MCT-150-L-C	Low-binding 1.5 mL tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.
Axygen 96 well no skirt PCR microplate	Axygen (available through Corning)	PCR-96-C	Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples
Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits	Agilent		To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)
Biotin (Long Arm) Hydrazide	Vector laboratories	SP-1100	Biotinylation/tagging
Cutsmart buffer	NEB		Restriction enzyme buffer
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase	NEB	M0259S	Second strand synthesis
DNA Ligation Kit, Mighty Mix	Takara	6023	Used for 5' and 3'-linker ligation
dNTP mix (10 mM each)	ThermoFisher Scientific	18427013	dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)
Dynabeads M-270 Streptavidin	Invitrogen	65305	Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.
DynaMag-2 Magnet	ThermoFisher Scientific	12321D	Magnetic stand for 1.5 mL tubes - used to prepare Streptavidin beads.
DynaMag-96 Side Skirted Magnet	ThermoFisher Scientific	12027	Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.
Ethanol, BioUltra, for molecular biology, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	51976-500ML-F	Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.
Exonuclease I (E. coli)	NEB	M0293S	Leftover primer degradation
Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS	NEB	B7025S	agarose gel loading dye
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040S	Kit for carrier in vitro transcription
Horizontal electrophoresis apparatus			purification of carrier DNA templates from agarose gels
I-Ceu	NEB	R0699S	Homing endonuclease used for carrier degradation.
I-SceI	NEB	R0694S	Homing endonuclease used for carrier degradation.
KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)	Kapa Biosystems (Supplied by Roche)	KK2601	PCR mix for target library amplification
KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x	Kapa Biosystems (Supplied by Roche)	KK4600	qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles
Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 µL, 1-20 µL, 20-200 µL)	Gilson		Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.
Microplate reader			For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.
nuclease free water	ThermoFisher Scientific	AM9937	Or any nuclease (DNase and RNase) free water
PCR thermal cycler			incubation steps and PCR amplficication
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	F530S	DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Purification of carrier PCR templates from agarose gels.
qPCR machine			determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent	ThermoFisher Scientific	P11495	Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	NEB	N0551S	DNA ladder
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N0550S	DNA ladder
Ribonuclease H	Takara	2150A	Digestion of RNA after cap-trapping.
RNase ONE Ribonuclease	Promega	M4261	Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free	VWR	AAJ63669-AK	Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free			Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium periodate	Sigma-Aldrich	311448-100G	Oxidation of vicinal diols
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 μL, Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719390-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1,000 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719463-1000EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719412-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719447-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
SpeedVac Vacuum Concentrator			concentrating samples in various steps to lower volume
SuperScript III Reverse Transcriptase	ThermoFisher Scientific	18080044	Used for reverse transcription (1st CAGE step)
Trehalose/sorbitol solution			Preparation is described in Murata et al. 2014.
Tris-HCl, 1 M aq.soln, pH 8.5			1 M solution, DNase and RNase free
tRNA (20 mg/mL)			tRNA solution. Preparation is described in Murata et al. 2014.
UltraPure Low Melting Point Agarose	ThermoFisher Scientific	16520050	Or any suitable pure low-melt agarose.
USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)	Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)	78390500UN
USER Enzyme	NEB	M5505S	Degradation of 3'linker's upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme
Vaccinia Capping System	NEB	M2080S	Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules
Wash buffer A			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer B			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer C			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.