Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

في الوقت الحقيقي ، وشبه التلقائي قياس الفلورسنت من الدرجة الهوائية السائل سطح المجري الجوي للخلايا الاساسيه الإنسان الظهاريه

Published: June 13, 2019 doi: 10.3791/59815
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2,4, 1,2, 2,3, 1
1Epithelial Research Group, Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 2Respiratory Group, Institute of Cellular Medicine, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 3Paediatric Respiratory Medicine, Great North Children's Hospital, Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, 4Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co

Summary

نقدم بروتوكولا لاجراء قياسات ديناميكية لدرجه الحموضة السائلة السطحية لمجري الهواء تحت ظروف الأفلام الرقيقة باستخدام قارئ اللوحة.

Abstract

في السنوات الاخيره ، تم تسليط الضوء علي اهميه الغشاء الهيدروجيني السطحية المخاطية في المسالك الهوائية من خلال قدرتها علي تنظيم السائل سطح المجري الهوائي (أسل) الترطيب ، واللزوجة المخاط ونشاط الببتيدات المضادة للميكروبات ، والمعلمات الرئيسية المشاركة في الدفاع الفطري الرئتين. هذا هو من الاهميه الاساسيه في مجال امراض الجهاز التنفسي المزمنة مثل التليف الكيسي (CF) حيث يتم dysregulated هذه المعلمات. في حين ان مجموعات مختلفه قد درست الأس الهيدروجيني علي حد سواء في الجسم المجري وفي المختبر, أساليبهم تقرير مجموعه واسعه نسبيا من قيم الأس الهيدروجيني وحتى النتائج المتناقضة فيما يتعلق بأي اختلافات الأس الهيدروجيني بين الخلايا غير CF و CF. وعلاوة علي ذلك ، فان بروتوكولاتها لا توفر دائما ما يكفي من التفاصيل من أجل ضمان استنساخ ، ومعظمها منخفض الانتاجيه وتتطلب معدات باهظه الثمن أو معرفه متخصصة لتنفيذها ، مما يجعل من الصعب إنشاء في معظم المختبرات. هنا نقوم بوصف قارئ لوحه فلورية شبه المؤتمتة التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من الأس الهيدروجيني في ظل ظروف الفيلم رقيقه التي تشبه بشكل وثيق في الحالة المجرية. هذه التقنية تسمح لقياسات مستقره لساعات عديده من ثقافات المسالك الهوائية متعددة في وقت واحد ، والاهم من ذلك ، يمكن رصد التغيرات الديناميكية في الأس الهيدروجيني في الاستجابة لناهضات ومثبطات. ولتحقيق ذلك ، يتم تلطيخ الخلايا الظهاريه الاوليه المتمايزة بالبالكامل لمجري الهواء البشري (hAECs) بين عشيه وضحيها بصبغه حساسة لدرجه الحموضة من أجل السماح باعاده امتصاص السوائل الزائدة لضمان ظروف الأفلام الرقيقة. بعد يرصد فلوري في وجود أو عدم وجود منبات ، يتم اجراء معايره الأس الهيدروجيني في الموقع لتصحيح لحجم وصبغ تركيز. الطريقة الموصوفة توفر الضوابط المطلوبة لجعل قياسات الأس الهيدروجيني ثابته وقابله للتكرار ، والتي يمكن استخدامها في نهاية المطاف كمنصة اكتشاف المخدرات للطب الشخصي ، وكذلك تكييفها مع الانسجه الظهاريه الأخرى والتجريبية الظروف ، مثل النماذج التهابيه و/أو المضيفة المسببة للمرض.

Introduction

يتم تغطيه ظهاره المسالك الهوائية بطبقه سائله رقيقه (~ 10 μm) تسمي السائل السطحي لمجري الهواء (أسل). يتم تنظيم تكوين وعمق (الترطيب) من هذا الأمر باحكام ويتحكم في كفاءه أزاله الممرات الهوائية من قبل المصعد موكوسيلياري1,2,3,4. في السنوات الاخيره ، تم إثباتاهميه المحتوي H +/hco3- من قبل مجموعات مختلفه نظرا لقدرته علي تنظيم الترطيب الكتروني5، التهاب المسالك الهوائية6 والعدوى7، 8 وكذلك اللزوجة المخاط8،9. الأهم من ذلك ، علي الرغم من وجود بعض الخلافات ، وقد أفادت العديد من الدراسات تقلبات لدرجه الحموضة في مجري التنفس في امراض المسالك الهوائية المزمنة مثل الربو10،11،12، مرض الانسداد الرئوي11، توسع القصبات11، جيوب المزمنة13،14 والتليف الكيسي (CF)5،9،15،16،17، والتي يشير إلى ان العلاجات التي تستعيد الأس الهيدروجيني يمكن ان تكون مفيده لعلاج أنواع متعددة من امراض المسالك الهوائية المزمنة. CF هو المرض الوراثي المتنحي الأكثر شيوعا في السكان القوقاز ويرجع ذلك إلى الطفرات في الجينات المحولة الموصلات (CFTR) CF الغشاء. هذا الجين رموز انيون (hco3- و Cl-) قناه التي تلعب دورا حاسما في نقل الأيونات والسوائل والتوازن عبر النعت18. علي الرغم من ان cf هو مرض متعدد الأعضاء ، وعلم الامراض الرئة هو السبب الرئيسي للامراض والوفاات19،20 والنظر في العيب الاولي في CF هو النقل الضعيف من Cl- و hco3-، يمكن للمرء ان يفترض ان pH السائل خارج الخلية في الأشخاص الذين يعانون من CF سيتم dysregulated بالمقارنة مع الناس الذي ليس لديهم CF. التالي ، فان قياس الأس الهيدروجيني كان مجالا موضعيا للبحوث CF والمجموعات المختلفة قد وضعت تقنيات لقياس الحموضة في CF الخطوط الجويه.

في فيفو ، تم قياس درجه الحموضة الهوائية باستخدام تقنيات مختلفه ، من التحقيقات الدقيقة (ألياف البصرية ، والذهب أو التحقيقات mobidium)5،21،22،23،24 إلى قياسات الحموضة من ماده طارده للبلغم أو الزفيرالمكثفات التنفس (ebc)10،11،12،25،26،27. في مجال البحث من CF ، يتم دراسة درجه الحموضة علي نطاق واسع نظرا للآثار السريرية المحتملة. نظريا, جعل المسالك الهوائية أكثر قلوية يمكن ان تزيد من قتل البكتيريا وتحسين أزاله موكوسيلياري والتوازن مجري التنفس ككل. ومع ذلك, في المجرية/ex الدراسات فيفو تقرير مجموعه واسعه من قيم الأس الهيدروجيني, وحتى الآن, النتائج ليست حاسمه فيما يتعلق بوجود فرق في درجه الحموضة بين غير CF و cf الخطوط الجوية. في أوائل 2000s ، أفادت مجموعات مختلفه pH من EBC. في المجموعات غير المريضة ، تراوحت قيم الحموضة من 4.6 إلى 8.5 ولكن من المثير للاهتمام ، تم العثور علي ebc ph أكثر حمضيه خلال التفاقم في الناس مع CF12،27. في الاونه الاخيره ، في القياسات المجرية من النموذج العام في نماذج الإنسان والحيوانية من CF وأفادت النتائج المتضاربة16،17،21،22،23، 24 ولا يزال من غير الواضح ما إذا كانت الخطوط الجوية cf أكثر حمضيه من الخطوط الجوية غير cf.

كما هو الأمر في قياس الجسم السفلي من الأس الهيدروجيني ادني ثبت الصعب بسبب كميه صغيره جدا من بطانة السوائل المسالك الهوائية ووجود محتمل من المقابس المخاط في المرض ، وتحولت العديد من المجموعات إلى التجارب في المختبر لقياس الأس الهيدروجيني ، وذلك أساسا باستخدام ثلاثه مختلفه منهجيات. يستخدم المنهج الأول الاصباغ الفلورية الحساسة للخلايا التي يتم اضافتها كمسحوق جاف ، اما مباشره إلى المعدة أو باستخدام سائل خامل يسمي الهيدروكربون المشبع بالفلور ،5،8،16 , 17 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. ومع ذلك ، فان هذا الأسلوب يوفر القليل من السيطرة علي كميه الدقيق من الصبغة التي تضاف إلى الثقافات ويعرض خطر المجاميع صبغ والاختلافات الكبيرة في التركيز بين العينات و/أو التجارب وحتى داخل نفس العينة . وقد أجريت أيضا بشكل عام مع المجهر البؤري ، الذي يحد من قابليته للتطبيق ، وفي كثير من الحالات ، يمنع الرصد المفصل لعينات متعددة والتغيرات في شروط التسجيل. الطريقة الثانية المستخدمة لقياس الأس الهيدروجيني هو استخدام الأقطاب المجهرية الحساسة لدرجه الحموضة5,15. ولذلك فان قياسات الأس الهيدروجيني لا تعتمد علي تركيز الصبغة الفلورية وينبغي ان تعطي نتائج اقوي وأكثر استنساخا. ومع ذلك ، لا يسمح هذا الأسلوب لقياسات ديناميكية ، في الوقت الحقيقي من الأس الهيدروجيني ، وليس من السهل اجراء قراءات متعددة في ظل ظروف مختلفه. وهي أيضا عمليه كثيفه العمالة ومعقده تتطلب معدات متخصصة (أجهزه التسجيل الكهربائي/الكهربائي) والتدريب علي جمع العينات لقياس الأس الهيدروجيني اللاحق والمعايرة. وعلاوة علي ذلك ، أظهرت هاتان التقنيتان أيضا بعض التناقضات في القدرة علي إنتاج نتائج قابله للتكرار: باستخدام طريقه صبغ الفلورسنت الحساسة لدرجه الحموضة ، والقيم المبلغ عنها تانغ وآخرون 7.35 لغير CF و 7.0 لل CF أسل8 بينما في أكثر ورقه الاخيره من نفس المجموعة ، وكان الأس الهيدروجيني 6.9 و 6.4 لغير CF و CF ، علي التوالي17. وبطريقه مماثله ، أعطت قياسات القطب المجهري قيم 6.4 في غير-CF و6.1 في الدراسة من 200315 في حين ان المجموعة نفسها أبلغت عن قيم 6.7 لغير cf و 6.45 ل cf أسل في دراسة من 20135. وأخيرا ، في النهج الثالث ، يضيف الباحثون حجما كبيرا نسبيا من المحلول المخزن بشكل ضعيف علي السطح المخاطي للثقافات ، التالي يدمرون ظروف الأفلام الرقيقة ويغيرون تكوين الجهاز ، ويحتمل ان يكون تنظيمه. ثم يقاس الأس الهيدروجيني اما باستخدام الاصباغ الفلورية الحساسة لدرجه الحموضة33، من خلال طريقه المعايرة بالقياس الهيدروجيني لدرجه الحموضة في غرفه الاستعمال13،14، أو يتطلب أزاله الأس المخفف من الثقافات وقياس درجه الحموضة باستخدام درجه الحموضة القطب ، محلل أو عباد الربيع شرائط34. ومن الصعوبات الأخرى في القياس الدقيق لدرجه الحموضة الهيدروجينية إنشاء منحني قياسي دقيق قدر الإمكان. في الواقع ، ما إذا كان يتم تنفيذ القراءات مع القطب الذي سيقيس الفرق في الطاقة الكهربائية عن طريق الراتنج أو استخدام الاصباغ الفلورية الحساسة لدرجه الحموضة ، سيتاثر كل من هذه النهج من البيئة المحلية الصغيرة للعينات يجري قياس. وبشكل أكثر تحديدا ، قد يختلف ثابت التفكك (Kd) من الاصباغ بشكل كبير اعتمادا علي درجه الحرارة ، والقوه الايونيه ، واللزوجة ، فضلا عن التفاعلات المحتملة للصبغة مع المكونات الخلوية مثل البروتينات والمخاط المحتمل.

من أجل محاولة التغلب علي العديد من هذه القضايا التقنية ، وكذلك لتطوير طريقه أكثر ديناميكية وابسط واعلي الانتاجيه ، انشانا تقنيه في المختبر الذي يسجل الأس الهيدروجيني في الثقافات hAEC الاوليه باستخدام خليه-التي تهدد pH الحساسة صبغه فلورية في القياسية التجارية لوحه القارئ. وتقوم هذه الطريقة بإنشاء قياسات قابله للتكرار وديناميكية وشبه مؤتمتة وفي الوقت الحقيقي لدرجه الحموضة من الخلايا ثلاثية الابعاد المتمايزة تماما في ظل ظروف الأفلام الرقيقة. من خلال استخدام قارئ لوحه متعددة البئر ، يمكن لهذا الفحص شبه الألى جعل القياسات المتزامنة القريبة من درجه الحموضة لمده تصل إلى 24 الظروف أكثر من 12 h ويمكن رصد تاثير أضافه منبات مختلفه أو مثبطات. في هذه الورقة نقوم بوصف المنهجية بالتفصيل والإبلاغ عن النتائج التمثيلية في ظل ظروف الرقابة الايجابيه والسلبية التي تتحقق من صحة هذه التقنية.

Protocol

الاوليه غير CF (ن = 3 المانحين ، العمر 34 ، 27 و 23 سنه) و CF (ن = 3 المانحين ، كل F580del/F508del ؛ العمر 40 ، 41 ، غير معروف) hAECs كانت هديه نوع من الدكتور سكوت h. Randell (معهد الرئة مارسيكو ، جامعه نورث كارولينا في تشابل هيل ، الولايات المتحدة) وكانت نيد ببموجب بروتوكول #03-1396 وافقت عليها جامعه نورث كارولينا في تشابل هيل مجلس المراجعة المؤسسية الطبية الحيوية. وقد نمت الخلايا وفقا للأساليب المنشورة سابقا باستخدام وسائل الاعلام النمو والتمايز التي وصفها fulcher و randell35،36.

1. اعداد العينة

  1. تنمو haecs الابتدائية علي 6.5 mm قطرها شبه نفاذيه يدعم (جدول المواد) في الهواء والسائل واجهه لمده 28 يوما علي الأقل ، كما هو موضح سابقا35،36.
  2. اعداد 50 mL من محلول معقم من hco3- التي تحتوي علي الحل العازلة krebs (هكو3- krb ، وترد التركيزات في المليمتر نحله3 (25) nacl (115) ، kcl (5) ، cacl2 (1) ، mgcl2 (1) ، D-الجلوكوز (5)) وتصفيه تعقيم باستخدام فلتر حقنه 0.2 μm.
  3. تغيير متوسط العرض الأول إلى متوسط التمايز الجديد كما هو موضح في 1.135،36.
    ملاحظه: وقد تبين ان تركيز الجلوكوز بالأضلاع يؤثر علي33الأس الهيدروجيني. في هذه المرحلة ، يمكن التحكم في محتوي الجلوكوز في المقصورة الاماميه عن طريق استبدال الوسيطة بحلول مخزنه لتركيزات الجلوكوز المعروفة.
  4. غسل سطح قمي من الخلايا عن طريق أضافه 150 μl من hco3- krb واحتضان لمده 20 دقيقه في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
  5. أزاله الغسيل قمي دون تعطيل ظهاره عن طريق الشفط بعناية باستخدام الزجاج المعقمة ماصه pipet-x باستور والعقيمة P200 ماصه pipet-x غيض مرتبطة بمضخة الطموح الذي يخلق فراغا في زجاجه جمع. في هذه المرحلة ، يجب ان يكون هناك القليل من السائل المتبقي علي سطح قمي ممكن لاستعاده واجهه الهواء والسائل.
  6. احتضان الخلايا لمده 30 دقيقه اضافيه في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.

2-قياس الخلفية

  1. قم بتشغيل قارئ اللوحة والكمبيوتر.
  2. افتح لوحه التحكم.
  3. انقر علي شراره 10M، وفتح التحكم في درجه الحرارة وتعيين إلى 37 درجه مئوية. فتح السيطرة علي الغاز وتعيين CO2 إلى 5 ٪.
  4. الانتظار حتى درجه الحرارة و CO2 قد وصلت إلى أهدافها.
  5. فتح درج القارئ لوحه ، ادراج الرطوبة كاسيت مليئه 6 مل من dH2س علي كل جانب. ضمان الغطاء والجزء السفلي من لوحه نظيفه-ان لم يكن ، نظيفه مع 70 ٪ من الايثانول علي قطعه من الانسجه-ووضع لوحه في كاسيت الرطوبة.
    ملاحظه: في جميع انحاء التجربة ، يتم الاحتفاظ بغطاء لوحه ثقافة الانسجه علي لوحه وأزالها فقط عند أضافه المخدرات أو تغيير الوسط الموجب ، والتي يتم تنفيذها في الانسجه ثقافة النسيج غطاء التدفق للحفاظ علي الثقافات في بيئة معقمه.
  6. افتح محرر أسلوب سبارك وقم باعداد المعلمات علي البرنامج كما يلي:
    1. حدد قالب لوحه المناسبة (ل 6.5 مم قطرها الدعم شبه نفاذيه ، حدد لوحه 24 جيدا) والآبار التي سيتم رصدها خلال هذه التجربة.
    2. أضافه درجه الحرارة و CO2 لوحه التحكم وتعيينها إلى 37 درجه مئوية و 5 ٪ ، علي التوالي. القراد الانتظار لدرجه الحرارة/ صناديق الغاز.
    3. أضافه لوحه حلقه الحركية وحدد المدة كنوع حلقه وتعيينها إلى 5-10 دقيقه. اختر غير معرف كنوع الفاصل الزمني لتمكين القراءة المستمرة.
      ملاحظه: يعتمد توقيت القراءة المستمرة علي عدد الآبار/الظروف. 5 دقائق طويلة بما يكفي ل6-12 الآبار في حين ان لوحه كامله تحتوي علي 24 الظروف سوف تتطلب 10 دقيقه من القياسات المستمرة.
    4. ضمن حلقه الحركية ، أضافه اثنين من "كثافة الفلوري" لوحات ، وذلك باستخدام وظيفة السحب والإسقاط ، التي سيتم اعدادها لحساسية الأس الهيدروجيني والاصباغ الفلورية غير الحساسة pH علي التوالي. تعيين الاثاره والانبعاثات الموجية إلى 560 و 590 نانومتر ، علي التوالي ، لصبغه حساسة لدرجه الحموضة و 495 و 520 نانومتر ، علي التوالي ، لصبغ الحموضة غير الحساسة.
    5. تعيين عدد ومضات إلى 30 و z-الموقف إلى 33200 لكل فلوكوفيري.
      ملاحظه: تعتمد إعدادات الوضع z والكسب علي خصائص قارئ اللوحة. تعيين الكسب يدويا إلى القيمة التي ستعطي عددا كافيا من التهم بحيث سيتم انتقاؤها الاختلافات بين العينات ولكن منخفضه بما يكفي بحيث أضافه ناهض لن تولد القيم من نطاق الكشف.
    6. تعيين قراءه متعددة لكل بئر للمستخدم تعريف كنوع دائره من 3 × 3 حجم مع حدود 4750 μm.
  7. انقر فوق زر البدء لاجراء قياس الخلفية وموافق للتاكد من غطاء كاسيت الرطوبة في مكانها.
  8. في نهاية القياس ، وفتح درج القارئ لوحه ، واتخاذ لوحه خارج و Pplace الزنزانة الجلوس مره أخرى في الحاضنة اثناء اعداد حل مزيج صبغ الفلورسنت.
  9. اعداد الحل مزيج صبغ الفلورسنت عن طريق أضافه 2 μl من 1 مغ/مل ديديكسين-المقترنة الحموضة الحساسة (phsens) صبغ الفلورسنت إلى 0.2 μl من 10 ملغ/مل ديكستين-إلى جانب الحموضة غير الحساسة (phsens) صبغ الفلورسنت و 0.8 μl من hco العقيمة3- krb لنهائي حجم 3 μL لكل حاله.
    ملاحظه: يجب اعداد الحجم الكلي لمحلول خلط الصبغة لآبار n + 1 إذا كان هناك بين 1 و 10 عينات ، أو n الآبار + 2 إذا كان هناك بين 11 و 24 عينات. يتم أعاده تشكيل الاصباغ التي تمت تصفيتها بالاضافه اليها في محلول hco3- krb المعقم والمصفي والمخزن عند-20 درجه مئوية. اي ماده كيميائية يستطيع كنت أضفت في هذا مرحله ل 16-24 h حضانة فتره37 علي السطح قمي. وينبغي اعداد المواد الكيميائية ك 0.1 x ، حيث ان الحجم النهائي ، بعد امتصاص السوائل الزائدة من قبل الثقافة ، سيكون حوالي 0.3 μL للحصول علي دعم شبه نفاذيه قطرها 6.5 مم.
  10. أضافه بعناية 3 μl من مزيج صبغ (انظر 2.8) إلى سطح قمي من الخلايا واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.

3. قياس الحركية

  1. كرر الخطوات 2.1 إلى 2.4 لاعداد قارئ لوحه.
  2. انقر علي أيقونه Open وحدد ملف الأسلوب المستخدم لقياسات الخلفية
  3. في لوحه حلقه الحركية ، والحفاظ علي نوع حلقه كما المدة وتعيينها إلى 8 ساعات. تغيير نوع الفاصل الزمني إلى ثابت وتعيينه إلى 5 دقائق. الحفاظ علي لوحات الكثافة الفلورية نفسها بالنسبة لقياسات الخلفية
    ملاحظه: يتم تعيين نوع الفاصل الزمني لقياسات الخلفية إلى "غير معرف" من أجل السماح بالقراءة المستمرة. للتجارب الحركية وكذلك والمعايرة ، يتم تعيين نوع الفاصل الزمني إلى "ثابت" مع فاصل زمني من 5 دقائق. ويمكن تعديل هذا وفقا لتصميم التجربة وعدد من الشروط.
  4. فتح درج القارئ لوحه ؛ ادراج شريط الرطوبة مليئه 6 مل من dH2س علي كل جانب. ضمان الغطاء والجزء السفلي من لوحه نظيفه-ان لم يكن ، نظيفه مع 70 ٪ الايثانول علي قطعه من الانسجه-ووضع لوحه في كاسيت الرطوبة ، مع تغطيتها.
  5. بدء قراءات مضان بالنقر علي أبدا. انقر فوق OK بعد ضمان غطاء الدرج الرطوبة في مكان.
  6. بعد n دورات ، عاده بين 12 و 24 ، وهو ما يعادل 1 إلى 2 ساعة ، انقر فوق إيقاف مؤقت لمقاطعه التجربة. تاخذ لوحه خارج وتطبيق اي المخدرات/ناهضات باسولاتيرالي إلى عينات مختلفه.
    ملاحظه: عندما يتم إخراج الخلايا من القارئ لوحه ، CO2 الهروب وهذا سيحفز زيادة في الأس الهيدروجيني كما هو مبين في انخفاض في الحموضة الحساسة صبغ فلوري. هذا CO2-الناجمة عن تغيير الأس الهيدروجيني يعكس في غضون 10-15 دقيقه بعد وضع الثقافات مره أخرى في القارئ لوحه.
  7. وضع لوحه مره أخرى في شريط الرطوبة علي الدرج ، وتغيير موضع غطاء كاسيت الرطوبة وانقر فوق متابعه من أجل مزيد من تسجيل الرقم الهيدروجيني لل ورصد تاثير المخدرات/منبات علي الأس الهيدروجيني.

4. في الموقع معايره الأس الهيدروجيني

  1. خذ لوحه من القارئ لوحه.
  2. يستنشق الوسط المماثل/الحل.
  3. أضافه 750 μl و 1 μl من حلول منحني القياسية المخزنة بشكل كبير إلى المقصورة الاساسيه وسطح قمي ، علي التوالي.
    ملاحظه: تحتوي حلول المنحني القياسية المخزنة بدرجه عاليه علي (مم) كلوريد الصوديوم (86) ، KCl (5) ، CaCl2 (1.2) ، mgcl2 (1.2) ، NAHEPES أو MES أو تريس (100 ملم). استخدام MES لحلول العازلة مع درجه الحموضة اقل من 7 ، NaHEPES لحلول الأس الهيدروجيني 7-7.5 و تريس للحل مع pH 8. المشبك الأس الهيدروجيني إلى القيمة المطلوبة باستخدام HCl.
  4. التبديل CO2 قباله علي قارئ لوحه أو تعيينها إلى 0.1 ٪ ووضع لوحه مره أخرى في كاسيت الرطوبة.
  5. اعداد قارئ لوحه مع نفس المعلمات كما هو موضح سابقا ولكن مع عدم وجود CO2 كما في الخطوة 3.2.
  6. بدء قراءات مضان ، كل 5 دقائق لمده 1-1.5 ساعة.

5. تقييم تاثير تركيز الصبغة وحجم التعليق علي بيانات المعايرة

  1. اعداد ما يكفي من الصبغة الحساسة لدرجه الحموضة وغير حساسة لتسجيل الفلورية في الحد الأدنى من 4 قيم الحموضة مختلفه في 3 احجام مختلفه.
    ملاحظه: هنا ، تم اعداد مزيج 1 مع 26 μL من حساسية الأس الهيدروجيني (1 مغ/مل) و 2.6 μL من الحساسية الهيدروجينية (10 ملغ/مل) ومزيج 2 مع 13 μL من الحساسة لدرجه الحموضة (1 ملغ/مل) و 1.3 μL من الحموضة-غير متحسسه (10 ملغ/مل).
  2. توزيع 2.2 μL أو 1.1 μL من مزيج 1 أو مزيج 2 ، علي التوالي ، إلى 12 الآبار من لوحه 96 جيدا وأضافه ما يكفي من حلول المعايرة للحصول علي كميات نهائيه من 50 ، 100 أو 200 μL وتخلط جيدا.
    ملاحظه: في هذا الاعداد ، سيتم تسجيل التهم الفلورية لتركيزات الاصباغ من 5 ميكروغرام/مل (في 200 μL) ، 10 ميكروغرام/مل (في 100 أو 200 μL) ، 20 ميكروغرام/مل (في 50 أو 100 μL) أو 40 ميكروغرام/مل (في 50 μL).
  3. تشغيل قارئ لوحه علي ، تعيين درجه الحرارة إلى 37 درجه مئوية وادراج لوحه في قارئ لوحه. لا تقم بتشغيل وحده تحكم CO2 علي.
    ملاحظه: بما ان هذا هو تجربه قصيرة ويتطلب فقط ما يكفي من الوقت لتتوازن درجه الحرارة ، لا يلزم كاسيت الرطوبة.
  4. ضبط z-موقف والحصول علي لوحه بئر 96 واستخدام نفس المعلمات كما للتجربة القيام به علي دعامات شبه نفاذيه.

6-تحليل البيانات

  1. حفظ كافة البيانات إلى جداول المعلومات وإنشاء ملف جديد.
  2. في ملف الخلفية ، حدد كافة البيانات المتوسطة لكل نموذج/شرط لكل من الأطوال الموجية والنسخ واللصق إلى الملف الجديد. احسب الخلفية المتوسطة لكل بئر وكل طول موجي.
  3. كرر هذا مع المعايرة والبيانات الحركية وطرح الخلفية من كل نقطه البيانات لكل الطول الموجي.
  4. لكل نقطه زمنيه وكل عينه ، وحساب النسبة بين الحساسية الهيدروجينية والدرجة الحموضة غير الحساسة.
  5. إذا تم الحصول علي جميع العينات من متبرع فردي ، احسب متوسط النسب في كل نقطه زمنيه من منحني المعايرة
    ملاحظه: من المهم لتوليد العديد من المنحنيات المعايرة كمانحين أو الحلول المماثلة. في الواقع ، يمكن ان تؤثر هذه المعلمات علي قراءات الخلفية أو معدل امتصاص السائل ، والتي بدورها سوف تؤثر علي تركيز الصبغة التالي درجه الحموضة المحسوبة.
  6. لكل نقطه زمنيه ، توليد منحني قياسي من النسب ، بالتامر قيم الأس الهيدروجيني المعروفة علي محور س ونسب علي محور ص.
  7. تحديد النقطة الزمنيه التي تكون فيها النسب مستقره ، وتناسب خط انحدار خطي والحصول علي المعادلة لهذا البند.
  8. من البيانات الحركية ، احسب درجه الحموضة لكل نقطه زمنيه وارسم الأس الهيدروجيني علي محور y والوقت علي محور x
    ملاحظه: يمكن حساب الراحة/pH القاعدية عن طريق متوسط نقاط البيانات علي قياس مستقر من درجه الحموضة قبل أضافه اي ناهض أو اي تدخل آخر. تاثير ناهض يمكن ان تتميز بحساب الفرق في درجه الحموضة قبل وبعد (مقدار معين من الوقت) العلاج أو عن طريق تركيب منحني غير خطيه إلى نقاط البيانات مباشره بعد التدخل. سيعطي هذا معلومات اضافيه حول1/2 t والقيمة القصوى. وأخيرا ، يمكن أيضا الحصول علي معدلات التحمض أو القلوية من منحدر خط مستقيم مزود بالنقاط الاولي بعد التدخل.

Representative Results

تمكن التقنية الموصوفة أعلاه القياس الديناميكي لدرجه الحموضة من الدرجة الاولي في ما يصل إلى 24 ثقافة hAECs أساسيه منفصلة. ويبين الشكل 1 تخطيطيا للخطوات الرئيسية والمعدات التي تم اعدادها. يتم وضع الخلايا المحملة بين عشيه وضحيها في CO2 ودرجه الحرارة التي تسيطر عليها قارئ لوحه التي يتم تسجيلها من الاصباغ الحساسة الحموضة المقترنة ديكسديكسين والحساسية ph كل 5 دقيقه.

Figure 1
الشكل 1: الرسم التخطيطي لطريقه قياس الأس الهيدروجيني. بعد غسل الثقافات وأداء القراءة في الخلفية ، يتم تحميل الخلايا الظهاريه مجري الهواء البشري الاوليه (hAECs) أسل مع المخلوطة الحساسة لدرجه الحموضة الحساسية والحموضة التي لا تتحسس الأس الهيدروجيني خليط صبغ بين عشيه وضحيها في 37 °C ، 5 ٪ CO2. في اليوم التالي ، يتم نقل لوحه إلى درجه الحرارة و CO2-التحكم لوحه القارئ والفلورية من كلا الاصباغ يتم تسجيلها مع مرور الوقت. بعد التجربة ، يتم اجراء معايره في الموقع وتحليل البيانات وتقديمها باعتبارها الأس الهيدروجيني مع مرور الوقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

أولا ، حققنا في تاثير احجام مختلفه وتركيزات صبغ علي التهم فلوري التالي علي نسبه 560/495. في الواقع ، والغرض من أضافه حساسية الأس الهيدروجيني لصبغه حساسة لدرجه الحموضة هو تصحيح للتغير في التحميل أسل. ومع ذلك ، كان من المهم لاختبار هذا الافتراض وتقييم ما إذا كنا نستطيع استخدام منحني المعايرة القياسية التي أجريت في غياب الخلايا في لوحه بئر 96 لجميع التجارب وأنواع الخلايا. نحن رصدت التهم مضان أكثر من 1 ح في 50 ، 100 أو 200 ميكرولتر من حلول المعايرة (في الأس الهيدروجيني 5.5 ، 6.5 ، 7 أو 8) تحتوي علي 5 ، 10 ، 20 أو 40 ميكروغرام/مل من الاصباغ. وترد النتائج في الشكل 2a-C، وتبين ان لنفس الرقم الهيدروجيني ونفس تركيز الاصباغ ، وذكرت phsens/phsens نسبه الانبعاثات (560/495 علي محور ص) تختلف اعتمادا علي حجم (الشكل 2a). بالاضافه إلى ذلك ، في نفس درجه الحموضة ونفس الحجم ، وتركيزات صبغ مختلفه توفر قيم نسبه مختلفه (الشكل 2B). ولذلك ، فان التغييرات في حجم أو صبغ تركيز تؤثر علي القيمة المطلقة لدرجه الحموضة محسوبة من نسبه الانبعاثات. يظهر الشكل 2C ان الوقت اللازم لتاخيرمن درجه الحرارة حوالي 15-20 دقيقه. لتاكيد تاثير تركيز الصبغة والحجم علي نسب الانبعاثات ، سجلنا مضان من الاصباغ المحملة في القائمة الاوليه لغير CF و CF hAECs في الموقع. ثم قمنا باجراء المعايرة وحللنا النتائج بواسطة (1) توليد منحني قياسي عالمي واحد من جميع العينات أو (2) توليد منحنيين قياسيين مستقلين لكل نوع من أنواع الخلايا (غير CF و CF). وتم بعد ذلك رسم الرقم الهيدروجيني لكل من نوعي الخلية مع الزمن (الشكل 3 ا، ب) والمتوسط (الشكل3 ج). وأظهرت قيم الأس الهيدروجيني التي تم الحصول عليها من منحني قياسي عالمي واحد فرقا كبيرا بين الثقافات غير cf و cf (الشكل 3a، C) في حين ان الرقم الهيدروجيني لم يكن مختلفا بشكل ملحوظ بين cf وغير cf haecs عندما تم حساب الأس الهيدروجيني من المنحنيات القياسية المستقلة (الشكل 3 ب ، ج). وتظهر هذه النتائج اهميه توليد منحنيات معايره مستقله لكل تجربه وداخل التجربة ، لكل عينه من المتبرعين ، حيث انه عندما كان متوسط منحنيات المعايرة معا ، تم العثور علي قيم نسبه pHsens/Phsens اعلي في ثقافات CF ، مما يشير إلى درجه حموضه أكثر حمضيه (الشكل 3C).

Figure 2
الشكل 2: تحسين معايره الرقم الهيدروجيني في المختبر. تم تحميل كميات مختلفه من الحلول من الأس الهيدروجيني المعروفة والتي تحتوي علي تركيزات صبغ مختلفه علي لوحه بئر 96 وسجلت فلوري علي مدي 1 ح. تاثير الحجم (ا) وتركيز الصبغة (ب) علي نسب الفلورية. تم رسم النسب ضد الأس الهيدروجيني للنقطة الزمنيه 24 دقيقه. (ج) تم حساب منحدر التغير في الفلورية لكل محلول ورسم كداله للوقت (في الدقيقة). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التحسين الأمثل لتحليل معايره الرقم الهيدروجيني علي الدرجة الاولي في الموقع . (ا) الآثار التمثيلية لدرجه الحموضة التي تم الحصول عليها من منحني قياسي واحد متوسط البيانات من الثقافات غير CF و cf. (ب) الآثار التمثيلية لدرجه الحموضة التي يتم الحصول عليها من المنحني المعياري المستقل الذي يتم اجراؤه علي ثقافات غير CF أو cf. تم حساب كل مجموعه بيانات من منحني المعايرة الخاص بها. (ج) تقييم الاختلافات في الأس الهيدروجيني بين الثقافات غير CF و cf كداله علي كيفيه اجراء المعايرة. البيانات تمثل المتوسط ± SEM من n = 3 التجارب, 2-الطريقة ANOVA, اختبار مقارنات Sidak المتعددة). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

من أجل المزيد من التحقق من صحة أسلوبنا ، ثم طلبنا السيطرة الايجابيه لإثبات ان هذه التقنية كانت قادره علي الكشف عن التغيير "المتوقع" في الأس الهيدروجيني. كما وجود الأكثر الحمضية في الخلايا CF لا تزال مثيره للجدل, استخدمنا المخيم ناهض فورسكولين, كشرط السيطرة ايجابيه, لتحفيز hco3- إفراز من خلال cftr. النتائج المتوقعة سوف تظهر القلوية الناجمة عن فورسكولين من الخلايا الوراثية الناتجة في غير CF الخلية التي من شانها ان تنخفض إلى حد كبير أو إلغاؤها في خلايا CF اعتمادا علي شده الطفرات. الشكل 4A يظهر اثار تمثيليه من الرقم الهيدروجيني من الخلايا غير CF و cf مع مرور الوقت والشكل 4a يظهر متوسط البيانات من الأس الهيدروجيني قبل وبعد العلاج مع فورسكولين في كل من أنواع الخلايا. يمكننا الحصول علي معلومات مختلفه من هذه النتائج. أولا ، كما هو مبين بالفعل في الشكل 3 ب ، ج، لم يكن الرقم الهيدروجيني لل (أسل) اليستريح مختلفا بين النعت غير CF و cf. الثانية, وأظهرت أول 3-4 الوقت النقاط بعد التوقف التجريبي لعلاج الخلايا مع فورسكولين, زيادة كبيره في درجه الحموضة التي استعادت داخل ~ 15 دقيقه. ويرجع ذلك إلى انخفاض في تركيز CO2 بين قارئ لوحه (5 ٪) ومجلس الوزراء سلامه الانسجه الثقافة (~ 0 ٪). وفقا لهندرسون هاسيلبال المعادلة ، ودرجه الحموضة من 7 في 5 ٪ CO2 البيئة يعادل تركيز hco3- من ~ 9.3 مم. عندما تتم أزاله الخلايا من قارئ لوحه ، وانخفاض في تركيز CO2 إلى 0 ٪ سوف يؤدي نظريا إلى زيادة في درجه الحموضة من > 8. ويبين الشكل 4A ان الرقم الهيدروجيني لل أسل ارتفع إلى ~ 7.8 التي يمكن تفسيرها بمرور الوقت أعاده تموضع لوحه في قارئ لوحه (اي, في 5% CO2 البيئة). وأخيرا ، كما هو متوقع ، أضافه المقابل 10 μM فورسكولين (Fsk) زيادة كبيره في الأس الهيدروجيني في الثقافات غير CF فقط. كما انه قد تبين من قبل مجموعات مختلفه ان هناك فرقا في الدولة ثابته الأس الهيدروجيني بين CF و غير CF النعت ، أردنا ان مزيد من التحقيق في الغياب الظاهر للفرق pH في تجاربنا ودور CFTR. للقيام بذلك نحن قبل احتضان الثقافات غير CF مع مثبطات CFTR محدده ، CFTRinh172 (172). كما ذكر في القسم البروتوكول 2.8 ، تم اعداد مزيج الصبغة كما ذكر أعلاه وتم أضافه المثبط بتركيز 0.1 X = 2 μM. وفقا ل الأدب, [أسل] ارتفاع من [نون-سف] خلايا تقريبا 10 [ميكرون]. في دعم شبه نفاذيه من 6.5 ملم قطرها ، والحجم النظري لل ، التالي π × 3.252 = 0.3 μl. من خلال أضافه 3 μL من صبغ + 172 في 2 μM, تركيز المثبط, بعد امتصاص السوائل الزائدة, سيكون نظريا 20 μM (1x, التركيز المطلوب). اثار الممثل في الشكل 4C وملخص يعني في الشكل 4c تبين ان 172 لم يقلل من الراحة الأس الهيدروجيني ولكن لم يمنع الزيادة المستحثة فورسكولين في الأس الهيدروجيني ، التالي تاكيد نتائجنا التي تم الحصول عليها من غير cf مقابل cf الثقافات والمزيد من التحقق من تقنيه لدينا.

Figure 4
الشكل 4: قياس الأس الهيدروجيني الديناميكي في الاستجابة لتنشيط CFTR بواسطة فورسكولين. (ا) اثار تمثيليه لتاثير فورسكولين (fsk, 10 μM) علي حركيه الأس الهيدروجيني مع مرور الوقت في غير CF و Cf haecs. البيانات تمثل المتوسط ± SEM من n = 3 التجارب. (ب) ملخص لتاثير fsk علي الأس الهيدروجيني في الثقافات غير CF و cf. تمثل البيانات متوسط ± SD من n = 69 الثقافات غير CF و 35 الثقافات CF (2-الطريقة ANOVA ، اختبار المقارنات المتعددة Sidak). (ج) اثار تمثيليه لتاثير cftrinh172 (172 ، 20 μM) علي الزيادة المستحثة بالنسبة لل fsk في الأس الهيدروجيني في غير CF haecs. البيانات تمثل المتوسط ± SEM من n = 5 التجارب. (د) ملخص للتاثير ال172 علي القلوية التي يسببها fsk في الثقافات غير CF. البيانات تمثل المتوسط ± SEM من n = 5 التجارب (2-الطريقة ANOVA ، اختبار المقارنات المتعددة Sidak). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

وأخيرا ، وكما ورد في القسم 6.8 من البروتوكول ، يمكن حساب معدلات التحمض/القلوية بتركيب انحدار خطي إلى النقاط الزمنيه الاوليه بعد التدخل. ويبين الشكل 5 الف ان أزاله الحل الذي يحتوي علي hco3 المقابل (hco3- krb) واستبداله بمحلول المخزن المؤقت hepes, في غياب CO2, المستحثة تحمض ملحوظ من الأول. وهذا يتسق مع عدم وجود hco3- تثبيط transepithelial hco3- إفراز, الذي يسمح إفراز البروتون التاسيسيه من قبل هذه الخلايا الهوائية للحد باطراد الأس الهيدروجيني15, 17. ومن المثير للاهتمام ان المعدل الاولي لتحمض الخلايا غير CF كان إبطا بكثير من الثقافات CF (الشكل 5 ب).

Figure 5
الشكل 5: التغيرات الديناميكية في الرقم الهيدروجيني للغة الأس ردا علي hco3- أزاله. (ا) اثار تمثيليه تبين تاثير hco3- أزاله علي حركيه الأس الهيدروجيني مع مرور الوقت في غير cf و cf haecs. وتم الحصول علي المعدلات الاوليه للتحمض عن طريق منحدر خط مستقيم مزود ب 7 نقاط زمنيه بعد أزاله hco3 . تمثل البيانات الوسائل ± SEM من n = 6 و 7 التجارب علي الثقافات غير CF و CF علي التوالي. (ب) موجز للمعدلات الاوليه للتحمض التالية لأزاله الحموضة (hco3 ). تمثل البيانات الوسائل ± SEM من n = 6 و 7 التجارب علي الثقافات غير CF و CF علي التوالي (اختبار مان ويتني). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هنا نقدم بروتوكولا مفصلا لقياس ديناميكية من الأس الهيدروجيني في الخلايا الظهاريه مجري التنفس البشري الاولي. وتشمل الخطوات الحاسمة غسل المخاط قباله سطح قمي من الخلايا ، وقياس وطرح الخلفية باستخدام نفس المعلمات كما في التجربة ، وتحسين الموقف z والحصول علي وأداء معايره الأس الهيدروجيني في الموقع.

الخطوة الاولي من غسل الخلايا حاسمه كطبقه سميكه من المخاط قد (ط) منع الاصباغ من الوصول إلى طبقه بيريسيلياري (PCL) و (2) تاخير أو منع الكشف عن التغيرات في فلوري استجابه لناهضات/مثبطات. وقد وضعت طريقتنا لدراسة كيفيه الاساسيه haecs التضمين نشاط hco3- وH + الناقلين في استجابه لناهضات. في حين انه سيكون من المثير للاهتمام للتحقيق في كيفيه التغييرات في PCL الأس الهيدروجيني تتعلق التغيرات في الحموضة المخاط, هناك حاجه إلى مزيد من التطوير لهذا البروتوكول, بما في ذلك استخدام الوزن الجزيئي المختلفة-dextrans إلى الهدف بشكل متفاوت 2 طبقات و z-بالمسح من خلال الجميع.

ويعد قياس الخلفية خطوه هامه أخرى في هذا البروتوكول. السطح قمي من التمايز الكامل الابتدائية المسالك الهوائية ونادرا ما تكون مسطحه تماما والتي سوف تؤثر علي مسار الضوء التالي الخلفية. التاكد من ان قراءات الخلفية يتم تنفيذها في نفس النقاط المحلية من الآبار كما في اثناء التجربة أمر بالغ الاهميه لاستنساخ واستقرار التسجيلات.

تحسين الوضع z والكسب هي الخطوات الضرورية التي تحتاج إلى اعداد لكل تركيز مختلفه من صبغ الفلورسنت التي سيتم استخدامها. وهذا من شانه ان يمنع ارتفاع التباين بين التجارب. وبمجرد الاعداد ، فان فحصنا يوفر نتائج مستقره وقابله للتكرار. واحده من الأسباب لذلك هو ان تضاف الاصباغ علي سطح قمي علي الخلايا في حجم صغير من السوائل التي يتم امتصاصها بسهوله من قبل ظهاره ، وترك المسمي المتجانسة أسل. طريقه أخرى لوصمه عار ، التي يمكن ان تكون ناجحه علي قدم المساواة ، وتستخدم مسحوق جاف أو "تعليق" في القوات الخاصة. علي الرغم من ان هذا قد يكون الوقت--إنقاذ (كما يتم اجراء التجارب عاده في غضون 2 h) ، فمن غير المرجح ان الاصباغ الجافة جعل تماما في أسل التالي قد شكل كتل. التالي سيتم العثور علي تركيزات مختلفه من صبغه حساسة لدرجه الحموضة علي سطح الخلايا الظهاريه.

وتعد معايره درجه الحموضة في الموقع خطوه هامه من أجل الحصول علي نتائج دقيقه وقابله للتكرار. وكما هو مبين وموضح في قسم النتائج ، فان الاختلافات في احجام الكميات الكترونيه ستؤثر علي العدد الفلوري التالي علي قيم الحموضة المحرفة (الشكل 2 والشكل 3). في حين ان مجموعات مختلفه قد نشرت في السابق قياسات الأس الهيدروجيني ، وقد تم الحصول علي مجموعه واسعه من القيم حتى بين الدراسات المختلفة التي نشرتها نفس المجموعة8،17. ونحن نعتقد انه من خلال القيام بالمعايرة في الموقع ، ستصبح النتائج أكثر قابليه للتكرار. بالمقارنة مع غيرها من تقنيات معايره الأسالهيدروجيني ، والتي تستخدم عاليه ك +/نيجري (أو العديد من ionophores) طريقه لتوليد منحني القياسية28،29،30، والفحص المقدمة هنا لديه ميزه ان ، طالما يتم تنفيذ كل خطوه في مجلس الوزراء السلامة ، والخلايا المستخدمة في الأس الهيدروجيني يمكن غسلها ، والاحتفاظ بها وأعاده استخدامها للتجارب الأخرى شريطه ان العلاجات التي أجريت لا تؤثر بشكل لا رجعه فيه علي الخلايا الظهاريه.

وقد قدم تطوير والاستفادة المثلي من هذا الفحص نتائج استنساخه ، ونحن نعتقد ان هذه الطريقة سوف تساعد المجموعات الأخرى مع قياس الأس الهيدروجيني الخاص بهم. ومع ذلك ، يحتوي هذا الأسلوب أيضا بعض القيود بسبب اعداد ونوع الخلايا التي يتم استخدامها. رصد الأس الهيدروجيني علي مدي فتره زمنيه أطول من التي قدمت هنا (> 8-10 ح) قد يكون من الصعب كما بيئة عاليه الرطوبة طويلة الأجل قد تضر المعدات وحقيقة ان معظم القراء لوحه تقدم فقط خيار لتسجيل قراءات الحركية علي مدي مقدار معين من الوقت (عاده 24 ساعة). استخدام haecs الابتدائية متمايزة تماما أمر حاسم في الطريقة التي مراحل مختلفه من التمايز سوف تؤثر علي التعبير عن hco3- وH + الناقلين. ومع ذلك ، هناك تقريبا اي امكانيه للسيطرة بدقه علي حجم الخلية في الخلايا المزروعة في ظل ظروف الفيلم رقيقه. وكما ذكر في أقسام البروتوكول والنتائج ، فان التغيرات في الحجم ستؤثر علي نسبه الفلورية ومن الضروري للأسف ان نفترض انه في الخلايا المزروعة من فرد واحد ، مصنفه في نفس اليوم علي دعامات مختلفه شبه منفذه ، مجلدات أسل ستكون هي نفسها. الناشئة عن هذا القيد ، اي ناهض أو مثبط من شانها ان تؤثر علي إفراز السوائل أو الامتصاص سوف تؤثر علي حجم أسل ويفترض نسب الفلورية. ومع ذلك ، في فحص لدينا ، يتم تنفيذ منحني المعايرة في نهاية التجربة ، لذلك يمكننا ان نفترض ان هذه التغييرات في حجم سوف تؤثر علي نسب المعايرة بنفس الطريقة كما هو الحال اثناء التجربة الحركية. لهذا السبب نحن ننصح المجموعات التي من شانها ان تكون مهتمة في تطوير هذا الفحص ، لاستخدام ما لا يقل عن 2-3 نسخ متماثلة لكل حاله اختبار لان هذا سيسمح لإنشاء منحني قياسي لكل شرط.

هنا نقدم بسيطه ، شبه الألى ، الفحص الذي يسمح قياس الوقت الحقيقي لدرجه الحموضة سطح الغشاء المخاطي في ظل ظروف رقيقه الفيلم. وهي تتمتع بالقدرة علي التحقيق في الاستجابات الديناميكية لدرجه الحموضة في العديد من الثقافات بطريقه شبه متزامنة تسمح باجراء مقارنات بين المانحين وداخلهم. رفع مستوي هذا الأسلوب إلى شكل لوحه بشكل جيد 96 باستخدام نظام الاستقطاب (لوحات الهيئة 96 جيدا)38 سيوفر إنتاجيه اعلي حتى كفحص اكتشاف المخدرات. وعلاوة علي ذلك ، لقد أظهرنا كيف يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة التاثير الحاد لناهضات علي الأس الهيدروجيني ، ونحن قد نشرت بالفعل ان هذه الطريقة يمكن استخدامها لدراسة تاثير طويل الأجل من مثبطات مضخة البروتون قمي علي CF haecs أسل39. كما ثبت الأس الهيدروجيني لتنظيم العدوى, التهاب, اللزوجة المخاط والنقل الأيوني, تحديد الأهداف الجزيئية التي يمكن ان تزيد من درجه الحموضة ستكون قيمه في مجالات البحث من امراض الرئة المزمنة وهذه التقنية من المحتمل ان تسهل تطوير فحص المخدرات في نهج الطب الشخصي. وأخيرا ، نظرا لان تقلبات في قاعده التوازن الحمضية يلعب دورا رئيسيا في الامراض الأخرى ، يمكن تكييف هذا البروتوكول ، مع خطوات التحسين ، للمعدات المختلفة (لوحه القراء) وأنواع الخلايا ، مثل الخلايا الظهاريه الأخرى. الحموضة خارج الخلية هو سمه من سمات السرطان40،41،42 وهذا الفحص يمكن ان تساعد في تحديد كيفيه إنتاج الأورام الصلبة منخفضه الحموضةe أو يمكن استخدامها كفحص المخدرات الانتاجيه المنخفضة استعاده التوازن الهيدروجيني. المثل ، وفيما يتعلق بامراض المسالك التنفسية المزمنة ، فانها يمكن ان توفر أيضا منصة لتطوير نهج الطب الشخصي.

Disclosures

ميغا بايت: غير مرتبطة بهذا العمل: منح بحثيه بقياده محقق من شركه فايزر وشركه روش للتشخيص ؛ رسوم المتحدث المدفوعة إلى جامعه نيوكاسل من نوفارتس ، والتشخيص روش و TEVA. نفقات السفر إلى الاجتماعات التعليمية من بواهرنجر انغلهايم والمستحضرات الصيدلانية الذروة.

Acknowledgments

وقد حظي هذا العمل بدعم اثنين من منح مركز البحوث الاستراتيجية التابع للصندوق الاستئماني CF (SRC003 و SRC013) ومنحه الثقة في المفاهيم الصادرة عن مجلس البحوث الطبية (MC_PC_15030). تم دعم JG من قبل منحه من مؤسسه البحوث الطبية (MRF-091-0001-RG-GARNE). [مب] كان ساندت ب [مديكل رسرش] طبية [كلينتيمن] عالم زمالة ([مستر/M008797/1]). وقد تم دعم IH من قبل زمالة التدريب السريري الثقة Wellcome (203520/Z/16/Z). تم دعم البحث من قبل المعهد الوطني للبحوث الصحية نيوكاسل مركز البحوث الطبية الحيوية مقرها في مستشفيات نيوكاسل المؤسسة الاستئمانية للصحة وجامعه نيوكاسل. الآراء المعرب عنها هي تلك التي للمؤلف (المؤلفين) وليس بالضرورة تلك الخاصة بالدائرة الصحية الخاصة أو المعهد النيجيري للصحة أو وزاره الصحة. تم دعم الخلايا الاوليه من الدكتور رانديل من قبل منحه مؤسسه التليف الكيسي (BOUCHE15R0) ومنحه المعاهد القومية للصحة (P30DK065988).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Starlab E4780-1226
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3470
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
CFTRInh172 RnD Systems (Tocris) 3430 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran ThermoFisher D22910 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran ThermoFisher P10361 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Forskolin RnD Systems (Tocris) 1099 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM
Greiner CELLSTAR 96 well plates Cellstar 655180
Humidity cassette TECAN 30090495
KCl Sigma Aldrich P9541
MES Sigma Aldrich M3885
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S9888
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NaHepes Sigma Aldrich H3784
Plate reader: TECAN SPARK 10M TECAN 30086375
Tris Sigma Aldrich T1503
Universal pH electrodes DJ 113 VWR 662-1385

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 150 (1), 271-281 (1994).
  2. Roomans, G. M., et al. Measurements of airway surface liquid height and mucus transport by fluorescence microscopy, and of ion composition by X-ray microanalysis. Journal of Cystic Fibrosis. 3, Suppl 2. 135-139 (2004).
  3. Haq, I. J., Gray, M. A., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M. Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis: pathophysiology and therapeutic targets. Thorax. 71 (3), 284-287 (2016).
  4. Martin, S. L., Saint-Criq, V., Hwang, T. C., Csanady, L. Ion channels as targets to treat cystic fibrosis lung disease. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2S), S22-S27 (2018).
  5. Garland, A. L., et al. Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15973-15978 (2013).
  6. Torres, I. M., Patankar, Y. R., Berwin, B. Acidosis exacerbates in vivo IL-1-dependent inflammatory responses and neutrophil recruitment during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (2), L225-L235 (2018).
  7. Berkebile, A. R., McCray, P. B. Effects of airway surface liquid pH on host defense in cystic fibrosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 124-129 (2014).
  8. Tang, X. X., et al. Acidic pH increases airway surface liquid viscosity in cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 879-891 (2016).
  9. Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
  10. Hunt, J. F., et al. Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161, 694-699 (2000).
  11. Kostikas, K., et al. pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (10), 1364-1370 (2002).
  12. Ojoo, J. C., Mulrennan, S. A., Kastelik, J. A., Morice, A. H., Redington, A. E. Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis. Thorax. 60 (1), 22-26 (2005).
  13. Cho, D. Y., Hajighasemi, M., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Proton secretion in freshly excised sinonasal mucosa from asthma and sinusitis patients. American Journal of Rhinology & Allergy. 23 (6), e10-e13 (2009).
  14. Cho, D. Y., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Acid and base secretion in freshly excised nasal tissue from cystic fibrosis patients with DeltaF508 mutation. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (2), 123-127 (2011).
  15. Coakley, R. D., et al. Abnormal surface liquid pH regulation by cultured cystic fibrosis bronchial epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 16083-16088 (2003).
  16. Pezzulo, A. A., et al. Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung. Nature. 487 (7405), 109-113 (2012).
  17. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
  18. Saint-Criq, V., Gray, M. A. Role of CFTR in epithelial physiology. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (1), 93-115 (2017).
  19. ECFS Patient Registry Annual Data Report. , Available from: https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf (2016).
  20. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2017. , Available from: https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2017).
  21. Abou Alaiwa, M. H., et al. Neonates with cystic fibrosis have a reduced nasal liquid pH; a small pilot study. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (4), 373-377 (2014).
  22. Abou Alaiwa, M. H., et al. Ivacaftor-induced sweat chloride reductions correlate with increases in airway surface liquid pH in cystic fibrosis. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  23. McShane, D., et al. Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 21 (1), 37-42 (2003).
  24. Schultz, A., et al. Airway surface liquid pH is not acidic in children with cystic fibrosis. Nature Communications. 8 (1), 1409 (2017).
  25. Abou Alaiwa, M. H., et al. Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease. JCI Insight. 1 (8), (2016).
  26. Ngamtrakulpanit, L., et al. Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis. Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).
  27. Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. P. Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate. Thorax. 57 (11), 926-929 (2002).
  28. Jayaraman, S., Song, Y. Airway surface liquid pH in well-differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 281 (5), C1504-C1511 (2001).
  29. Jayaraman, S., Song, Y., Vetrivel, L., Shankar, L., Verkman, A. S. Noninvasive in vivo fluorescence measurement of airway-surface liquid depth, salt concentration, and pH. Journal of Clinical Investigation. 107 (3), 317-324 (2001).
  30. Lennox, A. T., et al. ATP12A promotes mucus dysfunction during Type 2 airway inflammation. Scientific Reports. 8 (1), 2109 (2018).
  31. Song, Y., Thiagarajah, J., Verkman, A. S. Sodium and chloride concentrations, pH, and depth of airway surface liquid in distal airways. The Journal of General Physiology. 122 (5), 511-519 (2003).
  32. Thiagarajah, J. R., Song, Y., Haggie, P. M., Verkman, A. S. A small molecule CFTR inhibitor produces cystic fibrosis-like submucosal gland fluid secretions in normal airways. FASEB Journal. 18 (7), 875-877 (2004).
  33. Garnett, J. P., et al. Hyperglycaemia and Pseudomonas aeruginosa acidify cystic fibrosis airway surface liquid by elevating epithelial monocarboxylate transporter 2 dependent lactate-H(+) secretion. Scientific Reports. 6, 37955 (2016).
  34. Gorrieri, G., et al. Goblet Cell Hyperplasia Requires High Bicarbonate Transport To Support Mucin Release. Scientific Reports. 6, 36016 (2016).
  35. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods in Molecular Biology. 742, 285-310 (2011).
  36. Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods in Molecular Biology. , 109-121 (2013).
  37. Matsui, H., et al. Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease. Cell. 95 (7), 1005-1015 (1998).
  38. Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. npj Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
  39. Delpiano, L., et al. Esomeprazole Increases Airway Surface Liquid pH in Primary Cystic Fibrosis Epithelial Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1462 (2018).
  40. Gillies, R. J., Liu, Z., Bhujwalla, Z. 31P-MRS measurements of extracellular pH of tumors using 3-aminopropylphosphonate. American Journal of Physiology. 267 (1 Pt 1), C195-C203 (1994).
  41. Tannock, I. F., Rotin, D. Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation. Cancer Research. 49 (16), 4373-4384 (1989).
  42. Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., Reinhold, H. S. The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease. Radiotherapy and Oncology. 2 (4), 343-366 (1984).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 148 ، السائل السطحي لمجري الهواء ، التوازن الحمضي القاعدي ، درجه الحموضة ، قارئ اللوحة ، الواجهة الهوائية السائلة ، ظهاره المسالك الهوائية ، التليف الكيسي
في الوقت الحقيقي ، وشبه التلقائي قياس الفلورسنت من الدرجة الهوائية السائل سطح المجري الجوي للخلايا الاساسيه الإنسان الظهاريه
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, … More

Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, A. I., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M., Gray, M. A. Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (148), e59815, doi:10.3791/59815 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter