Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

В режиме реального времени, полуавтоматические флуоресцентные измерения воздуха поверхности жидкости рН первичных человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток

Published: June 13, 2019 doi: 10.3791/59815
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2,4, 1,2, 2,3, 1
1Epithelial Research Group, Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 2Respiratory Group, Institute of Cellular Medicine, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 3Paediatric Respiratory Medicine, Great North Children's Hospital, Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, 4Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co

Summary

Мы представляем протокол для динамических измерений поверхности дыхательных путей жидкого рН в условиях тонкой пленки с помощью плиты-читателя.

Abstract

В последние годы важность слизистой поверхности рН в дыхательных путях была подчеркнута его способностью регулировать гидратацию поверхности дыхательных путей (ASL), вязкость слизи и активность антимикробных пептидов, ключевые параметры, связанные с врожденной защитой легких. Это имеет первостепенное значение в области хронических респираторных заболеваний, таких как муковисцидоз (КФ), где эти параметры дисрегулируются. В то время как различные группы изучали ASL pH как in vivo, так и in vitro, их методы сообщают об относительно широком диапазоне значений ASL pH и даже противоречивых выводах относительно любых различий рН между клетками, не относящимися к CF и CF. Кроме того, их протоколы не всегда предоставляют достаточно деталей для обеспечения воспроизводимости, большинство из них имеют низкую пропускную выгоду и требуют дорогостоящего оборудования или специализированных знаний для реализации, что затрудняет их создание в большинстве лабораторий. Здесь мы описываем полуавтоматический флуоресцентный анализ считывателя пластин, который позволяет в режиме реального времени измерения ASL pH в условиях тонкой пленки, которые больше напоминают ситуацию in vivo. Этот метод позволяет для стабильных измерений в течение многих часов из нескольких культур дыхательных путей одновременно и, что важно, динамические изменения в ASL рН в ответ на агонистов и ингибиторы могут контролироваться. Для достижения этой цели, ASL полностью дифференцированных первичных человеческих эпителиальных клеток дыхательных путей (hAECs) окрашены на ночь с рН-чувствительный краситель для того, чтобы для повторного абсорбции избыточной жидкости для обеспечения тонкой пленки условиях. После флуоресценции контролируется в присутствии или отсутствии агонистов, калибровка рН выполняется на месте, чтобы исправить для объема и концентрации красителя. Описанный метод обеспечивает необходимые элементы управления, чтобы сделать стабильные и воспроизводимые измерения ASL pH, которые в конечном итоге могут быть использованы в качестве платформы обнаружения наркотиков для персонализированной медицины, а также адаптированы к другим эпителиальным тканям и экспериментальным состояний, таких как воспалительные и/или модели хоста-патогена.

Introduction

Эпителий дыхательных путей покрыт тонким (10 мкм) слоем жидкости, который называют поверхностной жидкостью дыхательных путей (ASL). Состав и глубина (гидратация) этого ASL жестко регулируется и контролирует эффективность очистки дыхательныхпутей смуцилерным эскалатором 1,2,3,4. В последние годы, важность ASL H /HCO3- содержание было продемонстрировано различными группами из-за его способности регулировать ASL гидратации5, воспаление дыхательных путей6 и инфекции7, 8, а также вязкость слизи 8,9. Важно отметить, что, хотя существует несколько споров, многие исследования сообщили о дисрегуляции рН дыхательных путей при хронических заболеваниях дыхательных путей, таких как астма10,11,12, ХОБЛ11, бронхиэктаз11, хронический риносинусит13,14 и муковисцидоз (CF)5,9,15,16,17, который предполагает, что методы лечения, которые восстанавливают ASL рН может быть полезным для лечения нескольких типов хронических заболеваний дыхательных путей. CF является наиболее распространенным аутосомно-рецессивным генетическим заболеванием в кавказских популяциях и связано с мутациями в гене регулятора трансмембранной проводимости CF (CFTR). Этот ген кодирует анион (HCO3- и Cl-) канал, который играет решающую роль в ионно-жидком транспорте и гомеостазе через эпителию18. Хотя CF является мультиорганной болезнью, патология легких является основной причиной заболеваемости и смертности19,20 и с учетом первичного дефекта в CF является нарушением транспортировки Cl- и HCO3-, можно предположить, что внеклеточная жидкость рН у людей с CF будет дисрегулируемым по сравнению с людьми, которые не имеют CF. Таким образом, измерение ASL рН была актуальной области исследований CF и различные группы разработали методы для измерения ASL pH в CF дыхательных путей.

In vivo, рН дыхательных путей был измерен с использованием различных методов, от микро-зондов (волоконно-оптические, золотые или мобидиевые зонды)5,21,22,23,24 до рН измерений ожидаемый материал или выдыхаемый конденсат дыхания (EBC)10,11,12,25,26,27. В области исследований CF, рН в настоящее время широко изучается в связи с его потенциальными клиническими последствиями. Теоретически, делая дыхательные пути более щелочной может увеличить бактериального убийства и улучшить муфтилиарии и гомеостаза дыхательных путей в целом. Тем не менее, исследования in vivo/ex vivo сообщают о широком диапазоне значений рН, и на сегодняшний день результаты не являются окончательными относительно наличия разницы в рН между не-CF и CF дыхательных путей. В начале 2000-х годов, различные группы сообщили рН EBC. В небольных групп, значения рН варьировались от 4,6 до 8,5, но интересно, РН EBC был найден более кислой во время обострений у людей с CF12,27. Совсем недавно, in vivo измерения ASL в человеческих и животных моделей CF сообщили противоречивые результаты16,17,21,22,23, 24 и до сих пор неясно, если CF дыхательные пути являются более кислыми, чем не-CF дыхательных путей.

Как in vivo измерения нижней ASL рН оказалось трудно из-за очень небольшого количества жидкости подкладка дыхательных путей и потенциальное присутствие слизистых плагинов в болезни, многие группы обратились к in vitro эксперименты для измерения ASL рН, в основном с использованием трех различных методологии. Первый подход использует dextran-соединенные клетки-impermeant рН-чувствительные флуоресцентные красители, которые добавляются в качестве сухого порошка, либо непосредственно в ASL или с помощью инертной жидкости называется перфторуглерод (PFC)5,8,16 , 17 Лет , 28 , 29 , 30 год , 31 год , 32. Однако, этот метод обеспечивает мало контроля над точным количеством красителя, который добавляется в культуры и представляет собой риск красителя агрегатов и большие различия в концентрации между образцами и / или экспериментов и даже в рамках одного образца . Он также, как правило, выполняется с конфокическим микроскопом, который ограничивает его применимость и во многих случаях предотвращает детальный мониторинг нескольких образцов и изменения условий записи. Второй метод, используемый для измерения ASL рН является использование рН чувствительных микроэлектродов5,15. Поэтому измерения ASL pH не зависят от концентрации флуоресцентного красителя и должны дать более надежные и воспроизводимые результаты. Тем не менее, этот метод не позволяет для динамических, в режиме реального времени измерения ASL pH, и это не легко сделать несколько показаний в различных условиях. Это также трудоемкий, сложный процесс, который требует специального оборудования (микроэлектродных изготовление/электрофизиологических записывающих устройств) и подготовки к сбору образцов для последующего измерения и калибровки рН. Кроме того, эти два метода также показали некоторые несоответствия в способности производить воспроизводимые результаты, используя pH-чувствительный метод флуоресцентного красителя, Tang et al. сообщили значения 7,35 для не-CF ASL и 7,0 для CF ASL8 в то время как в более последние бумаги из той же группы, ASL рН составил 6,9 и 6,4 для не-CF и CF, соответственно17. Аналогичным образом, микроэлектродов измерений дал значения 6,4 в не-CF ASL и 6,1 в CF ASL в исследовании с 200315 в то время как та же группа сообщила значения 6,7 для не-CF ASL и 6,45 для CF ASL в исследовании с 2013 года5. Наконец, в третьем подходе исследователи добавляют относительно большой объем слабо буферизированного раствора на апикальную (слизистую) поверхность культур, тем самым разрушая условия тонкой пленки и изменяя состав ASL, и потенциально его регулирование. рН затем измеряется либо с помощью рН-чувствительных флуоресцентных красителей33, по методу рН-стат титрации в Ussing камере13,14, или требует разбавленного ASL быть удалены из культур и рН измеряется с помощью рН электрод, анализатор или лакмусовая полоска34. Еще одной трудностью в точном измерении ASL pH является создание стандартной кривой, которая является максимально точной. Действительно, выполняются ли показания с помощью электрода, который будет измерять разницу в электрическом потенциале через смолу или с помощью рН-чувствительных флуоресцентных красителей, оба эти подхода будут затронуты местной микросредой образцов измеряется. Более конкретно, диссоциация постоянной (Kd) красителей может значительно варьироваться в зависимости от температуры, ионной силы, вязкости, а также потенциальных взаимодействий красителя с клеточными компонентами, такими как белки и потенциально слизь.

Для того, чтобы попытаться преодолеть многие из этих технических проблем, а также разработать более динамичный, простой и более высокий метод пропускной способностью, мы создали технику in vitro, которая записывает ASL pH в первичных культурах hAEC с помощью клеточного impermeant pH-чувствительного флуоресцентный краситель в стандартном коммерческом плите-читателя. Метод генерирует воспроизводимые, динамические, полуавтоматические измерения ASL pH полностью дифференцированных 3D-клеточных культур в условиях тонкой пленки. С помощью нескольких колодцев пластины читателя, это полуавтоматический опрос может сделать почти одновременные измерения рН до 24 условий более 12 ч и может контролировать эффект добавления различных агонистов или ингибиторов. В настоящем документе мы подробно описываем методологию и сообщаем репрезентативные результаты в условиях положительного и отрицательного контроля, который подтверждает технику.

Protocol

Первичные не-CF (n No 3 доноров, возраст 34, 27 и 23 лет) и CF (n No 3 доноров, все F580del / F508del; возраст 40, 41, неизвестный) hAECs были добрый подарок от д-ра Скотта Х. Ранделл (Марсико Лунг институт, Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл, США) и были obtai ned в соответствии с протоколом #03-1396 утвержденных Университетом Северной Каролины в Чапел-Хилл биомедицинских институциональных Обзор совета. Клетки были выращены в соответствии с ранее опубликованными методами с использованием роста и дифференциации средств массовой информации, описанные Fulcher и Randell35,36.

1. Подготовка образца

  1. Выращивайте первичные hAECs на полупроницаемых опорах диаметром 6,5 мм(Таблицаматериалов) при воздушно-жидком интерфейсе не менее 28 дней, как ранее описано35,36.
  2. Подготовка 50 мл стерильного раствора HCO3- содержащий буферный раствор Кребса (HCO3- KRB, концентрации приведены в mM NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CaCl2 (1), MgCl2 (1), D-глюкоза (5)) и фильтр-стерилизовать с помощью фильтра шприца 0,2 мкм.
  3. Измените базолатеральную среду на свежую среду дифференциации, описанную в 1.135,36.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ Примечание, было показано, что концентрация басолатеральной глюкозы влияет на ASL рН33. На этом этапе содержание глюкозы в баролатеральном отсеке можно контролировать, заменяя среду буферизированными растворами известных концентраций глюкозы.
  4. Вымойте апикальной поверхности клеток, добавив 150 л HCO3- KRB и инкубировать в течение 20 мин при 37 КС, 5% CO2.
  5. Удалите апикальную стирку, не нарушая эпителия, тщательно аспирируя его, используя стерильное стекло Пастерпайт и стерильный наконечник P200 pipet, связанный с аспирационным насосом, который создает вакуум в коллекционной бутылке. На этом этапе на апической поверхности должно остаться как можно меньше жидкости для восстановления воздушно-жидкостного интерфейса.
  6. Инкубировать клетки еще 30 мин при 37 градусахЦельсия, 5% CO 2.

2. Фоновое измерение

  1. Включите считыватель пластин и компьютер.
  2. Откройте панель мониторинга.
  3. Нажмите на Spark 10M,откройте контроль температуры и установите до 37 градусов по Цельсию. Откройте газовый контроль и установите CO от2 до 5%.
  4. Подождите, пока температура и CO2 достигли своих целей.
  5. Откройте ящик для чтения пластин, вставьте кассету влажности, заполненную 6 мл dH2O с каждой стороны. Убедитесь, что крышка и дно пластины чистые - если нет, очистить с 70% этанола на кусок ткани - и поместите пластину в влажности кассеты.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ я ввиду эксперимента, крышка пластины культуры ткани держится на плите и только извлекается добавлять снадобья или изменять basolateral среду, которые выполнены в капюшоне потока ламинара культуры ткани для того чтобы держать культуры в стерильной окружающей среде.
  6. Откройте редактор Spark Method и навяждите параметры программного обеспечения следующим образом.
    1. Выберите подходящий шаблон пластины (для полупроницаемых опор диаметром 6,5 мм, выберите 24 хорошо пластины) и колодцы, которые будут контролироваться в ходе этого эксперимента.
    2. Добавьте панель управления температурой и CO2 и установите их до 37 градусов по Цельсию и 5%, соответственно. Тик ждать температуры / газовых ящиков.
    3. Добавьте кинетическую панель цикла и выберите Продолжительность в качестве типа петли и установите ее на 5-10 мин. Выберите не определенный тип Интервала, чтобы обеспечить непрерывное чтение.
      ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ место медля отомности зависло от количества скважин/условий. 5 мин достаточно для 6-12 скважин, в то время как полная пластина, содержащая 24 условия, потребует 10 минут непрерывных измерений.
    4. В кинетической петле добавьте две панели "Интенсивность флуоресценции", используя функцию перетаскивания и падения, которая будет настроена для чувствительных к рН и рН нечувствительных флуоресцентных красителей соответственно. Установите возбуждение и длины волн выбросов до 560 и 590 нм, соответственно, для рН-чувствительного красителя и 495 и 520 нм, соответственно, для нечувствительного красителя pH.
    5. Установите количество вспышек до 30 и z-позиции до 33200 для каждого фторофра.
      ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ- z-позиция и настройки усиления зависят от характеристик считывателя пластин. Установите прибыль вручную к значению, которое даст достаточно высокие показатели, так что различия между образцами будут подобраны, но достаточно низкими, так что добавление агониста не будет генерировать значения из диапазона обнаружения.
    6. Установите несколько читать в хорошо для пользователя определяется как круг типа 3 и 3 размера с границей 4750 мкм.
  7. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы сделать фоновое измерение и ОК, чтобы подтвердить крышку влажности кассеты на месте.
  8. В конце измерения, откройте ящик для чтения пластин, возьмите тарелку и поместите cellsit обратно в инкубатор при подготовке раствора флуоресцентного красителя смеси.
  9. Подготовьте раствор флуоресцентного красителя, добавив 2 л 1 мг/мл dextran-coupled pH-чувствительный (pHsens) флуоресцентный краситель до 0,2 л 10 мг/мл dextran-coupled рН-нечувствительный (pHins) флуоресцентный краситель и 0,8 л стерильных HCO3- KRB для окончательного объем 3 зл на состояние.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ- Общий объем раствора смеси красителя должен быть подготовлен для n скважин No 1, если есть от 1 до 10 образцов, или n скважин no 2, если есть от 11 до 24 образцов. Dextran-соединенные красители воссозданы в фильтровано-стерильном растворе HCO3- Растворе KRB, aliquoted и хранится при -20 c. Любое химическое вещество может быть добавлено на данном этапе в течение 16-24 ч инкубационный период37 на апкальной поверхности. Химические вещества должны быть подготовлены как 0,1x, так как окончательный объем, после поглощения избыточной жидкости культурой, будет около 0,3 л для полупроницаемой опоры диаметром 6,5 мм.
  10. Аккуратно добавьте 3 qL смеси красителя (см. 2.8) к апикальной поверхности клетоки инкубируйте на ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO 2.

3. Кинетическое измерение

  1. Повторите шаги от 2.1 до 2.4 для подготовки считывателя пластин.
  2. Нажмите на значок Open и выберите файл метода, используемый для фоновых измерений
  3. В кинетической панели цикла держите тип цикла как Продолжительность и установите его на 08 часов. Измените тип Interval на исправление и установите его на 5 минут. Держите флуоресценции Интенсивность панелей так же, как для фоновых измерений
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, Тип интервала для фоновых измерений установлен на "не определенный" для того, чтобы непрерывное чтение. Для кинетических, а также и калибровочных экспериментов, тип интервала установлен на "фиксированный" с интервалом 5 мин. Это может быть скорректировано в соответствии с дизайном эксперимента и количество условий.
  4. Откройте ящик для чтения пластин; вставьте часовую кассету влажности, заполненную 6 мл dH2O с каждой стороны. Убедитесь, что крышка и дно пластины чистые - если нет, очистить с 70% этанола на кусок ткани - и поместите пластину в влажности кассеты, с ее крышкой.
  5. Начните флуоресценцию чтения, нажав на начало. Нажмите OK после обеспечения крышка влажности кассеты на месте.
  6. После n циклов, обычно между 12 и 24, что эквивалентно от 1 до 2 часов, нажмите Пауза, чтобы прервать эксперимент. Возьмите пластину и применять любые препараты / агонисты basolaterally к различным образцам.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, когда клетки взяты из пластины читателя, CO2 побегов, и это вызовет увеличение ASL рН, как показано на падение рН-чувствительных красителя флуоресценции. ЭтоCO 2-индуцированных рН изменения меняется в течение 10-15 минут после размещения культур обратно в пластины читателя.
  7. Положите пластину обратно в грушевую стрелку влажности на лоток, изменить положение крышки кассеты влажности и нажмите Продолжить для того, чтобы дальнейшее запись ASL рН и контролировать влияние наркотиков / агонистов на ASL рН.

4. Калибровка situ pH

  1. Выннь тарелку из тарелки.
  2. Аспирируй басолатеральной среды / решения.
  3. Добавьте 750 л и 1 Л высоко буферизированных стандартных решений кривой к басолатеральному отсеку и актической поверхности, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, Высоко буферизированные стандартные решения кривой содержат (в mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl2 (1.2), MgCl2 (1.2), NaHEPES или MES или Tris (100 mM). Используйте MES для буферных решений с рН ниже 7, NaHEPES для решений pH 7-7.5 и Tris для решения с pH 8. Зажим рН до нужного значения с помощью HCl.
  4. Выключите CO2 на считыватель пластины или установите его на 0,1% и поместите пластину обратно в кассету влажности.
  5. Настройка считывателя пластин с теми же параметрами, которые описаны ранее, но без CO 2, как в шаге 3.2.
  6. Начало флуоресценции показания, каждые 5 мин для 1-1,5 ч.

5. Оценка влияния концентрации красителя и объема подвески на данные калибровки

  1. Приготовьте достаточное количество рН-чувствительной и нечувствительной смеси красителя для записи флуоресценции при минимуме 4 различных значений рН в 3 различных томах.
    ПРИМЕЧАНИЕ Примечание, смесь 1 была подготовлена с 26 мл чувствительных к рН (1 мг/мл) и 2,6 л рН-нечувствительных (10 мг/мл) и смешать 2 с 13 мкг чувствительными (1 мг/мл) и 1,3 л рН-нечувствительных (10 мг/мл).
  2. Распределите 2,2 л или 1,1 л смеси 1 или 2, соответственно, в 12 скважин пластины из 96 скважин и добавьте достаточное количество калибровочных растворов для получения окончательных объемов 50, 100 или 200 л и хорошо перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ При МК. В этой настройке Количество флуоресценции будет зарегистрировано для концентраций красителей 5 мкг/мл (в 200 мл), 10 мкг/мл (в 100 или 200 мкг/мл (в 50 или 100 мл) или 40 мкг/мл (в 50 л).
  3. Включите считыватель пластины, установите температуру до 37 градусов по Цельсию и вставьте пластину в считыватель пластины. Не включайте контроллер CO 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, поскольку это короткий эксперимент и требует только достаточно времени, чтобы уравновесить температуру, влажность кассеты не требуется.
  4. Отрегулируйте z-позицию и привите для пластины 96 скважин и используйте те же параметры, что и для эксперимента, сделанного на полупроницаемых опорах.

6. Анализ данных

  1. Сохраните все данные в электронных таблицах и создайте новый файл.
  2. В фоновом файле выберите все средние данные для каждого образца/условия для длин волн, копирования и вставки в новый файл. Рассчитайте средний фон для каждого колодца и каждой длины волны.
  3. Повторите это с калибровкой и кинетической данных и вычесть фон из каждой точки данных для каждой длины волны.
  4. Для каждого времени точки и каждого образца, рассчитать соотношение между рН-чувствительной и рН-нечувствительной флуоресценции
  5. Если все образцы были получены от отдельного донора, вычислите среднее количество соотношений в каждой временной точке кривой калибровки
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, Важно генерировать столько кривых калибровки, сколько доноров или базолтеральных решений. Действительно, эти параметры могут повлиять на фоновые показания или скорость поглощения жидкости, что, в свою очередь, повлияет на концентрацию красителя и, следовательно, на расчетный рН.
  6. Для каждой временной точки генерируют стандартную кривую из соотношений, сражая известные значения pH на оси x и соотношения на y-оси.
  7. Определите точку времени, в которой соотношения стабильны, подвитай линейную линию регрессии и получите уравнение для этой строки.
  8. Из кинетических данных вычислите рН для каждой временной точки и наметьте рН на оси y и время на оси x
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, Отдых / базальный рН может быть рассчитан путем усреднения точек данных по сравнению со стабильным измерением рН до добавления любого агониста или любого другого вмешательства. Эффект агониста можно охарактеризовать при расчете разницы в рН до и после (определенное количество времени) лечения или путем установки нелинейной кривой к точкам данных непосредственно после вмешательства. Это даст дополнительную информацию о t1/2 и максимальной стоимости. Наконец, темпы подкисления или щелочности также могут быть получены со склона прямой линии, установленной на первые точки после вмешательства.

Representative Results

Описанный выше метод позволяет динамическое измерение рН ASL в 24 отдельных первичных культурах hAECs. На рисунке 1 показана схема основных ступеней и оборудования. Ночные нагруженные клетки помещаются в CO2 и температурный считыватель пластин, в котором каждые 5 минут регистрируются флуоресценция от декрен-связанных рН чувствительных и рН-нечувствительных красителей.

Figure 1
Рисунок 1. Схема метода измерения ASL pH. После мытья культур и выполнения фонового чтения, первичных человеческих эпителиальных клеток дыхательных путей (hAECs) ASL загружаются с dextran соединенных рН-чувствительных и рН-нечувствительной смеси красителя ночь на 37 градусов по Цельсию, 5% CO2. На следующий день пластина передаетсяна температуру и CO 2-контролируемый считыватель пластин и флуоресценция от обоих красителей регистрируется с течением времени. После эксперимента проводится калибровка на месте и анализируются данные и представлены как ASL pH с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Во-первых, мы исследовали влияние различных объемов и концентраций красителя на количество флуоресценции и, следовательно, на соотношении 560/495. Действительно, цель добавления рН-нечувствительны к рН-чувствительный краситель, чтобы исправить для изменчивости в ASL нагрузки. Тем не менее, было важно проверить это предположение и оценить, если мы могли бы использовать стандартную кривую калибровки выполняется в отсутствие клеток в 96 хорошо пластины для всех экспериментов и типов клеток. Мы отслеживали количество флуоресценции более 1 ч в 50, 100 или 200 л калибровочных растворов (при рН 5,5, 6,5, 7 или 8), содержащих 5, 10, 20 или 40 мкг/мл красителей. Результаты представлены на рисунке 2A-C, и показывают, что для того же рН и той же концентрации красителей, сообщили pHsens / pHins коэффициент выбросов (560/495 на оси y) отличается в зависимости от объема (рисунок2A). Кроме того, при том же рН и том же объеме различные концентрации красителя обеспечивают различные значения соотношения(рисунок 2B). Таким образом, изменения в концентрации объема или красителя будут влиять на абсолютное значение рН, рассчитанное из коэффициента выбросов. На рисунке 2С показано, что время, необходимое для оживляемого температуры, составляет примерно 15-20 мин. Чтобы подтвердить влияние концентрации красителей и объема на коэффициенты выбросов, мы зафиксировали флуоресценцию от красителей, загруженных в ASL первичных не-CF и CF hAECs на месте. Затем мы выполнили калибровку и проанализировали результаты (1), генерируя одну глобальную стандартную кривую из всех образцов или (2), генерируя две независимые стандартные кривые для каждого типа клеток (не CF и CF). ASL рН от обоих типов клеток были затем построены против времени(рисунок 3A, B) и усредненный (рисунок3C). Значения ASL pH, полученные из одной глобальной стандартной кривой, показали существенную разницу между культурами, не отнесемыми к CF и CF(рисунок3A,C), в то время как ASL pH не сильно отличался между CF и non-CF hAECs, когда рН был рассчитан с независимые стандартные кривые(рисунок 3B,C). Эти результаты показывают важность создания независимых кривых калибровки для каждого эксперимента и в рамках эксперимента, для каждого донора образца, так как, когда кривые калибровки были усреднены вместе, более высокие значения соотношения pHsens/pHins были найдены в культурах CF , что указывает на более кислый рН(рисунок 3C).

Figure 2
Рисунок 2. Оптимизация калибровки рН в пробирке. Различные объемы растворов известных рН и содержащих различные концентрации красителя были загружены на 96 хорошо пластины и флуоресценции было зарегистрировано более 1 ч. Влияние объема (A) и концентрации красителя (B) на коэффициенты флуоресценции. Коэффициенты были построены против рН для точки времени 24 мин. (C) Наклон изменения флуоресценции был рассчитан для каждого решения и построен как функция времени (в мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3. Оптимизация анализа калибровки рН на первичных hAECs на месте. (A) Представитель следы ASL рН, полученные из одной стандартной кривой усреднения данных из не-CF и CF культур. (B) Представительные следы ASL pH, полученные из независимой стандартной кривой, выполненной на культурах, не входящих в CF или CF. Каждый набор данных вычислялся по собственной кривой калибровки. (C) Оценка различий в рН ASL между культурами, не входящих в CF и CF, в зависимости от того, как была выполнена калибровка. Данные представляют собой среднее SEM от n'3 экспериментов, 2-путь ANOVA, Sidak в нескольких сравнений тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Для дальнейшей проверки нашей техники, мы затем требуется положительный контроль, чтобы продемонстрировать, что техника была способна обнаруживать "ожидаемые" изменения в ASL рН. Поскольку наличие более кислой ASL в клетках CF по-прежнему спорным, мы использовали агонист кампам форсколин, как положительное состояние контроля, чтобы стимулировать HCO3- секрецию через CFTR. Ожидаемые результаты показали бы форсколин-индуцированную алкалиализацию ASL в клетках non-CF которые больш были бы уменьшены или отменены в клетках CF в зависимости от суровости перегласовок. На рисунке 4A показаны репрезентативные следы ASL pH не-CF и CF клеток с течением времени, а на рисунке 4B показаны средние данные ASL pH до и после лечения форсколином в обоих типах клеток. Мы можем получить различную информацию из этих результатов. Во-первых, как уже показано на рисунке 3B,C, отдых ASL рН не отличается между не-CF и CF эпителии. Во-вторых, первые 3-4 тайм-точек после приостановки эксперимента по лечению клеток форсколином, показали значительное увеличение рН, которые восстановились в течение 15 мин. Это было связано с падением концентрации CO2 между считывателем пластин (5%) и шкаф безопасности культуры ткани (0%). Согласно уравнению Хендерсона Хассельбалха, рН 7 в 5% среде CO2 приравнивается к концентрации HCO3- 9,3 мМ. Когда клетки удаляются из считывателя пластин, снижение концентрации CO2 до 0% теоретически приведет к увеличению рН в размере 8 евро. Рисунок 4A показывает, что ASL рН увеличился до 7,8 евро, что можно объяснить промежуток времени, перепозиционируя пластину в считывателе пластины (т.е.в 5% CO2 среды). Наконец, как и предсказывалось, добавление басолатерального 10 мкм форсколина (Fsk) значительно увеличило ASL pH только в культурах, не входящих в CF. Как было показано различными группами, что существует разница в устойчивом состоянии ASL рН между CF и не-CF эпителия, мы хотели бы дальнейшего изучения очевидного отсутствия разницы рН в наших экспериментах и роль CFTR. Для этого мы предварительно инкубировали культуры, не связанные с CF, с конкретным ингибитором CFTR, CFTRinh172 (172). Как указано в разделе протокола 2.8, смесь красителя была подготовлена, как указано выше, и ингибитор был добавлен в концентрации 0,1X и 2 мкм. Согласно литературе, ASL высота не-CF клеток составляет около 10 мкм. Таким образом, в полупроницаемой опоре диаметром 6,5 мм теоретический объем ASL составляет 3,25 евро. Добавляя 3 зЛ красителя No 172 при 2 МКм, концентрация ингибитора после поглощения избыточной жидкости теоретически составит 20 мкм (1x, желаемая концентрация). Представитель следы на рисунке 4C и среднее резюме на рисунке 4D показывают, что 172 не уменьшить отдыха ASL рН, но предотвратить форколин-индуцированного увеличения ASL рН, тем самым подтверждая наши результаты, полученные от не-CF по сравнению с CF культур и дальнейшей проверки нашей техники.

Figure 4
Рисунок 4. Динамическое измерение рН ASL в ответ на активацию CFTR форсколином. (A) Представительследы влияния форсколина (Fsk, 10 мкм) на кинетику ASL рН с течением времени в не-CF и CF hAECs. Данные представляют собой среднее SEM от n'3 экспериментов. (B) Резюме влияния Fsk на ASL рН в non-CF и CF культур. Данные представляют собой среднее sD от n'69 не-CF культур и 35 культур CF (2-путь ANOVA, Sidak несколько сравнений тест). (C) Представительные следы влияния CFTRinh172 (172, 20 мкм) на fsk-индуцированное увеличение рН ASL в hAECs non-CF. Данные представляют собой среднее SEM от n'5 экспериментов. (D) Резюме влияния 172 на Fsk-индуцированной алкалиизации ASL в не-CF культур. Данные представляют собой среднее SEM от n'5 экспериментов (2-путь ANOVA, Sidak в нескольких сравнений тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Наконец, как указано в разделе протокола 6.8, темпы подкисления/щелочности могут быть рассчитаны путем установки линейной регрессии к исходным тайм-пойнтам после вмешательства. Рисунок 5A показывает, что удаление базолатерального HCO3- содержащего раствора (HCO3- KRB) и замена его буферным раствором HEPES, при отсутствии CO2,индуцированного заметного подкисления ASL. Это согласуется с отсутствием HCO3- ингибирование трансэпителиальной HCO3- секреции, что позволяет составной протонной секреции этих клеток дыхательных путей, чтобы неуклонно уменьшить ASL рН15,17. Интересно, что начальная скорость подкисления клеток, не относясь к CF, была значительно медленнее, чем у CF культур(рисунок 5B).

Figure 5
Рисунок 5. Динамические изменения в ASL рН в ответ на HCO3- удаление. (A) Представитель следы, показывающие влияние HCO3- удаление на кинетику ASL рН с течением времени в не-CF и CF hAECs. Первоначальные темпы подкисления были получены через склон прямой линии, установленной на 7 временных точек после HCO3- удаления. Данные представляют собой средства, полученные в рамках экспериментов n'6 и 7 на культурах, не относясь к CF и CF соответственно. (B) Резюме начальных темпов подкисления после HCO3- удаление. Данные представляют собой средства, полученные в рамках экспериментов n'6 и 7 на культурах, не относясь к CF и CF(тест Манн-Уитни). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Здесь мы предоставляем подробный протокол для динамического измерения ASL рН в первичных эпителиальных клеток дыхательных путей человека. Критические шаги включают смыв слизи с апикальной поверхности клеток, измерение и вычитание фона с использованием тех же параметров, что и в эксперименте, оптимизацию z-позиции и усиление и выполнение калибровки pH situ.

Первый шаг мытья клеток имеет решающее значение, поскольку толстый слой слизи может (i) предотвратить красители от достижения перицилятельного слоя (PCL) и (ii) задержки или предотвратить обнаружение изменений в флуоресценции в ответ на агонистов / ингибиторов. Наш метод был разработан для изучения того, как первичные hAECs модулировали активность HCO3- и Hq транспортеров в ответ на агонистов. Хотя будет интересно исследовать, как изменения в PCL рН связаны с изменениями в слизи рН, дальнейшее развитие этого протокола необходимо, в том числе использование различных молекулярных вес-декстранс для дифференциалов целевой 2 слоев и z-сканов через весь ASL.

Еще одним важным шагом этого протокола является измерение фона. Апикальная поверхность полностью дифференцированной первичной эпителии дыхательных путей редко полностью плоская, которая повлияет на световой путь и, следовательно, фон. Обеспечение того, чтобы фоновые показания выполнялись в тех же локальных точках скважин, что и во время эксперимента, имеет решающее значение для воспроизводимости и стабильности записей.

Оптимизация z-позиции и усиления являются необходимыми шагами, которые должны быть созданы для каждой различной концентрации флуоресцентного красителя, который будет использоваться. Это предотвратит высокую изменчивость межэкспериментов. После настройки наш результат обеспечивает стабильные и воспроизводимые результаты. Одной из причин этого является то, что красители добавляются на апикальной поверхности на клетках в небольшом объеме жидкости, которая легко абсорбируется эпителием, оставляя однородно помечены ASL. Другой метод для окрашивании ASL, который может быть столь же успешным, используется сухой порошок или "подвеска" в PFC. Хотя это может быть экономия времени (как эксперименты, как правило, выполняются в течение 2 ч), маловероятно, что сухие красители полностью растворить в ASL и, таким образом, может быть образуют сгустки. Таким образом, различные концентрации рН-чувствительных красителя будут найдены на поверхности эпителиальных клеток.

Калибровка pH in situ является важным шагом для получения точных, воспроизводимых результатов. Как показано и объясняется в разделе результатов, различия в объемах ASL будут влиять на количество флуоресценции и, следовательно, интерполированные значения рН(Рисунок 2 и Рисунок 3). В то время как различные группы ранее опубликовали ASL pH измерений, широкий спектр значений были получены даже между различными исследованиями, опубликованными одной и той же группой8,17. Мы считаем, что, выполняя в situ калибровки, результаты станут более воспроизводимыми. По сравнению с другими методами калибровки рН, которые используют высокий Метод калибровки K /nigericin (или нескольких ионофоров) для создания стандартной кривой28,29,30, анализа, представленного здесь, имеет преимущество, что , до тех пор, как каждый шаг выполняется в шкаф безопасности, клетки, используемые для ASL рН можно мыть, хранить и повторно использовать для других экспериментов при условии, что лечение выполняется не обратимо влияют на эпителиальные клетки.

Разработка и оптимизация этого исследования обеспечила воспроизводимые результаты, и мы считаем, что этот метод поможет другим группам с их ASL измерения рН. Тем не менее, этот метод имеет также некоторые ограничения из-за создания и тип клеток, которые используются. Мониторинг ASL рН в течение более длительного периода времени, чем представленные здесь (Зgt;8-10 ч) может оказаться трудным, как долгосрочные высокой влажности окружающей среды может повредить оборудование и тот факт, что большинство читателей пластины только предлагают возможность записи кинетических показаний в течение определенное количество времени (обычно 24 ч). Использование полностью дифференцированных первичных hAECs имеет решающее значение в том, что различные этапы дифференциации повлияет на выражение HCO3- и Hq транспортеров. Однако практически нет возможности точно контролировать объем ASL в клетках, выращенных в условиях тонкой пленки. Как указано в протоколе и разделе результатов, изменения в объеме повлияют на коэффициент флуоресценции и, к сожалению, необходимо предположить, что в клетках, выращенных из одного человека, посеянных в один и тот же день на разных полупроницаемых опорах, объемах ASL будет то же самое. В результате этого ограничения, любой агонист или ингибитор, который повлияет на секрецию или поглощение жидкости, повлияет на объем ASL и, предположительно, коэффициенты флуоресценции. Однако, по нашему анализу, кривая калибровки выполняется в конце эксперимента, поэтому мы можем предположить, что эти изменения в объеме повлияют на коэффициенты калибровки так же, как во время кинетического эксперимента. По этой причине мы советуем группам, которые были бы заинтересованы в разработке этого асссе, использовать по крайней мере 2-3 репликации на тестируемое состояние, поскольку это позволит создать стандартную кривую для каждого состояния.

Здесь мы представляем простой, полуавтоматический, анализ, который позволяет в режиме реального времени измерения слизистой поверхности рН в условиях тонкопленки. Он обладает потенциалом для изучения динамических ответов рН во многих культурах практически одновременным образом, что позволяет проводить меж- и внутридонорские сравнения. Увеличение этого метода до 96 хорошо пластины формата с использованием поляризованной системы (HTS 96 пластин)38 обеспечит еще более высокую пропускную вычисляемую как ассс открытия наркотиков. Кроме того, мы показали, как этот метод может быть использован для изучения острого влияния агонистов на ASL рН, и мы уже опубликовали, что этот метод может быть использован для изучения долгосрочного эффекта апикического ингибитора протонного насоса на CF hAECs ASL39. Как рН было показано, чтобы регулировать инфекцию, воспаление, вязкость слизи и ионного транспорта, выявление молекулярных целей, которые могут увеличить рН будет иметь важное значение в области исследований хронических заболеваний легких, и этот метод будет потенциально облегчить развитие скрининга лекарственных средств в персонализированных медицинских подходах. Наконец, поскольку дисрегуляция в кислотной основе гомеостаза играет важную роль в других заболеваниях, этот протокол может быть адаптирован, с оптимизацией шаги, к различным оборудованием (пластины считывателей) и типов клеток, таких как другие эпителиальные клетки. Внеклеточной кислотности является характеристикой рака40,41,42, и это анализ может помочь определить, как твердые опухоли производят низкий рНe или могут быть использованы в качестве низкой пропускной способностью наркотиков скрининга анализ для восстановление рН гомеостаза. Аналогичным образом, что касается хронических заболеваний дыхательных путей, то она может также служить платформой для разработки персонализированного подхода к медицине.

Disclosures

МБ, не связано с этой работой, не связанные с этими исследованиями, проведенными под руководством исследователей, от Pfizer и Roche Diagnostics; Плата за выступления в Ньюкаслском университете из Новартиса, Рош Диагностики и TEVA. Расходы на поездки на образовательные встречи от Boehringer Ingelheim и Vertex Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана двумя грантами CF Trust Strategic Research Centre (SRC003 и SRC013) и Советом по медицинским исследованиям (MRC) «Доверие к концепции гранта» (MC-PC-15030). JG была поддержана грантом Фонда медицинских исследований (MRF-091-0001-RG-GARNE). МБ была поддержана Медицинским исследовательским советом Клинического Научного Стипендия (MR/M008797/1). IH была поддержана Стипендией wellcome Trust Clinical Training Fellowship (203520/no/16/) Исследование было поддержано Национальным институтом медицинских исследований Ньюкасл биомедицинских научно-исследовательский центр, базирующийся в Ньюкасл больницы NHS Фонд Trust и Ньюкаслского университета. Высказанные мнения являются мнениями автора (ы) и не обязательно мнения ГСЗ, NIHR или Департамента здравоохранения. Первичные клетки доктора Ранделла были поддержаны грантом Фонда муковисцидоза (BOUCHE15R0) и грантом NIH (P30DK065988).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Starlab E4780-1226
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3470
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
CFTRInh172 RnD Systems (Tocris) 3430 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran ThermoFisher D22910 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran ThermoFisher P10361 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Forskolin RnD Systems (Tocris) 1099 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM
Greiner CELLSTAR 96 well plates Cellstar 655180
Humidity cassette TECAN 30090495
KCl Sigma Aldrich P9541
MES Sigma Aldrich M3885
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S9888
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NaHepes Sigma Aldrich H3784
Plate reader: TECAN SPARK 10M TECAN 30086375
Tris Sigma Aldrich T1503
Universal pH electrodes DJ 113 VWR 662-1385

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 150 (1), 271-281 (1994).
  2. Roomans, G. M., et al. Measurements of airway surface liquid height and mucus transport by fluorescence microscopy, and of ion composition by X-ray microanalysis. Journal of Cystic Fibrosis. 3, Suppl 2. 135-139 (2004).
  3. Haq, I. J., Gray, M. A., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M. Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis: pathophysiology and therapeutic targets. Thorax. 71 (3), 284-287 (2016).
  4. Martin, S. L., Saint-Criq, V., Hwang, T. C., Csanady, L. Ion channels as targets to treat cystic fibrosis lung disease. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2S), S22-S27 (2018).
  5. Garland, A. L., et al. Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15973-15978 (2013).
  6. Torres, I. M., Patankar, Y. R., Berwin, B. Acidosis exacerbates in vivo IL-1-dependent inflammatory responses and neutrophil recruitment during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (2), L225-L235 (2018).
  7. Berkebile, A. R., McCray, P. B. Effects of airway surface liquid pH on host defense in cystic fibrosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 124-129 (2014).
  8. Tang, X. X., et al. Acidic pH increases airway surface liquid viscosity in cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 879-891 (2016).
  9. Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
  10. Hunt, J. F., et al. Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161, 694-699 (2000).
  11. Kostikas, K., et al. pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (10), 1364-1370 (2002).
  12. Ojoo, J. C., Mulrennan, S. A., Kastelik, J. A., Morice, A. H., Redington, A. E. Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis. Thorax. 60 (1), 22-26 (2005).
  13. Cho, D. Y., Hajighasemi, M., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Proton secretion in freshly excised sinonasal mucosa from asthma and sinusitis patients. American Journal of Rhinology & Allergy. 23 (6), e10-e13 (2009).
  14. Cho, D. Y., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Acid and base secretion in freshly excised nasal tissue from cystic fibrosis patients with DeltaF508 mutation. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (2), 123-127 (2011).
  15. Coakley, R. D., et al. Abnormal surface liquid pH regulation by cultured cystic fibrosis bronchial epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 16083-16088 (2003).
  16. Pezzulo, A. A., et al. Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung. Nature. 487 (7405), 109-113 (2012).
  17. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
  18. Saint-Criq, V., Gray, M. A. Role of CFTR in epithelial physiology. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (1), 93-115 (2017).
  19. ECFS Patient Registry Annual Data Report. , Available from: https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf (2016).
  20. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2017. , Available from: https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2017).
  21. Abou Alaiwa, M. H., et al. Neonates with cystic fibrosis have a reduced nasal liquid pH; a small pilot study. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (4), 373-377 (2014).
  22. Abou Alaiwa, M. H., et al. Ivacaftor-induced sweat chloride reductions correlate with increases in airway surface liquid pH in cystic fibrosis. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  23. McShane, D., et al. Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 21 (1), 37-42 (2003).
  24. Schultz, A., et al. Airway surface liquid pH is not acidic in children with cystic fibrosis. Nature Communications. 8 (1), 1409 (2017).
  25. Abou Alaiwa, M. H., et al. Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease. JCI Insight. 1 (8), (2016).
  26. Ngamtrakulpanit, L., et al. Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis. Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).
  27. Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. P. Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate. Thorax. 57 (11), 926-929 (2002).
  28. Jayaraman, S., Song, Y. Airway surface liquid pH in well-differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 281 (5), C1504-C1511 (2001).
  29. Jayaraman, S., Song, Y., Vetrivel, L., Shankar, L., Verkman, A. S. Noninvasive in vivo fluorescence measurement of airway-surface liquid depth, salt concentration, and pH. Journal of Clinical Investigation. 107 (3), 317-324 (2001).
  30. Lennox, A. T., et al. ATP12A promotes mucus dysfunction during Type 2 airway inflammation. Scientific Reports. 8 (1), 2109 (2018).
  31. Song, Y., Thiagarajah, J., Verkman, A. S. Sodium and chloride concentrations, pH, and depth of airway surface liquid in distal airways. The Journal of General Physiology. 122 (5), 511-519 (2003).
  32. Thiagarajah, J. R., Song, Y., Haggie, P. M., Verkman, A. S. A small molecule CFTR inhibitor produces cystic fibrosis-like submucosal gland fluid secretions in normal airways. FASEB Journal. 18 (7), 875-877 (2004).
  33. Garnett, J. P., et al. Hyperglycaemia and Pseudomonas aeruginosa acidify cystic fibrosis airway surface liquid by elevating epithelial monocarboxylate transporter 2 dependent lactate-H(+) secretion. Scientific Reports. 6, 37955 (2016).
  34. Gorrieri, G., et al. Goblet Cell Hyperplasia Requires High Bicarbonate Transport To Support Mucin Release. Scientific Reports. 6, 36016 (2016).
  35. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods in Molecular Biology. 742, 285-310 (2011).
  36. Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods in Molecular Biology. , 109-121 (2013).
  37. Matsui, H., et al. Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease. Cell. 95 (7), 1005-1015 (1998).
  38. Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. npj Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
  39. Delpiano, L., et al. Esomeprazole Increases Airway Surface Liquid pH in Primary Cystic Fibrosis Epithelial Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1462 (2018).
  40. Gillies, R. J., Liu, Z., Bhujwalla, Z. 31P-MRS measurements of extracellular pH of tumors using 3-aminopropylphosphonate. American Journal of Physiology. 267 (1 Pt 1), C195-C203 (1994).
  41. Tannock, I. F., Rotin, D. Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation. Cancer Research. 49 (16), 4373-4384 (1989).
  42. Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., Reinhold, H. S. The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease. Radiotherapy and Oncology. 2 (4), 343-366 (1984).

Tags

Биохимия Выпуск 148 Поверхностная жидкость дыхательных путей кислотно-базовый баланс рН плита-читатель воздух-жидкий интерфейс эпителий дыхательных путей муковисцидоз
В режиме реального времени, полуавтоматические флуоресцентные измерения воздуха поверхности жидкости рН первичных человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, … More

Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, A. I., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M., Gray, M. A. Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (148), e59815, doi:10.3791/59815 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter