Summary
Här beskriver vi en enkel konfokalmikroskopi Imaging metod för att visualisera in situ lokalisering av celler som utsöndring av cytokin interferon gamma i murin sekundära lymfoida organ. Detta protokoll kan förlängas för visualisering av andra cytokiner i olika vävnader.
Abstract
Cytokiner är små proteiner som utsöndras av celler och förmedlar cell cells kommunikation som är avgörande för effektivt immunsvar. En egenskap hos cytokiner är deras pleiotropism, eftersom de produceras av och kan påverka en mängd olika celltyper. Som sådan är det viktigt att förstå inte bara vilka celler som producerar cytokiner, men också i vilken miljö de gör det, för att definiera mer specifika Therapeutics. Här beskriver vi en metod för att visualisera cytokinproduktion in situ efter bakteriell infektion. Denna teknik förlitar sig på Imaging cytokin-producerande celler i sin inhemska miljö genom konfokala mikroskopi. För att göra detta, är vävnads sektioner färgas för markörer av flera celltyper tillsammans med en cytokin fläck. Nyckeln till denna metod, cytokin sekretion blockeras direkt in vivo innan skörd vävnaden av intresse, möjliggör detektion av cytokin som samlats inuti de producerande cellerna. Fördelarna med den här metoden är flera. För det första, den mikromiljö där cytokiner produceras bevaras, som i slutändan skulle kunna informera om de signaler som krävs för cytokin produktion och de celler som påverkas av dessa cytokiner. Dessutom ger denna metod en indikation på placeringen av cytokinproduktionen in vivo, eftersom den inte förlitar sig på artificiell in vitro-återstimulering av de producerande cellerna. Emellertid, det är inte möjligt att samtidigt analysera cytokin nedströms signalering i celler som tar emot cytokin. På samma sätt motsvarar de observerade cytokinsignalerna endast det tidsfönster under vilket cytokinsekretion blockerades. Medan vi beskriver visualiseringen av cytokin interferon (IFN) gamma i mjälten efter mus infektion av intracellulära bakterier Listeria monocytogenes, denna metod skulle kunna anpassas till visualisering av någon cytokin i de flesta organ.
Introduction
Iscensätt ett effektivt immunsvar mot en patogen kräver komplex integration av signaler som visas av en mängd olika immunceller som ofta sprids mellan organismen. För att kommunicera, dessa celler producerar små lösliga proteiner med flera biologiska funktioner som fungerar som immunmodulerande namngivna cytokiner. Cytokiner kontroll cell rekrytering, aktivering och spridning och därmed är kända för att vara viktiga aktörer i främjandet av immunsvar1. Effektiva immunsvar kräver cytokiner att släppas i ett mycket organiserat spatiotemporal mönster som förbinder specifika celler för att inducera specifika signaler. Därför är det viktigt att studera cytokin produktion och dess signalering in situ, med hänsyn till den mikromiljö där cytokiner produceras.
Auktor (L. monocytogenes) är en grampositiv intracellulär bakterie som används som en utmärkt modell för att studera immunsvar mot intracellulära patogener hos möss. En cytokin, IFN gamma (IFNγ) produceras snabbt, inom 24 h efter L. monocytogenes infektion. Det är nödvändigt för patogenen clearance, som möss utslagen för IFNγ är mycket mottagliga för L. monocytogenes infektion2. Ifnγ är pleiotropiska och produceras av flera celler efter infektion3. Medan IFNγ produceras av Natural Killer (NK) celler krävs för direkt anti-bakteriell aktivitet4, ifnγ från andra källor har visat sig ha andra funktioner. Faktum är att vi och andra nyligen funnit att ifnγ produceras av CD8 + t-celler har en specifik funktion i direkt reglera T celldifferentiering5,6,7. Som sådan, förstå vilka celler producerar IFNγ (och i vilken mikromiljö) är avgörande för att dissekera dess funktion.
Den vanligaste tekniken för att studera cytokinproduktion förlitar sig på intracellulär cytokin färgning analyseras av flödescytometri. Denna metod möjliggör samtidig detektering av flera cytokiner kombinerat med cell ytan markörer i ett enda prov, vilket ger ett mycket användbart verktyg för att studera cytokin produktion. Men med hjälp av ovannämnda teknik innebär att förlora all rumslig information. Dessutom förlitar sig cytokin upptäckt ofta på in vitro-återstimulering för att möjliggöra cytokindetektion. Som sådan, kapaciteten hos en given cell för att producera en cytokin analyseras, och det inte nödvändigtvis korrelerar med faktisk cytokin sekretion in situ. Andra metoder använder reporter möss för vilka fluorescerande proteinuttryck korrelerar med cytokin transkription och möjliggör visualisering på en enda cellnivå8. Även om denna metod kan spåra cytokin transkription in situ, det finns ett begränsat antal cytokin-reporter möss tillgängliga. Dessutom kan transkription, översättning och sekretion ibland kopplas bort, och fluorescerande proteiner har en annan halveringstid än den cytokin de rapporterar, vilket gör denna metod ibland inte tillräcklig för in situ cytokin visualisering.
Här beskriver vi en metod för att visualisera in situ cytokin produktion av konfokalmikroskopi vid enkel cell upplösning. Denna teknik möjliggör visualisering av den cellulära källan och omgivande nisch inom vävnaden. Detta protokoll beskriver specifikt visualisering av IFNγ produktion i mjälten av L. monocytogenes infekterade möss, med fokus här på ifnγ produktion av NK-celler och antigen specifika CD8+ T-celler. Emellertid, det kan utökas och anpassas till karakterisering av någon cytokin produktion i samband med andra situationer där cytokiner produceras såsom infektion, inflammation eller autoimmuna sjukdomar, så länge den riktade cytokin kan behållas i celler av intracellulär proteintransport hämmare.
Protocol
Alla experiment med möss var i samförstånd med den brittiska Scientific procedur Act av 1986.
1. adoptiv överföring av antigena-specifika CD8+ T-celler hos möss
- Isolera äggalbumin (ova)-specifika CD8+ t-celler (OTI) uttrycker grönt fluorescerande protein (OTI-GFP) eller rött fluorescerande protein (OTI-RFP) från lymfkörteln suspension av T-cell receptor transgena möss9,10 med hjälp av en mus CD8+ T cell isolering kit enligt tillverkning instruktioner. Förbered cellsuspensionen genom att krossa lymfkörtlar med hjälp av en spruta kolv, som tidigare beskrivits11.
- Överför OTI-GFP-eller OTI-RFP-celler (3 x 106 celler) till C57BL/6-mottagare av vild typ med intravenös injektion enligt beskrivningen i Cahalan, et al.12. Använd möss som vanligtvis är 6 – 12 veckors ålder.
Anmärkning: Det här steget är valfritt och endast krävs för att spåra antigen-specifika CD8+ T-celler.
2. Listeria monocytogenes infektion
- Expandera L. monocytogenes genetiskt modifierade till Express OVA (LM-ova)13 till en exponentiell fas av tillväxt i buljong hjärt infusion vid 37 ° c under mild agitation tills OD600 når 0.08-0.1, som tidigare beskrivits i referens 14.
- Injicera 100 μL (maximal volym = 200 μL) på 0,1 – 0,5 LD50 LM-OVA utspädd i fosfatbuffrad SALTLÖSNING (PBS) genom intravenös injektion med hjälp av en 29 G insulinspruta, till C57BL/6 Wild typ möss mottagare med OTI-GFP eller OTI-RFP celler när det indikeras.
Anmärkning: I våra händer, 0,1 x LD50 LM-OVA motsvarar 2 x 104 Colony Forming enheter (CFU). L. monocytogenes genetiskt modifierad för att uttrycka ägg används för att aktivera tidigare överförda OTI CD8+ T-celler, men andra stammar av L. monocytogenes kan användas.
3. behandling med Brefeldin A (BFA) för att blockera utsöndring av cytokin
- Injicera 250 μg BFA i 200 μL PBS intraperitonealt 6 h före mus offret med hjälp av en 29 G insulinspruta.
Anmärkning: Frystorkade BFA återsuspenderas först i dimetylsulfoxid (DMSO) för att förbereda lager av 25 mg/mL koncentration. BFA späds sedan i PBS vid rumstemperatur (RT) för att undvika kristallisering före injektion. Hämning av cytokinsekretion inducerar ackumulering av IFNγ i celler. Detta är avgörande för cytokindetektion.
4. skörd av mjälten
- Euthanize möss med stigande koncentration av CO2 följt av cervikal dislokation.
Anmärkning: Följ lokal institutionens riktlinjer för Human eutanasi av möss. - Rengör buken med 70% etanol, gör ett snitt med sax för att göra en 1-2 cm skär genom huden på vänster flank av musen, där mjälten ligger. Försiktigt göra ett snitt i bukhinnan att exponera mjälten och ta ut den med pincett. Skörda mjälten, är noga med att inte pressa den med tång eller skära den för att undvika att störa Mjältens arkitektur.
5. fixering av mjälten med PARAFORMALDEHYD (PFA)
- Bered fixativ lösning genom att blanda 3,75 mL PBS och 3,75 mL 0,2 M L-lysin. Tillsätt 21 mg natrium m-periodat och blanda väl. Tillsätt sedan 2,5 mL 4% PFA och 20 μL 12 N NaOH.
Anmärkning: Använd fixativ lösning på samma dag och kassera överskottet. Förvara den inte. Detta fixeringssteg är viktigt om provet innehåller fluorescerande proteiner som GFP. Använd inte PFA som innehåller spår av metanol, eftersom det denaturerar fluorescerande proteiner.
Försiktighet: PFA är giftigt och måste hanteras med försiktighet. - Sänk mjälten i fixativ och fixera för minst 4 h, typiskt 16 – 20 h vid 4 ° c under mild agitation.
- Kassera fixativ lösning och tillsätt 5 mL PBS i 5 minuter vid RT under skonsam omrörning.
- Byt ut PBS med 5 mL färsk PBS-Inkubera i 1 h vid 4 ° c under skonsam omrörning.
- Byt ut PBS med 5 mL 30% sackaros, inkubera i 12 – 24 timmar.
Anmärkning: Denna metod hjälper till att bibehålla vävnadens morfologi. Efter inkubering med sackaroslösning, bör orgeln sjunka i botten av brunnen.
6. frysning och snittning
- Lägg torris i ett stort kärl och placera ett mindre kärl inuti som innehåller ca 50 mL ren metanol och några bitar av torris.
- Torka försiktigt mjälten på en luddfri torka.
- Placera mjälten inuti en bas mögel som innehåller en droppe optimal skärtemperatur (OCT) förening i botten. Var noga med att inte producera några bubblor. Lägg till ULT över mjälten.
- Med tång, deponera basen mögel på ytan av metanol, att se till att den inte vidrör ULT. frysa vävnaden så snabbt som möjligt för att minimera artefakter.
- När den är fryst, Fortsätt med snittning.
Anmärkning: Fryst mjälte kan hållas vid-80 ° c i flera månader. -
Avsnitt vävnaden med hjälp av en cryomicrotome.
- Ställ in kammartemperaturen på kryostaten bör-21 ° c. Snitt av den önskade tjockleken (vanligtvis runt 10 μm). Detta protokoll fungerar med tjocklekar upp till 30 μm.
- Samla sektioner på glas Mikroskop diabilder (se tabell över material) och inspektera visuellt.
Anmärkning: Sektioner kan hållas vid-80 ° c i flera månader.
7. Immunofluorescerande färgning
- Låt avsnittet komma till RT.
- Rita en cirkel med en vätske blockerare (t. ex. PAP-penna) runt vävnads sektionen. Rita utanför ULT eller det kommer inte att fastna.
- När den har torkat, rehydrera provet genom att placera PBS på vävnads sektionen i 5 min.
Anmärkning: Den volym som placeras i avsnittet beror på avsnittets storlek. Vi använder vanligtvis 100 – 300 μL. Låt inte avsnitten torka när de är rehydrerade. - Skölj med PBS minst två gånger för att säkerställa att avsnittet är väl anslutit till bilden.
-
Lägg till blockeringslösning i avsnittet för att minska icke-specifik bindning av antikroppar.
- Förbered blockerande lösning som följer: PBS med 0,1% Triton X100, 2% fetalt kalv serum (FCS), 2,5 μg/mL FC-receptorblockerare (anti-Mouse CD16/32). Tillsätt sedan 2 – 5% normalt serum av arten av varje sekundär antikropp i infärgnings panelen.
Anmärkning: Om antikropparna är direkt konjugerade/biotinylerade, tillsätt 5% normalt serum av arten av varje primär antikropp. Om en primär antikropp och en av de sekundära antikropparna är från samma art (t. ex. primär antikropp som föds upp hos kanin och sekundär kanin mot råtta), Använd inte de normala serum arterna eftersom det kommer att öka bakgrunds signalen. - Ta försiktigt bort PBS från sektionen genom aspiration och tillsätt 100 μL av den blockerande lösningen per prov sektion. Inkubera i en täckt våt kammare i minst 1 h vid RT.
- Förbered blockerande lösning som följer: PBS med 0,1% Triton X100, 2% fetalt kalv serum (FCS), 2,5 μg/mL FC-receptorblockerare (anti-Mouse CD16/32). Tillsätt sedan 2 – 5% normalt serum av arten av varje sekundär antikropp i infärgnings panelen.
-
Fläcken med primära antikroppar.
- Späd de primära antikropparna vid den optimala koncentrationen i den blockerande lösningen. Den allmänna utgångspunkten antikroppskoncentrationen är 5 μg/mL, men den bör optimeras för varje antikropp och vävnad.
Anmärkning: Om antikropparna är direkt konjugerade, Centrifugera antikropps blandningen vid 17,135 x g (13,500 rpm) i 15 min vid 4 ° c innan den tas i användning. Fluorophores kan fällas ut. Detta steg kommer att pelleten fällning och därmed förhindra icke-specifik avsättning av utfälld antikroppar på bilden. - Ersätt den blockerande lösningen med den primära antikropps blandningen för varje prov.
- Inkubera i 4 timmar vid RT eller övernattning (OVN) vid 4 ° c i en täckt våt kammare.
- Späd de primära antikropparna vid den optimala koncentrationen i den blockerande lösningen. Den allmänna utgångspunkten antikroppskoncentrationen är 5 μg/mL, men den bör optimeras för varje antikropp och vävnad.
-
Utför tvätt.
- Förbered tvättbuffert genom att tillsätta 2% FCS till PBS.
- Tvätta 4 gånger med tvättbuffert: en snabb (utan inkubation), en för 10 min och två för 5 min. Utför sedan en slutlig tvätt med PBS i 5 min.
-
Färgning med sekundära antikroppar.
- Späd de sekundära antikropparna av intresse vid den optimala koncentrationen i den blockerande lösningen. Centrifugera blandningen enligt beskrivningen för de primära antikropparna.
- Ta bort den slutliga tvättlösningen. Tillsätt den sekundära antikropps blandningen ovanpå sektionen och inkubera i 1 – 4 timmar vid RT i en täckt våt kammare.
- Tvätta 4 gånger med tvättbuffert: en snabb (utan inkubation), en för 10 min och två för 5 min. Utför sedan en slutlig tvätt med PBS i 5 min.
- Ta bort den slutliga tvättlösningen. Låt PBS avdunta men torka inte av den. Placera en droppe av monterings mediet ovanpå provet och placera försiktigt täckglaset ovanpå det. Monterings mediet måste återvinna hela sektionen. Låt det polymeras OVN på RT skyddas från ljus.
Anmärkning: Rita en cirkel runt avsnittet på baksidan av bilden innan du applicerar monterings mediet. När monterings mediet appliceras kan vävnaden bli svår att se. - Förvara bilderna i mörker vid 4 ° c tills bilden är klar.
8. avbildning och analys
- Utför avbildning av färgningen med ett konfokalmikroskop.
Anmärkning: I detta protokoll, en inverterad spektrallaser scanning Mikroskop användes (se tabellen av material), tillsammans med målen 10X/na 0,40 eller 60x/na 1,4 (för analys av cytokin sub-cellulär lokalisering). Våglängder av excitation och emission visas för varje fluorophore och fluorescerande protein i tabellen av material. - Utför analys och kvantifiering enligt behov med hjälp av bildbehandlings program (t. ex. Imaris eller Fiji).
Representative Results
IFNγ produceras inom de första 24 h efter Listeria monocytogenes infektion är avgörande för att kontrollera spridningen av denna patogen. Med det här protokollet kan vi inte bara visualisera vilka celler som producerar IFNγ, utan även om de finns i en viss mikromiljö. För att hjälpa oss att avgränsa arkitekturen i mjälten, vi märkt celler kända för att ha särskild plats inom mjälte. Markören F4/80 etiketter alla makrofager och belyser den röda massan. Markören B220 etiketter B-celler och belyser B-cellfolliklar som omger T-cellzonen. Markören CD169 etiketter marginella zonen makrofager, som omger den vita massan (figur 1). De flesta OTI celler, oavsett om de uttrycker IFNγ eller inte, finns i den vita massan och som sådan, alla bilder är de av vit massa, om inte anges.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är användningen av BFA för att hämma cytokin sekretion. Upptäckten av IFNγ av NK-celler var i själva verket kraftigt försämrad när möss inte behandlades med BFA (figur 2). Med hjälp av vårt protokoll, kunde vi hitta att minst två celltyper producera IFNγ 24 h efter infektion-NK-celler och antigen-specifika CD8+ T-celler (figur 3)-i likhet med vad som tidigare har hittats av flödescytometri3.
In situ-avbildning av IFNγ-producerande celler visade att produktionen av IFNγ inte sprids i mjälten utan koncentreras till diskreta områden (figur 4). Vi fann faktiskt att T-celler aktiverades i hela mjälten (markerad med T-cellskluster), och detta korrelerar inte nödvändigtvis med IFNγ-produktion. En sannolik förklaring är att produktionen av ifnγ är begränsad till placeringen av de infekterade cellerna15,16, och T cell aktivering — representeras av klustring — kan stödjas av både infekterade (ifnγ positiva) och icke-infekterade (ifnγ negativa) antigen-presenterande celler. Andra fläckar kommer att krävas för att lokalisera den exakta platsen och få en indikation på mekanismen begränsa IFNγ produktion till detta område och dess förhållande till antigen överföring. Intressant, vi fann att aktiverad, klustrade, antigen-specifika T-celler finns i hela den vita massan av mjälten men de producerar IFNγ endast i regioner där NK celler är samexisterande med dem (figur 5). Som sådan, närvaron av NK-celler avgränser en viss mikromiljö i den vita massan, där klustrade T-celler producerar IFNγ i motsats till klustrade T-celler i den andra delen av den vita massan. Detta tyder på att T cell aktiveringen inte är tillräcklig för att diktera IFNγ produktion vid denna tidpunkt.
En annan intressant funktion som lyfts fram av vårt protokoll är de olika sub-cellulära lokalisering av IFNγ i NK kontra CD8+ T-celler5. Som visas i figur 6, medan ifnγ lokalisering i NK-celler sprids i CYTOSOL, CD8+ T celler rekrytera ofta ifnγ mot en annan T-cell.
Figur 1: markörer som belyser Mjältens uppbyggnad. Möss var infekterade med 2 x 104 CFU LM-OVA och euthanized 24 h post infektion. Mjälten var explanterad och bearbetas enligt beskrivningen i protokollet. (A) sektionerna färgas för NK-celler (anti-NCR1 följt av anti-Goat IgG-FITC; grön), OTI-RFP-celler (röda) och makrofager (anti-F4/80-APC; magenta). RP = röd massa; WP = vit massa. Skalstapel = 200 μm.b) sektionerna färgas för b-celler (anti-B220-Pacific Blue; ), OTI-GFP-celler (GFP-signal som visas i rött) och marginal zons makrofager (anti-CD169-Alexa647; magenta). RP = röd massa; BF = B cell follikel; TZ = T cell zon. Skalstapel = 50 μm. Detta är en representativ bild av 3 oberoende experiment (N = 4). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: BFA-behandling möjliggör detektion av intracellulär IFNγ in situ. Produktionen av nγ är begränsad till specifika områden i Sple-möss var infekterade med 2 x 104 CFU LM-OVA och behandlades med BFA (a) eller lämnas obehandlad (B) efter 18 h. var euthanized 24 h post infektion. Mjälten var explanterad och bearbetas enligt beskrivningen i protokollet. Sektionerna färgas för NK-celler (anti-NCR1 följt av anti-Goat IgG-FITC; grön), OTI-RFP-celler (röd) och IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). Skalstapel = 5 μm. Detta är en representativ bild av NK cell-rika områden från 3 oberoende experiment (N = 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: IFNγ producerar celler i mjälten. Möss var infekterade med 2 x 104 CFU LM-OVA när det indikeras och behandlades med BFA efter 18 h. möss var euthanized 24 h post infektion. Mjälten var explanterad och bearbetas enligt beskrivningen i protokollet. Sektionerna färgas för NK-celler (anti-NCR1 följt av anti-Goat IgG-FITC; grön), OTI-RFP-celler (röd) och IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). (A) representativ bild av en mjälte från en icke-infekterad naiv mus för att påvisa avsaknad av IFNγ-ospecifik färgning. Vita linjer avgränsa den vita massan. WP = vit massa; RP = röd massa. Brepresentativ bild av den vita massan från mjälten från en mus som INFEKTERATS av LM-OVA och som visar invasionen av NK-celler till den vita massan och produktionen av IFNγ av NK-celler, OTI-celler och icke-märkta celler. Bilderna är representativa för 4 oberoende experiment (N = 4). Skalstreck = 70 μm (A); och 20 μm (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: IFNγ-produktion är begränsad till specifika områden i mjälten efter LM-OVA-infektion. Möss var infekterade med 2 x 104 CFU LM-OVA och behandlades med BFA efter 18 h. möss var euthanized 24 h post infektion. Mjälten var explanterad och bearbetas enligt beskrivningen i protokollet. Alla sektioner färgas för B-celler (B220-Pacific Blue AB, Blue) och IFNγ (anti-IFNγ-biotin följt av streptavidin-PE; cyan). GFP-celler (GFP-signalen visas i rött). Cyan linjer motsvarar områden med hög IFNγ produktion. De är representativa avbildar av 4 oberoende experiment (N = 4). (A) sektionerna färgas för marginella zoner makrofager (anti-CD169-Alexa 647, magenta). Skalstapel = 50 μm.B) sektionerna färgas för alla makrofager (F4/80). Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: IFNγ produktion av aktiverade OTI celler uppstår i en viss mikromiljö. Möss var infekterade med 2 x 104 CFU LM-OVA och behandlades med BFA efter 18 h. möss var euthanized 24 h post infektion. Spleens var explanterad och bearbetas enligt beskrivningen i protokollet. Sektionerna färgas för NK-celler (anti-NCR1 följt av anti-Goat IgG-FITC; grön), OTI-RFP-celler (röd) och IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). Gröna och röda linjer markerar NK respektive OTI cell zoner. Vit pil indikerar exempel på T-cellskluster som inte producerar IFNγ. Gröna pilar exempel på T-cellskluster som producerar IFNγ. Skalstapel = 100 μm. Detta är en representativ bild av fyra oberoende experiment (N = 4). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: subcellulär lokalisering av IFNγ i NK-celler och T-celler. Möss var infekterade med 2 x 104 CFU LM-OVA och behandlades med BFA efter 18 h. möss var euthanized 24 h post infektion. Mjälten var explanterad och bearbetas enligt beskrivningen i protokollet. Alla sektioner färgas för IFNγ (anti-IFNγ-BV421; cyan). Vita linjer avgränsa cellkanter och vita pilar visar riktningen av sekretion. Detta är en representativ bild av två oberoende experiment (N = 5). (A)-OTI-RFP-celler visas i rött. Skalstapel = 5 μm. (B) sektionerna färgas för NK-celler (anti-NCR1 följt av anti-Goat IgG-FITC; grön. Scale bar = 2 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I detta manuskript presenterar vi en metod för att visualisera produktionen av IFNγ i mjälten efter L. monocytogenes infektion hos möss. Detta protokoll är enkelt och kan anpassas till andra vävnader och utlöser cytokiner, men följande aspekter måste övervägas. Celler ofta snabbt utsöndrar de cytokiner de producerar, och cytokiner snabbt plockas upp av angränsande celler. Det är så svårt att upptäcka cytokiner på plats. En vanlig metod för att snabbt åter initiera cytokin produktion är att åter stimulera cellerna ex vivo följt av cytokin detektion i medierna genom enzymkopplad immunosorbent assay. I detta sammanhang förloras all information om den rumsliga lokaliseringen av de cytokinproducerande cellerna. Dessutom, cytokin produktion efter omstimulering inte nödvändigtvis reflektera om cytokiner faktiskt produceras och utsöndras in vivo, utan snarare indikerar kapaciteten hos en viss cellpopulation att producera cytokiner. Därför kommer båda metoderna att ge olika information och man bör överväga vilken information som är mest värdefull för deras experiment.
För att upptäcka intracellulära cytokiner, vår metod använder en intracellulär proteintransport hämmare att fälla cytokiner inuti celler och öka signaldetektering. Emellertid, det är viktigt att notera att dessa hämmare påverkar den normala transporten av proteiner från endotelceller nätmagen (re) till Golgi apparaten och att den sekretoriska vesikeln försämra deras frisättning, vilket kan orsaka toxicitet. Som en följd, BFA, eller andra hämmare, bör användas under en kort tid, vanligtvis inte mer än några timmar. Därför, det är viktigt att hitta rätt balans mellan inhibitor dos och tid för behandling för att optimera nivån av cytokiner fångade inuti cellen utan att orsaka allvarliga cytotoxiska effekter. Dessa variabler kan skilja sig mellan cytokiner och administreringsväg för BFA. I vår infektions modell administrerades BFA intraperitonealt för att ge en snabb systemisk dispersion, men det kan också levereras intravenöst.
De mest använda intracellulära proteintransport hämmare är BFA, används här, och monensin (MN). Dessa hämmare används ofta otydligt att ackumulera och studera cytokin produktion men de har små skillnader i deras verkningsmekanismer. MN hämmar transporten av proteiner inom Golgi apparaten därmed ackumulera proteiner i Golgi17 medan BFA förhindrar coatomer protein Complex-I rekrytering, hämma retrograd förflyttning av proteiner till endoplasmatiska Retikulum (er) och därigenom främja ackumulering av cytokiner i ER18. Som sådan, att välja den bästa intracellulära proteintransport hämmare kommer att bero på olika faktorer, såsom cytokin som ska upptäckas. Till exempel, det har visats i lipopolysackarid-inducerad intracellulär färgning av monocyter att BFA är mer effektivt att mäta cytokinerna IL-1 β, IL-6 och TNF än MN19.
Detta protokoll innebär visualisering av cytokin in situ av konfokalmikroskopi och därför finns det bara ett begränsat antal markörer än vad som kan användas för att studera de cytokinproducerande cellerna och deras mikromiljö. Det är också nödvändigt att överväga att proteintransport hämmare såsom BFA eller MN stör det normala uttrycket av flera proteiner och därmed deras användning när man studerar det samtidiga uttrycket av vissa aktiverings cell yta markörer måste kontaktas Noggrant. Till exempel BFA men inte MN blockerar uttrycket av CD69 i murin lymfocyter20. Trots denna begränsning, konfokalmikroskopi Imaging möjliggör sub-cellulära lokalisering av cytokiner, samt riktningen av cytokin sekretion i cellen. De data som genereras med hjälp av detta protokoll tyder på att NK-celler tenderar att utsöndra IFN-y i ett diffust mönster medan CD8+ t celler verkar rikta IFNγ sekretion mot andra CD8+ t-celler som är i direkt interaktion med dem5.
Sammanfattningsvis är detta protokoll lämpligt att visualisera en mängd olika cytokiner på plats och identifiera producerande celler och deras mikromiljö efter många triggers såsom infektion eller autoimmunitet. Den information som erhålls är avgörande för att förstå vikten av in vivo rumsliga orkestrering av olika celltyper och cytokin de producerar, nödvändigt för ett effektivt immunsvar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Kennedy Institute Imaging Facility personal för teknisk assistans med Imaging. Detta arbete stöddes av bidrag från Kennedy Trust (till AG), och bioteknik och biologiska vetenskaper forskningsrådet (BB/R015651/1 till AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |
| Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |
| L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |
| D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |
| Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |
| O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |
| Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml |
| Microscope slides - Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |
| anti-CD169 - AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
| anti-F4/80 - APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
| anti-B220 - PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/mL Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
| anti-IFNg - biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL |
| anti-IFNg - BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/mL Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
| anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/mL |
| anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/mL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Streptavidin - PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mL Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
| Streptavidin - FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/mlL Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Cover glasses 22 mm x 40 mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |
| Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |
| Imaris - Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Confocal microscope - Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||
| Cryostat - CM 1900 UV | Leica | ||
| Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |
| PBS 1x | Life Technologies Ltd | 20012068 | |
| BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |
| GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||
| RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||
| Insulin syringe, with needle, 29 G | VWR International | BDAM324824 | |
| C57BL/6 wild type mice | Charles River |
References
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Kubota, K., Kadoya, Y. Innate IFN-gamma-producing cells in the spleen of mice early after Listeria monocytogenes infection: importance of microenvironment of the cells involved in the production of innate IFN-gamma. Frontiers in Immunology. 2 (26), (2011).
- Dunn, P. L., North, R. J. Early gamma interferon production by natural killer cells is important in defense against murine listeriosis. Infection and Immunity. 59 (9), 2892-2900 (1991).
- Krummel, M. F., et al. Paracrine costimulation of IFN-gamma signaling by integrins modulates CD8+ T cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), 11585-11590 (2018).
- Curtsinger, J. M., Agarwal, P., Lins, D. C., Mescher, M. F. Autocrine IFN-gamma promotes naive CD8+ T cell differentiation and synergizes with IFN-alpha to stimulate strong function. Journal of Immunology. 189 (2), 659-668 (2012).
- Hosking, M. P., Flynn, C. T., Whitton, J. L. Antigen-specific naive CD8++ T cells produce a single pulse of IFN-gamma in vivo within hours of infection, but without antiviral effect. Journal of Immunology. 193 (4), 1873-1885 (2014).
- Croxford, A. L., Buch, T. Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned. Immunology. 132 (1), 1-8 (2011).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8++ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. Journal of Visualized Experiments. (9), 409 (2007).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. Journal of Visualized Experiments. (7), 265 (2007).
- Pope, C., et al. Organ-specific regulation of the CD8+ T cell response to Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 166 (5), 3402-3409 (2001).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance. Current Protocols in Microbiology. 31, 1-7 (2013).
- Kang, S. J., Liang, H. E., Reizis, B., Locksley, R. M. Regulation of hierarchical clustering and activation of innate immune cells by dendritic cells. Immunity. 29 (5), 819-833 (2008).
- Chang, S. R., et al. Characterization of early gamma interferon (IFN-gamma) expression during murine listeriosis: identification of NK1.1+ CD11c+ cells as the primary IFN-gamma-expressing cells. Infection and Immunity. 75 (3), 1167-1176 (2007).
- Mollenhauer, H. H., Morre, D. J., Rowe, L. D. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1031 (2), 225-246 (1990).
- Helms, J. B., Rothman, J. E. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature. 360 (6402), 352-354 (1992).
- Schuerwegh, A. J., Stevens, W. J., Bridts, C. H., De Clerck, L. S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes. Cytometry. 46 (3), 172-176 (2001).
- Nylander, S., Kalies, I. Brefeldin A, but not monensin, completely blocks CD69 expression on mouse lymphocytes: efficacy of inhibitors of protein secretion in protocols for intracellular cytokine staining by flow cytometry. Journal of Immunology Methods. 224 (1-2), 69-76 (1999).
