Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantificering af åreforkalkning i mus

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59828
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Cardiovascular Medicine Unit, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute for Molecular Medicine, University of Southern Denmark (SDU)

Summary

Murine modeller af åreforkalkning er nyttige værktøjer til at undersøge patogene veje på et Molekylær niveau, men kræver standardiseret kvantificering af læsion udvikling. Denne protokol beskriver en optimeret metode til at bestemme læsion størrelse i de store arteriel beholdere, herunder aorta roden, aortabuen, og brachiocephalic arterie.

Abstract

Hjerte-kar-sygdom er den vigtigste dødsårsag i verden. Den underliggende årsag i de fleste tilfælde er åreforkalkning, som er delvis en kronisk inflammatorisk sygdom. Eksperimentelle åreforkalkning undersøgelser har belyst rollen af kolesterol og inflammation i sygdomsprocessen. Dette har ført til vellykkede kliniske forsøg med farmaceutiske agenter, der reducerer kliniske manifestationer af åreforkalkning. Omhyggelig og velkontrollerede eksperimenter i musemodeller af sygdommen kunne yderligere belyse patogenesen af sygdommen, som ikke er fuldt forstået. Standardiseret læsions analyse er vigtig for at reducere eksperimentel variabilitet og øge reproducerbarhed. Bestemmelse af læsion størrelse i aorta rod, aortabuen, og brachiocephalic arterie er fælles endepunkter i eksperimentel åreforkalkning. Denne protokol giver en teknisk beskrivelse til vurdering af åreforkalkning på alle disse steder i en enkelt mus. Protokollen er særlig nyttig, når der er tale om begrænset materiale, hvilket ofte er tilfældet, når genetisk modificerede dyr er karakteriseret.

Introduction

Hjerte-kar-sygdom er den vigtigste dødsårsag i verden med iskæmisk hjertesygdomme og slagtilfælde tegner sig for en ud af fire dødsfald1. De fleste tilfælde er forårsaget af åreforkalkning, en sygdom karakteriseret ved en langsom ophobning af lipid-lastet plaques med tegn på kronisk inflammation i store og mellemstore arterier2. Sygdommen normalt forbliver ubemærket over flere årtier, indtil en ruptur eller erosion af plaque fremkalder en arteriel trombose, der fører til iskæmisk vævsskade.

En normal arterie består af et intima lag med endotelceller og tyndt fordelte glatte muskelceller, et medielag med glatte muskelceller og elastik lamel, og et omgivende utilsigtet lag med løst bindevæv3. En intima fastholdelse af LDL forskydninger åreforkalkning udvikling4. Ophobning og modifikation af lipoproteiner fører til aggregering og fastklemning inden for arteriel intima5. En inflammatorisk respons er fremkaldt af de fangede og modificerede lipoproteiner6. Endotelceller begynder at udtrykke vedhæftnings molekyler, såsom VCAM-1 på steder i arteriel træet med turbulent blodgennemstrømning, hvilket fører til rekruttering af cirkulerende monocytter og andre leukocytter7. De infiltrerende monocytter skelner i makrofager, der opsluge lipid med efterfølgende omdannelse til makrofag skum celler8.

Atherosclerose er blevet undersøgt i musemodeller med stigende hyppighed siden midten af 1980 ' erne. C57BL/6 er den mest almindeligt anvendte indavlede musestamme for disse undersøgelser, og det bruges som den genetiske baggrund for de fleste genetisk modificerede stammer9. Denne stamme blev etableret i 1920 ' er10, og dens genom blev offentliggjort i 200211. Eksperimenter i musemodeller har flere fordele: kolonierne gengiver hurtigt, huset er pladsbesparende, og indavl reducerer eksperimentel variabilitet. Modellen giver også mulighed for genetiske manipulationer, såsom målrettede gensletninger og indsættelse af transgener. Dette har ført til ny patofysiologisk forståelse af sygdommen og nye terapi mål12.

Wild-type C57BL/6 mus er naturligt resistente over for åreforkalkning. De har de fleste af de cirkulerende kolesterol i HDL, og komplekse aterosklerotiske læsioner dannes ikke selv når fodret en højt fedtindhold og højt kolesteroltal kost13. Hyperkolesterolemic mus, såsom ApoE-/- på C57BL/6-baggrund, anvendes derfor som eksperimentelle modeller af åreforkalkning14,15. Manglen på ApoE hæmmer hepatisk optagelse af rest lipoproteiner og alvorligt foruroliger lipid metabolisme. I ApoE-/- mus er cirkulerende kolesterol overvejende i VLDL-partikler, og musene udvikler komplekse aterosklerotiske plaques på en almindelig Chow diæt.

Ldlr-/- mus efterligner udviklingen af aterosklerose set hos mennesker med familiær hyperkolesterolæmi16. Ldlr-/- mus har brug for en vestlig type kost for at udvikle åreforkalkning17. Vestlig kost efterligner menneskelig fødeindtagelse og indeholder normalt 0,15% kolesterol. LDL-receptoren genkender ApoB100 og ApoE og medierer optagelsen af LDL-partikler gennem endokytose. LDL-receptorer er grundlæggende for lever clearance af LDL fra cirkulation, mens LDL-receptor ekspression i hæmatopoietiske celler ikke påvirker denne proces. Dette åbner mulighed for knoglemarvstransplantation af ldlr+/+ celler til hyperkolesterolemic ldlr-/- modtagere og vurdering af åreforkalkning udvikling. Knoglemarv kimærer har almindeligvis været anvendt til at studere deltagelse af hæmatopoietiske celler i eksperimentel åreforkalkning. Men, knoglemarvstransplantation kan påvirke størrelsen og sammensætningen af aterosklerotiske plaques, gør fortolkningen af resultaterne tvetydige.

Forskellige varianter af ApoE-/- og ldlr-/- mus med yderligere genetiske ændringer er blevet udviklet til at studere specifikke processer af sygdommen18. Et eksempel er human APOB100-transgene ldlr-/- (hubl) mus, der bærer fuld længde menneske APOB100 gen19,20. Disse mus udvikler hyperkolesterolæmi og åreforkalkning på en regelmæssig Chow kost. Men, udviklingen af komplekse aterosklerotiske plaques tager mindst seks måneder og kortere eksperimentelle protokoller normalt bruge vestlig kost21. En stor brøkdel af plasma kolesterol cirkulerer i LDL-partikler, hvilket giver hubl -mus en mere menneskelig-lignende dyslipidemisk lipoprotein profil sammenlignet med ApoE-/- og ldlr-/- mus. Hubl -mus tillader også studier af human apob som Auto antigen22.

Musens modeller af åreforkalkning udvikle komplekse aterosklerotiske plaques med fælles træk ved sygdomme hos mennesker. Men, plaques er temmelig modstandsdygtige over for ruptur med efterfølgende myokardieinfarkt. Aterotrombose er kun sporadisk detekteres og eksperimentelt udfordrende at vurdere23,24,25. Der er udviklet særlige modeller for plaque ruptur, men forsøgsområdet mangler en pålidelig og reproducerbar model til vurdering af plaque-stabiliserende stoffer.

Kvantificering af åreforkalkning er blevet rapporteret på mange måder i litteraturen. De seneste bestræbelser har forsøgt at standardisere eksperimentel design, udførelse og rapportering af dyreforsøg26. Efterforskere har forskellige præferencer og teknikker tilpasset deres laboratorier. De fleste forskningsprojekter er også unikke på en måde, at de kræver nogle protokol ændringer. På grund af sygdommens multifaktorielle karakter varierer de optimale Kontroller mellem projekterne. Lokale forhold og manglende standardisering kan forårsage observerede forskelle i sygdomsudvikling, hvilket hæmmer fremskridtene på forskningsområdet. Forskelle i eksperimentel variation betyder også, at beregninger af statistisk effekt skal baseres på pilotundersøgelser under lokale forhold.

Kvantificering af åreforkalkning anbefales på flere steder i det vaskulære træ. Denne protokol beskriver, hvordan man kan opnå resultater fra aorta roden, aorta Arch, og brachiocephalic arterie i en enkelt mus, ud over at forlade resten af thoracoabdominal aorta for andre analyser. En ansigts præparater giver mulighed for hurtig kvantificering af lipid-ladede plaques i aortabuen. Sygdomsbyrden i brachiocephalic arterien kan også kvantificeres, hvis prøverne er omhyggeligt vist. Jo mere tidskrævende Cross-skæring af aorta roden efterlader flere sektioner til rådighed for detaljeret vurdering af plaque sammensætning.

Protocol

Alle dyreforsøg kræver godkendelse af etiske myndigheder.

1. mus offer og Microdissection af aorta

  1. Ofrer musen ved CO2 kvælning og rekord vægt.
  2. Spray musen med 70% ethanol for at undgå pels forurening af prøverne. Placer musen i en liggende position. Fra den jugulære hak, lave en midterlinje indsnit ved hjælp af Mayo saks udvide det næsten ned til den kønsbehåring knogle.
    Forsigtig: Høj procentdel ethanol er meget brandfarlig og kan forårsage alvorlig øjenirritation. Træffe retsbevarende foranstaltninger.
  3. Brug en 23 G nål til afblødning musen ved hjerte punktering gennem thorax væggen. Denne procedure giver normalt 750 μL blod fra en 20 ugers gammel mus. Typisk indsamle halvdelen af volumen i en tri-kalium EDTA-coated rør og den anden halvdel i et serum eller lithium heparin-belagt rør. Drej forsigtigt rørene og opbevar dem ved stuetemperatur indtil videre forarbejdning.
  4. Brug Mayo saks til at skære parietal bughinden i midterlinjen for at åbne bughulen. Hold xiphoid processen med vævs tang og skær åbne bughinden sideværts på begge sider og fortsætte med at åbne membranen.
    1. Brug Mayo saks til at åbne brysthulen ved at skære gennem rib bur så sideværts som muligt. Dette vil muliggøre brede vinkler for instrumenterne, mens microdissecting aorta senere.
  5. Lav et snit i den rigtige øremuslingen for perfusion væske dræning. Indsæt en 27 G nål gennem spidsen af hjertet i kranie retning. Hold nålen fast i venstre ventrikel, mens du langsomt perfektionere musen med 10 mL iskold fosfat-Buffered saltvand (PBS) under minimum 2 min. observere leveren skiftende i farve og få paler.
    Bemærk: Nogle protokoller bruger PARAFORMALDEHYD perfusion, men dette interfererer med flere downstream-applikationer, såsom immunohistokemisk analyse af lymfocytter. Derfor udføres ingen perfusions fiksering med PARAFORMALDEHYD i denne protokol.
  6. Dissect organer af interesse (f. eks lymfeknuder, milt, leveren, tarm, inginal fedt puder, nyrer, etc.) ved hjælp af anatomiske pincet og dissekere saks.
  7. Skær luftrør og spiserøret på højre side af hjertet uden at beskadige aortabuen. Skær mellem gulvet og strukturer, som fastgør indvolde til retroperitoneum, forlader hjertet, aorta, og nyrer in situ. Fold lungerne og indvolde, og dæk dem med en serviet for at påbegynde retroperitoneal mikrodissektion af para-aorta lymfeknuder og abdominal aoronom.
  8. Start microdissection under et stereomicroskop ved 6x forstørrelse. Begynd at dissekere aorta bifurcation ved at løfte omgivende væv med Dumont tang og skæring under spænding med Vannas saks.
    1. Fortsæt dissektion af abdominal aorta cranially. Skær abdominale grene fra aorta og befri aorta proklielt gennem aorta pause i mellem gulvet.
      Bemærk: Microdissection kræver præcis hånd-øje koordination gennem stereomicroskop, som tager nogle praksis at mestre.
  9. Fjern fedtvæv, der dækker thorax aorta. Forsigtigt dissekere dorsalt af thymus at frigøre aortabuen med grene. Fortsæt dissekerende halspulsåren så fikseres som muligt i brysthulen. I særlige tilfælde, hals dissektion kunne udføres for at omfatte carotis bifurcation.
  10. Rengør instrumenterne ved fortløbende skylning i deioniseret vand, RNase dekontaminerings løsning, 70% ethanol og PBS, før du rent faktisk skærer aorta. Løft hjertet ved spidsen med pincet. Skær aorta tæt på hjertet og Placer hele hjertet i et rør med PBS. Hjertet kunne opbevares på is i et par timer før fortsat behandling og cryomounting aorta roden.
  11. Skær aortabuen i henhold til figur 1a. Aortabuen sættes i et rør, der indeholder 1 mL 4% formaldehyd natten over ved 4 °C. Præparatet kan opbevares på denne måde i flere år før fastgørelse og analyse.
    Forsigtig: Formaldehyd kan fremkalde kræft, allergiske hudreaktioner og er skadelig ved indtagelse. Brug personligt beskyttelsesudstyr efter behov.
  12. Dissekere den resterende faldende aorta og sætte det i en RNA stabilisering løsning eller snap fryse det til efterfølgende RNA-analyse eller anden applikation. Optimering af arbejdsstrømmen for at minimere dissektions tid er afgørende for at undgå overdreven RNA-nedbrydning.
  13. Sæt blodindsamlings rørene (opsamlet i trin 1,3) i en centrifuge. Skru ned for de separate plasma-og serum-rør ved 1.500 x g i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør forsigtigt plasma og serum til mikrocentrifuge glas og opbevar ved-80 °C. Indsamling af både EDTA-og hepariniserede plasma-eller serum blade muligheder for flere downstream-applikationer.
  14. Placer hjertet på en kork seng med den ventrale side opad. Fastgør hjertet til kork med en nål gennem spidsen. Hold bunden af hjertet med anatomiske pincet.
    1. Brug en skalpel til at klippe den apikale 2/3 af hjertet væk med retningen af snittet som en linje mellem de to ører med skalpel vinklet 20 ° caudally i sagittale flyet og 20 ° kranie i det tværgående plan (figur 1b).
  15. Integrer aorta roden i optimal skæring temperatur (OCT) sammensatte, som omgiver, men ikke infiltrere vævet. Sænk bunden af hjertet i OCT sammensatte. Klem forsigtigt hjertet med pincet for at fylde aorta roden med OLT og fjern eventuelle luftbobler.
  16. Prøven overføres til bunden af en kryomgammel fyldt med okt. Aorta roden bør nu være vinkelret på den nederste overflade. Sæt det monterede hjerte på tøris for at fryse. Prøverne opbevares i zip-låse poser i-80 °C, indtil de forfølger kryosectioning i henhold til punkt 3 i denne protokol.

Figure 1
Figur 1: hjerte og aorta bue in situ. A) lunger, luftrør, spiserøret og thymus fjernes for at vise aortabuen in situ i en 20 uger gammel kvindelig ApoE-/- mus på regelmæssig Chow kost i en Mikrograf, skala bar = 2 mm. De stiplede linjer angiver, hvor man skal klippe aortabuen og dens grene. (B) en skematisk skildring af hjertet og aorta. Den stiplede linje i rødt angiver, hvor hjertet skal skæres, før den aorta rod kryomountes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. en ansigts analyse af aortabuen og brachiocephalic arterien

  1. Forbered fastgørelse af senge til en ansigts analyse af aorta buer. Fold et segment af paraffinvoks film otte gange for at gøre en flad 25 mm x 25 mm overflade. Wrap det med sort elektrisk isoleringstape til at gøre en mørk baggrund for aorta. Placer en etiket på bagsiden af fastgørelse af-sengen, og brug blyblyant til at skrive muse identifikationsnummeret (normal penneblæk forsvinder i farvningsprocessen).
  2. Overfør aortabuen til fastgørelse af sengen og Placer en dråbe PBS oven på den. Begynd at rense aorta fra det resterende periadventielle fedtvæv under et stereomicroskop.
    1. Brug Vannas saks og Dumont pincet til forsigtigt at skrælle det omgivende fedtvæv væk uden at manipulere eller beskadige aorta. Sudan IV vil bejdse fedtvæv smukt, og det er afgørende at fjerne alle sådanne væv på dette punkt.
      Bemærk: Hold aorta fugtig til enhver tid anvende yderligere PBS når det er nødvendigt.
  3. Skær åben aorta i det koronale plan ved at introducere Vannas saks i aorta lumen for at udsætte den intimale overflade. Begynd at skære den ydre krumning af den stigende bue i distale retning og fortsætte med at skære åbne grenene, herunder brachiocephalic arterie. Skåne rygdelen af den nedadgående thorax region.
    1. Skær åben den mindre krumning og fold åben aorta for at vise den intimale overflade.
      Bemærk: Dette trin kræver fine motoriske færdigheder og har brug for nogle praksis at mestre.
  4. Fastgør den åbne bue til fastgørelse af sengen ved hjælp af den stumme ende af minutien insekt stifter. Brug en Micro Castroviejo nål holder til at sætte benene på plads. Bøje forsigtigt benene væk fra præparatet, når de er på plads. Fastgør aorta fladt på sengen uden at strække prøven. Opbevar den fastgjorte bue nedad i en Petri skål fyldt med PBS ved 4 °C.
    Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her.
  5. Forberede en fungerende løsning af Sudan IV. Bland 1 g Sudan IV pulver, 100 mL 70% ethanol, og 100 mL acetone i en mørk flaske og rør forsigtigt i 10 min. Der er ingen grund til at filtrere opløsningen, og den kan bruges i et par måneder, hvis den holdes mørk ved stuetemperatur. Hvis farvnings farven ikke er tilfredsstillende, kan der laves en ny opløsning, og prøverne farves igen.
    Forsigtig: Acetone er en Brandfarlig væske, der kan forårsage alvorlig øjenirritation. Opbevares på et godt ventileret sted og træffe forholdsregler ved håndtering.
  6. Arranger fem Petri skåle på laboratorie bænken: en fyldt med 70% ethanol, en fyldt med Sudan IV arbejds løsning, to fyldt med 80% ethanol, og en fyldt med PBS.
    1. Begynd med at skylle prøven i 70% ethanol i 5 minutter ved at anbringe fastgørelse af sengen i den første Petri skål med buen vendt nedad. Overfør prøven til Sudan IV arbejds løsning og lad det plette buen i 7 min.
    2. Dernæst skylles i 80% ethanol i 3 min to gange for at deplette den normale intimale overflade. Affarvnings tiden kan justeres for at optimere resultaterne. Endelig skylles i PBS før du sætter præparatet tilbage i den oprindelige Petri skål.
  7. Få mikrografer ved hjælp af et stereoanlæg ved 10 gange forstørrelse forbundet til et digitalt kamera. Tag billeder af den fastgjorte bue nedsænket i PBS ved hjælp af små metal vægte (20 mm x 10 mm x 5 mm) for at holde fastgørelse af sengen til bunden af en Petri skål. Placer en lineal ved siden af aorta til kalibrering af billedet.
  8. Brug en billedanalyse software (f. eks. ImageJ) til at bestemme læsionsområdet og den totale intimale overflade. I mangel af anatomiske landemærker til at definere aortabuen, måling er normalt udføres fra starten af opstigende aorta ned til den første interkostale gren (figur 2a). Brug område kvantificerings funktionen i softwaren til manuelt at omringe det totale intimale Arch-område.
    Bemærk:     læsions kvantificeringen skal foretages på en blind måde, og det tilrådes, at en anden investigator bekræfter resultaterne.
    1. I ImageJ skal du vælge værktøjet polygon markering og omslutte det samlede Arch-område med gentagne klik. Vælg derefter mål i menuen Analysér for at få vist det samlede Arch-område i resultatvinduet.
    2. Derefter omkredsede alle Sudan IV-farvede plaques i buen. Sudan IV er en lysokrom Diazo farvestof, der pletter lipiderne, triglycerider, og lipoproteiner med en orange-rød farve. I ImageJ skal du vælge værktøjet Frihåndsmarkering og omslutte alle plaques, mens du trykker på alt-tasten. Klik på mål i menuen Analysér for at få vist et lesionsfri Arch-område i resultatvinduet.
    3. Beregn relativ læsionsområde ved at trække det læsions frie område fra det totale svang område og derefter dividere resultatet med det samlede svang område.
  9. Fastgør forsigtigt subclavia-og carotis-arterierne for at muliggøre læsions kvantificering i brachiocephalic-arterien (figur 2a). Kvantificering af læsioner i de subclaviske arterier og de almindelige carotis arterier er normalt meget udfordrende og ikke meningsfuld, hhv.
    1. I ImageJ, omkredsen begge stykker af braciocephalic arterien ved hjælp af polygon markeringsværktøjet, mens du trykker på Shift-tasten. Klik på mål i menuen Analysér for at få vist det samlede brachiocephalic-arterie område i resultatvinduet.
    2. Derefter skal du vælge værktøjet Frihåndsmarkering og omslutte alle plaques i brachiocephalic-arterien, mens du trykker på alt-tasten. Klik på mål i menuen Analysér for at få vist det lesionsfri brachiocephalic-arterie område i resultatvinduet.
    3. Beregn det relative læsionsområde ved at trække det læsions frie område fra det totale brachiocephalic-arterie område og derefter dividere resultatet med det totale brachiocephalic-arterie område.

Figure 2
Figur 2: kvantificering af aterosklerotisk læsion. (A) aortabuen fra en 20 uger gammel mandlig menneskelig APOB100-transgene ldlr-/- (hubl) mus fodret vestlig kost i ti uger fastgjort åben og plettet for lipid-rige plaques med Sudan IV. Samlede aorta svang overfladeareal er skitseret med den stiplede linje i hvidt i mikrografen, skala bar = 2 mm. De stiplede linjer i gult skitserer det totale overfladeareal af brachiocephalic-arterie. (B) aorta roden tværsnit på 400 μm fra aorta sinus i en 20 uger gammel mandlig ldlr-/- mus fodret vestlig kost i otte uger visualiseret i en Mikrograf, skala bar = 500 μm. De stiplede linjer i sort skitserer det samlede fartøjs område og aterosklerotiske læsioner farvet med olie rød O lokaliseret i arteriel intima. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

3. kryosectioning af aorta roden

  1. Indstil kryostat temperaturen ved-20 °C og snittykkelse til 10 μm. Monter OLT-blokken med aorta roden på prøveholderen med ventrikel vævet vendt udad. Når du begynder at klippe, skal du finjustere justeringen af sektions overfladen, så den er parallel med prøveholderen.
  2. Fjern overdreven omgivende OLT for at gøre det lettere at indsamle sektioner uden folder. Aorta roden bør nu placeres vinkelret på knivbladet, da bunden af hjertet blev anbragt korrekt i formen.
  3. Saml indledende kontrol sektioner på almindelige mikroskop slides, som vil blive kasseret. De første sektioner bør kun indeholde hjerte muskelvæv. Fremskridt sektionerne med 200 μm på det tidspunkt. Saml en sektion og tjek fremskridtene med et let mikroskop.
  4. Når du kommer tættere på den venstre ventrikel udstrømning tarmkanalen, kontrollere hver 100 μm under mikroskopet. Når der observeres indledende indikationer på en fartøjs væg, skal du sænke tempoet til 50 μm.
    Bemærk: Når den første aorta nippet til vises, vil dette være punkt nul for indsamling af sektioner. Det kan være svært at se, når de cusps vises nøjagtigt, men en nøjagtig lokalisering er afgørende for at udføre sammenligninger af læsioner i samme region.
  5. VIP prøven mod punktet Zero nippet til for at justere sektions planet med de to andre cusps. Dette er afgørende for at opnå ægte tværsnit af aorta. Lav en tegning af aorta roden, angiver de cusps som de vises, og tælle hver 10 μm sektion, der er skåret fra punkt nul og fremefter.
    1. Når der vises en anden nippet til, skal du let vippe prøven igen væk fra nippet til for at justere prøven med den tredje nippet til. Niveauforskellen mellem cusps bør ikke overstige 50 μm. Begynd at samle sektioner på slides fra niveau 90 μm og fremefter.
    2. Saml sektioner i henhold til slide planlægningen i figur 3. Samlingen af sektioner kan startes fra 190 μm, hvis aorta roden er mere end 50 μm vippes, for at give yderligere plads til at justere roden i en lige position. Fortsæt med at skære, indtil du når niveau 800 μm fra punkt nul. Hvis der stadig er synlige plaques på dette niveau, kan samlingen udvides til 1.000 μm.
      Bemærk: En forenklet slide organisation er præsenteret i supplerende figur 1, som kan øge skærehastigheden. Den optimale slide planlægning bør afgøres afhængigt af projektplanen.
  6. Ret afsnittene efter samlingen.
    1. Fastgør de sektioner, som er indsamlet til olie rød O farvning og Picrosirius rød farvning af kollagen i 4% formaldehyd i 10 min. Skyl i deioniseret vand, tør, og opbevar i stuetemperatur, indtil du fortsætter med punkt 4 i denne protokol. Hvis slides skal farves med olie rød O med det samme og er stadig våd, placere dem i 60% isopropanol for 1 min at fremskynde tørreprocessen.
      Forsigtig: Isopropanol er en Brandfarlig væske, der kan forårsage alvorlig øjenirritation og kan forårsage døsighed eller svimmelhed. Opbevares på et godt ventileret sted og træffe forholdsregler ved håndtering.
    2. Fiksjer de sektioner, som er indsamlet til immun histokemi eller immunofluorescens i iskold ren acetone i 10 min. tør i stuetemperatur i 30 min. Opbevar sektioner i-20 °C.

Figure 3
Figur 3: organisering af slides for serielle sektioner af aorta roden. Under kryosektionering af aorta roden skal hver 10 μm tyk sektion, der spænder over den første 800 μm af opstigende aorta, opsamles. En systematisk slide organisation er nødvendig for at opnå passende sektioner til forskellige applikationer. Analyse af læsion sammensætning omfatter normalt olie rød O farvning for lipider og Picrosirius rød farvning for kollagen. Resterende sektioner opsamles og acetone-fastgjort til immun histokemi og immunofluorescens farvning. Dette tal er blevet modificeret fra Gisterå et al30. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

4. olie rød O farvning og kvantificering af åreforkalkning i aorta rødder

  1. Forbered en mættet olie rød O opløsning ved at opløse 1 g olie rød O i 100 mL isopropanol. Opløsningen omrøres i en mørk flaske i 1 time ved stuetemperatur. Den mættede opløsning kan opbevares i flere måneder.
    Bemærk: Det er tilrådeligt at have udpeget laboratorieudstyr til olie rød O farvning, da det er vanskeligt at rengøre udstyr, der har været i kontakt med opløsningen.
  2. Forbered en arbejdsopløsning ved at blande 75 mL af den mættede olie røde O opløsning med 50 mL afioniseret vand. Lad stå i stuetemperatur i 10 min. Filtrer gennem et kvalitativt filtrerpapir.
  3. Placer diasene i olie rød O arbejdsopløsning i 20 min. Skyl i ledningsvand i 5 minutter.
  4. For at hjælpe vævs visualisering, plette med Mayer's hematoxylinlegemer i 1 min. Skyl i lunkent ledningsvand i 5 min. Alle kerner bør nu farves i blå farve, justere farvning tid til at optimere resultatet.
  5. Monter slides i et vandigt monterings medium (f. eks. Kaiser glycerol gelatine). Varm kejsers glycerol gelatine til 40 °C for at gøre den flydende før brug. Det er ikke nødvendigt at tørre rutsjebanerne, da monterings mediet er vandbaseret. Vær omhyggelig med at undgå luftboble dannelse, når du tilføjer dækglasset.
    Forsigtig: Kejsers glycerol gelatine indeholder phenol, som mistænkes for at forårsage genetiske defekter. Brug personligt beskyttelsesudstyr efter behov.
  6. Anskaffe digitale mikrografer ved hjælp af et kamera, der er tilsluttet et let mikroskop. Normalt den fulde fartøj væg og læsion grænser kunne tydeligt visualiseret ved 50 gange forstørrelse. Gem billeder i høj opløsning, helst i TIFF (Tagged Image File Format).
  7. Udfør analyse af læsions tørrelse ved hjælp af et computerstøttet billedanalyse software system. Oil Red O er et lysokrom Diazo-farvestof, der pletter neutrale fedt og visualiserer aterosklerotiske plaques med en intens rød farve, som assisterer læsions kvantificering.
    Bemærk:     læsions kvantificeringen skal foretages på en blind måde, og det tilrådes, at en anden investigator bekræfter de opnåede resultater.
    1. Brug område kvantificerings funktionen i billedanalyse softwaren til at definere det samlede fartøjs areal ved at omkredse den udvendige elastiske lamina af aorta fartøjs væggen (figur 2b). I ImageJ skal du vælge værktøjet polygon markering og omslutte området med gentagne klik. Vælg derefter mål i menuen Analysér. Det samlede fartøjs område vises i resultatvinduet.
    2. Fortsæt med at kvantificere de aterosklerotiske læsioner i det intimale lag af beholderen, defineret af den indvendige elastiske lamina og luminale grænse. Normalt er læsioner på ventil-cusps udelukket fra målingen27. I ImageJ skal du vælge værktøjet Frihåndsmarkering og omslutte alle plaques, mens du trykker på alt-tasten. Vælg mål i menuen Analysér for at få vist det lesionsfri fartøjs område i resultatvinduet.
    3. Beregn det relative læsionsområde ved at trække det læsions frie område fra det samlede fartøjs areal og derefter dividere resultatet med det samlede fartøjs areal.
      Bemærk: Kalibrer resultaterne i billedanalyse softwaren i henhold til den anvendte forstørrelse for at opnå absolut læsionsområde i kvadratisk mikrometer.
  8. Definer den olie røde O-farvede område i læsioner ved hjælp af en farve tærskel funktion i billedanalyse software til at beregne procentdelen af olie rød O positive område af samlede læsion område.
    1. I ImageJ, omring alle læsionsområdet ved hjælp af frihånds markeringsværktøjet, mens du trykker på Shift-tasten. Vælg mål i menuen Analysér for at få vist det samlede læsionsområde er i resultatvinduet.
    2. Vælg Ryd udenfor i menuen Rediger. Skift billedtype til 8-bit i billedmenuen.
    3. Indstil en rød tærskel for olie rødt O negativt område ved at vælge tærskel i undermenuen Juster i billedmenu. Klik på Anvend. Gør billedet binær ved at vælge denne indstilling i undermenuen binær i menuen proces.
      Bemærk: Normalt varierer olie rød O farvning mellem partier. Derfor, farve tærskel anbefales kun inden for samme farvnings batch. Resultatet skal præsenteres sammen med en beskrivelse af, hvordan tærsklen blev fastlagt og standardiseret.
    4. Analysér billedet ved at vælge Analysér partikler i menuen Analysér, og klik på OK. Totalt olie rødt O negativt læsionsområde vises nu i oversigtsvinduet. Beregn det relative olie røde O-positive område ved at trække det olie røde O-negative område fra det totale læsionsområde og derefter dividere med det totale læsionsområde.

Representative Results

I musemodeller af åreforkalkning de mest fremtrædende læsioner tendens til at udvikle sig i aorta roden og aortabuen. Denne protokol beskriver kvantificering af åreforkalkning i aorta roden, aortabuen, og brachiocephalic arterien i en enkelt mus. Målbare læsioner i thorax faldende aorta og abdominal aorta er kun til stede hos dyr med Advance sygdom. I denne protokol, disse dele er ikke analyseret for aterosklerotisk byrde, men gemt til efterfølgende analyse af mRNA niveauer eller andre analyser. Serielle sektioner af aterosklerotiske læsioner i aorta roden vises normalt i en graf med læsion størrelse på y-aksen og afstanden til aorta sinus på x-aksen28. True Cross-sektioner er afgørende for læsion størrelse kvantificering. Skrå sektioner kan overvurdere læsions størrelserne, og en hældning på kun 20 ° kan overvurdere den absolutte læsions flade med 15%29. Beregningen af læsions fraktionen af det samlede fartøjs areal gør imidlertid resultatet mindre følsomt over for mulige vinkel forskelle under skæring (figur 4a). En hensigtsmæssig statistisk metode til påvisning af forskelle mellem grupperne er sædvanligvis en regelmæssig 2-vejs analyse af variansen (ANOVA). Bonferroni efter test udføres derefter for at påvise forskelle på visse niveauer. Fishers mindste betydelige forskel kunne også bruges som en opfølgende test til ANOVA. Det reducerer sandsynligheden for type II statistiske fejl, men ikke tegner sig for flere sammenligninger. Desuden kunne det være illustrativt at beregne arealet under kurven eller den gennemsnitlige læsions tørrelse pr. mus og præsentere dataene i et prik plot for yderligere at visualisere individuelle variationer i grupperne (figur 4b).

Olie rød O er en fedtopløselig klar rød Diazo farvestof, som pletter neutrale lipider. Polar lipider i cellemembraner er ikke plettet. Olie rød O farvning kan udføres på ferske, frosne eller formalin-faste prøver, men ikke på paraffin-indlejrede prøver på grund af fjernelsen af lipider i den krævede deparaffinisering proces. Der kan foretages en kvantificering af hud lipid-akkumulering ved farve tærskel for olie rødt O positivt område af det samlede læsionsområde (figur 4c). Hematoxylin producerer en blå farvning af cellekerner, hvilket er nyttigt at visualisere plaque morfologi. De højre og venstre kranspulsårerne afviger normalt fra aorta omkring 250 μm fra aorta sinus27, som ofte falder sammen med de mest fremtrædende læsions størrelser. Tværsnit fra denne region vises ofte som repræsentative resultater (figur 4d).

Figure 4
Figur 4: aterosklerotiske læsioner i aorta roden. (A) otteogtyve uger gamle mandlige knoglemarv kimærer fodret vestlig kost i otte uger blev evalueret for at bestemme effekten af Smad7-mangelfulde T-celler på åreforkalkning udvikling. Eksperimentel ldlr-/- kimærer fik CD4-CRE+Smad7fl/fl knoglemarv og kontroller fik CD4-CRE+Smad7fl/+ knoglemarv. Grafen viser kvantificering af aterosklerotisk læsion område fra otte på hinanden følgende sektioner, 100-800 μm fra aorta sinus vises som læsion fraktion af den samlede fartøjs overflade (Cd4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 6, Cd4-CRE+Smad7fl/fl/ldlr-/- n = 9, 2-vejs ANOVA med bonferroni's post test, graf viser Mean ± SEM, seler indikerer signifikansniveau for stamme sammenligning). B) den kombinerede prik-plot og søjlegrafen viser det gennemsnitlige aterosklerotiske læsionsområde fra aorta-rodsektionerne (CD4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 6, CD4-CRE+Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n = 9, student's t-test) (C) fraktion af olie rødt O-farvet område i læsionerne (CD4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 4, Cd4-CRE+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n = 6, student's t-test, ns = ikke-signifikant) (B-C) prikker repræsenterer individuelle mus og søjler viser gennemsnit ± SEM.D) repræsentative mikrografer, der viser olie-rød O-farvning (i rødt farve) af neutrale lipiderne i aorta roden 300 μm fra aorta sinus (50x forstørrelse), skala bar = 500 μm. *p ≤ 0,05, * * *p ≤ 0,001. Dette tal er blevet modificeret fra Gisterå et al.31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Olie rød O kunne bruges til farvning af en ansigt forberedt Aortas, men denne protokol bruger Sudan IV, en anden praktisk fedtopløselige Diazo farvestof. Sudan IV visualiserer tydeligt aterosklerotiske plaques i en orange-rød farve ved farvning af lipiderne, triglycerider og lipoproteiner. Fjernelse af den mørke baggrund i repræsentative billeder af en-Face aorta buer kunne forbedre det visuelle display (figur 5a). Normalt er læsion størrelse normalt distribueres inden for grupper, tillader statistisk test med elevens t-test mellem grupperne. Et prik plot, der viser både individuelle mus og middelværdien, som sammenlignes mellem grupperne, er en informativ måde at vise resultaterne på (figur 5b-C). Da variationen inden for grupperne typisk er forskellig mellem steder i det vaskulære træ, er der normalt behov for separate effekt beregninger. Unødvendig variation kan undgås ved metode færdighed og protokol standardisering. Det er vigtigt at opnå statistisk signifikante resultater, men den biologiske relevans for en observeret forskel skal altid også overvejes.

Figure 5
Figur 5: aterosklerotiske læsioner i aortabuen og brachiocephalic arterie. (A) repræsentative en ansigt mikrografer af aorta buer med lipid-lastet plaques farvet med Sudan IV (i orange farve) fra 20 uger gamle mus fodret vestlig kost i ti uger, visualiseret sammen. Scale bar = 2 mm. Human APOB100-transgene ldlr-/- (hubl) mus blev anvendt som kontrol og den eksperimentelle gruppe bestod af TCR-Transgene mus med LDL-reaktive T celler (BT1) krydsede til hubl mus. B) aterosklerotiske læsioner i aortabuen (hubl n = 10, BT1xHuBL n = 12; Elevens t-test). C) aterosklerotiske læsioner i brachiocephalic arterien (hubl n = 8, BT1xHuBL n = 9, student's t-test). (B-C) Prikker repræsenterer individuelle mus, søjler viser gennemsnit ± SEM. *p ≤ 0,05. Dette tal er blevet modificeret fra Gisterå et al.32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: alternativ organisering af dias til serielle sektioner af aorta roden. En forenklet systematisk slide organisation til indsamling af sektioner fra aorta roden. Samlingen muliggør olie rød O farvning for lipiderne og immun histokemi eller immunofluorescens farvning. Dedikerede slides til Picrosirius rød farvning af kollagen er udeladt. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Hjerte-kar-sygdom er den største morder i verden og nye forebyggende målinger er nødvendige2. Musemodeller af sygdommen giver en omfattende platform for undersøgelse af Patofysiologi og eksperimentelle behandlinger13. Pålidelig læsion størrelse kvantificering er afgørende for denne tilgang. Kvantificerings metoderne varierer dog mellem laboratorierne. Standardisering og optimering har været en løbende proces siden 1980 ' er13,27,33,34. Aorta rødder er dukket op som den mest populære sted at kvantificere eksperimentel åreforkalkning. Tværsnit af plaques muliggør sammenligning af plaque volumen mellem grupperne. En ansigt præparater er begunstiget for læsion kvantificering i større segmenter af aorta. En Face metode visualiserer plaque mængde og muliggør kvantificering af plaque områdedækning, men ikke tager plaque tykkelse i betragtning. Den biologiske relevans for observerede forskelle underbygges af sammenhængende resultater på forskellige steder i det vaskulære træ. Evaluering af åreforkalkning udvikling på forskellige steder adresser mulige site specifikke effekter. Effekten af transplanterede hæmatopoietiske celler på åreforkalkning udvikling kan vurderes i hyperkolesterolemic ldlr-/- chimeras. Men, hele kroppen bestråling påvirker åreforkalkning proces med site specifikke effekter. Mere fremtrædende aterosklerotiske læsioner er udviklet i aorta roden, mens reduceret læsion udvikling observeres i aorta buer35.

Vigtigere, ikke kun læsion størrelse skal behandles i undersøgelser af eksperimentel åreforkalkning. Lesion sammensætning er også en nøgleparameter. Flere plaque funktioner har været forbundet med manifestationer af sygdommen hos mennesker36. Seriel skæring af aorta roden efterlader flere sektioner til rådighed for omhyggelig analyse af plaque sammensætning. Plaque ruptur i mennesker er karakteriseret ved en tynd fibrøs hætte med få glatte muskelceller, sparsom kollagen indhold og tegn på betændelse i plaques36. Selvom plaque ruptur er en sjælden begivenhed i musemodeller af åreforkalkning, markører for plaque stabilitet er informative at evaluere. Translationelle tilgange kan bekræfte mekanistiske fund fra musemodeller og afdække vigtige træk ved sygdomme hos mennesker31. Inflammatorisk status af atherosclerotiske plaques kunne bestemmes ved at immun histokemi farvning af VCAM-1, MHC klasse II, makrofager, og lymfocytter30. Nogle protokoller bruger langsgående sektioner i den koronale plan af aortabuen eller brachiocephalic arterien til måling af aterosklerotisk læsion størrelse og sammensætning37. Men, denne alternative metode efterlader kun få sektioner, der skal analyseres, som begrænser sine applikationer.

Et første kritisk skridt i denne protokol er evnen til at høste Aortas effektivt. Hånd-øje koordination under mikroskop kræver praksis og er afgørende både for mikrodissektion og den efterfølgende fastgørelse af aortabuen. Det næste kritiske trin i denne protokol er samlingen af serielle sektioner fra aorta roden. 80 på hinanden følgende sektioner skal indsamles for hver mus, hvilket kræver både fokus og tålmodighed. Metodologiske færdigheder kunne fremskynde de beskrevne processer betragteligt. Ikke desto mindre, aterosklerotisk læsion kvantificering er stadig en tidskrævende opgave. Ny teknologi, automatiseret håndtering, og små dyr billeddannelse kan lette kvantificering af eksperimentel åreforkalkning i fremtiden. Progression af åreforkalkning er langsom og de fleste eksperimentelle protokoller i musemodeller tager mere end fire måneder at fuldføre13. Derfor, Aortas skal indsamles på en optimeret måde på undersøgelsens endepunkter. Denne protokol giver en omfattende guide til høst Aortas effektivt og den foreslåede behandling forbereder Aortas til multi-purpose brug, herunder læsion kvantificering i aorta rod, aortabuen, og brachiocephalic arterie. Forhåbentlig protokollen kan reducere eksperimentel variation, øge pålideligheden af resultater, og føre til resultater, der vil bane vejen for nye behandlinger mod åreforkalkning.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker alle tidligere medlemmer af Göran K Hanssons eksperimentelle kardiovaskulære forskningsenhed, som hjalp med at udvikle denne protokol i løbet af det sidste kvart århundrede. Vi er især taknemmelige for bidragene fra Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson og Inger Bodin. Dette arbejde blev støttet af Project Grant 06816 og Linnaeus support 349-2007-8703 fra det svenske Forskningsråd og af tilskud fra den svenske hjerte-lunge fond, Stockholms Amts råd, professor Nanna Svartz Foundation, Loo og hans Osterman Institut for medicinsk forskning, Karolinska Institutet Research Foundation og Foundation for geriatriske sygdomme i Karolinska Institutet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone VWR Chemicals 20066.296 For fixation of sections for immunohistochemistry.
Black electrical insulation tape (50 mm wide) Any specialized retailer - To create pinning beds for aortic arches.
Centrifuge Eppendorf 5417C Benchtop microcentrifuge.
Cork board Any specialized retailer - For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Cryostat Thermo Scientific Microm HM 560 For serial cryosectioning of aortic roots.
Deionized water - - For rinsing and preparation of solutions.
Digital camera Leica Microsystems DC480 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.
Dissecting scissors (10 cm, straight) World Precision Instruments 14393 For general dissection of organs.
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) World Precision Instruments 500341 For microdissection of aorta.
Ethanol 70% (v/v) VWR Chemicals 83801.290 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Ethanol absolute ≥99.8% VWR Chemicals 20821.310 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) VWR Chemicals 9713.1000 Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
ImageJ NIH - Image analysis software.
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) World Precision Instruments 15915-G Used as anatomical forceps.
Isopropanol Merck 1096341011 Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.
Kaiser's glycerol gelatine Merck 1092420100 Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.
Light microscope Leica Microsystems DM LB2 For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.
Mayer's hematoxylin Histolab 1820 Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.
Mayo scissors (17 cm, straight) World Precision Instruments 501751-G For general dissection.
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) World Precision Instruments 503376 For pinning of aortic arches.
Microcentrifuge tubes Corning MCT-175-C Polypropylene microtubes with snaplock cap.
Microlance 3 needles, 23 gauge BD 300800 For blood collection.
Microlance 3 needles, 27 gauge BD 302200 For perfusion of mice.
Microvette 500 µL, K3 EDTA Sarstedt 20.1341.100 For blood collection.
Microvette 500 µL, Lithium Heparin Sarstedt 20.1345.100 For blood collection.
Minutien insect pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10 For pinning of aortic arches.
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount Histolab 45830 For embedding tissue.
Parafilm M Bemis PM992 Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.
Petri dishes (100 mm x 20 mm) Any cell culture supplier - Proposed as a storage container for pinned aortas.
Phosphate buffered saline (PBS) - - Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.
Qualitative filter paper (grade 1001) Munktell 120006 For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm).
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76106 For stabilization of RNA in tissue samples
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780 A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.
Scalpel handle #3 (13 cm) World Precision Instruments 500236 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Standard scalpel blade #10 World Precision Instruments 500239 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Stereomicroscope Leica Microsystems MZ6 For dissection and en face documentation
Sudan IV Sigma-Aldrich S4261 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Superfrost Plus microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ To collect aortic root sections.
Tissue forceps (15 cm) World Precision Instruments 501741-G For general dissection.
Tissue-Tek cryomolds (10 mm x 10 mm x 5 mm) Sakura 4565 For embedding aortic roots in OCT.
Vannas scissors (8 cm, straight) World Precision Instruments 503378 For microdissection of aorta.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Gistera, A., Hansson, G. K. The immunology of atherosclerosis. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).
  3. Hansson, G. K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).
  4. Williams, K. J., Tabas, I. The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).
  5. Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima. Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).
  6. Ruuth, M., et al. Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths. European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).
  7. Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).
  8. Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).
  9. Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice. Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).
  10. Russell, E. S. Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little. Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).
  11. Waterston, R. H., et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).
  12. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).
  13. Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. Mouse models of atherosclerosis. Current Protocols in Immunology. Chapter 15, Unit 15.24.11-23 (2012).
  14. Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
  15. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  16. Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).
  17. Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).
  18. Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. T cell-based therapies for atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).
  19. Skalen, K., et al. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis. Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).
  20. Boren, J., et al. Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100. Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).
  21. Sanan, D. A., et al. Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).
  22. Gistera, A., et al. Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis. Journal of Internal Medicine. , (2017).
  23. Johnson, J. L., Jackson, C. L. Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse. Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).
  24. Calara, F., et al. Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice. The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).
  25. Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).
  26. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
  27. Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
  28. Purcell-Huynh, D. A., et al. Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet. Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).
  29. Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).
  30. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque. Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).
  31. Gistera, A., et al. Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway. Science Translational Medicine. 5 (196), 196ra100 (2013).
  32. Gistera, A., et al. Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice. Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).
  33. Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).
  34. Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root. Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).
  35. Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).
  36. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  37. Seijkens, T. T. P., et al. Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).

Tags

Immunologi og infektion åreforkalkning ApoE Knockout mus Ldlr Knockout mus aorta dissektion Microtomy farvning olie rød O Sudan IV
Kvantificering af åreforkalkning i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Centa, M., Ketelhuth, D. F. J.,… More

Centa, M., Ketelhuth, D. F. J., Malin, S., Gisterå, A. Quantification of Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (148), e59828, doi:10.3791/59828 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter