Summary
돌리올리다 게겐바우리종을 포함한 돌리올리드는 전 세계적으로 생산적인 아대륙 선반 시스템에서 발견되는 생태학적 중요성의 작은 젤라틴 해양 동물플랑크톤이다. 이 섬세한 유기체를 배양하는 어려움은 그들의 조사를 제한합니다. 본 연구에서는 돌리올리야게겐바우리(doliolid Dolioletta gegenbauri)를수집, 사육 및 유지하기 위한 재배 접근법을 설명합니다.
Abstract
젤라틴 동물원 플랑크는 해양 생태계에서 중요한 역할을합니다. 그러나, 그들의 생리학을 조사 하는 것이 일반적으로 어렵다, 성장, fecundity, 그리고 영양 상호 작용 주로 방법론 적 도전으로 인해, 그들을 배양 하는 능력을 포함 하 여. 이것은 돌리올리드, 돌리올레타 게겐바우리에 특히 사실이다. D. gegenbauri 일반적으로 생산적인 아열대 대륙 선반 시스템에서 발생, 종종 매일 기본 생산의 큰 부분을 소비 할 수있는 꽃 농도에서. 이 연구에서는 실험실 기반 연구를 수행하기 위한 목적으로 D. 게겐바우리(Gegenbauri)를 수집, 사육 및 유지 관리하는 재배 방법을 설명합니다. D. 게겐바우리 및 기타 돌리올리드 종은 표류하는 선박으로부터 202 μm 메쉬 플랑크톤 그물을 비스듬히 견인하여 살아서 포획할 수 있다. 배양은 수온이 21 °C 이하이고 미성숙한 여조, 숙성 포로주이드 및 대형 간호사로부터 시작될 때 가장 안정적으로 확립됩니다. 배양은 천천히 회전하는 플랑크톤 휠에 둥근 배양 용기에서 유지될 수 있으며 여러 세대에 걸쳐 천연 해수에서 배양된 조류의 식단을 유지할 수 있습니다. D. 게겐바우리(D. gegenbauri)의실험실 배양을 확립하는 능력 외에도, 우리는 자연적으로 조절된 바닷물에 대한 수집 상태, 조류 농도, 온도 및 노출이 모두 문화에 중요하다는 것을 입증합니다. D. 게겐바우리의 설립, 성장, 생존 및 번식.
Introduction
동물플랑크톤은 바다에서 가장 큰 동물 바이오매스를 차지하고 있으며, 해양 식품 거미줄의 핵심 구성요소이며 해양 생물지구화학 주기 1,2에서중요한 역할을 한다. 동물플랑크톤은 생물체의 거대한 다양성으로 구성되어 있지만, 두 가지 범주로 크게 구별 될 수있다 :몇 중간 택시 3,4와젤라틴과 비 젤라틴 . 젤라틴 동물플랑크톤이 아닌 동물성 동물플랑크톤에 비해, 젤라틴 동물플랑크톤은 복잡한 삶의역사5 때문에 공부하기가 특히 어렵고, 포획 및 취급 중에 섬세한 조직이 쉽게 손상됩니다. 젤라틴 동물플랑크톤 종은, 따라서, 실험실에서 배양하기가 어렵고 일반적으로 비젤라틴종6에 비해 덜 연구된다.
젤라틴 동물플랑크톤 그룹 중 에는 전 세계 바다에서 풍부하고 생태학적으로 중요한 것이 탈리아세안(Thaliaceans)입니다. 탈리아세산은 살피다, 피로소미다, 돌리오리다 7의 주문을 포함하는 원골 잡화의한 등급이다. 돌리올리다(Doliolida)는 아열대 바다의 생산적인 네릭 지역에서 높은 풍부에 도달할 수 있는 작은 배럴 모양의 자유 수영 펠라그 생물입니다. 돌리올리드는 모든 동물플랑크톤 그룹4,8중 가장 풍부하다. 서스펜션 피더로서, doliolids는 필터 전류를 생성하고 점액 그물9에캡처하여 물 기둥에서 음식 입자를 수집합니다. 분류학적으로, 돌리올리드는 phylum Urochordata10에서분류된다. 조상은 코르다테에 대한 조상이며, 해양 펠라그 시스템의 핵심 구성 요소로서의 생태학적 중요성외에도, 탈리아세산은 식민지 생명의 역사10,11 및 진화의 기원을 이해하는 데 중요합니다. 5,7,10,12,13,14.
doliolids의 생활 역사는 복잡 하 고 그들의 수명 주기를 통해 그들을 배양 하 고 유지에 어려움에 기여. 돌리오리드 수명 주기와 해부학에 대한 리뷰는 Godeaux 외15에서찾을 수 있습니다. 성및 무성생애주기간의 의무적인 교대를 수반하는 돌리올리드 수명주기는 그림1에 제시되어 있다. 계란과 정자는 생애 주기의 유일한 고독한 단계인 헤르마로디틱 고노주이드에 의해 생성됩니다. Gonozooids는 물 기둥에 정액을 풀어 놓이고 계란은 내부적으로 기름지게 하고 애벌레로 발전하기 위하여 풀어 놓입니다. 유충 해치와 1-2 mm에 도달 할 수있는 oozooids로 변신. 도움이 환경 조건과 영양을 가정, oozooids는 20 °C에서 1-2 일 이내에 초기 간호사가되고 수명 주기의 식민지 단계를 시작합니다. Oozooids 무성 그들의 복부 stolon에 싹을 생산. 이 싹은 stolon을 떠나 그들이 세 개의 쌍을 이루는 행에 줄 등도 카도포어로 마이그레이션합니다. 중앙 이중 행은 공포증이 되고 바깥쪽 두 개의 이중 행은 트로포주이드가 됩니다. 후자는 간호사와 포로주시드 모두에게 음식을 제공합니다16,17. 트로포주이드는 간호사에게 모든 내부 장기를 잃으면서 영양을 공급합니다. trophozooids의 풍부가 증가함에 따라, 간호사의 크기는 실험실에서 15mm에 도달 할 수 있습니다. 포로주이드가 자라면서, 그들은 점점 플랑크토닉 먹이를 섭취하고 개인17로출시되기 전에 ~ 1.5 mm 크기에 도달한다. 한 명의 간호사가 수명18동안 > 100 개의 포지주이드를 방출 할 수 있습니다. 공포증이 카도포어에서 풀어 놓인 후에, 그(것)들은 성장을 계속하고 생활 주기의 두 번째 식민지 단계입니다. 일단 그들이 ~ 5mm 크기에 도달하면, 각 포주이드는 복부 페던클에 고노 주이드의 클러스터를 개발합니다. 이 고지체는 길이가 ~1mm에 도달하면 입자를 섭취 할 수 있습니다. gonozooids가 크기에 ~ 2 ~ 3mm에 도달 한 후 그들은 광주체이드에서 방출되고 수명 주기의 유일한 독방 단계가됩니다. 일단 그들이 도달하면 ~ 6mm 크기로, 고노 주이드는 성적으로 성숙17이된다 . 고노주이드는 길이가 9mm 이상에 달할 수 있습니다. 고노주이드는 헤르마로디틱이며, 정자는 간헐적으로 방출되고, 난자의 수정은 내부적으로16,17에서발생한다. 가노주이드의 크기가 ≥ 6 mm일 때, 최대 6개의 수정란을 방출합니다. 성공적인 배양은 이러한 독특한 삶의 역사 단계각각의 특정 한 요구를 지원해야 합니다.
돌리올리드를 포함한 탈리아세산의 생태학적, 진화적 중요성으로 인해, 이 유기체의 독특한 생물학, 생리학, 생태학 및 진화역사의 이해를 증진시키기 위한 재배 방법론이 필요하다19 . Doliolids는 발달 생물학 및 기능성 유전체학에 있는 실험적인 모형 유기체로 상당한 약속이 있기 때문에 투명하고 가능성이 유전체20,21. 그러나 신뢰할 수있는 재배 방법의 부족은 실험실 모델로의 유용성을 방해합니다. 소수의 실험실이 배양 된 돌리오 리드를 기반으로 결과를 발표했지만, 우리의 지식 재배 접근 법 및 자세한 프로토콜은 이전에 출판되지 않았습니다. 다년간의 경험과 시행착오 배양 시도를 바탕으로, 이 연구의 목적은 경험을 검토하고 돌리올라이드, 특히 돌리오레타 게겐바우리종의 수집 및 재배를 위한 프로토콜을 공유하는 것이었다.
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Protocol
1. 디게겐바우리 사육을 위한 배양시설 준비
참고: 필요한 모든 재료와 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
- 1 M 수산화 나트륨 (NaOH), 0.06 M 과망간산산 칼륨(KMnO 4) 용액을 준비하십시오. 이 용액을 준비하려면 NaOH 400g을 10 L 탈이온수에 녹입니다. NaOH 용액에 KMnO4 100 g을 넣고 잘 섞습니다.
- NaHSO3의 100 g을 10L 탈이온수로 용해시켜 0.1 M 나트륨 바이설피테(NaHSO3)용액을 준비하고 잘 섞는다.
주의: 이 시약은 흡입하는 경우에 호흡 문제를 일으키는 원인이 될 수 있는 자극제입니다. 연기 후드와 같이 통풍이 잘되는 곳에 두어 놓습니다. 피부 접촉을 피하십시오. 취급 시 보호 장갑, 보호복, 눈 보호 및 얼굴 보호 기능을 착용하십시오. - 실험실에서 돌리올리드 배양을 확립하고 사육하기 전에 배양 항아리를 청소하고 살균하십시오.
- 탈이온수로 1.9L 및 3.8L 배양 항아리를 3회 이상 헹구는다. 캡은 다음 청소 단계에 포함되지 않기 때문에 나사 캡을 건조시키십시오.
- NaOH/KMnO4 용액에 담그어 1.9- 및 3.8L 유리 배양 항아리를 세척하고 살균합니다. 항아리가 하룻밤 동안 담가 두십시오.
- NaOH/KMnO4 용액에서 항아리를 제거하고 항아리를 나트륨 비설피테 (NaHSO3)용액에 담그다. 항아리가 하룻밤 동안 담가 두십시오.
- NaHSO3 용액에서 항아리를 제거하고 탈이온수로 완전히 헹구십시오. 용기가 건조되도록 합니다.
- 플랑크톤 휠(그림 2)을 온도 제어 공간(환경 챔버)에 놓습니다. 온도를 20°C로 평형화합니다. 사용자 정의 플랑크톤 휠에 대한 자세한 설명은 추가 그림1을 참조하십시오.
2. 식물성 플랑크톤 문화
- 국립 해양 조류 및 미생물 (NCMA) 또는 D. 게겐 바우리에대 한 음식으로 사용 될 다른 소스에 대 한 국립 센터에서 조류 문화를 얻을. 이소크리시스 갈바나(CCMP 1323), 로도모나스 스프(CCMP 740), 작은 규조류, 탈라시오시라 바이스플로기이(CCMP 1051)를 포함한 두 종의 기혈종의 혼합물은 NCMA로부터 수득되었고 이전 실험실에서 사용되어 왔다. 성공적으로 후면 돌리오리드에 연구17.
- NCMA에서 권장하는 대로 L1 및 L1-Si 성장 매체(22)를 준비한다.
- 새로운 조류 문화를 시작 하려면 공급 업체에서 제공 하는 지침에 따라.
- 엄격한 축배양 기술을 사용하여 스톡 배양을 유지하기 위해 2주에 한 번씩 멸균 55 mL 유리 배양 튜브에서 25 mL의 신선한 성장 배지로 오래된 노화 배양액0.5 mL을 옮김을 전달합니다.
참고: 살아있는 조류 문화를 정기적으로 옮기지 않고는 저장할 수 없습니다. 문화권이 장기간 사용되지 않고 비사용 기간 동안 문화권유지가 불가능한 경우, 이러한 일반적인 조류 문화를 원래 소스(예: NCMA)로부터 다시 획득하는 것이 좋습니다. - 200 mL의 성장 배지를 함유한 깨끗한 500 mL 플라스틱 조직 배양 플라스크에서 돌리올리드를 먹이기 위해 더 많은 양의 식물성 플랑크톤을 준비합니다.
- 축주식(4mL)에서 200 mL의 성장매체(1:50 희석)로 식물성 플랑크톤을 접종합니다.
- 20 °C에서 12:12 h 의 빛으로 배양: 65-85 μE/m2의 시원한백색 광 조명 하에서 어두운 주기. 배양 플라스크를 평평하게 배치하여 조명을 최대화합니다. 매일 부드럽게 소용돌이치는 배양.
- 배양의 성장을 모니터링하기 위해 입자 카운터 또는 현미경을 사용하여 세포의 농도를 결정합니다.
참고 : 접종 후 7-10 일 후, 기혈 배양액은 ~ 105-106 세포 / mL을 포함하고 규조류 배양은 ~ 104-105 세포 / mL을 포함합니다. 이러한 농도는 돌리올리드 배양을 유지하기에 충분하다. - 모든 문화 활동을 지원하기에 충분한 조류 바이오매스를 제공하기 위해 최소 2주마다 새로운 수유 주식을 시작하십시오.
3. 야생 돌리올라이드와 바닷물 문화 컬렉션
참고: 수집 및 재배 접근 방식에 대한 개요는 그림3에 설명되어 있습니다. 도4에서는 전문 수거 플랑크톤 네트 및 대구말에 대한 설명이 제공된다.
- 플랑크톤 그물 또는 시투 이미징 시스템(23)을 사용하여이를 감지하여 돌리오리드를 찾습니다.
참고: 돌리올리드는 표면 수역에 거의 존재하지 않으며 원격 감지 기술로 감지할 수 없기 때문에 돌리올리드에 유리한 조건에 대한 전제 조건 지식에 의해 유도됩니다(토론 참조) 돌리올리드의 존재를 결정해야 합니다. 샘플링 하기 전에. - D. 게겐바이 문화를 시동하기 위한 준비를 위해 살아있는 돌리올리드를 수집하기 전에 입자가 풍부한 바닷물을 수집합니다.
- CTD 로제트 또는 이에 상응하는 장비에 장착된 Niskin 병을 배치하여 돌리올라이드가 있는 장소와 현장 형광계에서 추정된 가장 높은 엽록소 농도를 포함하는 깊이에서 물을 수집합니다.
참고: 엽록소 농도는 입자 농도의 지표로 사용됩니다. 남대서양 Bight (SAB) 중간 대륙 선반에, 최대 표면 엽록소는 일반적으로 바닥에 가까운, 하지만 다른 위치에, 그것은 하지 않을 수 있습니다.
- CTD 로제트 또는 이에 상응하는 장비에 장착된 Niskin 병을 배치하여 돌리올라이드가 있는 장소와 현장 형광계에서 추정된 가장 높은 엽록소 농도를 포함하는 깊이에서 물을 수집합니다.
- 돌리올리드가 위치하면 특수 플랑크톤 그물과 대구 끝을 사용하여 손상되지 않은 돌리오리드 주이드를 복구하십시오. 그물을 배포하기 전에, 바닷물로 대구 끝을 채웁니다.
- 표류선박에서, 하부 및 15~25°의 경사 견인 각을 유지하고 15m/min 이하의 수직 배치 및 검색 속도를 유지하여 물 기둥을 통해 그물을 올립니다.
- 그물이 온보드되면, 대구 말단의 내용물을 3, 5 갤런 (~20 L) 플라스틱 양동이로 부드럽게 옮기고 각 부위에서 수집 한 표면 해수 10L을 함유합니다.
참고 : 새로운 플라스틱 양동이는 살아있는 돌리올리드 수집 전에 해수 일의 추가에 의해 조절되어야한다. 목표는 플라스틱에서 화학 물질의 침출을 줄이는 것입니다. 바닷물을 사용할 수 없는 경우, 정제된(예: 밀리 Q) 또는 수돗물무이면 독성 오염물질이 없는 물을 사용하여 양동이를 조절하십시오. - 다른 플랑크톤에서 돌리올리드 주이드를 분리합니다.
- 작은 배치 (~ 2 L)에서 그물 견인 내용물 (현재 20 L 플라스틱 양동이)에서 2 L 유리 비커로 혼합 판자를 옮니다.
- 와이드 보어 유리 파이펫(8mm ID x 38cm 길이)을 사용하여, 조심스럽게 사이펀을 하고, 비커에서 활발하게 수영하는 돌리오리드 주니드를 깨끗한 유리 배양 항아리로 옮기고, 돌리올리드가 있던 곳에서 니스킨 병을 사용하여 채취한 입자가 풍부한 바닷물을 함유한 깨끗한 유리 배양 항아리로 옮겨줍니다. 있는.
- 바닷물 표면 아래에 있는 돌리올리드 동물원을 부드럽게 풀어놓습니다.
참고 : 여조, 부착 된 개발 된 가노 주이드를 포함하는 공포증, 부착 된 트로포주이드를 포함하는 간호사 단계를 수집합니다 (그림 1).
- 돌리오리드를 첨가한 후, 로도모나스 스프. 배양을 ~ 5 x 103 – 104 세포/mL의 최종 농도에 첨가합니다(~ 5 x 104 - 1 x 105 세포/mL를 3.8 L 병에 함유하는 배양의 ~ 50 mL). 이것은 돌리오리드가 활발하게 공급되는지 여부를 결정하기 위한 것입니다. 돌리올라이드가 로도모나스 를 섭취하면소화관이 빨간색으로 나타납니다. 먹이를 주지 않는 주이드를 제거합니다.
- 돌리오리드가 공기-물 인터페이스에 갇히지 않도록 하려면 여과되지 않은 입자가 풍부한 바닷물로 항아리를 완전히 채우고 항아리 개구부(폭 89mm)에 플라스틱 랩 조각을 놓음으로써 배양 항아리의 헤드스페이스를 피하십시오.
- 동물을 손상시킬 수 있는 기포를 만들지 마십시오. 조심스럽게 항아리에 뚜껑을 조여 거품이 있는지 확인하기 위해 항아리를 부드럽게 뒤집습니다. 거품이 있으면 제거합니다.
- 항아리가 채워진 후, 항아리 의 외부에서 여분의 물을 닦아.
- 각 항아리를 플랑크톤 휠에 장착 (그림2)고무 튜브로 덮인 수직 금속 막대에 항아리를 놓고 스테인레스 스틸 호스 클램프 사이에 놓습니다.
- 용기의 뒷면이 고무 튜브에 대해 쿠션되어 있는지 확인하십시오. 나사를 조정하여 항아리 주변의 호스 클램프를 조입니다.
- 제자리에 단단히 고정된 후에는 항아리가 움직이지 않는지 확인하십시오. 항아리가 0.3rpm에서 회전하여 돌리오리드를 서스펜션상태로 유지합니다.
주의: 항아리가 깨지는 것을 방지하기 위해 항아리를 과도하게 조이지 않는 것이 중요합니다.
- 선박에서, 그들은 실험실 배양 시설로 전송 될 수 있을 때까지 희미한 빛에 20 °C에서 플랑크톤 바퀴에 배양 용기를 유지합니다.
- 실험실로 돌아오면 돌리올라이드가 들어있는 항아리를 준비된 문화 시설로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김. 플랑크톤 휠에 항아리를 장착하고 (단계 3.8 참조) 항아리가 0.3 rpm에서 계속 회전 할 수 있도록하십시오.
참고: 본 연구에서 돌리올라이드의 모든 사육은 20°C에서 수행되었다.
4. D. 게겐바우리 문화 유지
- 배에서 실험실로, 동물이 3 일 동안 실험실 조건에 원래 항아리에 적응 할 수 있도록.
- 적응 기간 동안 넓은 보어 유리 파이펫을 사용하여 3 일 동안 매일 수집 사이트에서 여과되지 않은 입자가 풍부한 바닷물로 물의 10 %를 교환하십시오.
- 항아리에 여러 개의 코포드를 보관하지만 다른 모든 동물 플랑크톤, 큰 배설물 펠릿 및 doliolid의 여과 장치 (점액 그물)를 막을 수있는 큰 응집 입자를 제거하십시오. 문화가 초기 간호사로 구성되어 있는 경우, 항아리에 하나의 큰 가노주이드 (≥ 6 mm)를 보관하십시오.
참고 : 어떤 copepod 종은 문화에 포함되어 있는지 중요하지 않지만,이 실험에서 돌리올라이드가 포획 된 곳에서 존재하는 가장 풍부한 종이 사용되었습니다.
- 적응 기간 이후에, 80% 유리 섬유 필터 (GF/F) 여과 된 바닷물과 원래 항아리에서 바닷물의 20 %를 포함하는 깨끗한 재배 항아리에 원래 항아리에서 돌리오 리드 주니드와 대처를 전송합니다. 0.7 μm 필터 용지의 공칭 기공 크기로 GF/F를 통해 바닷물을 여과하여 여과된 바닷물을 준비합니다.
- 3일마다 GF/F 여과 된 해수로 물의 10 %를 교환하고 응집체와 배설물을 제거하여 새로운 문화를 유지하십시오. 매주, 4.2단계에서 설명한 대로 동물을 새로운 항아리로 옮김을 옮김을 옮김을 한다.
- 40-95 μg C/L 사이의 배양 항아리에서 식물성 플랑크톤 농도를 유지하여 돌리올리드를 공급합니다.
참고: 이러한 농도는 D. 게겐바우리17에대한 꽃 조건을 지원하는 것으로 알려진 환경 조건을 모방. 조류 종의 혼합물은 각 항아리의 수명 단계와 zooids 수에 따라 다릅니다. 초기 수명 단계에서 크립토 모나드 조류(이소크리시스 갈바나 및 로도모나스 sp.)의 1 :1 혼합물 (탄소 함량)을 추가하십시오. 더 큰 먹이 종은 쉽게 작은 간호사와 개발 trophozooids의 먹이 장치를 막을 수 있습니다. 조류 혼합물에 규조류 Thalassiosira weissflogii를 추가, 또한 동등한 탄소 함량에, 더 큰 간호사를 공급 할 때, 포주이드, 및 고노 주이드.- 조류 농도를 전과 후 공급하여 배양액과 조류가 얼마나 자주 그리고 얼마나 많은 조류를 추가해야 하는지 결정하는 방법을 안내합니다. 배양 항아리의 조류 농도가 상대적으로 희석되기 때문에 입자 카운터를 사용하여 조류 농도를 결정합니다.
- 40 – 95 μgC/L의 조류 농도를 유지하기에 충분한 zooids를 제거하여 나머지 돌리올라이드가 자라기에 충분한 음식을 갖도록 하십시오.
참고 : 실험실 조건하에서 성공적으로 유지하기가장 어려운 생활 단계는 개발 애벌레와 oozooid (초기 간호사)입니다. 배양의이 단계 동안, 하나의 큰 gonozooid유지 (≥ 6 mm) 유충과 oozooids를 개발 항아리에 여러 copepods 이외에 유지 (~ 20 당 3.8 L 항아리). - 최소 8개의 trophozooids가 간호사의 cadophore에 보입니다 (그림 1B)에 1개의적어도 4명의 간호원을 새로운 배양 항아리로 옮기는 것은.
참고: 트로포주이드는 20°C에서 1-2일마다 두 배로 증가합니다. 트로포주이드는 육안으로 볼 수 있을 만큼 크다.- 간호사가 20 개의 trophozooids를 개발하면 간호사 2 명을 제거하십시오.
- 간호사가 개발할 때 간호사 1 명 (30 trophozooids)을 카도포에 제거하십시오. 나머지 간호사가 카도포에 포로 주드를 개발할 수 있도록 하십시오.
- 간호사가 최대 30개의 포지주이드를 방출하면 간호사를 제거하십시오.
- 포주체이드의 크기가 3mm에 도달하면 항아리에 있는 동물의 수를 줄입니다.
- 포지시드가 커지면 (> 5 mm) 4개의 포지체이드를 제외한 모든 포지시드를 제거하고 고노주이드 클러스터를 개발했습니다.
- 가노주이드 클러스터의 수가 증가하고 먹이를 시작할 때 배양을 두 개의 광주체이드로 줄입니다.
- 광주체이드가 최대 30개의 고노주이드를 방출하면 포주이드를 제거합니다.
- 병당 30개의 주이드에서 2개로 고노주이드의 수를 줄입니다. 기름지게 한 계란이 항아리에 풀어 놓일 수 있도록 하십시오.
- oozooids가 발전하면 항아리에 하나의 고노 주이드를 떠나 하나의 고노 주이드를 제거합니다.
참고 : 버려진 간호사, 포지시드 및 고노 주시드는 추가 배양을 시드하고 추가 실험을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
- oozooids가 발전하면 항아리에 하나의 고노 주이드를 떠나 하나의 고노 주이드를 제거합니다.
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Representative Results
도3에 기재된 돌리올리드를 수집하고 배양하기 위한 기술된 절차에 따라, D. 게겐바우리의 복잡한 수명 역사를 통틀어 D. 게겐바우리의 배양을 유지할 수 있다(도1)및 여러 세대에 걸쳐 그것을 지탱해 주시고 있습니다. D. 게겐바우리 재배는 여기에 설명되어 있지만, 이러한 절차는 다른 돌리올라이드 종의 재배와도 관련이 있어야합니다.
건강하고 손상되지 않은 돌리오리드 주이드를 캡처하려면 특수 그물및견인 절차를 적용해야합니다 (그림 4). 단단한 구조물이 없는 섬세한 동물로서 물리적 인 손상을 초래할 수있는 절차를 최소화하기 위해주의를 기울여야합니다. 이러한 요인에는 난류, 압력 및 그물, 공기 및 기포를 포함한 표면과의 상호 작용이 포함될 수 있습니다. 그러나 섬세한 특성에도 불구하고 손상되지 않은 돌리오리드 주이드는 개구지 대 길이 비율이 1:5인 원금 플랑크톤 그물을 사용하여 수집할 수 있으며 상대적으로 큰 가중치가 있는 비여과 대구 단을 장착할 수 있습니다. 일상적으로 우리는 스위블 하네스에 장착 된 0.5 m 개구부가있는 202 μm 메쉬 2.5 m (길이) 플랑크톤 그물을 사용하고4 L 가중 비 필터링 대구 엔드를 장착했습니다 (그림 4). 재배 가능한 D. 게겐바우리 주이드의 포획에 대한 플랑크톤 메쉬 크기의 효과는 체계적으로 조사되지 않았지만, 이론적으로 는 메쉬 크기가 큰 그물을 사용하면 메쉬 크기가 커지므로 더 개선될 수 있습니다. 견인 하는 동안 발생 하는 압력 필드를 줄일 수 있습니다. 또는 메시 크기가 커면 그물을 통해 더 큰 물 흐름이 발생하여 잠재적으로 doliolid zooids가 손상될 수 있습니다. 견인 속도와 순 각도를 최적화하여 수집 중 견인 시간과 손상을 최소화해야 합니다. 우리의 경험에서, 우리는 수직 배치 및 검색 속도가 15m / min보다 크지 않은 표류 선박에서 15-25 °의 각도로 그물을 비스듬히 견인함으로써 충분히 부드러운 견인 조건을 달성 할 수 있음을 발견했습니다. 물 흐름의 방향으로 그물을 지향하기 위해, 플랑크톤 그물은 스위블 하네스에 장착된다. 일반적으로 물 기둥내의 돌리오리드의 분포가 무작위가 아니며 일반적으로 가장 높은 미립자 하중(24)을 가진 지역에서 가장 큰 경우이다. 따라서 지하 엽록소 아래에서 표면까지의 물 기둥을 샘플링해야 합니다. 얕은 SAB 중간 대륙 선반 (20 - 45m)에서, 수면에 바닥 ~ 1m 에서 물 기둥을 샘플링한다.
건강한 zooids가 수집되면 표면에 대한 노출을 최소화하는 방식으로 유지하는 것이 중요합니다. 표면과의 만남을 최소화하기 위해 해수로 채워진 둥근 항아리에 보관하고 천천히 회전하는 플랑크톤 휠에부드럽게 떨어집니다 (그림 2).
이론적으로는 모든 삶의 단계의 동물원으로 문화를 시작할 수 있지만, 남대서양 Bight에서 2015 -2018 년 6 번의 시도에서 D. gegenbauri의 새로운 문화를 확립하는 데 성공과 실패를 탐구하는 것이 성공이라고 제안합니다. Zooids는 <21°C의 물에서 수집될 때 가장 자주 달성되며, 큰 성숙한 여지체 이외의 생명 단계가 새로운 문화를 시작하는 데 활용될 때 달성됩니다(표1 및 표2). 실제로, 새로운 문화를 시작했을 때 doliolid zooids의 여러 생활 단계를 포함하는 것이 도움이되거나 적어도 해롭지 않습니다.
D. 게겐바우리(D. gegenbauri)의문화를 유지하는 데 성공은, 다른 원양 tunicate 종20에대해 설명된 바와 같이, 각 생명 단계를 지원하는 데 필요한 충분한, 그러나 과도하지 않은 음식 및 음식 다양성을 제공하는 것에 달려 있다. 식이 요법 요구 사항은 수명 주기 에 걸쳐 다르므로, 각 수유 시간에 제공되는 조류의 양은 원하는 목표 수준 (40 –95 μg C /L)에서 음식 농도를 유지하기 위해 변화해야합니다 (표 3). 이러한 수준 이상 또는 아래 농도 증가 사망률 귀 착될 수 있다 (G.A. Paffenhöfer pers. comm.). D. gegenbauri의 자연적인 규정식은 제대로이해되지 않는 남아 있더라도 6, 배양된 조류의 상대적으로 간단한 혼합물을 공급하고 다양한 미생물 지역 사회가 설치하는 것을 허용하는 절차를 활용하여 문화를 유지할 수 있습니다 문화를 따라가다. 먹이 필드의 잠재적 다양성을 증가 하는 것은 이전 문화에서 입자 라덴 물의 일부를 유지 하 고 각 물 변경 또는 전송에 생활 copepods 및 큰 doliolids의 작은 수의 포함 하 여 달성 된다. 아마도, 이러한 유기체는 조류와 해로운 물질을 처리하고 doliolid 영양에 사용할 수있는 입자 크기와 품질 스펙트럼을 다양화하는 역할을하지만,이 가설을 확인하기 위해 추가 연구가 필요합니다.
doliolid 문화의 가용성조사 하는 수단을 제공 합니다., 통제 된 실험 조건 하에서, 돌리 오 리드 생물학의 많은 중요 한 측면, 생리학, 생태학, 그리고 분자 생물학. 예를 들어, 해안 해역의 수많은 지역에 는 돌리올라이드가 풍부하고 주요 판자 방목장(25)이지만, 먹이주기 및 성장률에 대한 데이터는26으로남아 있다. D. 게겐바우리의배양을 활용, 배양 기반 연구의 초점은 온도 및 식품 농도 를 포함하는 중요한 환경 매개 변수에 대응하여 공급 및 성장 속도를 정량화하는 것이 되었습니다26. 이러한 연구의 결과는 통관 비율이 20 ~ 60 μg C/L의 농도에서 유사하고 음식농도가 증가함에 따라 감소한다는 것을 나타났습니다 (그림 5A). 클리어런스 비율은 D. 게겐바우리 성장을 지지하는 온도 범위에 비례하여 증가합니다(그림5B). 성장률(k)은 온도 및 식품 가용성의 함수로서 0.1 - 0.7/day 범위입니다(그림 6). 이러한 연구는 배양에 대한 실질적인 정보를 제공하는 것 외에도 doliolid 공급과 성장 속도 사이의 양적 관계를 환경 매개 변수의 함수로 측정하고 중요한 통찰력을 제공했습니다. 이 중요한 동물플랑크톤 그룹을 모델링 프레임워크(27)에 포함시키는 데필요한 돌리올라이드의 생물학 및 생태학.
그림 1: 의 수명 주기 D. 20 °C에서 게겐바우리.
수명 주기 도면(1A)은 Walters et al. 20186 이후에 수정되었으며 허가를 받아 다시 그려졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 배양에 사용되는 플랑크톤 휠 D. 게겐바우리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 회로도 개요 D. 게겐바우리 수집 및 재배 접근 방식.
바다에서 수집(A), 농축 된 양동이에서 작은 배치 (B)로작은 유리 비커로 옮기고, 돌리오리드 주이드를 입자가 풍부한 바닷물 (C)을 포함하는 재배 항아리로 격리), 플랑크톤 휠의 유지 보수 (D,E)를 통해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 플랑크톤 그물 및 배포.
배포(왼쪽 위), 검색(오른쪽 상단) 및 그물 및 대구 끝(아래)의 회로도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 조류 통관률 D. 게겐바우리 고노주이드.
(A) 사이의 관계 (A) 평균 (± S.E.) 클리어런스 속도 (mL/ zooid/day) 대 식물성 플랑크톤 농도 (μg C/L) D. 게겐바우리 고노주이드의 세 가지 크기에 대한. 각 점은 4~11개의 관측점을 나타냅니다. (B) 평균 (± S.E.) 클리어런스 속도 (mL / zooid / 일) 대 온도 (° C) D. 게겐 바우리 gonozooids의 세 가지 크기에 대한. 각 점은 4~12개의 관측점을 나타냅니다. Gonozooids 크기는 2.5
mm (), 4.5 mm
(),
그리고 6.5 mm ()입니다. 그림은 권한26으로다시 그려졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 성장률 D. 게겐바우리 고노주이드.
사이의 관계(A) 평균 (± S.E.) 성장 속도 (k) 대 식물성 플랑크톤 농도 (μg C/L) 돌리오레타 게겐바우리 고노주이드의 세 가지 크기에 대한. 각 점은 4~11개의 관측점을 나타냅니다. (B) 평균 (± S.E.) 성장 속도 (k) 대 온도 (° C) 돌리오레타 게겐바우리 고노주이드의 세 가지 크기에 대한. 각 점은 4~12개의 관측점을 나타냅니다. Gonozooids 크기는 2.5mm (), 4.5 mm(),그리고 6.5 mm ()입니다. 그림은 깁슨과 파펜회퍼26의허가를 받아 다시 그려졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 표 1. 해양 조건 및 돌리올리드 풍요로움 | |||||||||||
| 표면 | 하단 | 표면 | 하단 | 표면 | 하단 | 돌리올리드 풍요로움 | |||||
| 날짜 | 크루즈 신분증 | 위도 (N) | 경도 (W) | 깊이(m) | 온도 (ºC) | 온도 (ºC) | 염도 (PSU) | 염도 (PSU) | 클라 (μg /L) | 클라 (μg /L) | 주이드/m3 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 31.1889 | 80.1527 | 41.30 | 25.26 | 22.43 | 33.58 | 36.96 | Na | 0.20 | Na |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 29.5687 | 80.3269 | 40.00 | 26.40 | 21.75 | 36.26 | 36.32 | 1.04 | 1.35 | 218 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 31.1674 | 80.1249 | 40.80 | 23.24 | 22.60 | 35.91 | 35.81 | 1.06 | 1.70 | 13 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 31.2139 | 80.1823 | 41.00 | 18.72 | 18.84 | 36.00 | 36.12 | 0.83 | 1.50 | 3 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 31.2144 | 80.1822 | 42.00 | 24.19 | 23.85 | 36.00 | 36.04 | 0.63 | 1.30 | 254 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 31.1835 | 80.1466 | 43.00 | 16.85 | 16.45 | 36.50 | 36.48 | 0.56 | 0.89 | Na |
| NA: 데이터를 사용할 수 없음 | |||||||||||
표 1: 남대서양 빅트 중부 대륙붕의 해양 조건과 돌리올리드 풍부함 D. 게겐바우리 주이드는 수집되어 새로운 문화를 시작하는 데 사용되었습니다.
| 표 2. D. 게겐바우리 배양 시도의 결과 | ||||
| 날짜 | 크루즈 신분증 | 주이드 수집 | 결과 | 코멘트 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 성적으로 성숙한 큰 (6-7 mm) gonozooids | 실패 | 모든 고노주이드는 4일 후에 죽었다. Oozooid와 초기 간호사 생활 단계는 생산되었지만 번창하지 못했습니다. |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 성적으로 성숙한 큰 (8-10 mm) gonozooids | 실패 | 고노주이드는 수거 직후 사망했다. Oozooids와 초기 간호사는 생산되었지만 번창하지 못했습니다. |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 늦은 간호사 (4-5mm) 부착 된 trophozooids, 성적으로 성숙한 큰 (6mm) gonozooids 및 oozooids (2mm)를 포함하여 혼합 컬렉션 | 성공적인 | 2016년 1월과 3월에 수집된 4세대 배양, 추가 적인 고노주이드 및 간호사가 문화에 추가되었습니다. 2016년 10월 허리케인 매튜 기간 동안 실험실은 4일 동안 대피했으며 문화는 살아남지 못했습니다. |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 고노주이드(1.5-5mm) 및 대형 포로주이드(6mm)와 부착된 고노주이드 클러스터를 포함한 혼합 컬렉션 | 성공적인 | 2017년 4월에 수집된 4세대 배양된 고노주이드가 문화에 추가되었습니다. 허리케인 어마에 앞서 2017년 9월 문화 종료. |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 고노주이드 (3-6 mm) | 실패 | 큰 고노주이드는 하루 후에 죽었다. 미숙한 고노주이드는 14일 동안 문화에서 살아남았다. 계란은 두 가지 고노주이드에 의해 방출되었다. Oozooids는 생성되었지만 간호사 단계로 발전하는 데 실패했습니다. 문화는 1 개월 후에 실패했습니다. |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | trophozooids 없이 큰 (6-7 mm) 늦은 간호사 | 성공적인 | 문화에서 간호사는 트로포주이드를 생산했습니다. 문화는 3대에 걸쳐 유지되었고 실험이 끝난 2018년 6월 말에 종료되었습니다. |
표 2: 실험실 문화를 확립하려는 시도의 결과 D. 게겐바우리는 남대서양 빅트 중부 대륙 붕어에서 수집되었습니다.
| 돌리오레타 게겐바우리 | 주이드 번호당 | 주이드 번호당 | |||
| 생활 단계 | 3.9 L 항아리 | 1.9L 항아리 | 이소크리시스 갈바나 | 로도모나스 sp. | 탈라시오시라 바이스플로기이 |
| 오주이드 (주)(주)( | 20 | 10 | 포함 | 포함 | 포함하지 않음 |
| 초기 간호사 | 20 | 10 | 포함 | 포함 | 포함하지 않음 |
| 늦은 간호사 와 8 trophozooids | 4 | 2 | 포함 | 포함 | 포함 |
| 늦은 간호사 와 20 trophozooids | 2 | 1 | 포함 | 포함 | 포함 |
| 늦은 간호사 와 30 trophozooids | 1 | 1 | 포함 | 포함 | 포함 |
| 포주이드(1~3mm) | 30 | 15 | 포함 | 포함 | 포함 |
| 공포증 가노주이드 클러스터 (> 5 mm) | 2 | 1 | 포함 | 포함 | 포함 |
| 고노주이드(1~3mm) | 30 | 15 | 포함 | 포함 | 포함 |
| 고노주이드 (> 5 mm) | 2 | 1 | 포함 | 포함 | 포함 |
| 조류의 목표 농도는 각 조류 종의 동일한 혼합물 (탄소 함량)과 40 - 95 μg C / L 사이에서 유지되어야합니다. | |||||
표 3: 각 문화조건의 대상 D. 게겐바우리 수명 주기 단계.
추가 그림 1: 사용자 정의 플랑크톤 휠에 대한 자세한 설명. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
문화 doliolids 수용량은 지난 수십 년 동안 설립되었으며 여러 분야에서 연구를 지원하는 데 사용되었습니다. 우리의 실험실에서 실험 연구는 먹이 와 성장에 초점을 맞춘 적어도 15 과학 연구의 출판을 지원 했다18,26,재생18,28,다이어트6, 29,생리학30,생태31,그리고 돌리오리드의 생태 모델링27.
이 섬세한 동물의 문화는 현재 노동 집약적이고 시간이 많이 걸리지만, 돌리올라이드의 재배는 가능하며, 더 넓은 공동체가 착수한다면 이 생태학적으로 이에 대한 이해의 발전을 촉진할 것입니다. 동물의 진화적으로 중요한 그룹. 이 연구의 목적은 실험실 기반 연구를 수행하기위한 목적으로 문화에서 D. 게겐바우리 수집, 사육 및 유지에 대한 현재의 접근 방식을 설명하는 것이었습니다.
돌리올라이드 문화의 확립은 건강하고 손상되지 않은 동물의 수집을 필요로하며, 일단 포획되면 부드러운 치료, 적절한 영양 및 축산이 필요합니다. 돌리올라이드, 특히 종 D. 게겐바우리,아열대 대륙 선반에 전역적으로 발생하지만 풍부는 매우 가변적 일 수있다. 예를 들어, SAB의 중간 선반 지역에 초점을 맞춘 최근 연구에서, 풍부도는
일단 돌리오리드 주이드가 발견되고 포획되면 동물이 손상되었는지 여부를 확인하기가 어려울 수 있습니다. 동물은 손상되지 않은 것처럼 보일 수 있으며 활발한 수영 과 탈출 행동을 보일 수 있지만, 심지어 가장 작은 부상조차도 번창하지 못할 수 있습니다. 특히 포획된 돌리오리드 주이드의 건강 평가와 관련된 한 가지 특징은 먹이를 주는 능력입니다. 수유 활동은 갓 포획된 동물에게 색소 조류를 제공함으로써 간단하게 평가될 수 있다. 동물이 먹이를 주면 짧은 시간 내에 장이 착색됩니다. 우리의 경험에서, 우리는 붉은 색소 조류의 소량을 추가하는 것을 발견했다, Rhodomonas sp., 신속하게 먹이 활동에 대한 정보를 제공합니다. 먹이가 관찰되지 않으면 문화가 확립 될 가능성이 매우 낮습니다.
경계와 좋은 축산은 그들의 복잡 한 수명 주기 동안 doliolids를 설정 하 고 유지에 대 한 중요 한. 아마도 가장 문제가되는 단계는 애벌레 단계에서 실행 가능한 간호사의 개발과 먹이 trophoozoids의 생산 (발아)입니다. 이 수명 단계에서 우리는 수량, 품질 및 입자 크기와 관련하여 식품 요구 사항이 가장 제한적이라고 추측합니다. 우리의 지식에, D. 게겐바우리 애벌레와 oozooids의 먹이 활동을 조사 한 이전 연구 되었습니다. 예를 들어, 개발 된 여조 및 광색체이드는 광범위한 크기로 입자를 섭취 할 수 있지만 유충, oozooids 및 소규모 간호사의 용량은 더 제한적일 수 있습니다. 실제로, 우리는 이러한 생활 단계에서 성공적인 재배는 조류 식품 혼합물에서 규조류를 생략하여, 적당한 수준에서 음식 농도를 유지함으로써, 낮은 농도에서 빈번한 공급을 수행함으로써, 유지함으로써 달성 될 수 있음을 발견 하나의 큰 gonozooid 및 문화와 몇 가지 copepods, 수동으로 해악의 큰 응집체를 제거하여.
우리는 단일 컬렉션에서 유래 여러 세대에 대한 D. gegenbauri의 문화를 유지하지만, 가능하면 우리는 정기적으로 유전 적 다양성과 견고성을 높이기 위해 갓 수집 된 동물과 기존 문화를 보완 문화의. 이 사례의 잠재적 인 위험은 기생충이나 질병을 문화에 도입하는 것이지만, 우리의 지식에 따르면, 우리는이 문제를 결코 겪지 않았습니다. doliolids 의 기생충의 몇 가지 보고 가 있었지만32,의심 할 여지없이, 그들은 존재한다. 흥미롭게도, 배양된 D. 게겐바우리 고노주이드의 식단을 비교하여 야생에서 발견된 것으로 추정되는 D. 게겐바우리 고노주이드를 대상으로 한 연구에서, 야생 개체군에서 발견된 것으로 추정되는 아피콤플렉스의 기생충이 발견되었다. 배양 동물에결석 6.
기재된 배양 기술의 기존 한계는 주이드 생산량의 한계이다. 특히 설명된 기술은 회전하는 플랑크톤 휠의 낮은 밀도에서 밀봉된 항아리에서 재배를 포함하기 때문에 이 접근 방식을 확장할 수 있는지 또는 작업 흐름이 자동화를 수행할 수 있는지 여부는 불분명합니다. 더 큰 규모의 재배 시스템, 그러나, 또 다른 섬세한 작은 젤라틴 해양 동물 플랑크톤 종, 애벌레 Oikopleura dioica,설명 된20,33,34,그것은 할 수 있음을 시사 향후 doliolids에 대한 유사한 시스템을 설계할 수 있습니다. 그러나, O. dioica의 단순한 생활 역사에 비해 D. 게겐바우리의 복잡한 삶의 역사는 대규모 재배에 중요한 도전남아있을 것입니다.
결론적으로, 여기에 설명 된 프로토콜에 따라, D. gegenbauri 안정적으로 그것의 복잡 한 생활 역사를 통해 제어 된 실험실 조건 하에서 재배 될 수 있다. 이 용량은 종을 통제된 실험 연구의 다양한 관할하게 하고, 아마도 발달 생물학과 진화에 있는 새로운 동물 모형으로 doliolids를 개발하기 위하여. 그러나 이 목표를 달성하기 위해서는 생산 규모의 한계를 극복해야 합니다.
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Disclosures
저자는 선언할 것이 없습니다.
Acknowledgments
G.A를 포함하여 수년에 걸쳐 이 프로젝트에 축적된 지식을 기부해 주신 많은 분들에게 감사드립니다. 파펜회퍼와 D. 데이벨은 원래 이러한 프로토콜을 개발했다. M. Köster, 그리고 L. Lamboley는 또한 이 절차의 발달에 크게 기여했습니다. N.B. 로페즈-피게로아와 아에 로드리게스-산티아고는 표 1에 제공된 돌리올리드 풍부도의 추정치를 생성했다. 이 연구는 MEF에 OCE 082599, 1031263, 공동 프로젝트 OCE 1459293 및 OCE 14595010 MEF와 DMG에, 국립 해양 및 대기 관리 상 NA16SEC4810007에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 R / V 사바나의 근면하고 전문적인 승무원에게 감사드립니다. 리 앤 델레오(Lee Ann DeLeo)가 피규어를 준비했고, 찰스 Y. 로버트슨이 원고를 교정했고, 제임스(지미) 윌리엄스가 플랑크톤 휠을 제작했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
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