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Anbau des Marine Pelagischen Tunikas Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) für experimentelle Studien

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59832
Automatic Translation
1, 2, 1
1Skidaway Institute of Oceanography, University of Georgia, 2Hampton University

Summary

Doliolide, einschließlich der Art Dolioletta gegenbauri, sind kleine gelatinöse Marine Zooplankton von ökologischer Bedeutung auf produktiven subkontinentalen Regalsystemen weltweit gefunden. Die Schwierigkeit, diese empfindlichen Organismen zu kultivieren, schränkt ihre Untersuchung ein. In dieser Studie beschreiben wir Anbauansätze für das Sammeln, Aufzucht und die Pflege des Doliolid Dolioletta gegenbauri.

Abstract

Gelatinezooplanktons spielen eine entscheidende Rolle in den Ökosystemen der Ozeane. Jedoch, Es ist in der Regel schwierig, ihre Physiologie zu untersuchen, Wachstum, Fruchtbarkeit, und trophische Wechselwirkungen in erster Linie aufgrund methodischer Herausforderungen, einschließlich der Fähigkeit, sie zu kulturisieren. Dies gilt insbesondere für die Doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri kommt weltweit häufig in produktiven subtropischen Kontinentalschelfsystemen vor, oft in Blütenkonzentrationen, die einen großen Teil der täglichen Primärproduktion verbrauchen können. In dieser Studie beschreiben wir Anbauansätze für das Sammeln, Aufziehen und Pflegen von D. gegenbauri zum Zweck der Durchführung von Laborstudien. D. gegenbauri und andere doliolid Arten können live mit schräg geschleppten konischen 202 m Mesh Planktonnetzen von einem treibenden Schiff gefangen werden. Kulturen werden am zuverlässigsten etabliert, wenn die Wassertemperaturen unter 21 °C liegen und von unreifen Gonozooiden, reifenden Phorozooiden und großen Krankenschwestern gestartet werden. Kulturen können in abgerundeten Kulturgefäßen auf einem sich langsam drehenden Planktonrad gepflegt und auf einer Ernährung von kultivierten Algen im natürlichen Meerwasser für viele Generationen aufrechterhalten werden. Neben der Fähigkeit, Laborkulturen von D. gegenbaurizu etablieren, zeigen wir, dass der Sammelzustand, die Algenkonzentration, die Temperatur und die Exposition gegenüber natürlich bedingtem Meerwasser für die Kultur entscheidend sind. Gründung, Wachstum, Überleben und Reproduktion von D. gegenbauri.

Introduction

Zooplankton ist die größte tierische Biomasse im Ozean, sind Schlüsselkomponenten in marinen Nahrungsbahnen und spielen eine wichtige Rolle in den biogeochemischen Zyklen der Ozeane1,2. Zooplankton, obwohl aus einer großen Vielfalt von Organismen besteht, kann grob in zwei Kategorien unterschieden werden: gelatinös und nicht-gelatinelatinus mit wenigen Zwischentaxa3,4. Im Vergleich zum nicht-gelatinösen Zooplankton ist das gelatinöse Zooplankton aufgrund seiner komplexen Lebensgeschichten5besonders schwer zu untersuchen und ihre empfindlichen Gewebe werden beim Erfassen und Handling leicht beschädigt. Gelatinezooplankton-Arten sind daher notorisch schwer zu kulturierieren im Labor und im Allgemeinen weniger untersucht im Vergleich zu nicht-gelatinösen Arten6.

Unter den gelatinösen Zooplanktongruppen sind die Thaliaceans eine reichliche und ökologische Bedeutung im Weltmeer. Thaliaceans sind eine Klasse von pelagischen Tunikaten, die die Ordnungen Salpida, Pyrosomida und Doliolida7enthalten. Doliolida, kollektiv als Doliolide bezeichnet, sind kleine fassförmige freischwimmende pelagische Organismen, die in produktiven neritischen Regionen subtropischer Ozeane hohe Mengen erreichen können. Doliolids gehören zu den am häufigsten vorkommenden aller Zooplanktongruppen4,8. Als Suspensionszubringer sammeln Doliolids Lebensmittelpartikel aus der Wassersäule, indem sie Filterströme erzeugen und auf Schleimnetzen erfassen9. Taxonomisch werden Doliolide in das Phylum Urochordata10eingestuft. Die Thaliazer sind neben ihrer ökologischen Bedeutung als Schlüsselkomponenten mariner pelagischer Systeme von Bedeutung für das Verständnis der Ursprünge der kolonialen Lebensgeschichte10,11 und der Evolution. der Akkorddaten5,7,10,12,13,14.

Die Lebensgeschichte der Dolioliden ist komplex und trägt dazu bei, dass es schwierig ist, sie durch ihren Lebenszyklus zu kultivieren und zu erhalten. Einen Überblick über den dolioliden Lebenszyklus und die Anatomie finden Sie in Godeaux et al.15. Der doliolidische Lebenszyklus, der einen obligatorischen Wechsel zwischen sexuellen und asexuellen lebensgeschichtlichen Stadien beinhaltet, ist in Abbildung 1dargestellt. Eier und Spermien werden von den hermaphroditischen Gonozooiden, dem einzigen einsamen Stadium des Lebenszyklus, produziert. Gonozooiden geben Spermien in die Wassersäule frei und Eier werden intern befruchtet und freigesetzt, um sich zu Larven zu entwickeln. Larven schlüpfen und metamorphosen zu Oozooiden, die 1-2 mm erreichen können. Unter der Voraussetzung, dass die bedingungenund die Ernährung förderlich sind, werden Oozooide innerhalb von 1-2 Tagen bei 20 °C zu frühen Krankenschwestern und initiieren die kolonialen Stadien des Lebenszyklus. Oozooiden produzieren asexuell Knospen auf ihrem ventralen Stolon. Diese Knospen verlassen den Stolon und wandern zum dorsalen Cadophor, wo sie sich in drei gepaarten Reihen aneinanderreihen. Die zentralen Doppelreihen werden zu Phorozooiden und die äußeren zwei Doppelreihen zu Trophozooiden. Letztere versorgen sowohl die Krankenschwester als auch die Phorozooiden mit Nahrung16,17. Die Trophozooide versorgen die Krankenschwester mit Nahrung, da sie alle inneren Organe verliert. Mit zunehmender Fülle von Trophozooiden kann die Größe der Krankenschwester im Labor 15 mm erreichen. Während die Phorozooide wachsen, schlucken sie zunehmend planktonische Beute und erreichen eine Größe von 1,5 mm, bevor sie als Individuen17freigelassen werden. Eine einzige Krankenschwester kann > 100 Phorozooide während ihrer Lebensdauer18freisetzen. Nachdem die Phorozoiden aus dem Cadophor befreit wurden, wachsen sie weiter und sind die zweite koloniale Phase des Lebenszyklus. Sobald sie 5 mm groß sind, entwickelt jeder Phorozooid einen Haufen Gonozooide auf seinem ventralen Pedunkel. Diese Gonozooide können Partikel aufnehmen, wenn sie eine Länge von 1 mm erreichen. Nachdem die Gonozooiden 2 bis 3 mm groß sind, werden sie aus dem Phorozooid befreit und werden zum einzigen Einzelstadium des Lebenszyklus. Sobald sie 6 mm groß werden, werden Gonozooide geschlechtsreif17. Gonozooide können 9 mm oder mehr länge werden. Gonozooide sind hermaphroditisch, Spermien werden zeitweise freigesetzt, während die Befruchtung der Eier intern erfolgt16,17. Wenn der Gonozooid 6 mm groß ist, gibt er bis zu 6 befruchtete Eier frei. Erfolgreiche Kultivierung erfordert die Unterstützung der spezifischen Bedürfnisse jeder dieser einzigartigen Lebensgeschichte-Stadien.

Aufgrund der ökologischen und evolutionären Bedeutung der Thaliaceaner, einschließlich der Dolioliden, sind die Kultivierungsmethoden erforderlich, um das Verständnis der einzigartigen Biologie, Physiologie, Ökologie und Evolutionsgeschichte dieses Organismus zu fördern19 . Doliolids haben als experimentelle Modellorganismen in der Entwicklungsbiologie und der funktionellen Genomik erhebliche Versprechen, weil sie transparent sind und wahrscheinlich die Genome20,21gestrafft haben. Der Mangel an zuverlässigen Anbaumethoden behindert jedoch deren Nutzen als Labormodelle. Obwohl eine Handvoll Laboratorien Ergebnisse veröffentlicht haben, die auf kultivierten Dolioliden basieren, wurden zu unserem Wissen Anbauansätze und detaillierte Protokolle bisher nicht veröffentlicht. Basierend auf jahrelanger Erfahrung und Versuchs- und Fehlerkultivierungsversuchen bestand der Zweck dieser Studie darin, Erfahrungen zu überprüfen und Protokolle für die Sammlung und Kultivierung von Dolioliliden, insbesondere der Art Dolioletta gegenbauri,auszutauschen.

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Protocol

1. Vorbereitung von Aufzuchteinrichtungen Für D. gegenbauri

HINWEIS: Alle benötigten Materialien und Ausrüstungen sind in der Materialtabelleaufgeführt.

  1. Bereiten Sie 1 M Natriumhydroxid (NaOH), 0,06 M Kaliumpermanganat (KMnO4) Lösung vor. Um diese Lösung vorzubereiten, lösen Sie 400 g NaOH in 10 L entionisiertes Wasser auf. 100 g KMnO4 in die NaOH-Lösung geben und gut vermischen.
  2. Eine 0,1 M Natriumbisulfitlösung (NaHSO3) vorbereiten, indem Sie 100 g NaHSO3 in 10 L entionisiertes Wasser auflösen und gut vermischen.
    VORSICHT: Diese Reagenzien sind Reizstoffe, die atemsordenprobleme verursachen können, wenn sie eingeatmet werden. Platzieren Sie in einem gut belüfteten Bereich wie einer Dunstabzugshaube. Vermeiden Sie Hautkontakt. Tragen Sie Schutzhandschuhe, Schutzkleidung, Augenschutz und Gesichtsschutz bei der Handhabung.
  3. Vor der Etablierung und Aufzucht doliolid Kulturen im Labor, reinigen und sterilisieren die Kulturgläser.
    1. Spülen Sie 1,9 L und 3,8 L KulturGläser mindestens 3 mal mit entionisiertem Wasser. Lassen Sie die Schraubverschlüsse trocknen, da die Kappen in den folgenden Reinigungsschritten nicht enthalten sind.
    2. Reinigen und sterilisieren 1,9- und 3,8 L Glaskulturgläser, indem Sie sie in die NaOH/KMnO 4-Lösung eintauchen. Lassen Sie die Gläser über Nacht einweichen.
    3. Entfernen Sie die Gläser aus der NaOH/KMnO 4-Lösung und tauchen Sie die Gläser in die Natriumbisulfitlösung (NaHSO3) ein. Lassen Sie die Gläser über Nacht einweichen.
    4. Entfernen Sie die Gläser aus der NaHSO3 Lösung und spülen Sie sie gründlich mit entionisiertem Wasser ab. Lassen Sie die Gläser trocknen.
  4. Legen Sie das Planktonrad (Abbildung 2) in einen temperaturgeregelten Raum (Umweltkammer). Die Temperatur auf 20 °C ausdemieren. Eine ausführlichere Beschreibung des kundenspezifischen Planktonrades finden Sie in der Ergänzenden Abbildung 1.

2. Phytoplanktonkultur

  1. Erhalten Sie Algenkulturen vom National Center for Marine Algen and Microbiota (NCMA) oder anderen Quellen, die als Nahrung für D. gegenbauriverwendet werden. Mischungen von zwei Flagellate-Arten, darunter Isochrysis galbana (CCMP 1323), Rhodomonas sp (CCMP 740) und ein kleines Diatom, Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) wurden aus der NCMA gewonnen und in früheren Laboren verwendet. Studien, um Doliolids erfolgreich zu hinterziehen17.
  2. Bereiten Sie L1 und L1-Si Wachstumsmedien22 wie von der NCMA empfohlen vor.
  3. Folgen Sie den Anweisungen des Lieferanten, um die neuen Algenkulturen zu initiieren.
  4. Um die Bestandskulturen mit strengen axtischen Kulturtechniken zu erhalten, übertragen Sie alle zwei Wochen 0,5 ml alter Seneszenkultur auf 25 ml frische Wachstumsmedien in sterilen 55 ml Glaskulturröhren.
    HINWEIS: Es ist nicht möglich, lebende Algenkulturen zu speichern, ohne sie regelmäßig zu übertragen. Wenn Kulturen über einen längeren Zeitraum nicht verwendet werden und es nicht möglich ist, Kulturen für die Dauer des Nichtnutzungszeitraums aufrechtzuerhalten, wird empfohlen, diese gemeinsamen Algenkulturen aus ihren ursprünglichen Quellen (z. B. NCMA) wieder zu erwerben.
  5. Bereiten Sie größere Mengen Anbauplankton für die Fütterung von Dolioliden in sauberen 500 ml Kunststoffgewebekulturkolben vor, die 200 ml Wachstumsmedien enthalten.
    1. Phytoplankton aus axtischen Beständen (4 ml) in 200 ml Wachstumsmedien (1:50 Verdünnung) impfen.
    2. Bei 20 °C mit einem 12:12 h-Licht:dunkel-Zyklus unter kühlweißer Lichtbeleuchtung von 65-85 x E/m2inkubieren. Legen Sie Kulturkolben flach, um die Beleuchtung zu maximieren. Sanft wirbeln Kultur täglich.
    3. Bestimmen Sie die Konzentration von Zellen mit einem Partikelzähler oder Mikroskop, um das Wachstum der Kulturen zu überwachen.
      HINWEIS: Nach 7-10 Tagen nach der Impfung enthalten die Flagellate-Kulturen 105-106 Zellen/ml und die Diatomkultur 104-105 Zellen/ml. Diese Konzentrationen reichen aus, um die dolioliden Kulturen zu erhalten.
    4. Initiieren Sie mindestens alle zwei Wochen neue Fütterungsbestände, um genügend Algenbiomasse für die Unterstützung aller Kulturaktivitäten bereitzustellen.

3. Sammlung von wilden Dolioliden und Meerwasser für die Kultur

ANMERKUNG: Abbildung 3ist ein Überblick über die Sammlungs- und Anbauansätze. Eine Beschreibung des spezialisierten Sammelplanktonnetzes und des Kabeljauends ist in Abbildung 4enthalten.

  1. Suchen Sie Doliolid, indem Sie sie entweder mit Planktonnetzen oder In-situ-Bildgebungssystemen erkennen23.
    HINWEIS: Da Doliolids selten in Oberflächengewässern vorhanden sind und nicht durch Fernerkundungstechnik nachweisbar sind, geleitet von der erforderlichen Kenntnis der für Doliolids günstigen Bedingungen (siehe Diskussion), muss das Vorhandensein von Dolioliden bestimmt werden. vor der Probenahme.
  2. Sammeln Sie partikelreiches Meerwasser, bevor Sie lebende Doliolide sammeln, um eine D. gegenbauri-Kultur zu ins Leben zu schaffen.
    1. Setzen Sie Niskin-Flaschen, die auf einer CTD-Rosette oder einer gleichwertigen Ausrüstung montiert sind, ein, um Wasser von dem Ort zu sammeln, an dem sich Doliolid befinden, und aus der Tiefe, die die höchsten Schätzungen von Chlorophyll enthält, eine Konzentration, die durch in situ Fluorometrie geschätzt wird.
      HINWEIS: Chlorophyll eine Konzentration wird als Indikator für Partikelkonzentrationen verwendet. Auf dem Südatlantik-Bight (SAB) Mittelkontinentalschelf ist das untergrundige Chlorophyll in der Regel nahe am Boden, aber an anderen Stellen ist es möglicherweise nicht.
  3. Sobald Doliolide gefunden sind, erholen Sie unbeschädigte Doliolid-Zooiden mit dem spezialisierten Planktonnetz und Kabeljau-Ende. Bevor Sie das Netz einsetzen, füllen Sie das Kabeljau-Ende mit Meerwasser.
    1. Von einem treibenden Schiff, niedriger und heben Sie das Netz durch die Wassersäule mit einem schrägen Abschleppwinkel von 15 - 25° und vertikale Einsatz- und Abrufgeschwindigkeit nicht größer als 15 m/min.
  4. Sobald das Netz an Bord ist, übertragen und teilen Sie den Inhalt des Kabeljau-Endes vorsichtig in 3, 5-Gallonen (ca. 20 l) Plastikeimer, die jeweils 10 l Oberflächenmeerwasser enthalten, das von der Website gesammelt wird.
    HINWEIS: Neue Plastikeimer sollten durch die Zugabe von Meerwasser Tage vor der lebenden doliolid Sammlung konditioniert werden. Ziel ist es, die Auslaugung von Chemikalien aus Kunststoff zu reduzieren. Wenn kein Meerwasser zur Verfügung steht, verwenden Sie gereinigtes (z. B. Milli Q) oder Leitungswasser frei von giftigen Verunreinigungen, um die Eimer zu konditionieren.
  5. Isolieren Sie Doliolid-Zooiden von anderen Plankton.
    1. In kleinen Chargen (ca. 2 l) gemischte Bretter aus dem Netzschleppinhalt (jetzt in 20 L Kunststoffeimer) in einen 2 L Glasbecher übertragen.
    2. Mit einer Breitbohrglaspipette (8 mm ID x 38 cm Länge), vorsichtig siphon und übertragen aktiv schwimmendoliolid Zooiden aus dem Becher in saubere Glaskultur Gläser mit partikelreichem Meerwasser gesammelt mit Niskin-Flaschen, aus denen Doliolids waren befindet.
    3. Lassen Sie die Doliolid-Zooiden vorsichtig unter der Oberfläche des Meerwassers frei.
      HINWEIS: Sammeln Sie Gonozooide, Phorozooide, die angehängte Gonozooide enthalten, und Krankenschwesternstadien, die angehängte Trophozooide enthalten (Abbildung 1).
  6. Fügen Sie nach der Zugabe von Dolioliden Rhodomonas sp. Kultur zu einer Endkonzentration von 5 x 103 – 104 Zellen/ml hinzu (50 ml einer Kultur, die 5 x 104 – 1 x 105 Zellen/ml in einem 3,8 l Glas enthält). Dabei soll festgestellt werden, ob die Doliolid aktiv gefüttert werden. Wenn Doliolids Rhodomonas sp.einnehmen, erscheint ihr Verdauungstrakt rot in der Farbe. Entfernen Sie Zooide, die nicht zu füttern scheinen.
  7. Um zu verhindern, dass Doliolide an der Luft-Wasser-Schnittstelle eingeschlossen werden, vermeiden Sie den Kopfraum in den Kulturgläsern, indem Sie die Gläser vollständig mit ungefiltertem partikelreichem Meerwasser füllen und ein Stück Plastikfolie über die Glasöffnung legen (89 mm breit).
    1. Vermeiden Sie die Schaffung von Luftblasen, die auch die Tiere beschädigen können. Schrauben Sie die Kappe vorsichtig auf das Glas und invertieren Sie das Glas vorsichtig, um festzustellen, ob Blasen vorhanden sind. Wenn Blasen vorhanden sind, entfernen Sie sie.
    2. Nachdem die Gläser gefüllt sind, wischen Sie das überschüssige Wasser von der Außenseite des Glases ab.
  8. Montieren Sie jedes Glas auf das Planktonrad (Abbildung 2), indem Sie das Glas auf die mit Gummirohren überzogenen vertikalen Metallstangen und zwischen einer Schlauchklemme aus Edelstahl legen.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Rückseite des Glases gegen den Gummischlauch gepolstert ist. Ziehen Sie die Schlauchklemme um das Glas, indem Sie die Schraube einstellen.
    2. Stellen Sie sicher, dass sich das Glas nicht bewegt, sobald es sicher an Ort und Stelle befestigt ist. Lassen Sie die Gläser bei 0,3 Rpm drehen, um die Doliolids in Suspension zu halten.
      VORSICHT: Es ist wichtig, das Glas nicht zu festziehen, um zu verhindern, dass das Glas knackt.
  9. Halten Sie auf dem Schiff die Kulturgefäße auf dem Planktonrad bei 20 °C in dim light, bis sie in die Laborkulturanlage gebracht werden können.
  10. Nach der Rückkehr ins Labor die Gläser mit Doliolids in die vorbereitete Kultureinrichtung zu übertragen. Montieren Sie Gläser am Planktonrad (siehe Schritt 3.8) und lassen Sie die Gläser bei 0,3 Rpm weiter drehen.
    HINWEIS: Die gesamte Aufzucht von Doliolids in dieser Studie wurde bei 20 °C durchgeführt.

4. Erhaltung der D. gegenbauri-Kulturen

  1. Vom Schiff bis zum Labor, lassen Sie die Tiere in den Originalgläsern an die Laborbedingungen für 3 Tage zu akklimatisieren.
    1. Verwenden Sie während der Eingewöhnungszeit eine Breitbohrglaspipette, um 10% des Wassers mit ungefiltertem partikelreichem Meerwasser aus der Sammelstelle jeden Tag für 3 Tage auszutauschen.
    2. Halten Sie mehrere Copepods im Glas, aber entfernen Sie alle anderen Zooplankton, große Fäkalienpellets und große aggregierte Partikel, die das Filtergerät des Doliolidvers verstopfen können (Schleimnetz). Wenn die Kultur aus frühen Krankenschwestern besteht, halten Sie ein großes Gonozooid (ca. 6 mm) im Glas.
      HINWEIS: Es ist nicht wichtig, welche Copepod-Arten in die Kultur aufgenommen werden, aber in diesem Experiment wurden die am häufigsten vorkommenden Arten verwendet, von denen aus die Doliolids gefangen wurden.
  2. Nach der Akklimatisierungsphase doliolid zooids und copepods aus dem Originalglas in ein sauberes Anbauglas mit 80% Glasfaserfilter (GF/F) gefiltertem Meerwasser und 20% des Meerwassers aus dem Originalglas übertragen. Bereiten Sie gefiltertes Meerwasser vor, indem Sie Meerwasser durch ein GF/F mit einer Nominnoporengröße von 0,7 m Filterpapier filtern.
  3. Erhalten Sie die neue Kultur, indem Sie alle 3 Tage 10 % des Wassers mit GF/F gefiltertem Meerwasser austauschen und Aggregate und Fäkalienpellets entfernen. Wöchentlich Tiere in ein neues Glas überführen, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
  4. Füttern Sie Doliolid, indem Sie die Phytoplanktonkonzentrationen in den Kulturgläsern zwischen 40 - 95 °C/L aufrechterhalten.
    HINWEIS: Diese Konzentrationen imitieren Umweltbedingungen, die bekanntermaßen die Blütenbedingungen für D. gegenbauri17unterstützen. Die Mischung der Algenarten variiert je nach Lebensstadium und Anzahl der Zooide in jedem Glas. In den frühen Lebensphasen nur 1:1-Mischung (durch Kohlenstoffgehalt) der Kryptomonadenalgen(Isochrysis galbana und Rhodomonas sp.) hinzufügen. Größere Beutearten können leicht die Fütterungsapparate von kleinen Krankenschwestern und die Entwicklung von Trophozooiden verstopfen. Fügen Sie das Diatom Thalassiosira weissflogii in die Algenmischung, auch bei gleichem Kohlenstoffgehalt, bei der Fütterung größerer Krankenschwestern, Phorozooide und Gonozooide.
    1. Überwachen Sie die Algenkonzentrationen vor und nach der Fütterung, um die Entscheidung zu bestimmen, wie häufig und wie viel Algen den Kulturen hinzugefügt werden sollen. Verwenden Sie einen Partikelzähler, um Algenkonzentrationen zu bestimmen, da die Algenkonzentrationen in den Kulturgläsern relativ verdünnt sind.
  5. Entfernen Sie genügend Zooide, um Algenkonzentrationen von 40 – 95 gC/L beizubehalten, damit die verbleibenden Doliolide genügend Nahrung zum Wachsen haben.
    HINWEIS: Das schwierigste Lebensstadium, das unter Laborbedingungen erfolgreich aufrechterhalten werden kann, sind die sich entwickelnden Larven und Oozooiden (frühe Krankenschwester). Während dieser Phase der Kultur, halten Sie eine große Gonozooid (ca. 6 mm) zusätzlich zu mehreren Copepoden im Glas mit sich entwickelnden Larven und Oozooiden (ca. 20 pro 3,8 l Glas).
  6. Übertragen Sie mindestens 4 Krankenschwestern in ein neues Kultivierungsgefäß, sobald mindestens 8 Trophozooide auf dem Cadophor der Krankenschwester sichtbar sind (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Trophozooide verdoppeln sich alle 1 – 2 Tage bei 20 °C. Trophozooide sind groß genug, um mit bloßem Auge sichtbar zu sein.
    1. Entfernen Sie zwei der Krankenschwestern, sobald Krankenschwestern entwickeln 20 Trophozooide.
    2. Entfernen Sie eine Krankenschwester, wenn die Krankenschwestern entwickeln > 30 Trophozooide auf ihren Cadophoren. Erlauben Sie der verbleibenden Krankenschwester, Phorozooide auf ihrem Cadophor zu entwickeln.
    3. Entfernen Sie die Krankenschwester, sobald die Krankenschwester bis zu 30 Phorozooide freisetzt.
  7. Reduzieren Sie die Anzahl der Tiere im Glas, sobald die Phorozooide 3 mm groß werden.
    1. Entfernen Sie alle bis auf vier Phorozooide, wenn die Phorozooide größer werden (> 5 mm) und haben gonozooid Cluster entwickelt.
    2. Reduzieren Sie die Kultur auf zwei Phorozooide, wenn die Anzahl der Gonozooiden-Cluster an Größe zunimmt und zu füttern beginnt.
    3. Entfernen Sie die Phorozooiden, sobald die Phorozooiden bis zu 30 Gonozooide freisetzen.
  8. Reduzieren Sie die Anzahl der Gonozoiden von 30 Zooiden auf 2 pro Glas. Befruchtete Eier in das Glas geben lassen.
    1. Entfernen Sie eine Gonozooid verlassen eine einzelne Gonozooid im Glas, sobald die Oozooiden entwickeln.
      HINWEIS: Ausrangierte Krankenschwestern, Phorozooide und Gonozooide können verwendet werden, um zusätzliche Kulturen auszusäen und weitere Experimente durchzuführen.

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Representative Results

Nach den beschriebenen Verfahren zur Erhebung und Kultivierung des Doliolids, D. gegenbauri in Abbildung 3beschrieben, ist es möglich, eine Kultur von D. gegenbauri während seiner komplexen Lebensgeschichte zu erhalten (Abbildung 1) und für viele Generationen erhalten. Obwohl hier der Anbau von D. gegenbauri beschrieben wird, sollten diese Verfahren auch für den Anbau anderer Doliolidarten relevant sein.

Die Erfassung gesunder und unbeschädigter Doliolid-Zooide erfordert die Anwendung spezialisierter Netze und Abschleppverfahren (Abbildung 4). Als empfindliche Tiere ohne harte Strukturen sollte darauf geachtet werden, Verfahren zu minimieren, die zu körperlichen Schäden führen können. Zu diesen Faktoren können Turbulenzen, Druck und Wechselwirkungen mit Oberflächen wie Netz-, Luft- und Luftblasen gehören. Trotz ihrer zarten Natur können jedoch unbeschädigte Doliolid-Zooide mit einem konischen Planktonnetz mit einem Öffnungsdurchmesser von 1:5 gesammelt und mit einem relativ großen gewichteten, nicht filternden Kabeljau-Ende ausgestattet werden. Routinemäßig haben wir ein 202 m Mesh 2,5 m (Länge) Planktonnetz mit einer 0,5 m Öffnung in einem Schwenkgurt montiert und mit einem 4 L gewichteten, nicht filternden Kabeljau-Ende ausgestattet (Abbildung4). Obwohl die Wirkung der Planktonmaschengröße auf den Fang von kultivierten D. gegenbauri Zooiden nicht systematisch untersucht wurde, kann theoretisch die Verwendung eines Netzes mit einer größeren Maschenöffnung zu einer weiteren Verbesserung führen, da eine größere Maschenöffnung das während des Abschleppens entstehende Druckfeld zu reduzieren. Alternativ führt eine größere Maschenöffnung zu einem größeren Wasserfluss durch das Netz, was potenziell schädliche Doliolid-Zooide. Abschleppgeschwindigkeiten und Netzwinkel sollten optimiert werden, um Abschleppzeit und Schäden während der Abholung zu minimieren. Nach unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass ausreichend schonende Abschleppbedingungen erreicht werden können, indem das Netz schräg in einem Winkel von 15-25° von einem driftenden Schiff mit vertikalen Einsatz- und Abrufgeschwindigkeiten von nicht mehr als 15 m/min abgeschleppt wird. Um das Netz an der Strömungsrichtung auszurichten, ist das Planktonnetz in einem Schwenkgurt montiert. Es ist in der Regel der Fall, dass die Verteilung der Doliolid in der Wassersäule nicht zufällig und in der Regel am größten in der Region mit den höchsten Partikelbelastungen24ist. Daher sollte die Wassersäule unterhalb des unterirdischen Chlorophylls maximal zur Oberfläche beprobt werden. Im flachen SAB-Mittelkontinentschelf (20 - 45 m) wird die Wassersäule von 1 m über dem Boden bis zur Oberfläche abgetastet.

Sobald gesunde Zooide gesammelt wurden, ist es wichtig, sie in einer Weise zu erhalten, die die Exposition gegenüber Oberflächen minimiert. Um Begegnungen mit Oberflächen zu minimieren, werden Doliolids in abgerundeten, mit Meerwasser gefüllten Gläsern aufbewahrt und sanft auf ein sich langsam drehendes Planktonrad getrommelt (Abbildung 2).

Obwohl es theoretisch möglich ist, eine Kultur mit Zooiden jeder Lebensphase zu beginnen, deuten die Erforschung von Erfolgen und Misserfolgen bei der Etablierung neuer Kulturen von D. gegenbauri aus 6 Versuchen zwischen 2015 – 2018 in der Südatlantik-Bucht darauf hin, dass der Erfolg wird am häufigsten erreicht, wenn Zooide aus Gewässern gesammelt werden, die < 21°C sind, und wenn andere Lebensstadien als große reife Gonozooide verwendet werden, um eine neue Kultur zu beginnen (Tabelle 1 und Tabelle 2). In der Praxis ist es hilfreich oder zumindest nicht schädlich, mehrere Lebensstadien von doliolid enzoden Zooiden einzubeziehen, wenn eine neue Kultur ins Leben geschlossen wird.

Der Erfolg bei der Erhaltung einer Kultur von D. gegenbauri, wie für andere pelagische Tunikatenarten20beschrieben wurde, hängt davon ab, dass ausreichende, aber nicht übermäßige Nahrungsmittel- und Nahrungsvielfalt vorhanden sind, die erforderlich ist, um jede Lebensphase zu unterstützen. Da die Anforderungen an die Ernährung über den gesamten Lebenszyklus variieren, muss die bei jeder Fütterungszeit bereitgestellte Algenmenge variiert werden, um die Futterkonzentrationen auf den gewünschten Zielwerten (40 – 95 g C/L) zu halten (Tabelle 3). Konzentrationen oberhalb oder unterhalb dieser Werte können zu erhöhten Sterblichkeitsraten führen (G.A. Paffenhöfer pers. comm.). Obwohl die natürliche Ernährung von D. gegenbauri nach wie vor wenig verstanden wird6, können Kulturen durch die Bereitstellung relativ einfacher Mischungen von kultivierten Algen und die Verwendung von Verfahren, die es ermöglichen, verschiedene mikrobielle Gemeinschaften in die Kultur. Die Erhöhung der potenziellen Vielfalt des Beutefeldes wird erreicht, indem ein Bruchteil des Partikelwassers aus älteren Kulturen erhalten bleibt und eine kleine Anzahl von lebenden Copepods und großen Dolioliden bei jedem Wasserwechsel oder -transfer aufgenommen wird. Vermutlich verarbeiten diese Organismen Algen und detritales Material und dienen dazu, die Partikelgröße und das Qualitätsspektrum für die doliolide Ernährung zu diversifizieren, aber zusätzliche Studien sind erforderlich, um diese Hypothese zu bestätigen.

Die Verfügbarkeit von Doliolidkulturen bietet die Möglichkeit, unter kontrollierten experimentellen Bedingungen viele wichtige Aspekte der Doliolidbiologie, Physiologie, Ökologie und Molekularbiologie zu untersuchen. Zum Beispiel, obwohl Doliolids in zahlreichen Regionen des Küstenmeeres reichlich vorhanden sind und wichtige Planktonic-Weidensind 25, Bleiben Daten über Fütterungsraten und Wachstum knapp26. Die Verwendung von Kulturen von D. gegenbauri, ein Schwerpunkt der kulturbasierten Forschung war die Quantifizierung von Fütterungs- und Wachstumsraten als Reaktion auf kritische Umweltparameter wie Temperatur und Lebensmittelkonzentrationen26. Die Ergebnisse dieser Studien haben gezeigt, dass die Clearance-Raten bei Konzentrationen von 20 bis 60 g C/L ähnlich sind und mit zunehmender Nahrungsmittelkonzentration abnehmen (Abbildung 5A). Die Clearance-Raten steigen proportional über Temperaturbereiche, die das Wachstum von D. gegenbauri unterstützen (Abbildung 5B). Die Wachstumsraten (k) liegen je nach Temperatur und Verfügbarkeit von Lebensmitteln zwischen 0,1 und 0,7/Tag (Abbildung 6). Diese Studien lieferten nicht nur praktische Informationen für die Kultivierung, sondern ermöglichten auch die Bestimmung quantitativer Zusammenhänge zwischen doliolider Fütterung und Wachstumsraten in Abhängigkeit von Umweltparametern und liefern kritische Einblicke in die die Biologie und Ökologie der Dolioliden, die für die Einbeziehung dieser wichtigen Zooplanktongruppe in Modellierungsrahmen erforderlich sind27.

Figure 1
Abbildung 1: Der Lebenszyklus von D. gegenbauri bei 20 °C.
Die Lebenszykluszeichnung (1A) wurde nach Walters et al. 20186 geändert und mit Genehmigung neu gezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Planktonrad zur Kultur D. gegenbauri. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Übersicht D. gegenbauri Sammlung und Anbau Ansatz.
Sammlung auf See (A), Transfer von konzentrierten Eimern zu kleinen Glasbechern in kleinen Chargen (B), Isolierung von Doliolid-Zooiden in Anbaugefäße mit partikelreichem Meerwasser (C), Pflege am Planktonrad während des gesamten Lebenszyklus (D,E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Planktonnetz und Bereitstellung.
Bereitstellung (oben links), Abruf (oben rechts) und Schemata von Netz und Kabeljauende (unten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Algenabfertigungsraten von D. gegenbauri gonozooids.
(A) Beziehung zwischen (A) Mittleren (S.E.) Clearance-Raten (mL/zooid/day) und Phytoplanktonkonzentration (g C/L) für drei Größen von D. gegenbauri gonozooiden. Jeder Punkt stellt 4–11 Beobachtungen dar. (B) Mittlere Clearance-Raten (mL/Zooid/Tag) im Vergleich zur Temperatur (°C) für drei Größen von D. gegenbauri gonozooiden. Jeder Punkt stellt 4–12 Beobachtungen dar. Gonozooiden Größen sind 2,5 mm (black circlegray circle), 4,5 mmwhite circle( ), und 6,5 mm ( ). Die Zahlen wurden mit Genehmigung26neu gezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Wachstumsraten D. gegenbauri gonozooid.
Verhältnis zwischen (A) Mittleren Wachstumsraten (k) im Vergleich zur Phytoplanktonkonzentration (g C/L) für drei Größen von Dolioletta gegenbauri gonozooiden. Jeder Punkt stellt 4–11 Beobachtungen dar. (B) Mittlere Wachstumsraten (k) gegenüber Temperatur (°C) für drei Größen von Dolioletta gegenbauri gonozooiden. Jeder Punkt stellt 4–12 Beobachtungen dar. Gonozooiden Größen sind 2,5 mm (black circlegray circle), 4,5 mmwhite circle( ), und 6,5 mm ( ). Die Figuren wurden mit Genehmigung von Gibson und Paffenhöfer26neu gezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1. Ozeanographische Bedingungen und Doliolid-Überfluss
oberfläche Unteres oberfläche Unteres oberfläche Unteres Doliolid Abundance
datum Kreuzfahrt ID Breitengrad (N) Längengrad (W) Tiefe (m) Temperatur (C) Temperatur (C) Salinität (PSU) Salinität (PSU) Chla (g/L) Chla (g/L) zooids/m3
20/05/2015 SAV-15-10 31.1889 80.1527 41.30 25.26 22.43 33.58 36.96 Na 0.20 Na
04/08/2015 SAV-15-19 29.5687 80.3269 40.00 26.40 21.75 36.26 36.32 1.04 1.35 218
02/12/2015 SAV-15-31 31.1674 80.1249 40.80 23.24 22.60 35.91 35.81 1.06 1.70 13
02/02/2017 SAV-17-03 31.2139 80.1823 41.00 18.72 18.84 36.00 36.12 0.83 1.50 3
07/11/2017 SAV-17-23 31.2144 80.1822 42.00 24.19 23.85 36.00 36.04 0.63 1.30 254
01/02/2018 SAV-18-02 31.1835 80.1466 43.00 16.85 16.45 36.50 36.48 0.56 0.89 Na
NA: Daten nicht verfügbar

Tabelle 1: Ozeanographische Bedingungen und doliolide Fülle auf dem Südatlantik-Bight-Mittelkontinentschelf zu der Zeit und dem Ort, an dem D. gegenbauri Zooiden wurden gesammelt und verwendet, um neue Kulturen zu initiieren.

Tabelle 2. Ergebnisse von D. gegenbauri Culturing Attempts
datum Kreuzfahrt ID Zooiden gesammelt ergebnis Kommentare
20/05/2015 SAV-15-10 Geschlechtsreife große (6-7 mm) Gonozooide gescheitert Alle Gonozoiden waren nach 4 Tagen gestorben. Oozooid und frühe Krankenschwester Lebensphasen wurden produziert, aber nicht gedeihen.
04/08/2015 SAV-15-19 Geschlechtsreif große (8-10 mm) Gonozooide gescheitert Gonozooiden starb kurz nach der Sammlung. Oozooiden und frühe Krankenschwestern wurden produziert, aber nicht gedeihen.
02/12/2015 SAV-15-31 Gemischte Sammlung mit später Krankenschwester (4-5 mm) mit angebrachten Trophozooiden, geschlechtsreifen großen (6 mm) Gonozooiden und Oozooiden (2 mm) erfolgreich Kultur für 4 volle Generationen, zusätzliche Gonozooiden und Krankenschwestern gesammelt im Januar und März 2016 wurden der Kultur hinzugefügt. Labor wurde für 4 Tage während Hurrikan Matthew im Oktober 2016 evakuiert und die Kultur überlebte nicht.
02/02/2017 SAV-17-03 Gemischte Sammlung mit Gonozooiden (1,5-5 mm) und großen Phorozooiden (6 mm) mit angeschlossenen Gonozooiden-Clustern erfolgreich Kultur für 4 volle Generationen, zusätzliche Gonozooiden gesammelt im April 2017 wurden der Kultur hinzugefügt. Beendet Kultur im September 2017 vor Hurrikan Irma.
07/11/2017 SAV-17-23 Gonozooide (3-6 mm) gescheitert Große Gonozooid starb nach 1 Tag. Der unreife Gonozooid überlebte 14 Tage lang in der Kultur. Eier wurden von beiden Gonozooiden freigegeben. Oozooiden wurden produziert, aber nicht zu Krankenschwesternstadien entwickelt. Die Kultur ist nach 1 Monat ausgefallen.
01/02/2018 SAV-18-02 Große (6-7 mm) späte Krankenschwester ohne Trophozooide erfolgreich In der Kultur produzierte die Krankenschwester Trophozooide. Die Kultur wurde für 3 Generationen aufrechterhalten und Ende Juni 2018 mit dem Abschluss der Experimente beendet.

Tabelle 2: Ergebnis der Versuche, Laborkulturen D. gegenbauri aus dem Südatlantik-Bight-Mittelkontinentschelf gesammelt.

Dolioletta gegenbauri Zooid-Zahl pro Zooid-Zahl pro
Lebensphase 3.9 L Glas 1.9 L Glas Isochrysis galbana Rhodomonas sp. Thalassiosira weissflogii
oozooid 20 10 einschließen einschließen NICHT EINSCHLIEßEN
Frühkrankenschwester 20 10 einschließen einschließen NICHT EINSCHLIEßEN
späte Krankenschwester mit 8 Trophozooiden 4 2 einschließen einschließen einschließen
späte Krankenschwester mit 20 Trophozooiden 2 1 einschließen einschließen einschließen
späte Krankenschwester mit 30 Trophozooiden 1 1 einschließen einschließen einschließen
phorozooid (1 bis 3 mm) 30 15 einschließen einschließen einschließen
phorozooid gonozooid Cluster (> 5 mm) 2 1 einschließen einschließen einschließen
gonozooid (1 bis 3 mm) 30 15 einschließen einschließen einschließen
gonozooid (> 5 mm) 2 1 einschließen einschließen einschließen
Zielkonzentrationen von Algen sollten zwischen 40 - 95 g C/L mit gleichen Mischungen (nach Kohlenstoffgehalt) jeder Algenart gehalten werden.

Tabelle 3: Zielkulturbedingungen für jeden D. gegenbauri Lebenszyklusphase.

Ergänzende Abbildung 1: Detaillierte Beschreibung des kundenspezifischen Planktonrades. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

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Discussion

Die Fähigkeit zur Kultur von Doliolids wurde in den letzten Jahrzehnten etabliert und zur Unterstützung der Forschung in mehreren Bereichen genutzt. Experimentelle Studien in unseren Laboratorien haben die Veröffentlichung von mindestens 15 wissenschaftlichen Studien unterstützt, die sich auf die Fütterung und das Wachstum konzentrierten18,26, Reproduktion18,28, Diät6, 29, Physiologie30, Ökologie31und ökologische Modellierung27 von Dolioliden.

Obwohl die Kultur dieser empfindlichen Tiere derzeit arbeitsintensiv und zeitaufwändig ist, ist der Anbau von Dolioliden machbar und wird, wenn sie von der breiteren Gemeinschaft durchgeführt wird, die Förderung des Verständnisses dieser ökologischen und evolutionär wichtige Gruppe von Tieren. Ziel dieser Studie war es, aktuelle Ansätze zur Sammlung, Aufzucht und Aufrechterhaltung von D. gegenbauri in der Kultur zum Zweck der Durchführung von Laborstudien zu beschreiben.

Die Etablierung einer dolioliden Kultur erfordert die Sammlung von gesunden und unbeschädigten Tieren und, einmal gefangen, sanfte Behandlung, angemessene Ernährung und Haltung. Doliolids, speziell die Art D. gegenbauri, kommt global auf subtropischen Kontinentalböden vor, aber die Fülle kann sehr variabel sein. In einer aktuellen Studie, die sich auf die Mittelregalregion des SAB konzentrierte, war die Häufigkeit zwar dramatisch von <1/m3 bis > 20.000/m3variiert, aber doliolids waren das ganze Jahr über vorhanden6. Aufgrund der hohen Variabilität von Dolioliden in Raum und Zeit und der relativen Schwierigkeit, die mit der Probenahme von Kontinentalschelf-Randumgebungen verbunden ist, ist zuverlässiges Wissen über die doliolidcommunity-Dynamik, in dem Studien durchgeführt werden, ein wichtiges Voraussetzung für die erfolgreiche Etablierung der Kultur.

Sobald Doliolid-Zooiden gefunden und gefangen wurden, kann es schwierig sein, festzustellen, ob die Tiere beschädigt wurden. Tiere scheinen unbeschädigt zu sein und zeigen aktiveschwimm- und Fluchtverhalten, aber selbst kleinste Verletzungen können dazu führen, dass sie nicht gedeihen. Eine Eigenschaft, die besonders relevant für die Gesundheitsbewertung von gefangenen Doliolid-Zooiden ist ihre Fähigkeit zu füttern. Die Fütterungsaktivität kann einfach durch die Bereitstellung von pigmentierten Algen an frisch gefangene Tiere beurteilt werden. Wenn ein Tier füttert, wird der Darm innerhalb kurzer Zeit gefärbt. Nach unserer Erfahrung haben wir herausgefunden, dass das Hinzufügen einer kleinen Menge der rot pigmentierten Algen, Rhodomonas sp., schnell Informationen über die Fütterungsaktivität liefert. Wenn die Fütterung nicht beobachtet wird, ist es höchst unwahrscheinlich, dass eine Kultur etabliert werden kann.

Wachsamkeit und gute Haltung sind entscheidend für die Etablierung und Aufrechterhaltung von Dolioliden während ihres gesamten komplexen Lebenszyklus. Das vielleicht problematischste Stadium ist die Entwicklung einer lebensfähigen Krankenschwester aus der Larvenstufe und die Produktion (Spriegung) der Fütterungstrophoozoide. In dieser Lebensphase spekulieren wir, dass der Lebensmittelbedarf in Bezug auf Quantität, Qualität und Partikelgröße am begrenztsten ist. Unserer Kenntnis nach gab es keine früheren Studien, die die Fütterungsaktivität von D. gegenbauri Larven und Oozooiden untersucht haben. Zum Beispiel, obwohl die sich entwickelnden Gonozooiden und Phorozooiden in der Lage sind, Partikel über eine Breite von Größen zu schlucken, ist die Kapazität von Larven, Oozooiden und kleinen Krankenschwestern wahrscheinlich begrenzter. In der Praxis stellen wir fest, dass eine erfolgreiche Kultivierung in diesen Lebensphasen erreicht werden kann, indem Diatomeen aus der Algennahrungsmischung weggelassen werden, indem die Nahrungsmittelkonzentrationen auf einem moderaten Niveau gehalten werden, indem häufige Fütterungen in niedrigeren Konzentrationen durchgeführt werden, einzelne größere Gonozooid und ein paar Copepoden mit der Kultur, und durch manuelle Entfernung von großen Aggregaten von Detritus.

Obwohl wir Kulturen von D. gegenbauri für mehrere Generationen aus einer einzigen Sammlung gepflegt haben, ergänzen wir nach Möglichkeit routinemäßig bestehende Kulturen mit frisch gesammelten Tieren, um die genetische Vielfalt und Robustheit zu erhöhen. der Kultur. Eine potenzielle Gefahr dieser Praxis ist die Einführung von Parasiten oder Krankheiten in die Kultur, aber nach unserem Wissen sind wir noch nie auf dieses Problem gestoßen. Obwohl es nur wenige Berichte über Parasitenvon Doliolid32 gab, existieren sie zweifellos. Interessanterweise wurden in einer aktuellen Studie, in der die Ernährung kultivierter D. gegenbauri Gonozooiden, die natürlichen Gewässern ausgesetzt waren, mit feldgefangenen D. gegenbauri gonozooids verglichen wurden, mutmaßliche Apicomplexa-Parasiten in der wilden Population, die fehlen datierte Tiere6.

Eine bestehende Einschränkung der beschriebenen Kulturtechnologie ist die Begrenzung des Zooid-Produktionsvolumens. Insbesondere weil die beschriebenen Techniken den Anbau in versiegelten Gläsern bei geringer Dichte auf einem rotierenden Planktonrad beinhalten, ist unklar, ob dieser Ansatz verkleinert werden könnte oder ob der Arbeitsablauf automatisierungsfähig wäre. Größere Anbausysteme wurden jedoch für eine andere empfindliche kleine gelatinöse Marine-Zooplankton-Art, die Larvacean Oikopleura dioica,20,33,34beschrieben, was darauf hindeutet, dass ähnliche Systeme für Doliolids in Zukunft entwerfen können. Die komplexe Lebensgeschichte von D. gegenbauri im Vergleich zur einfacheren Lebensgeschichte von O. dioica wird jedoch eine bedeutende Herausforderung für den großflächigen Anbau bleiben.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass D. gegenbauri nach den hier beschriebenen Protokollen während seiner komplexen Lebensgeschichte zuverlässig unter kontrollierten Laborbedingungen kultiviert werden kann. Diese Fähigkeit macht die Art für eine Vielzahl von kontrollierten experimentellen Studien zugänglich, und vielleicht Doliolids als neues Tiermodell in der Entwicklungsbiologie und Evolution zu entwickeln. Die Begrenzung des Produktionsumfangs muss jedoch überwunden werden, bevor dieses Ziel erreicht werden kann.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Acknowledgments

Wir sind dankbar für die vielen Personen, die im Laufe der Jahre an diesem Projekt gesammeltes Wissen, einschließlich G.-A. Paffenhöfer und D. Deibel, die diese Protokolle ursprünglich entwickelt haben. Auch M. Köster und L. Lamboley haben wesentlich zur Entwicklung dieser Verfahren beigetragen.  Die in Tabelle 1 enthaltenen Schätzungen der dolioliden Fülle wurden von N.B. Lépez-Figueroa und Der E.E. Rodriguez-Santiago erstellt. Diese Studie wurde teilweise von der US National Science Foundation awards OCE 082599, 1031263 an MEF, den Kooperationsprojekten OCE 1459293 und OCE 14595010 an MEF und DMG und dem National Oceanic and Atmospheric Administration Award NA16SEC4810007 an DMG unterstützt. Wir danken der fleißigen und professionellen Crew der R/V Savannah. Lee Ann DeLeo bereitete die Figuren vor, Charles Y. Robertson korrekturlas das Manuskript und James (Jimmy) Williams fertigte das Planktonrad

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) Any NA For algal cultures
Autoclave Any NA For sterilizing equipment and seawater for algal cultures
Beakers (2 L glass) Any NA For sorting diluted plankton net tow contents
Buckets (5 gallon, ~20L) Any NA For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use
Carboys (20 L)  Any NA For storing seawater
Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) Qorpak GLC-01882 Container for culture
Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) Qorpak GLC-01858 Container for culture
Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) Any NA To accommodate plankton wheel and culture maintenance
Filtration apparatus for 47 mm filters Any NA For filtering seawater for cultures
Glass microfiber filters, 47 mm Whatman 1825-047 For filtering seawater for cultures
Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) Science Company NC-10894 Custom cut and edges polished
Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) Any NA For holding culturing jars to the plankton wheel
Isochrysis galbana strain CCMP1323 National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) strain CCMP1323 For feeding doliolid cultures
L1 Media Kit, 50 L National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) MKL150L For culturing algae
Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) Any NA For illuminating doliolids in the jars and beakers
Lighted temperature controlled incubator Any NA For algal cultures
Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) Any NA For algal cultures
Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and  4 L aquarium cod-end Sea-Gear Corporation 90-50x5-200-4A/BB For collecting living doliolids (see Figure 4)
Plankton Wheel NA NA Custom built (see Figure 2)
Plastic wrap Any NA To cover inside of lid of doliolid culture jars
Potassium Permanganate Fisher Scientific P279-500 Reagent for cleaning jars and glassware
Rhodomonas sp. strain CCMP740 National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) strain CCMP740 For feeding doliolid cultures
Rubber Tubing NA NA For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing)
Sodium Bisulfite Fisher Scientific S654-500 Reagent for cleaning jars and glassware
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-212 Reagent for cleaning jars and glassware
Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) Any NA For algal cultures
Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) strain CCMP1051 For feeding doliolid cultures
Tissue culture flasks (250 mL) Any NA For algal cultures

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References

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Anbau des Marine Pelagischen Tunikas <em>Dolioletta gegenbauri</em> (Uljanin 1884) für experimentelle Studien
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Walters, T. L., Gibson, D. M.,… More

Walters, T. L., Gibson, D. M., Frischer, M. E. Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies. J. Vis. Exp. (150), e59832, doi:10.3791/59832 (2019).

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