Summary
Doliolids, כולל את המינים דולילטה gegenbauri, הם קטנים זואופלנקטון הג ימית של משמעות אקולוגית המצויים על מערכות משנה יצרנית המדף ברחבי העולם. הקושי של התקשות האורגניזמים העדינים האלה מגביל את החקירה שלהם. במחקר זה אנו מתארים גישות טיפוח לאיסוף, גידול ושמירה על הdoliolid דולילטה gegenbauri.
Abstract
לגטין זואופלנקקלס משחקים תפקיד מכריע בתוך מערכות אקולוגיות של האוקיינוס. עם זאת, קשה בדרך כלל לחקור את הפיזיולוגיה, הצמיחה, הפוריות והאינטראקציות ההזנה בעיקר עקב אתגרים מתודולוגיים, כולל היכולת להתרבות. הדבר נכון במיוחד לגבי הdoliolid, דולילטה גגנבאורי. ד. gegenbauri בדרך כלל מתרחשת במערכות המדף סובטרופי continental פרודוקטיבי ברחבי העולם, לעתים קרובות בריכוזים פורחים מסוגל לצרוך חלק גדול של הייצור הראשוני היומי. במחקר זה אנו מתארים גישות טיפוח לאיסוף, גידול ואחזקה של ד. gegenbauri לצורך ביצוע מחקרים מבוססי מעבדה. ד. gegenbauri ומינים doliolid אחרים ניתן ללכוד לחיות באמצעות שכאוכלי מאוד נגרר 202 יקרומטר שינוי כילות פלנקטון של הספינה נסחף. תרבויות הן הוקמה באופן אמין ביותר כאשר טמפרטורות המים הן מתחת ל -21 ° c והם התחילו מגונזוסואידים בלתי-מפותחים, התבגרות ואחיות גדולות. תרבויות ניתן לשמור על כלי תרבות מעוגל על גלגל פלנקטון מסתובבת לאט ומתמשכת על דיאטה של אצות תרבותית במי ים טבעיים במשך דורות רבים. בנוסף ליכולת להקים תרביות מעבדה של D. gegenbauri, אנו מדגימים כי מצב האיסוף, ריכוז אצות, טמפרטורה, וחשיפה למי ים ממוזג באופן טבעי כולם קריטיים לתרבות הקמה, צמיחה, הישרדות ורבייה של D. gegenbauri.
Introduction
זואופלנקטון חשבון עבור ביומסה בעלי חיים הגדול ביותר באוקיינוס, הם רכיבי מפתח באתרי מזון ימיים, ולשחק תפקידים חשובים בתוך מחזורי אושן ביוגיאוכימיים1,2. זואופלנקטון, למרות מורכב של מגוון עצום של אורגניזמים, ניתן להבדיל בגסות לשתי קטגוריות: ז'לטין ולא ז'לטין עם מספר ביניים מטקא3,4. לעומת זואופלנקטון שאינם ז'לטין, זואופלנקטון ז'לטין קשים במיוחד ללמידה בשל ההיסטוריה המורכבת שלהם מהחיים5, והרקמות העדינות שלהם ניזוקו בקלות במהלך לכידת וטיפול. מינים זואופלנקטון ז'לטין הם, ולכן, קשה לשמצה התרבות במעבדה ובדרך כלל למדו פחות לעומת מינים שאינם ז'לטין6.
בין קבוצות זואופלנקטון ז'לטין, אחת שופעת ובעלת חשיבות אקולוגית באוקיינוס העולמי הם התאליאכאנים. התאליסים הם מחלקה של מטונפלאים הכוללים את ההוראות סאלפידה, פירוסואידה ודוליאולידה7. Doliolida, באופן קולקטיבי המכונה doliolida, הם קטנים בצורת חבית בריכת שחייה בחינם האורגניזמים שיכולים להגיע הגבוה מחולות שחיה באזורים neritic פורה של אוקיינוסים סובטרופי. Doliolids הם בין הנפוצים ביותר של כל זואופלנקטון קבוצות4,8. כמו מזינים ההשעיה, doliolids לאסוף חלקיקי מזון מעמודת המים על ידי יצירת זרמים מסנן לכידת אותם על רשתות ריר9. באופן מטקאני, doliolids מסווגים ב-מערכה שאורונתונים10. אב קדמון לבני הזוג, ובנוסף למשמעות האקולוגית שלהם כמרכיבים מרכזיים של מערכות מרכזיות ימיות, הם משמעותיות להבנת מקורותיה של תולדות החיים הקולוניאליים10,11 והאבולוציה , מהדמית הרוח5,7,10.12,13,14
ההיסטוריה החיים של doliolids הוא מורכב תורם את הקושי של culturing ולקיים אותם באמצעות מחזור החיים שלהם. ניתן למצוא סקירה של מחזור החיים הdoliolid והאנטומיה בגובדו אל15. מחזור החיים הdoliolid, הכרוך בשלבי התעללות מיניים והיסטוריה מינית, מוצג באיור 1. ביצים וזרע מיוצרים על ידי זיבה, השלב הבודד היחיד במחזור החיים. גונזואידים משחררים זרע לעמודת המים וביצים מופרות ומשתחררים להתפתח לזחלים. הזחלים לבקוע ומהפך לתוך האוזואידים שיכולים להגיע 1-2 מ"מ. בהנחה לטיפול בתנאי הסביבה ובתזונה, הפכו האחים המוקדמים לאחיות בתוך 1-2 ימים ב-20 ° c ומפעילים את השלבים הקולוניאליים של מחזור החיים. בעלי החיים מייצרים בלוטות. מיניות על התחת שלהם ניצנים אלה להשאיר את הסטעל ולהגר למטה המאמצים האחרונים שבו הם בשורה בשלוש שורות מזווג. השורות המרכזיות הופכות לפלואוזואידים ולשתי השורות החיצוניות הופכות לטרוזואידים. האחרון מספק מזון הן לאחות והן לבני הפאורוזואידים16,17. בזמן שהיא מאבדת. את כל האיברים הפנימיים ככל ששפע של הטרופואידים גדל, גודל האחות יכול להגיע 15 מ"מ במעבדה. כמו phorozooids לצמוח, הם יותר ויותר לבלוע טרף פלנקטון ולהגיע ~ 1.5 מ"מ בגודל לפני שוחרר כמו יחידים17. אחות בודדת עשויה לשחרר את > 100 phorozooids במהלך תוחלת החיים שלה18. לאחר שחרור הפאורוזואידים מהפתבים, הם ממשיכים לצמוח והם השלב הקולוניאלי השני של מחזור החיים. ברגע שהם מגיעים ~ 5 מ"מ בגודל, כל phoroבאיד מפתחת מקבץ של גונדוזואידים על הדוד שלהם מדווש. הגונזואידים האלה יכולים לבלוע חלקיקים כשהם מגיעים ~ 1 מ"מ באורך. לאחר שהגונזואידים הגיעו ~ 2 עד 3 מ"מ בגודלם הם שוחררו מן phorozooid ולהיות השלב הבודד היחיד של מחזור החיים. ברגע שהם מגיעים ~ 6 מ"מ בגודל, הגונזואידים להפוך בוגרת מינית17. הגונזואידים יכולים להגיע לאורך 9 מ"מ או יותר. גונסוזואידים הם מרמוניסטיים, זרע משוחרר לסירוגין בעוד הפריה הביצים מתרחשת באופן פנימי16,17. כאשר ה≥ בגודל של 6 מ"מ, הוא משחרר עד 6 ביצים מופרות. Culturing מוצלחת דורש תמיכה בצרכים הספציפיים של כל אחד משלבי ההיסטוריה הייחודיים האלה של החיים.
בשל המשמעות האקולוגית והאבולוציונית של התאליסים, כולל doliolids, קיים צורך במתודולוגיות הטיפוח לקדם את ההבנה של הביולוגיה הייחודית, הפיזיולוגיה, האקולוגיה וההיסטוריה האבולוציונית של האורגניזם הזה19 . Doliolids יש הבטחה ניכרת כמו אורגניזמים מודל ניסיוני בביולוגיה התפתחותית גנומיקה תפקודית משום שהם שקופים וכנראה יש גנום יעיל20,21. לעומת זאת, חוסר שיטות הטיפוח האמינות מעכבת את התועלת שלהם כמודלים מעבדתיים. למרות קומץ של מעבדות פרסמו תוצאות המבוססות על doliolids תרבותי, לגישות הידע שלנו ופרוטוקולים מפורטים לא פורסמו בעבר. בהתבסס על שנות ניסיון, ניסיון וטיפוח שגיאה, מטרת מחקר זה הייתה לסקור חוויות ולשתף פרוטוקולים לאוסף ולטיפוח של doliolids, במיוחד את המין המיני דולילטה gegenbauri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מתקני מינון לגידול מתקנים
הערה: כל החומרים והציוד הנדרשים מפורטים בטבלת החומרים.
- הכינו 1 M נתרן הידרוקסיד (NaOH), 0.06 M אשלגן פרמנגנט (KMnO4) פתרון. כדי להכין את הפתרון הזה, לפזר 400 g של NaOH ל 10 המים האלה מימי. הוסף 100 g של KMnO4 לפתרון naoh ולערבב היטב.
- הכינו את התמיסה 0.1 M ביסולפיט (נחכ3) על-ידי המסת 100 g של נחסו3 ל -10 מים מיוהים ומערבבים היטב.
התראה: ריאגנטים אלה הם גירויים שעלולים לגרום לבעיות בדרכי הנשימה אם נשאף. מקום באזור מאוורר היטב, כגון ברדס. . הימנע ממגע עם העור לובשים כפפות מגן, ביגוד מגן, הגנת עיניים והגנה על הפנים בעת טיפול. - לפני הקמת והגידול של תרבויות doliolid במעבדה, לנקות ולעקר את צנצנות התרבות.
- לשטוף 1.9 L ו 3.8 צנצנות תרבות לפחות 3 פעמים עם מים מלא מימים. אפשר לייבש את כובעי הברגים, מכיוון שהמכסים אינם נכללים בשלבי הניקוי הבאים.
- לנקות ולעקר 1.9-ו-3.8 צנצנות זכוכית לויטראז ' על-ידי האישירה בתמיסה של NaOH/KMnO4 . הניחו לצנצנות להשרות בין לילה.
- הסירו את הצנצנות מהפתרון הרביעי של naoh/kmno והישאב את הצנצנות לתוך התמיסה של סודיום ביסולפיט (נחכ3). הניחו לצנצנות להשרות בין לילה.
- הסירו את הצנצנות מהפתרון נחכ3 ושטפו היטב במים מפוהים. . הניחו לצנצנות להתייבש
- מניחים את גלגל הפלנקטון (איור 2) בחלל מבוקר טמפרטורה (חדר סביבתי). הטמפרטורה היא 20 ° c. לקבלת תיאור מפורט יותר של גלגל הפלנקטון המותאם אישית, עיין באיור המשלים 1.
2. תרבות הפיטופלנקטון
- להשיג תרבויות פריחת אצות מן המרכז הלאומי לאצות ים microbiota (ncma) או מקורות אחרים כדי לשמש כמזון עבור D. gegenbauri. תערובות של שני מינים הדגל כולל איזוקריזיס galbana (ccmp 1323), rhodomonas sp (ccmp 740), ו Diatom קטן, thalassiosira וייספלוי (ccmp 1051) התקבלו מ-ncma ושימשו במעבדה הקודמת לימודים האחורי doliolids בהצלחה17.
- הכינו את מדיית הצמיחה L1 ו-L1-Si22 כפי שמומלץ על ידי ncma.
- בצע את ההוראות המסופקות על ידי הספק כדי ליזום את התרבויות החדשות של פריחת אצות.
- כדי לשמור על תרבויות המניות, באמצעות טכניקות התרבות הקפדנית axenic, העברת 0.5 mL של תרבות senescing הישן ל 25 מ ל של מדיה צמיחה טריים ב סטרילי 55 mL זכוכית התרבות צינורות מדי שבועיים.
הערה: לא ניתן לאחסן את התרבויות החיות מבלי להעבירו בקביעות. אם לא נעשה שימוש בתרבויות לפרקי זמן ארוכים, ואין אפשרות לשמור על התרבויות למשך התקופה שאינה שימוש, מומלץ לרכוש מחדש את התרבויות הנפוצות הללו ממקורות המקור שלהם (למשל, NCMA). - הכנת כמויות גדולות יותר של פיטופלנקטון עבור doliolids האכלה בניקוי 500 mL פלסטיק רקמות התרבות המכילה 200 mL של מדיית הצמיחה.
- איחסן פיטופלנקטון ממניות axenic (4 מ"ל) לתוך 200 mL של מדיית גדילה (1:50 דילול).
- מודטה ב 20 ° c עם אור 12:12 h: מחזור כהה תחת התאורה מגניב אור לבן של 65-85 μE/m2. הניחו מבחנות תרבות שטוח כדי למקסם את התאורה. מערבולת בעדינות את התרבות היומית.
- לקבוע את ריכוז התאים באמצעות מונה חלקיקים או מיקרוסקופ כדי לפקח על צמיחת התרבויות.
הערה: לאחר 7-10 ימים מהחיסונים, התרביות המרצפות יכילו ~ 105-106 תאים/ml והתרבות הדיאטומית תכיל ~ 10-4-10 תאים/ ml. ריכוזים אלה מספיקים כדי לשמור על התרבויות הdoliolid. - ליזום מניות האכלה חדשה במינימום של כל שבועיים כדי לספק מספיק ביומסה פריחת אצות לתמיכה בכל פעילויות התרבות.
3. אוסף של doliolids פראי ו מי ים לתרבות
הערה: סקירה של גישות הגבייה והטיפוח מחולקת באיור 3. תיאור של האוסף המקצועית פלנקטון נטו ו-בקלה מסופק באיור 4.
- אתר doliolids על ידי זיהוי אותם באמצעות רשתות פלנקטון או מערכות הדמיה באתרו23.
הערה: מכיוון doliolids הם לעתים רחוקות נוכח מי השטח ולא ניתן לגילוי על ידי טכנולוגיית חישה מרחוק, מונחה על ידי הידע התנאי של תנאים נוחים doliolids (ראה דיון), נוכחות של doliolids חייב להיקבע לפני הדגימה. - איסוף מי ים עשירים בחלקיקים לפני איסוף doliolids חי לקראת ייזום תרבות D. gegenbauri .
- פריסת בקבוקי Niskin רכוב על שושנת העלים CTD או ציוד מקביל כדי לאסוף מים מהאתר שבו doliolids ממוקמים מעומק המכיל את האומדנים הגבוהים ביותר של כלורופיל ריכוז המשוער על ידי באתרו פלואורומטריה.
הערה: מכלורופיל הריכוז משמש כאינדיקטור לריכוזי חלקיקים. ב דרום האוקיינוס האטלנטי בייט (SAB) באמצע היבשת, משטח המשנה כלורופיל מקסימום הוא בדרך כלל קרוב לתחתית, אבל במקומות אחרים, זה לא יכול להיות.
- פריסת בקבוקי Niskin רכוב על שושנת העלים CTD או ציוד מקביל כדי לאסוף מים מהאתר שבו doliolids ממוקמים מעומק המכיל את האומדנים הגבוהים ביותר של כלורופיל ריכוז המשוער על ידי באתרו פלואורומטריה.
- לאחר doliolids ממוקמים, לשחזר doliolid בעלי חיים שאינם תקינים באמצעות ברשת הפלנקטון המקצועית ו-בקלה סוף. לפני פריסת הרשת, מלא את בקלה עם מי ים.
- מתוך הספינה נסחף, נמוך להעלות את הרשת דרך עמודת המים שמירה על זווית גרירה אלכסונית של ~ 15-25 ° ופריסה אנכית מהירות אחזור לא יותר 15 m/min.
- לאחר הרשת היא על הסיפון, בעדינות להעביר ולחלק את התוכן של בקלה לתוך 3, 5-ליטר (~ 20 L) דליים פלסטיק כל המכיל ~ 10 L של מי-ים משטח שנאסף מהאתר.
הערה: דליי פלסטיק חדשים צריכים להיות ממוזגים על ידי הוספת ימי מי ים לפני doliolid החיים אוסף. המטרה היא להפחית את שטיפת כימיקלים מפלסטיק. אם מי-ים אינו זמין, השתמש בטוהר (למשל, מילי Q) או ברז מים ללא מזהמים רעילים כדי לטפל בדליים. - בודד doliolid זואידים. מפלנקטון אחר
- בקבוצות קטנות (~ 2 l) העברת לוחיו מעורבים מתוכן הגרירה הנטו (כיום ב -20 דליי פלסטיק ליטר) לגביע מזכוכית בעלת 2 מטרים.
- באמצעות שימוש בצנרת זכוכית משעממת (8 מ"מ מזהה x 38 ס"מ אורך), סיפון בזהירות להעביר באופן פעיל שחייה doliolid זואוids מן הגביע לתוך צנצנות אמנות זכוכית נקייה המכיל מי ים עשיר חלקיקים שנאספו באמצעות בקבוקי Niskin מאיפה doliolids היו מוקם.
- שחררו בעדינות את מdoliolid הזואואידים מתחת לפני-הים.
הערה: לאסוף מחלות, שלבים המכילים מפתחים מחוברים, ושלבי האחות המכילים מצורף מטפוטזואידים (איור 1).
- לאחר תוספת של doliolids, להוסיף Rhodomonas sp. תרבות לריכוז הסופי של ~ 5 x 103 – 104 תאים/mL (~ 50 mL של תרבות המכילה ~ 5 x 104 – 1 x 105 תאים/mL בצנצנת 3.8 L). זה כדי לקבוע אם doliolids הם האכלה באופן פעיל. כאשר doliolids לבלוע Rhodomonas sp., מערכת העיכול שלהם יופיע אדום בצבע. הסר את הזואואידים שאינם נראים כניזונים.
- כדי למנוע doliolids מלהיות לכוד בממשק מים האוויר, למנוע את החלל הקדמי של צנצנות התרבות על ידי מילוי לחלוטין את הצנצנות עם מי ים עשירים חלקיק מסונן והצבת פיסת פלסטיק לעטוף על פתיחת צנצנת (89 מ"מ רחב).
- להימנע מיצירת בועות אוויר שיכול גם לפגוע בחיות. בזהירות להרוס את הכובע על הצנצנת ולהפוך בעדינות את הצנצנת כדי לקבוע אם בועות נוכחים. אם קיימים בועות, הסר אותם.
- לאחר מילוי הצנצנות, מסירים את המים העודפים מחוץ לצנצנת.
- הר כל צנצנת על גלגל הפלנקטון (איור 2) על ידי הצבת הצנצנת על פסי מתכת אנכיים מכוסים אבובים גומי, בין מלחציים צינור נירוסטה.
- ודא כי החלק האחורי של הצנצנת מרופד נגד אבובים גומי. הדק את מהדק הצינור מסביב לצנצנת על-ידי כוונון הבורג.
- בדוק כי הצנצנת אינה נעה ברגע שהוא מהודק היטב במקום. לאפשר את הצנצנות לסובב ב 0.3 סל ד כדי לשמור את doliolids בהשעיה.
התראה: חשוב שלא להדק את הצנצנת כדי למנוע סדיקה של הצנצנת.
- על הספינה, שמרו על כלי התרבות על גלגל הפלנקטון ב -20 ° c באור עמום עד שניתן יהיה להעבירו למתקן תרבות המעבדה.
- לאחר שחזרו למעבדה, העבירו את הצנצנות המכילות דוליולידים לתוך מתקן התרבות המוכן. צנצנות הר על גלגל הפלנקטון (ראה שלב 3.8) ולאפשר לצנצנות להמשיך לסובב ב 0.3 סל ד.
הערה: כל הגידול של doliolids במחקר זה נערך ב 20 ° c.
4. שמירה על תרביות D. gegenbauri
- מהספינה למעבדה, הרשו לבעלי החיים להאקלים בצנצנות המקוריות לתנאי המעבדה במשך 3 ימים.
- במהלך תקופת הסתגלות, השתמשו בפיפטה רחב ומשעמם להחלפת 10% מהמים עם מי ים עשירים בחלקיקים ללא פילטר מאתר האוסף מדי יום במשך 3 ימים.
- שמרו על מספר שורות בצנצנת אך הסירו את כל הזואופלנקטון האחרות, כדורי בצואה גדולים, וחלקיקים צבורים גדולים שעלולים לסתום את מנגנון הסינון של הdoliolid (רשת ריר). אם התרבות כוללת מהאחיות המוקדמות, שמרו על גונדואיד גדול אחד (≥ 6 מ"מ) בצנצנת.
הערה: לא חשוב אילו מינים שטרגליים כלולים בתרבות, אבל בניסוי זה, המינים הנפוצים ביותר הנמצאים מהמקום שבו נלכדו doliolids שימש.
- בעקבות תקופת הסתגלות, להעביר doliolid בעלי החיים והקותוכים מן הצנצנת המקורית לצנצנת טיפוח נקי המכיל 80% סיבי זכוכית מסנן (GF/F) מי ים מסוננים ו 20% ממי הים מן הצנצנת המקורית. להכין מי ים מסוננים על ידי סינון מי ים דרך GF/F עם גודל נקבובית הנומינלי של נייר מסנן יקרומטר 0.7.
- לשמור על התרבות החדשה על ידי החלפת 10% מהמים עם מי ים מסוננים GF/F כל 3 ימים על ידי הסרת אגרגטים וכדורי צואה. שבועי, העברת בעלי חיים לצנצנת חדשה כמתואר בשלב 4.2.
- להאכיל doliolids על ידי שמירה על ריכוזי פיטופלנקטון בצנצנות התרבות בין 40-95 μg C/L.
הערה: ריכוזים אלה מחקים תנאים סביבתיים הידועים לתמוך בתנאי הפריחה עבור D. gegenbauri17. תערובת המינים של אלגל משתנה בהתאם לשלב החיים ולמספר הזואופיאידים בכל צנצנת. במהלך שלבי החיים המוקדמים, יש להוסיף 1:1 תערובת (על-ידי תוכן פחמן) של האצות הקריפטטוונספירה (איזוקריזיס גליאנה ורודומונס sp.) בלבד. מינים טרף גדול יכול בקלות לסתום את מנגנון האכלה של אחיות קטנות ופיתוח trophozooids. הוסיפו את הדיאטום האידיאסיאוטרה לתערובת האלגל, גם בתכולת הפחמן השווה, כאשר מאכילים את האחיות הגדולות, הפלואוזואידים והגונזואואידים.- לעקוב אחר ריכוזי פריחת אצות לפני ואחרי האכלה כדי להנחות את ההחלטה של כמה פעמים וכמה אצות להוסיף לתרבויות. השתמש במונה חלקיקים כדי לקבוע ריכוזים של פריחת אצות, כי ריכוזי פריחת אצות בצנצנות התרבות הם מדלל יחסית.
- הסרת מספיק זואוids כדי לשמור על ריכוזי פריחת אצות של 40 – 95 μgc/L כך את doliolids הנותרים יהיה מספיק אוכל כדי לצמוח.
הערה: השלב הקשה ביותר לקיום בהצלחה בתנאים מעבדתיים הוא הזחלים המתפתחים והאוזואיד (האחות המוקדמת). במהלך שלב זה של התרבות, שמרו על גונדואיד גדול אחד (≥ 6 מ"מ) בנוסף למספר כפרים בצנצנת עם הזחלים המפתחים והאוזאואידים (~ 20 לכל 3.8 L). - העברת לפחות 4 אחיות לתוך צנצנת culturing חדש פעם מינימום של 8 trophozooids גלויים על המאומצים של האחות (איור 1B).
הערה: הטרוזואידים יוכפל במספר כל 1 – 2 ימים ב-20 ° c. טרוזוזואידים גדולים מספיק כדי. להיות גלויים לעין בלתי- להסיר שתי אחיות פעם אחיות לפתח 20 טרופוטזואידים.
- להסיר אחות אחת כאשר האחיות לפתח > 30 טרופוטזואידים על המאמצים שלהם. הרשו לאחות הנותרת לפתח את הפלואוזואידים על מאמצים.
- להסיר את האחות ברגע שהאחות משחררת עד 30 פלואורוזואידים.
- להקטין את מספר בעלי החיים בצנצנת פעם הפלואורוזואידים להגיע 3 מ"מ בגודל.
- להסיר את כל מלבד ארבעה phorozooids כאשר הפלואואידים לגדול (> 5 מ"מ) ופיתחו אשכולות gonozooid.
- הפחת את התרבות לשני פלואוזואידים כאשר מספר האשכולות של גונבזואואידים גדל בגודל ומתחיל להיזון.
- הסירו את הפלואוזואידים ברגע. שהפלומאידים ישחררו עד 30 גונבזואואידים
- הפחת את מספר הזיבה מ -30 בעלי חיים ל -2 לכל צנצנת. הניחו לביצים מופרות להשתחרר לתוך הצנצנת.
- . לאחר שהאובזואידים יתפתחו
הערה: ניתן להשתמש באחיות שנמחקו, בפלואוזואידים, ובגונזואופיקציה כדי לזרוע תרבויות נוספות ולערוך ניסויים נוספים.
- . לאחר שהאובזואידים יתפתחו
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות ההליכים המתוארים לאיסוף ולעיבוד הdoliolid, d. gegenbauri המתואר באיור 3, ניתן לשמור על תרבות של d. gegenbauri במהלך ההיסטוריה המורכבת שלה חיים (איור 1) ו קיים אותו במשך דורות רבים. למרות שהטיפוח של D. gegenbauri מתואר כאן, הליכים אלה צריכים גם להיות רלוונטיים לטיפוח של זנים doliolid אחרים.
לכידת doliolid בריאים ולא ניזוק דורש יישום של רשתות מיוחדות והליכי גרירה (איור 4). כבעלי חיים עדינים ללא מבנים קשים, יש לנקוט כדי למזער את ההליכים שעלולים לגרום לנזק פיזי כלשהו. גורמים אלו יכולים לכלול מערבולות, לחץ ואינטראקציות עם משטחים כולל בועות הרשת, האוויר והאוויר. למרות האופי העדין שלהם, עם זאת, doliolid בעלי חיים לא ניזוק ניתן לאסוף באמצעות מרחב הפלנקטון חרוט עם קוטר הפתיחה ליחס אורך של 1:5 ומצויד עם משוקלל גדול יחסית ללא סינון הקצה-בקלה. באופן שגרתי השתמשנו 202 יקרומטר רשת 2.5 m (אורך) פלנקטון נטו עם הפתיחה 0.5 m רכוב הרתמה מסתובב ומצויד 4 L משוקלל ללא סינון בקלה-סוף (איור 4). למרות ההשפעה של שינוי גודל הפלנקטון על לכידת הזנים D. gegenbauri זואוids לא נחקרו בשיטתיות, תיאורטית, השימוש ברשת עם גודל שינוי גדול יותר עלול לגרום לשיפור נוסף כמו גודל שינוי גדול יותר היה להפחית את שדה הלחץ שנוצר במהלך הגרירה. לחילופין, גודל רשת גדול יותר יגרום לזרימת מים גדולה יותר דרך הרשת, העלולים להזיק doliolid זואוids. מהירויות גרירה וזווית נטו צריכה להיות ממוטבת כדי למזער את זמן הגרירה והנזק במהלך האיסוף. בניסיון שלנו, מצאנו כי תנאי גרירה עדין מספיק יכול להיות מושגת על ידי גרירה הרשת ob, בזווית של 15-25 ° מ הספינה נסחף עם פריסה אנכית מהירויות אחזור לא יותר מ 15 m/min. כדי לכוון את הרשת לכיוון זרימת המים, רשת הפלנקטון מותקן ברתמה. זה בדרך כלל המקרה כי התפלגות של doliolids בעמודת המים היא לא אקראית בדרך כלל הגדול ביותר באזור עם החלקיקים הגבוהים ביותר מטענים24. לכן, יש לדגום את עמודת המים שמתחת למשטח המשנה כלורופיל מקסימום עד לפני השטח. ב-SAB הרדוד באמצע-קונטיננטל מדף (20-45 m), את עמודת המים מ ~ 1 מ מעל לתחתית לפני השטח הוא שנדגמו.
ברגע שנאסף בריא החיים נאספו, זה קריטי כדי לשמור אותם באופן זה ממזער את החשיפה למשטחים. כדי למזער מפגשים עם doliolids משטחים נשמרים בצנצנות מעוגלות מלא מי ים בעדינות מעד על גלגל פלנקטון מסתובבת לאט (איור 2).
למרות שתיאורטית אפשר להקים תרבות עם זואוids של כל שלב חיים, חקר הצלחות וכישלונות בהקמת תרבויות חדשות של D. gegenbauri מ 6 ניסיונות בין 2015-2018 בדרום האוקיינוס האטלנטי מציע כי הצלחה מושגת בדרך כלל כאשר בעלי החיים נאספים מהמים ה< 21 ° c, וכאשר שלבים שונים מאשר זיבה בוגרת גדול מנוצלים כדי להתחיל תרבות חדשה (שולחן 1 ושולחן 2). בפועל, היא מועילה, או לפחות לא מזיקה, לכלול שלבי חיים מרובים של זואוdoliolid בזמן ייזום תרבות חדשה.
הצלחה בקיום תרבות של D. gegenbauri, כפי שתוארה עבור מינים אחרים של הפלג מטונט20, תלוי במתן מספיק, אך לא מוגזם, מזון ומזון מגוון הנדרש כדי לתמוך בכל שלב חיים. ככל שדרישות הדיאטה משתנות במהלך מחזור החיים, כמות האצות המסופקת בכל זמן האכלה חייבת להיות מגוונת כדי לשמור על ריכוזי מזון ברמות היעד הרצויות (40 – 95 μg C/L) (שולחן 3). ריכוזים מעל או מתחת רמות אלה יכול לגרום לשיעורי התמותה מוגברת (G.A. Paffenhöfer האנשים. comm.). למרות שהדיאטה הטבעית של D. gegenbauri נותרת מובנת באופן לא הגיוני6, התרבויות יכולות להישמר על ידי הזנת תערובות פשוטות יחסית של אצות מתורתיות ושימוש בהליכים המאפשרים לקהילות שונות של חיידקים להקים התרבות. הגדלת הגיוון הפוטנציאלי של שדה הטרף מושגת על ידי שמירה על חלקיק של החלקיקים לאדן מים מן התרבויות הישנות והכללת מספר קטן של שדות מגורים גדולים doliolids גדול בכל שינוי המים או להעביר. ככל הנראה, אורגניזמים אלה מעבדים את האצות ואת החומר החומרי ומשמשים לגוון את גודל החלקיקים ואת הספקטרום האיכותי הזמין לתזונה doliolid, אבל מחקרים נוספים נדרשים כדי לאשר השערה זו.
הזמינות של התרבויות הdoliolid מספקת את האמצעים לחקור, בתנאים ניסיוניים מבוקרים, היבטים חשובים רבים של doliolid ביולוגיה, פיזיולוגיה, אקולוגיה וביולוגיה מולקולרית. לדוגמה, למרות doliolids הם בשפע באזורים רבים של האוקיינוס החוף הם מרכזי פלנקטון הגדולות25, נתונים על שיעורי האכלה וצמיחה להישאר נדירים26. ניצול תרבויות של D. gegenbauri, מוקד של מחקר מבוסס תרבות כבר לכמת האכלה ושיעורי צמיחה בתגובה לפרמטרים סביבתיים קריטיים כולל טמפרטורה וריכוזי מזון26. תוצאות ממחקרים אלה הראו כי שיעורי הסיווג דומים בריכוזים מ 20 כדי 60 μg C/L ולהקטין כמו ריכוזי מזון להגדיל (איור 5A). תעריפי הסיווג עולים באופן פרופורציונלי באמצעות טווחי טמפרטורות התומכים בצמיחת D. gegenbauri (איור 5b). שיעורי צמיחה (k) נע בין 0.1-0.7/day כפונקציה של הטמפרטורה וזמינות המזון (איור 6). מחקרים אלה, בנוסף למתן מידע מעשי לגבי culturing, אפשרו לקבוע יחסים כמותיים בין doliolid האכלה ושיעורי צמיחה כפונקציה של פרמטרים סביבתיים ולספק תובנות קריטיות לתוך ביולוגיה ואקולוגיה של doliolids נדרש לרבות זו קבוצה חשובה זואופלנקטון לתוך מסגרות דוגמנות27.
איור 1: מחזור החיים של ד. gegenbauri ב 20 ° c.
ציור מחזור החיים (1A) שונה לאחר וולטרס ואח ' 20186 וצויר מחדש באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: גלגל הפלנקטון המשמש לתרבות ד. גגנבורי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סקירה סכימטית של מגישת הטיפוח והעיבוד של ד. gegenbauri .
אוסף בים (א), העברה מדליים מרוכזים לכלי זכוכית קטנים בקבוצות קטנות (ב), בידוד של doliolid בעלי חיים לתוך צנצנות גידול המכילות מי ים עשירים בחלקיקים (C), תחזוקה על גלגל הפלנקטון במהלך מחזור החיים (D, E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: לינת הפלנקטון והפריסה.
פריסה (למעלה משמאל), אחזור (למעלה מימין), וסכימטי של הרשת וקצה הקוד (למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שיעורי סיווג אלגל של ד. גגנבורי גונאוזואואידים.
(א) קשר בין (א) ממוצע (± S.E.) שיעורי הסיווג (mL/זואואיד/יום) לעומת ריכוז הפיטופלנקטון (Μg C/L) עבור שלושה גדלים של D. gegenbauri בלוטת התריס. כל נקודה מייצגת 4 – 11 תצפיות. (ב) ממוצע (± S.E.) שיעורי הסיווג (mL/בזואיד/יום) לעומת טמפרטורה (° c) במשך שלושה גדלים של D. gegenbauri gonozooids. כל נקודה מייצגת 4 – 12 תצפיות. גדלים של גונסוזואידים הם 2.5 מ"מ
(), 4.5 מ"מ
() ו-6.5 מ"מ
(). . הדמויות נמשכו מחדש באישור26 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שיעורי צמיחה של ד. גוגנורי גונזואואיד.
היחסים בין (A) ממוצע (± S.E.) שיעורי הצמיחה (k) לעומת ריכוז פיטופלנקטון (Μg C/L) במשך שלושה גדלים של דולילטה gegenbauri בגונזואידים. כל נקודה מייצגת 4 – 11 תצפיות. (ב) ממוצע (± S.E.) שיעורי הצמיחה (k) לעומת הטמפרטורה (° צ') עבור שלושה גדלים של דולולטה gegenbauri הגוזואידים. כל נקודה מייצגת 4 – 12 תצפיות. גדלים של גונסוזואידים הם 2.5 מ"מ(), 4.5 מ"מ() ו-6.5 מ"מ(). מספרים שצוירו מחדש עם אישור מגיבסון ומPaffenhöfer26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| . שולחן 1 תנאי האוקיינוס והשפע הDoliolid | |||||||||||
| שטח | תחתית | שטח | תחתית | שטח | תחתית | Doliolid שפע | |||||
| תאריך | מזהה שיוט | קו רוחב (N) | קו אורך (W) | עומק (ז) | טמפרטורה (⁰ C) | טמפרטורה (⁰ C) | מליחות (PSU) | מליחות (PSU) | Chla (μg/L) | Chla (μg/L) | זואוids/m3 |
| 20/05/2015 | המשך-15-10 | 31.1889 | 80.1527 | 41.30 | 25.26 | 22.43 | 33.58 | 36.96 | נה | 0.20 | נה |
| 04/08/2015 | המשך-15-19 | 29.5687 | 80.3269 | 40.00 | 26.40 | 21.75 | 36.26 | 36.32 | 1.04 | 1.35 | 218 |
| 02/12/2015 | המשך-15-31 | 31.1674 | 80.1249 | 40.80 | 23.24 | 22.60 | 35.91 | 35.81 | 1.06 | 1.70 | 13 |
| 02/02/2017 | המשך-17-03 | 31.2139 | 80.1823 | 41.00 | 18.72 | 18.84 | 36.00 | 36.12 | 0.83 | 1.50 | 3 |
| 07/11/2017 | המשך-17-23 | 31.2144 | 80.1822 | 42.00 | 24.19 | 23.85 | 36.00 | 36.04 | 0.63 | 1.30 | 254 |
| 01/02/2018 | המשך-18-02 | 31.1835 | 80.1466 | 43.00 | 16.85 | 16.45 | 36.50 | 36.48 | 0.56 | 0.89 | נה |
| NA: נתונים לא זמינים | |||||||||||
טבלה 1: תנאי הימים והשפע הdoliolid על המדף הדרומי-אטלנטי בינוני בזמן ובמקום בו בעלי החיים של ד. gegenbauri נאספו ונהגו ליזום תרבויות חדשות.
| . שולחן 2 תוצאות הניסיונות של ד. gegenbauri מנסה בטיורינג | ||||
| תאריך | מזהה שיוט | זואואידים שנאספו | תוצאה | ערות |
| 20/05/2015 | המשך-15-10 | מיני בוגרים גדול (6-7 מ"מ) גונאוזואואידים | נכשל | . כל התרופות מתו לאחר 4 ימים שלבי האחות והאחיות המוקדמות יוצרו אך לא הצליחו לשגשג. |
| 04/08/2015 | המשך-15-19 | מיני בוגרים גדול (8-10 מ"מ) גונאוזואואידים | נכשל | . גונזואידים מת זמן קצר לאחר האיסוף האוזואידים והאחיות המוקדמות יוצרו אך לא הצליחו לשגשג. |
| 02/12/2015 | המשך-15-31 | אוסף מעורב, כולל האחות המאוחרת (4-5 מ"מ) עם הטרופואידים המצורפים, בוגרים מבחינה מינית (6 מ"מ) גונדואידים ואוזואידים (2 ממ) | וצלח | מתורבת לארבעה דורות שלמים, גונדואידים נוספים ואחיות שנאספו בינואר ובמרץ 2016 נוספו לתרבות. המעבדה פונתה במשך 4 ימים במהלך הוריקן מתיו באוקטובר 2016 והתרבות לא שרדה. |
| 02/02/2017 | המשך-17-03 | אוסף מעורב כולל גונדוזואידים (1.5-5 מ"מ) ופלאוזואידים גדולים (6 מ"מ) עם אשכולות מצורפים מוחיים | וצלח | מתורבת לארבעה דורות מלאים, בנוסף שנאסף באפריל 2017 נוספו לתרבות. התרבות הופסקה בספטמבר 2017. לפני הוריקן אירמה |
| 07/11/2017 | המשך-17-23 | גונדוזואידים (3-6 מ"מ) | נכשל | . גונזואואיד גדול מת אחרי יום אחד הגונאוזואיד הילדותי שרד. במשך 14 ימים . ביצים שוחררו ע י שני הגונזואידים האוזואידים יוצרו אך לא. התפתחו לשלבי האחות התרבות נכשלה לאחר חודש אחד. |
| 01/02/2018 | המשך-18-02 | אח גדול (6-7 מ"מ) אחות מאוחרת ללא טרופוטזואידים | וצלח | בתרבות המטפלת הפיקה טרוזואידים. התרבות נשמרה במשך 3 דורות והסתיימה בסוף יוני 2018 כאשר הסתיימו הניסויים. |
שולחן 2: תוצאת הניסיון ליצור תרביות מעבדה של ד. gegenbauri שנאסף מדרום האוקיינוס האטלנטי בייט באמצע היבשת.
| דולילטה גגנבאורי | מספר זואואיד לכל | מספר זואואיד לכל | |||
| משלב החיים | 3.9 L צנצנת | 1.9 L צנצנת | איזוקריזיס גלבנא | הרודומונס sp. | תלאסיאוטרה ויספלוגי |
| מיכל בוחבוט | 20 | 10 | כוללים | כוללים | אל תכלול |
| אחות מוקדמת | 20 | 10 | כוללים | כוללים | אל תכלול |
| אחות מאוחרת עם 8 טרוזוזואידים | 4 | 2 | כוללים | כוללים | כוללים |
| אחות מאוחרת עם 20 טרוזוזואידים | 2 | 1 | כוללים | כוללים | כוללים |
| אחות מאוחרת עם 30 טרופוזואידים | 1 | 1 | כוללים | כוללים | כוללים |
| פלאוזואיד (1 עד 3 מ"מ) | 30 | 15 | כוללים | כוללים | כוללים |
| צביר הפיטוזואואיד (> 5 מ"מ) | 2 | 1 | כוללים | כוללים | כוללים |
| גונדוסואיד (1 עד 3 ממ) | 30 | 15 | כוללים | כוללים | כוללים |
| בעלי חיים (> 5 מ"מ) | 2 | 1 | כוללים | כוללים | כוללים |
| ריכוזי היעד של אצות יש לשמור בין 40-95 μg C/L עם תערובות שוות (על ידי תוכן פחמן) של מינים כל פריחת אצות | |||||
שולחן 3: תנאי התרבות היעד עבור כל . שלב מחזור החיים של ד. גגנבורי
איור משלים 1: תיאור מפורט של גלגל הפלנקטון המותאם אישית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הקיבולת של doliolids התרבות הוקמה במהלך העשורים האחרונים ושימש לתמיכה במחקר במספר תחומים. מחקרים ניסיוניים במעבדות שלנו תמכו בפרסום של לפחות 15 מחקרים מדעיים התמקדו האכלה וצמיחה18,26, רבייה18,28, דיאטה6, 29, פיזיולוגיה30, אקולוגיה31, ו מודל אקולוגי27 של doliolids.
למרות שהתרבות של בעלי החיים העדינים האלה מהווה כיום עבודה אינטנסיבית וגוזלת זמן, הטיפוח של doliolids הוא אפשרי, ואילו הקהילה הרחבה מאמצת את קידום ההבנה של התרבות האקולוגית הזאת ו קבוצה חשובה ואבולוציונית של בעלי חיים. מטרת מחקר זה הייתה לתאר את הגישות הנוכחיות לאיסוף, לגידול ולתחזוקה של ד. gegenbauri בתרבות לצורך ביצוע מחקרים מבוססי מעבדה.
הקמת התרבות הdoliolid מחייבת איסוף של בעלי חיים בריאים ושאינם תקינים, ולאחר שנתפסו, טיפול עדין, תזונה מתאימה וכלי-גידול. Doliolids, במיוחד את המין D. gegenbauri, מתרחשת circumglobally על מדפים סובטרופי continental אבל שפע יכול להיות משתנה מאוד. לדוגמה, במחקר שנערך לאחרונה התמקד באזור אמצע המדף של SAB, למרות השפע מגוונת באופן דרמטי מ < 1/m3 כדי > 20000/m3, doliolids היו נוכחים לאורך כל השנה6. בגלל השונות הגבוהה של doliolids בחלל ובזמן ואת הקושי היחסי מעורב בדגימה יבשת קונטיננטל סביבות שוליים, הידע האמין של הדינמיקה הקהילתית doliolid שם מחקרים מתנהלים הוא חשוב תנאי מוקדם להקמת התרבות המצליחה.
לאחר doliolid זואוids כבר ממוקמים ונלכד, זה יכול להיות קשה כדי לקבוע אם בעלי החיים ניזוקו. בעלי חיים עלולים להיראות כפגומים ולהפגין התנהגויות שחייה ובריחה פעילים, אבל אפילו הפציעה הקטנה ביותר עלולה לגרום לכישלון לשגשג. מאפיין אחד הרלוונטי במיוחד להערכת הבריאות של doliolid זואוids שנתפסו היא היכולת שלהם להאכיל. פעילות האכלה ניתן להעריך פשוט על ידי מתן אצות פיגמנט בעלי חיים שנתפסו טרי. אם בעל חיים ניזון, המעיים יהפכו לצבעוניים תוך פרק זמן קצר. מניסיוננו, גילינו כי הוספת כמות קטנה של אצות פיגמנט אדום, Rhodomonas sp., מספק במהירות מידע על פעילות האכלה. אם האכלה לא נצפתה, זה מאוד לא סביר כי התרבות ניתן להקים.
דריכות וטיפול טוב הם קריטיים להקמת ולקיים doliolids במהלך מחזור החיים המורכבים שלהם. אולי השלב הבעייתי ביותר הוא התפתחות של אחות ברת קיימא משלב הזחל וההפקה (לבלוב) של הטרופוזואידים המזינים. בשלב זה של החיים, אנו משערים כי דרישות המזון, ביחס לכמות, איכות וגודל החלקיקים מוגבלים ביותר. לידיעתך, לא היו מחקרים קודמים שחקרו את פעילות ההזנה של הזחלים של ד. gegenbauri והאוזזואידים. לדוגמה, למרות שהזיבה המתפתחת והפאורוזואידים מסוגלים לבלוע חלקיקים במגוון רחב של גדלים, היכולת של הזחלים, האוזאידים והאחיות הקטנות, כנראה מוגבלת יותר. בפועל, אנו מוצאים שטיפוח מוצלח בשלבי חיים אלה ניתן להשגה על-ידי השמטת דיטומים מתערובת המזון האלגל, על-ידי שמירה על ריכוזי מזון ברמות בינונית, על-ידי ביצוע הארוחות תכופות בריכוזים נמוכים, על-ידי שמירה על גונאוזואיד גדול בודד וכמה מעטים עם התרבות, ועל ידי הסרת באופן ידני אגרגטים גדולים של דטריטוס.
למרות שאנחנו שמרו על תרבויות של D. gegenbauri עבור דורות מרובים שמקורם באוסף אחד, כאשר אנו משלימים באופן שגרתי את התרבויות הקיימות עם בעלי חיים שנאספו טרי כדי להגדיל את הגיוון הגנטי וחוסן של התרבות. סכנה פוטנציאלית של פרקטיקה זו היא הקדמה של טפילים או מחלות לתוך התרבות, אך לידיעתנו, מעולם לא נתקלנו בבעיה זו. למרות שהיו דיווחים מעטים של טפילים של doliolids32, ללא ספק, הם קיימים. מעניין, במחקר שנערך לאחרונה השוואת הדיאטה של d. gegenbauri גונדוids חשופים למים טבעיים עם שדה-נתפס d. gegenbauri gonozooids, טפילים שוערת Apicomplexa זוהו באוכלוסיית הפראי כי היו נעדר מבעלי חיים מתורבתים6.
מגבלה קיימת של טכנולוגיית התרבות המתוארת היא המגבלה של נפח הייצור בזואואיד. במיוחד משום שהשיטות המתוארות כרוכות בגידול בצנצנות אטומות בצפיפויות נמוכות על גלגל פלנקטון מסתובב, לא ברור אם גישה זו יכולה להיות מצטמצמת או שזרימת העבודה תהיה קלה לאוטומציה. מערכות טיפוח בקנה מידה גדול יותר, לעומת זאת, עבור מינים אחרים עדין של הזואופלנקטון הימיים של ז'לטין, הדו הליקואית של הצ, המתואר20,33,34, מציע כי ייתכן ניתן לעצב מערכות דומות עבור doliolids בעתיד. עם זאת, היסטוריית החיים המורכבת של D. gegenbauri לעומת ההיסטוריה החיים הפשוטה של O. דיואיקה יישאר אתגר משמעותי לטיפוח בקנה מידה גדול.
לסיכום, בעקבות הפרוטוקולים המתוארים כאן, D. gegenbauri יכול להיות מטופח באופן אמין תחת תנאי מעבדה מבוקרת במהלך ההיסטוריה המורכבת שלה החיים. הקיבולת הזאת הופכת את המין למגוון של מחקרים ניסיוניים מבוקרים, ואולי לפתח doliolids כמודל בעלי חיים חדש בביולוגיה התפתחותית ואבולוציה. מגבלות של קנה מידה של ייצור, עם זאת, יהיה צורך להתגבר לפני מטרה זו ניתן להשיג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה להצהיר
Acknowledgments
אנו אסירי תודה לאנשים רבים שתרמו ידע שנצבר לפרויקט זה במהלך השנים כולל G.-A. Paffenhöfer וד. דימוס שפיתחו את הפרוטוקולים האלה במקור מ. קייסטר, ול' למברלי תרמו גם הם באופן משמעותי לפיתוח ההליכים הללו. N.B. לופס-פיגרואה ו-האדרגס-סנטיאגו יצרו את האומדנים של doliolid שפע שניתן בטבלה 1. מחקר זה היה נתמך בחלקו על ידי הקרן הלאומית המדע הלאומי פרסים OCE 082599, 1031263 MEF, פרויקטים שיתופיים OCE 1459293 ו OCE 14595010 כדי MEF ו DMG, הלאומית הלאומי והאטמוספירה המינהל פרס NA16SEC4810007 ל DMG. אנו אסירי תודה לצוות החרוץ והמקצועי של סוואנה. לי אן דלאו הכין את הדמויות, צ'ארלס י. רוברטסון הגהה על כתב היד וג (ג'ימי) ויליאמס ייצרה את גלגל הפלנקטון
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T.
- Holland, L. Z.
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L.
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P.
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
