Summary
Los doliolids, incluyendo la especie Dolioletta gegenbauri,son pequeños zooplancton marinos gelatinosos de importancia ecológica que se encuentran en los sistemas productivos de estanterías subcontinentales en todo el mundo. La dificultad de cultivar estos delicados organismos limita su investigación. En este estudio, describimos los enfoques de cultivo para la recolección, cría y mantenimiento de la doliolida Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Los zooplanktos gelatinosos desempeñan un papel crucial en los ecosistemas oceánicos. Sin embargo, generalmente es difícil investigar su fisiología, crecimiento, fecundidad e interacciones tróficas principalmente debido a desafíos metodológicos, incluyendo la capacidad de cultivarlos. Esto es particularmente cierto para el doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri ocurre comúnmente en sistemas productivos de estanterías continentales subtropicales en todo el mundo, a menudo a concentraciones de floración capaces de consumir una gran fracción de la producción primaria diaria. En este estudio, describimos los enfoques de cultivo para recolectar, criar y mantener D. gegenbauri con el propósito de realizar estudios basados en laboratorio. D. gegenbauri y otras especies de doliolid pueden ser capturados en vivo usando redes de plancton de malla remolcadas oblicuamente de 202 m de un barco a la deriva. Los cultivos se establecen de forma más fiable cuando las temperaturas del agua están por debajo de los 21 oC y se inician a partir de gonozooides inmaduros, farorzooides madurantes y enfermeras grandes. Los cultivos pueden mantenerse en recipientes de cultivo redondeados en una rueda de plancton giratoria lenta y mantenerse en una dieta de algas cultivadas en agua de mar natural durante muchas generaciones. Además de la capacidad de establecer cultivos de laboratorio de D. gegenbauri,demostramos que la condición de recolección, la concentración de algas, la temperatura y la exposición al agua de mar naturalmente condicionada son fundamentales para el cultivo crecimiento, supervivencia y reproducción de D. gegenbauri.
Introduction
Zooplancton representan la mayor biomasa animal en el océano, son componentes clave en las redes de alimentos marinos, y desempeñan un papel importante en los ciclos biogeoquímicos oceánicos1,2. Zooplancton, aunque compuesto por una gran diversidad de organismos, se puede distinguir en dos categorías: gelatinosa y no gelatinosa con pocos taxones intermedios3,4. En comparación con el zooplancton no gelatinoso, el zooplancton gelatinosoes especialmente difícil de estudiar debido a sus complejas historias de vida 5, y sus delicados tejidos se dañan fácilmente durante la captura y manipulación. Las especies de zooplancton gelatinoso son, por lo tanto, notoriamente difíciles decultivar en el laboratorio y generalmente menos estudiadas en comparación con las especies no gelatinosas 6.
Entre los grupos gelatinosos de zooplancton, uno abundante y de importancia ecológica en el océano del mundo son los thaliaceanos. Los thaliaceans son una clase de tunicados pelágicos que incluyen los órdenesSalpida, Pyrosomida y Doliolida 7. Los doliolida, denominados colectivamente doliolids, son pequeños organismos pelágicos de natación libre en forma de barril que pueden alcanzar altas abundancias en regiones neríticas productivas de los océanos subtropicales. Los doliolids se encuentran entre los más abundantes de todos los grupos de zooplancton4,8. Como alimentadores de suspensión, los doliolids recogen partículas de alimentos de la columna de agua creando corrientes de filtro y capturándolas en redes de moco9. Taxonómicamente, los doliolids se clasifican en el phylum Urochordata10. Ancestrales a los cordados, y además de su importancia ecológica como componentes clave de los sistemas pelágicos marinos, los thaliaicos son de importancia para entender los orígenes de la historia colonial10,11 y la evolución de los cordatos5,7,10,12,13,14.
La historia de vida de los doliolids es compleja y contribuye a la dificultad para cultivarlos y sostenerlos a lo largo de su ciclo de vida. Una revisión del ciclo de vida doliolid y la anatomía se puede encontrar en Godeaux et al.15. El ciclo de vida doliolid, que implica una alternancia obligatoria entre las etapas de la historia de la vida sexual y asexual, se presenta en la Figura1. Los óvulos y espermatozoides son producidos por los gonozooides hermafroditas, la única etapa solitaria del ciclo de vida. Los gonozooides liberan espermatozoides a la columna de agua y los óvulos son fertilizados internamente y liberados para convertirse en larvas. Las larvas eclosionan y metorfican en oozooides que pueden alcanzar 1-2 mm. Suponiendo condiciones ambientales y nutrición propicias, los oozooides se convierten en enfermeras tempranas dentro de 1-2 días a 20 oC e inician las etapas coloniales del ciclo de vida. Los oozooides producen asexualmente brotes en su eston ventral. Estos cogollos salen del estony migran al cadoforo dorsal donde se alinean en tres filas emparejadas. Las filas dobles centrales se convierten en phorozooides y las dos filas dobles externas se convierten en trophozooides. Estos últimos proporcionan alimento tanto a la enfermera como a los farorozooides16,17. Los trophozooides suministran nutrición a la enfermera, ya que pierde todos los órganos internos. A medida que aumenta la abundancia de trophozooides, el tamaño de la enfermera puede alcanzar los 15 mm en el laboratorio. A medida que los farorozooides crecen, ingenian cada vez más presas planctónicas y alcanzan 1,5 mm de tamaño antes de ser liberados como individuos17. Una sola enfermera puede liberar > 100 phorozooides durante su vida útil18. Después de que los farorozooides son liberados del cadoforo, siguen creciendo y son la segunda etapa colonial del ciclo de vida. Una vez que alcanzan los 5 mm de tamaño, cada phorozooide desarrolla un racimo de gonozooides en su pedúnculo ventral. Estos gonozooides pueden ingerir partículas cuando alcanzan 1 mm de longitud. Después de que los gonozooides han alcanzado de 2 a 3 mm de tamaño, se liberan del phorozooide y se convierten en la única etapa solitaria del ciclo de vida. Una vez que alcanzan los 6 mm de tamaño, los gonozooides se vuelven sexualmente maduros17. Los gonozooides pueden alcanzar 9 mm o más de longitud. Los gonozooides son hermafroditas, los espermatozoides se liberan intermitentemente mientras que la fertilización de los óvulos ocurre internamente16,17. Cuando el gonozooide tiene un tamaño de 6 mm, libera hasta 6 óvulos fertilizados. El cultivo exitoso requiere apoyar las necesidades específicas de cada una de estas etapas únicas de la historia de la vida.
Debido a la importancia ecológica y evolutiva de los thaliaceanos, incluidos los doliolids, es necesario que las metodologías de cultivo avancen en la comprensión de la biología, fisiología, ecología e historia evolutiva únicas de este organismo19 . Los doliolids tienen una promesa considerable como organismos modelo experimentales en biología del desarrollo y genómica funcional porque son transparentes y probablemente tienen genomas simplificados20,21. La falta de métodos de cultivo fiables, sin embargo, impide su utilidad como modelos de laboratorio. Aunque un puñado de laboratorios han publicado resultados basados en doliolides cultivados, a nuestroconocimiento no se han publicado previamente enfoques de cultivo y protocolos detallados. Basándose en años de experiencia, y los intentos de cultivo de ensayos y errores, el propósito de este estudio fue revisar experiencias y compartir protocolos para la recolección y cultivo de doliolids, específicamente la especie Dolioletta gegenbauri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de instalaciones de cultivo para la cría de D. gegenbauri
NOTA: Todos los materiales y equipos requeridos se enumeran en la Tabla de Materiales.
- Preparar 1 M de hidróxido de sodio (NaOH), 0.06 M Permanganato de potasio (KMnO4). Para preparar esta solución, disolver 400 g de NaOH en agua desionizada de 10 L. Agregue 100 g de KMnO4 a la solución NaOH y mezcle bien.
- Preparar una solución de bisulfito desodio de 0,1 M (NaHSO 3) disolviendo 100 g de NaHSO3 en agua desionizada de 10 L y mezcle bien.
ADVERTENCIA: Estos reactivos son irritantes que pueden causar problemas respiratorios si se inhalan. Colocar en un área bien ventilada, como una campana de humo. Evite cualquier contacto con la piel. Use guantes de protección, ropa protectora, protección para los ojos y protección facial cuando manipule. - Antes de establecer y criar cultivos de doliolid en el laboratorio, limpiar y esterilizar los frascos de cultivo.
- Enjuagar frascos de cultivo de 1,9 L y 3,8 L al menos 3 veces con agua desionizada. Deje que las tapas del tornillo se sequen, ya que las tapas no están incluidas en los siguientes pasos de limpieza.
- Limpie y esterilice los frascos de cultivo de vidrio de 1,9 y 3,8 l sumergiéndolos en la solución NaOH/KMnO 4. Deje que los frascos se empaquen durante la noche.
- Retire los frascos de la solución NaOH/KMnO4 y sumerja los frascos en la solución de bisulfito sódico (NaHSO3). Deje que los frascos se empaquen durante la noche.
- Retire los frascos de la solución NaHSO3 y enjuague bien con agua desionizada. Deje que los frascos se sequen.
- Coloque la rueda de plancton (Figura2) en un espacio de temperatura controlada (cámara ambiental). Equilibrar la temperatura a 20oC. Para obtener una descripción más detallada de la rueda de plancton personalizada, consulte la Figura suplementaria 1.
2. Cultura del fitoplancton
- Obtener cultivos de algas del Centro Nacional de Algas Marinas y Microbiota (NCMA) u otras fuentes para ser utilizados como alimento para D. gegenbauri. Mezclas de dos especies flageadas incluyendo Isochrysis galbana (CCMP 1323), Rhodomonas sp (CCMP 740), y una pequeña diatomea, Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) se obtuvieron de la NCMA y se han utilizado en laboratorio anterior estudios a los doliolids traseros con éxito17.
- Prepare los medios de crecimiento L1 y L1-Si22 según lo recomendado por la NCMA.
- Siga las instrucciones proporcionadas por el proveedor para iniciar los nuevos cultivos de algas.
- Para mantener los cultivos de stock, utilizando rigurosas técnicas de cultivo axénico, transfiera 0,5 ml de cultivo de senescente antiguo a 25 ml de medios de crecimiento fresco en tubos estériles de cultivo de vidrio de 55 ml cada dos semanas.
NOTA: No es posible almacenar cultivos de algas vivos sin transferirlos regularmente. Si los cultivos no se utilizarán durante largos períodos, y no es posible mantener los cultivos durante el período de no uso, se recomienda volver a adquirir estos cultivos de algas comunes a partir de sus fuentes originales (por ejemplo, NCMA). - Preparar volúmenes más grandes de fitoplancton para alimentar doliolidas en matraces limpios de cultivo de tejido plástico de 500 ml que contengan 200 ml de medios de crecimiento.
- Fitoplancton de inocular a partir de poblaciones axenicas (4 ml) a 200 ml de medios de crecimiento (1:50 dilución).
- Incubar a 20oC con una luz de 12:12 h: ciclo oscuro bajo iluminación de luz blanca fría de 65-85 oE/m2. Los matraces de cultivo de laicos están planos para maximizar la iluminación. Suavemente remolino de cultura todos los días.
- Determinar la concentración de células utilizando un contador de partículas o microscopio para monitorear el crecimiento de los cultivos.
NOTA: Después de 7-10 días desde la inoculación, los cultivos flagelados contendrán 105-106 celdas/ml y el cultivo de diatomea contendrá 104-105 celdas/ml. Estas concentraciones son suficientes para mantener los cultivos doliolidas. - Iniciar nuevas poblaciones de alimentación en un mínimo de cada dos semanas para proporcionar suficiente biomasa de algas para apoyar todas las actividades de cultivo.
3. Recogida de doelilidos silvestres y agua de mar para la cultura
NOTA: En la Figura 3se describe una descripción general de los enfoques de recolección y cultivo. En la Figura 4se proporciona una descripción de la red de plancton de colección especializada y el extremo del bacalao.
- Localice los doliolids detectándolos utilizando redes de plancton o sistemas de imágenes in situ23.
NOTA: Debido a que los doliolides rara vez están presentes en las aguas superficiales y no son detectables por la tecnología de teledetección, guiados por el conocimiento previo de condiciones favorables a los doliolids (ver Discusión),la presencia de doliolides debe determinarse antes del muestreo. - Recoger agua de mar rica en partículas antes de recoger doliolides vivos en preparación para iniciar un cultivo D. gegenbauri.
- Despliegue botellas de Niskin montadas en una roseta CTD o equipo equivalente para recoger agua del sitio donde se encuentran los doliolidas y de la profundidad que contiene las estimaciones más altas de clorofila una concentración estimada por fluorometría in situ.
NOTA: La clorofila una concentración se utiliza como indicador de las concentraciones de partículas. En la plataforma continental media de South Atlantic Bight (SAB), la clorofila subsuperficial un máximo suele estar cerca de la parte inferior, pero en otros lugares, puede que no lo esté.
- Despliegue botellas de Niskin montadas en una roseta CTD o equipo equivalente para recoger agua del sitio donde se encuentran los doliolidas y de la profundidad que contiene las estimaciones más altas de clorofila una concentración estimada por fluorometría in situ.
- Una vez localizados los doliolids, recupere los zooides doliolides no dañados utilizando la red de plancton especializada y el extremo del bacalao. Antes de desplegar la red, llene el extremo del bacalao con agua de mar.
- Desde un barco a la deriva, baje y levante la red a través de la columna de agua manteniendo un ángulo de remolque oblicuo de 15 a 25o y una velocidad de despliegue y recuperación vertical no superior a 15 m/min.
- Una vez que la red esté a bordo, transfiera y divida suavemente el contenido del extremo de bacalao en cubos de plástico de 3 galones (20 L) cada uno que contengan 10 L de agua de mar superficial recogida del sitio.
NOTA: Los nuevos cubos de plástico deben estar acondicionados mediante la adición de agua de mar días antes de la recolección de doliolides vivos. El objetivo es reducir la lixiviación de productos químicos del plástico. Si no hay agua de mar disponible, utilice agua purificada (por ejemplo, Milli Q) o agua del grifo libre de contaminantes tóxicos para acondicionar los cubos. - Aísle los zooides doliolid de otros plancton.
- En pequeños lotes (2 L) transfiera tablones mixtos del contenido neto de remolque (ahora en cubos de plástico de 20 L) a un vaso de vidrio de 2 L.
- Usando una pipeta de vidrio de gran diámetro (8 mm ID x 38 cm de longitud), sifón cuidadosamente y transferir activamente los zooides doliolid nadadores desde el vaso de precipitados a frascos de cultivo de vidrio limpio que contienen agua de mar rica en partículas recogida con botellas de Niskin de donde estaban los doliolidas Situado.
- Suelte suavemente los zooides doliolid bajo la superficie del agua de mar.
NOTA: Recoger gonozooides, phorozooides que contengan gonozooides en desarrollo adjuntos y etapas de enfermería que contengan trohozooides adjuntos (Figura 1).
- Después de la adición de doliolids, agregue el cultivo de Rhodomonas sp. a una concentración final de 5 x 103 – 104 células/ml (50 ml de un cultivo que contenga 5 x 104 – 1 x 105 células/ml en un frasco de 3,8 L). Esto es para determinar si los doliolides están alimentando activamente. Cuando los doliolids ingienden Rhodomonas sp., su tracto digestivo aparecerá de color rojo. Retire los zooides que no parecen estar alimentándose.
- Para evitar que los doliolids queden atrapados en la interfaz aire-agua, evite el espacio en la cabeza en los frascos de cultivo llenando completamente los frascos con agua de mar rica en partículas sin filtrar y colocando un pedazo de plástico sobre la abertura del frasco (89 mm de ancho).
- Evite crear burbujas de aire que también puedan dañar a los animales. Atornille cuidadosamente la tapa al frasco e invierta suavemente el frasco para determinar si hay burbujas presentes. Si hay burbujas, retírelas.
- Después de llenar los frascos, limpie el exceso de agua del exterior del frasco.
- Monte cada frasco en la rueda de plancton (Figura2) colocando el frasco en las barras metálicas verticales cubiertas con tubos de goma, y entre una abrazadera de manguera de acero inoxidable.
- Asegúrese de que la parte posterior del frasco esté acolchada contra el tubo de goma. Apriete la abrazadera de la manguera alrededor del frasco ajustando el tornillo.
- Compruebe que el frasco no se mueve una vez que esté bien fijado en su lugar. Deje que los frascos giren a 0,3 rpm para mantener los doliolides en suspensión.
ADVERTENCIA: Es importante no apretar demasiado el frasco para evitar que el frasco se agriete.
- En el barco, mantenga los recipientes de cultivo en la rueda de plancton a 20 oC con luz tenue hasta que puedan ser transferidos a la instalación de cultivo de laboratorio.
- Al regresar al laboratorio, transfiera los frascos que contienen doliolidis a la instalación de cultivo preparada. Monte los frascos en la rueda del plancton (consulte el paso 3.8) y permita que los frascos continúen girando a 0,3 rpm.
NOTA: Toda la cría de doliolidas en este estudio se llevó a cabo a 20 oC.
4. Mantener las culturas D. gegenbauri
- Desde el barco hasta el laboratorio, permita que los animales se aclimaten en los frascos originales a las condiciones del laboratorio durante 3 días.
- Durante el período de aclimatación, utilice una pipeta de vidrio de diámetro ancho para intercambiar el 10% del agua con agua de mar rica en partículas sin filtrar del sitio de recolección todos los días durante 3 días.
- Mantenga varios copépodos en el frasco, pero retire todos los demás zooplancton, pellets fecales grandes y partículas agregadas grandes que pueden obstruir el aparato de filtrado del doliolid (red de moco). Si el cultivo consiste en enfermeras tempranas, mantenga un gonozooide grande (6 mm) en el frasco.
NOTA: No es importante qué especies de copépodos están incluidas en el cultivo, pero en este experimento, se utilizaron las especies más abundantes presentes desde donde se capturaron los doliolids.
- Después del período de aclimatación, transfiera los zooides y copópodos doliolides del frasco original a un frasco de cultivo limpio que contenga un 80% de filtro de fibra de vidrio (GF/F) filtrado de agua de mar y el 20% del agua de mar del frasco original. Prepare el agua de mar filtrada filtrando el agua de mar a través de un GF/F con un tamaño de poro nominal de papel de filtro de 0,7 m.
- Mantener el nuevo cultivo intercambiando el 10% del agua con agua de mar filtrada por GF/F cada 3 días y eliminando agregados y pellets fecales. Semanalmente, transfiera animales a un frasco nuevo como se describe en el paso 4.2.
- Alimentar los doliolids manteniendo las concentraciones de fitoplancton en los frascos de cultivo entre 40 - 95 g c/l.
NOTA: Estas concentraciones imitan las condiciones ambientales que se sabe que apoyan las condiciones de floración de D. gegenbauri17. La mezcla de especies de algas varía dependiendo de la etapa de vida y el número de zooides en cada frasco. Durante las primeras etapas de la vida, añadir 1:1 mezcla (por contenido de carbono) de las algas criptomonad (Isochrysis galbana y Rhodomonas sp.) solamente. Las especies de presas más grandes pueden obstruir fácilmente el aparato de alimentación de las pequeñas enfermeras y desarrollar trophozooides. Añadir la diatom Thalassiosira weissflogii a la mezcla de algas, también a igual contenido de carbono, cuando se alimentan de enfermeras más grandes, phorozooides y gonozooides.- Monitorear las concentraciones de algas antes y después de la alimentación para guiar la decisión de con qué frecuencia y cuánta cantidad de algas añadir a los cultivos. Utilice un contador de partículas para determinar las concentraciones de algas, ya que las concentraciones de algas en los frascos de cultivo son relativamente diluidas.
- Retire suficientes zooides para mantener concentraciones de algas de 40 – 95 gC/L para que los doliolids restantes tengan suficiente comida para crecer.
NOTA: La etapa de vida más difícil de mantener con éxito en condiciones de laboratorio es el desarrollo de larvas y oozooide (enfermera temprana). Durante esta fase del cultivo, mantenga un gonozooide grande (6 mm) además de varios copépodos en el frasco con larvas en desarrollo y oozooides (20 euros por frasco de 3,8 L). - Transfiera al menos 4 enfermeras a un nuevo tarro de cultivo una vez que un mínimo de 8 trophozooides sean visibles en el cadoforo de la enfermera (Figura1B).
NOTA: Los trohozooides se duplicarán en número cada 1 – 2 días a 20 oC. Los trohozooides son lo suficientemente grandes como para ser visibles a simple vista.- Retire dos de las enfermeras una vez que las enfermeras desarrollen 20 trophozooides.
- Retire una enfermera cuando las enfermeras desarrollen > 30 trophozooides en sus cadopforos. Permita que el enfermero restante desarrolle farorzooides en su cadoforo.
- Retire la enfermera una vez que la enfermera libere hasta 30 farorzooides.
- Reducir el número de animales en el frasco una vez que los farorzooides alcanzan 3 mm de tamaño.
- Retire todos los farorzooides excepto cuatro cuando los phorozooides se hacen más grandes (> 5 mm) y han desarrollado racimos de gonozooides.
- Reduzca el cultivo a dos phorozooides cuando el número de racimos de gonozooides aumente de tamaño y comience a alimentarse.
- Retire los farorzooides una vez que los phorozooides liberen hasta 30 gonozooides.
- Reduzca el número de gonozooides de 30 zooides a 2 por frasco. Deje que los óvulos fertilizados se liberen en el frasco.
- Retire un gonozooide dejando un solo gonozooide en el frasco una vez que se desarrollen los oozooides.
NOTA: Las enfermeras desechadas, los farorzooides y los gonozooides se pueden utilizar para sembrar cultivos adicionales y para llevar a cabo más experimentos.
- Retire un gonozooide dejando un solo gonozooide en el frasco una vez que se desarrollen los oozooides.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siguiendo los procedimientos descritos para la recolección y el cultivo del doliolid, D. gegenbauri descritos en la Figura 3, es posible mantener un cultivo de D. gegenbauri a lo largo de su compleja historia de vida (Figura1) y sostenerlo durante muchas generaciones. Aunque el cultivo de D. gegenbauri se describe aquí, estos procedimientos también deben ser relevantes para el cultivo de otras especies de doliolid.
La captura de zooides doliolid sanos y no dañados requiere la aplicación de redes especializadas y procedimientos de remolque (Figura4). Como animales delicados sin estructuras duras, se debe tener cuidado de minimizar los procedimientos que pueden resultar en cualquier daño físico. Estos factores pueden incluir turbulencia, presión e interacciones con superficies como la red, el aire y las burbujas de aire. A pesar de su naturaleza delicada, sin embargo, los zooides doliolid no dañados se pueden recolectar utilizando una red de plancton cónico con una relación de diámetro de apertura a longitud de 1:5 y equipada con un extremo de bacalao no filtrado ponderado relativamente grande. Rutinariamente hemos utilizado una red de plancton de malla de 202 m (longitud) con una abertura de 0,5 m montada en un arnés giratorio y equipada con un extremo de bacalao no filtrado ponderado de 4 L (Figura4). Aunque el efecto del tamaño de malla de plancton en la captura de zooides D. gegenbauri cultivables no se ha investigado sistemáticamente, teóricamente, el uso de una red con un tamaño de malla más grande puede resultar en mejoras adicionales, ya que el tamaño de malla más grande reducir el campo de presión generado durante el remolque. Alternativamente, un mayor tamaño de malla resultará en un mayor flujo de agua a través de la red, potencialmente dañinas zooides doliolid. Las velocidades de remolque y el ángulo neto deben optimizarse para minimizar el tiempo de remolque y el daño durante la recolección. En nuestra experiencia, hemos encontrado que las condiciones de remolque suficientemente suaves se pueden lograr remolcando la red oblicuamente en un ángulo de 15-25o desde una nave a la deriva con velocidades de despliegue y recuperación verticales no superiores a 15 m/min. Para orientar la red hacia la dirección del flujo de agua, la red de plancton se monta en un arnés giratorio. Por lo general, la distribución de los doliolids en la columna de agua no es aleatoria y generalmente mayor en la región con las cargas de partículas más altas24. Por lo tanto, se debe muestrear la columna de agua desde debajo de la clorofila del subsuelo máxima hasta la superficie. En la plataforma poco profunda SAB mid-continental (20 - 45 m), se muestrea la columna de agua desde 1 m por encima de la parte inferior hasta la superficie.
Una vez que se han recogido zooides sanos, es fundamental mantenerlos de una manera que minimice la exposición a las superficies. Para minimizar los encuentros con superficies, los doliolides se mantienen en frascos redondeados llenos de agua de mar y se desploman suavemente sobre una rueda de plancton que gira lentamente (Figura2).
Aunque teóricamente es posible iniciar una cultura con zooides de cualquier etapa de la vida, la exploración de éxitos y fracasos en el establecimiento de nuevas culturas de D. gegenbauri de 6 intentos entre 2015 - 2018 en el Atlántico Sur de la Bight sugieren que el éxito se logra con mayor frecuencia cuando los zooides se recogen de aguas que están < 21 oC, y cuando se utilizan etapas de la vida distintas de los gonozooides maduros grandes para iniciar una nueva cultura (Tabla1 y Tabla 2). En la práctica, es útil, o al menos no perjudicial, incluir múltiples etapas de la vida de los zooides doliolid al iniciar una nueva cultura.
El éxito en el sostenimiento de un cultivo de D. gegenbauri, como se ha descrito para otras especies de tunicatopel escénico20, depende de proporcionar suficiente, pero no excesiva, diversidad alimentaria y alimentaria necesaria para apoyar cada etapa de la vida. Dado que los requisitos de la dieta varían a lo largo del ciclo de vida, la cantidad de algas proporcionadas en cada tiempo de alimentación debe variarse para mantener las concentraciones de alimentos en los niveles deseados (40 – 95 g C/L) (Tabla3). Las concentraciones por encima o por debajo de estos niveles pueden dar lugar a un aumento de las tasas de mortalidad (G.A. Paffenháfer pers. comm.). Aunque la dieta natural de D. gegenbauri sigue siendo mal entendida6, las culturas se pueden mantener suministrando mezclas relativamente simples de algas cultivadas y utilizando procedimientos que permiten que diversas comunidades microbianas la cultura. El aumento de la diversidad potencial del campo de presas se logra reteniendo una fracción de agua cargado de partículas de cultivos más antiguos y la inclusión de un pequeño número de copépodos vivos y grandes doliolides en cada cambio o transferencia de agua. Presumiblemente, estos organismos procesan algas y material detrital y sirven para diversificar el tamaño de partícula y el espectro de calidad disponible para la nutrición doliolida, pero se requieren estudios adicionales para confirmar esta hipótesis.
La disponibilidad de cultivos doliolides proporciona los medios para investigar, bajo condiciones experimentales controladas, muchos aspectos importantes de la biología doliolida, la fisiología, la ecología y la biología molecular. Por ejemplo, aunque los doliolides son abundantes en numerosas regiones del océano costero y son pastores planctónicos importantes25, los datos sobre las tasas de alimentación y crecimiento siguen siendo escasos26. Utilizando cultivos de D. gegenbauri, un enfoque de la investigación basada en el cultivo ha sido cuantificar las tasas de alimentación y crecimiento en respuesta a parámetros ambientales críticos, incluyendo temperatura y concentraciones de alimentos26. Los resultados de estos estudios han indicado que las tasas de aclaramiento son similares en concentraciones de 20 a 60 g de C/L y disminuyen a medida que aumentan las concentraciones alimentarias (Figura5A). Las tasas de aclaramiento aumentan proporcionalmente sobre los rangos de temperatura que apoyan el crecimiento de D. gegenbauri (Figura5B). Las tasas de crecimiento (k) oscilan entre 0,1 y 0,7/día en función de la temperatura y la disponibilidad de alimentos (Figura 6). Estos estudios, además de proporcionar información práctica para el cultivo, han permitido la determinación de las relaciones cuantitativas entre la alimentación doliolida y las tasas de crecimiento en función de los parámetros ambientales y proporcionan información crítica sobre la biología y la ecología de los doliolids necesarios para incluir este importante grupo de zooplancton en los marcos de modelado27.
Figura 1: El ciclo de vida de D. gegenbauri a 20oC.
El dibujo del ciclo de vida (1A) ha sido modificado después de Walters et al. 20186 y re-dibujado con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Rueda de plancton utilizada para el cultivo D. gegenbauri. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Visión general esquemática de D. gegenbauri colección y enfoque de cultivo.
Recogida en el mar (A), transferencia de cubos concentrados a pequeñovaso de vidrio en pequeños lotes (B ), aislamiento de zooides doliolid en frascos de cultivo que contienen agua de mar rica en partículas (C ), mantenimiento en la rueda de plancton durante todo el ciclo de vida (D,E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Plancton net y despliegue.
Implementación (arriba a la izquierda), recuperación (arriba a la derecha) y esquema de red y extremo de bacalao (abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Tasas de aclaramiento de algas de D. gegenbauri gonozooies.
(A) relación entre (A) Tasas medias de aclaramiento (ml/zooide/día) frente a la concentración de fitoplancton (g C/L) para tres tamaños de gonozooides de D. gegenbauri. Cada punto representa 4–11 observaciones. (B) Tasas medias de aclaramiento (lL/zooide/día) frente a la temperatura (C) para tres tamaños de gonozooides D. gegenbauri. Cada punto representa 4-12 observaciones. Los tamaños de los gonozooides son de 2,5 mm (
), 4,5 mm (
) y 6,5 mm (
). Las cifras se han vuelto a dibujar con el permiso26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Gráfico 6: Tasas de crecimiento de D. gegenbauri gonozooi.
Relación entre (A) Tasas medias de crecimiento (s.E.) (k) frente a la concentración de fitoplancton (g C/L) para tres tamaños de gonozooides Dolioletta gegenbauri. Cada punto representa 4–11 observaciones. (B) Tasas medias de crecimiento (s.E.) (k) frente a la temperatura (c) para tres tamaños de gonozooides Dolioletta gegenbauri. Cada punto representa 4-12 observaciones. Los tamaños de los gonozooides son de 2,5 mm (), 4,5 mm () y 6,5 mm (). Las figuras han sido re-dibujadas con el permiso de Gibson y Paffenháfer26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tabla 1. Condiciones oceanográficas y abundancia de doliolidas | |||||||||||
| Superficie | Parte inferior | Superficie | Parte inferior | Superficie | Parte inferior | Abundancia de Doliolid | |||||
| Fecha | ID de crucero | Latitud (N) | Longitud (W) | Profundidad (m) | Temperatura (0C) | Temperatura (0C) | Salinidad (PSU) | Salinidad (PSU) | Chla (g/L) | Chla (g/L) | zooides/m3 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 31.1889 | 80.1527 | 41.30 | 25.26 | 22.43 | 33.58 | 36.96 | Na | 0.20 | Na |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 29.5687 | 80.3269 | 40.00 | 26.40 | 21.75 | 36.26 | 36.32 | 1.04 | 1.35 | 218 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 31.1674 | 80.1249 | 40.80 | 23.24 | 22.60 | 35.91 | 35.81 | 1.06 | 1.70 | 13 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 31.2139 | 80.1823 | 41.00 | 18.72 | 18.84 | 36.00 | 36.12 | 0.83 | 1.50 | 3 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 31.2144 | 80.1822 | 42.00 | 24.19 | 23.85 | 36.00 | 36.04 | 0.63 | 1.30 | 254 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 31.1835 | 80.1466 | 43.00 | 16.85 | 16.45 | 36.50 | 36.48 | 0.56 | 0.89 | Na |
| NA: datos no disponibles | |||||||||||
Tabla 1: Condiciones oceanográficas y abundancia de doliolidas en la plataforma mid-continental del South Atlantic Bight en el momento y lugar donde Los zooides D. gegenbauri fueron recolectados y utilizados para iniciar nuevas culturas.
| Cuadro 2. Resultados de los intentos de cultivo de D. gegenbauri | ||||
| Fecha | ID de crucero | Zooids Recogidos | Resultado | Comentarios |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | Gonozooides grandes de maduración sexual (6-7 mm) | Fallado | Todos los gonozooides habían muerto después de 4 días. Se produjeron etapas de oozooide y de la vida de la enfermera temprana, pero no prosperaron. |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | Gonozooides grandes de maduración sexual (8-10 mm) | Fallado | Los gonozooides murieron poco después de la recolección. Los oozooides y las primeras enfermeras fueron producidos, pero no prosperaron. |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | Colección mixta que incluye enfermera tardía (4-5 mm) con trophozooides unidos, gonozooides grandes sexualmente maduros (6 mm) y oozooides (2 mm) | Exitoso | Cultivados durante 4 generaciones completas, se añadieron a la cultura gonozooides y enfermeras adicionales recolectados en enero y marzo de 2016. Laboratorio fue evacuado durante 4 días durante el huracán Matthew en octubre de 2016 y la cultura no sobrevivió. |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | Colección mixta que incluye gonozooides (1,5-5 mm) y grandes farorzooides (6 mm) con racimos de gonozooides adjuntos | Exitoso | Cultivados durante 4 generaciones completas, se añadieron a la cultura gonozooides adicionales recogidos en abril de 2017. Cultivo terminado en septiembre de 2017 antes del huracán Irma. |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | Gonozooides (3-6 mm) | Fallado | Gran gonozooide murió después de 1 día. El gonozooide inmaduro sobrevivió en la cultura durante 14 días. Los huevos fueron liberados por ambos gonozooides. Los oozooides se produjeron, pero no se convirtieron en etapas de enfermería. La cultura fracasó después de 1 mes. |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | Enfermera tardía grande (6-7 mm) sin trotrozooides | Exitoso | En el cultivo, la enfermera produjo trophozooides. La cultura se mantuvo durante 3 generaciones y se terminó a finales de junio de 2018, cuando se concluyeron los experimentos. |
Cuadro 2: Resultado de los intentos de establecer cultivos de laboratorio de D. gegenbauri recogido de la plataforma continental medio del South Atlantic Bight.
| Dolioletta gegenbauri | zooide por | zooide por | |||
| etapa de la vida | 3.9 L tarro | Tarro de 1.9 L | Isochrysis galbana | Rhodomonas sp. | Thalassiosira weissflogii |
| oozooid | 20 | 10 | incluír | incluír | NO INCLUYA |
| enfermera temprana | 20 | 10 | incluír | incluír | NO INCLUYA |
| enfermera tardía con 8 trophozooides | 4 | 2 | incluír | incluír | incluír |
| enfermera tardía con 20 trophozooides | 2 | 1 | incluír | incluír | incluír |
| enfermera tardía con 30 trophozooides | 1 | 1 | incluír | incluír | incluír |
| phorozooide (1 a 3 mm) | 30 | 15 | incluír | incluír | incluír |
| cúmulo de gonozooides de phorozooide (> 5 mm) | 2 | 1 | incluír | incluír | incluír |
| gonozooide (1 a 3 mm) | 30 | 15 | incluír | incluír | incluír |
| gonozooide (> 5 mm) | 2 | 1 | incluír | incluír | incluír |
| Las concentraciones objetivo de algas deben mantenerse entre 40 y 95 g de C/L con mezclas iguales (por contenido de carbono) de cada especie de algas | |||||
Tabla 3: Condiciones culturales objetivo para cada D. fase del ciclo de vida de gegenbauri.
Figura suplementaria 1: Descripción detallada de la rueda de plancton personalizada. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La capacidad de cultivar doliolids se ha establecido en las últimas décadas y se ha utilizado para apoyar la investigación en varias áreas. Los estudios experimentales en nuestros laboratorios han apoyado la publicación de al menos 15 estudios científicos centrados en la alimentación y el crecimiento18,26,reproducción18,28, dieta6, 29, fisiología30, ecología31, y modelado ecológico27 de doliolids.
Aunque la cultura de estos animales delicados es actualmente laboriosa y requiere mucho tiempo, el cultivo de doliolids es factible y, si lo lleva a cabo la comunidad en general, fomentará el avance de la comprensión de esto ecológica y grupo de animales evolutivamente importante. El objetivo de este estudio fue describir los enfoques actuales para la recolección, cría y mantenimiento de D. gegenbauri en cultivo con el fin de realizar estudios basados en laboratorio.
El establecimiento de un cultivo doliolid requiere la recolección de animales sanos y no dañados y, una vez capturados, un tratamiento suave, una nutrición adecuada y la cría. Los doliolids, específicamente la especie D. gegenbauri,se produce circunglobalmente en los estantes continentales subtropicales, pero la abundancia puede ser muy variable. Por ejemplo, en un estudio reciente centrado en la región de mitad de estante de la SAB, aunque la abundancia varió drásticamente de <1/m3 a > 20.000/m3, los doliolids estuvieron presentes durante todo el año6. Debido a la alta variabilidad de los doliolids en el espacio y el tiempo y la relativa dificultad que implica el muestreo de entornos de margen de plataforma continental, el conocimiento confiable de la dinámica de la comunidad doliolida donde se están llevando a cabo los estudios es un requisito previo para el establecimiento exitoso de la cultura.
Una vez que los zooides doliolid han sido localizados y capturados, puede ser difícil determinar si los animales han sido dañados. Los animales pueden parecer intactos y exhibir comportamientos activos de natación y escape, pero incluso la lesión más pequeña puede resultar en su fracaso para prosperar. Una característica que es especialmente pertinente para la evaluación de la salud de los zooides doliolid capturados es su capacidad para alimentarse. La actividad de alimentación se puede evaluar simplemente proporcionando algas pigmentadas a los animales recién capturados. Si un animal se está alimentando, el intestino se coloreará en un corto período de tiempo. En nuestra experiencia, hemos encontrado que la adición de una pequeña cantidad de algas pigmentadas rojas, Rhodomonas sp., proporciona rápidamente información sobre la actividad de alimentación. Si no se observa la alimentación, es muy poco probable que se pueda establecer un cultivo.
La vigilancia y la buena ganadería son fundamentales para establecer y sostener los doliolidas a lo largo de su complejo ciclo de vida. Tal vez la etapa más problemática es el desarrollo de una enfermera viable a partir de la etapa larval y la producción (sprouting) de los trophoozoides de alimentación. En esta etapa de la vida, especulamos que los requisitos alimentarios, con respecto a la cantidad, la calidad y el tamaño de las partículas, son más limitados. Hasta donde sabemos, no ha habido estudios previos que hayan investigado la actividad de alimentación de las larvas y oozooides de D. gegenbauri. Por ejemplo, aunque los gonozooides y los farorzooides en desarrollo son capaces de ingerir partículas en una amplia gama de tamaños, la capacidad de larvas, oozooides y enfermeras pequeñas es probablemente más limitada. En la práctica, encontramos que el cultivo exitoso en estas etapas de la vida se puede lograr omitiendo las diatomeas de la mezcla de alimentos de algas, manteniendo las concentraciones de alimentos a niveles moderados, mediante la realización de alimentos frecuentes a concentraciones más bajas, manteniendo una gonozooides más grandes y unos pocos copépodos con el cultivo, y mediante la eliminación manual de grandes agregados de detritus.
Aunque hemos mantenido cultivos de D. gegenbauri durante varias generaciones originarias de una sola colección, cuando es posible complementamos rutinariamente los cultivos existentes con animales recién recolectados para aumentar la diversidad genética y la robustez de la cultura. Un peligro potencial de esta práctica es la introducción de parásitos o enfermedades en la cultura, pero hasta nuestro conocimiento, nunca hemos encontrado este problema. Aunque ha habido pocos informes de parásitos de doliolids32,sin duda, existen. Curiosamente, en un estudio reciente que comparó la dieta de los gonozooides cultivados de D. gegenbauri expuestos a aguas naturales con gonozooides D. gegenbauri capturados en el campo, se detectaron parásitos presuntivos de Apicomplexa en la población silvestre que ausentes en los animales cultivados6.
Una limitación existente de la tecnología de cultivo descrita es la limitación del volumen de producción de zooides. En particular, debido a que las técnicas descritas implican el cultivo en frascos sellados a bajas densidades en una rueda de plancton giratoria, no está claro si este enfoque podría ampliarse o que el flujo de trabajo sería susceptible de automatización. Los sistemas de cultivo a mayor escala, sin embargo, para otra delicada especie de zooplancton marino gelatinoso, la larvaca Oikopleura dioica,han sido descritos20,33,34, lo que sugiere que puede ser posible diseñar sistemas similares para los doliolids en el futuro. Sin embargo, la compleja historia de vida de D. gegenbauri en comparación con la historia de vida más simple de O. dioica seguirá siendo un desafío significativo para el cultivo a gran escala.
En conclusión, siguiendo los protocolos descritos aquí, D. gegenbauri puede ser cultivado de forma fiable bajo condiciones de laboratorio controladas a lo largo de su compleja historia de vida. Esta capacidad hace que la especie sea susceptible a una variedad de estudios experimentales controlados, y tal vez para desarrollar doliolidas como un nuevo modelo animal en biología y evolución del desarrollo. Sin embargo, habrá que superar las limitaciones de la escala de producción antes de que se pueda alcanzar este objetivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a las muchas personas que han aportado conocimiento acumulado a este proyecto a lo largo de los años, incluyendo G.-A. Paffenháfer y D. Deibel que originalmente desarrollaron estos protocolos. M. K-ster, y L. Lamboley también han contribuido significativamente al desarrollo de estos procedimientos. N.B. López-Figueroa y el S.E. Rodríguez-Santiago generaron las estimaciones de abundancia de doliolidas proporcionadas en la Tabla 1. Este estudio fue apoyado en parte por los premios OCE 082599, 1031263 a MEF, proyectos colaborativos OCE 1459293 y OCE 14595010 a MEF y DMG y, el premio Nacional de Administración Oceánica y Atmosférica NA16SEC4810007 a DMG. Estamos agradecidos a la tripulación trabajadora y profesional de la R / V Savannah. Lee Ann DeLeo preparó las figuras, Charles Y. Robertson aprueba el manuscrito y, James (Jimmy) Williams fabricó la rueda de plancton
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T.
- Holland, L. Z.
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L.
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P.
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
