Summary
Doliolids, incluindo a espécie Dolioletta gegenbauri, são pequeno zooplâncton marinho gelatinoso de significado ecológico encontrado em sistemas de prateleira subcontinentais produtivos em todo o mundo. A dificuldade de cultivar esses organismos delicados limita sua investigação. Neste estudo, descrevemos abordagens de cultivo para a coleta, criação e manutenção do doliolid Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Os e gelatinosos desempenham um papel crucial nos ecossistemas oceânicos. No entanto, é geralmente difícil investigar sua fisiologia, crescimento, fecundidade e interações tróficas, principalmente devido aos desafios metodológicos, incluindo a capacidade de cultura-los. Isto é particularmente verdadeiro para o doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri comumente ocorre em sistemas de prateleira continental subtropical produtiva em todo o mundo, muitas vezes em concentrações de floração capazes de consumir uma grande fração da produção primária diária. Neste estudo, descrevemos abordagens de cultivo para a coleta, criação e manutenção de D. gegenbauri com o objetivo de realizar estudos laboratoriais. D. gegenbauri e outras espécies de doliolid pode ser capturado ao vivo usando obliquamente rebocada cônicos 202 μm malha plâncton redes de um navio à deriva. As culturas são mais confiantemente estabelecidas quando as temperaturas da água estão abaixo de 21 ° c e são iniciadas a partir de gonozooids imaturos, amadurecimento de phorozooids, e grandes enfermeiros. As culturas podem ser mantidas em embarcações de cultura arredondadas em uma roda de plâncton lentamente rotativa e sustentada em uma dieta de algas cultivadas em água do mar natural por muitas gerações. Além da capacidade de estabelecer culturas laboratoriais de D. gegenbauri, demonstramos que a condição de coleta, a concentração de algas, a temperatura e a exposição à água do mar naturalmente condicionada são essenciais para a cultura estabelecimento, crescimento, sobrevivência e reprodução de D. gegenbauri.
Introduction
Zooplâncton conta para a maior biomassa animal no oceano, são componentes-chave em Webs de alimentos marinhos, e desempenham papéis importantes no oceano biogeoquímica ciclos1,2. O zooplâncton, embora constituído por uma enorme diversidade de organismos, pode ser distinguido grosseiramente em duas categorias: gelatinosa e não-gelatinosa com poucos táxons intermediários3,4. Comparado com o zooplâncton não-gelatinoso, o zooplâncton gelatinoso é especialmente difícil de estudar por causa de suas complexas histórias de vida5, e seus tecidos delicados são facilmente danificados durante a captura e manuseio. As espécies de zooplâncton gelatinosas são, portanto, notoriamente difíceis de cultura em laboratório e geralmente menos estudadas em comparação com espécies não gelatinosas6.
Entre os grupos gelatinosos do zooplâncton, um abundante e de importância ecológica no oceano do mundo são os Thaliaceans. Thaliaceans são uma classe de tunicados pelágicos que incluem as ordens salpida, pyrosomida, e doliolida7. Doliolida, coletivamente referidos como doliolids, são pequenos organismos pelágicos livres de natação em forma de barril que podem atingir altas abundâncias em regiões nerióticas produtivas de oceanos subtropicais. Doliolids estão entre os mais abundantes de todos os grupos zooplâncton4,8. Como alimentadores de suspensão, os os coletam partículas de alimento da coluna de água criando correntes filtrantes e capturando-as em redes de muco9. Taxonomicamente, os os são classificados no filo Urochordata10. Ancestral dos chordates, e além de seu significado ecológico como componentes-chave dos sistemas marinhos pelágicos, os Taliaceanos são de importância para a compreensão das origens da história da vida colonial10,11e da evolução dos Cordados5,7,10,12,13,14.
A história de vida dos os é complexa e contribui para a dificuldade em cultivá-los e sustentá-los através do seu ciclo de vida. Uma revisão do ciclo de vida e da anatomia do doliolid pode ser encontrada em Godeaux et al.15. O ciclo de vida doliolid, que envolve uma alternância obrigatória entre estágios sexuais e assexuais da história da vida, é apresentado na Figura 1. Os ovos e o esperma são produzidos pelos gonozooids hermafroditas, o único estágio solitário do ciclo de vida. Gonozooids liberar esperma para a coluna de água e os ovos são fertilizados internamente e liberados para se desenvolverem em larvas. Larvas eclodir e metamorfose em oozooids que podem chegar a 1-2 mm. presumindo condições ambientais propícias e nutrição, oozooids tornam-se enfermeiros precoces dentro de 1-2 dias a 20 ° c e iniciam as fases coloniais do ciclo de vida. Oozooids produzem brotos assexualmente em seu stolon ventral. Estes botões deixam o estolão e migram para o cadóforo dorsal onde se alinham em três fileiras emparelhadas. As fileiras dobro centrais transformam-se designados e as duas fileiras dobro exteriores transformam-se trophozooids. Estes últimos fornecem alimentos tanto para o enfermeiro quanto para os designados16,17. Os trophozooids fornecem a enfermeira a nutrição enquanto perde todos os órgãos internos. Como a abundância de trophozooids aumenta, o tamanho do enfermeiro pode chegar a 15 mm no laboratório. À medida que os designados crescem, cada vez mais ingerem presas planktónicas e atingem ~ 1,5 mm de tamanho antes de serem liberados como indivíduos17. Uma única enfermeira pode liberar > 100 designados durante sua vida útil18. Depois que os designados são liberados do cadophore, continuam a crescer e são a segunda etapa colonial do ciclo de vida. Uma vez que alcangam ~ 5 milímetros no tamanho, cada phorozooid desenvolve um conjunto de gonozóoides em seu pedúnculo ventral. Estes gonozooides podem ingerir partículas quando atingem ~ 1 mm de comprimento. Depois que os gonozóoides alcangaram ~ 2 a 3 milímetros no tamanho são liberados do phorozooid e transformam-se o único estágio solitário do ciclo de vida. Uma vez que alcançam ~ 6 milímetros no tamanho, os gonozóoides tornam-se sexualmente maduros17. Gonozooids pode atingir 9 mm ou maior de comprimento. Gonozooids são hermafroditas, o espermatozóide é liberado intermitentemente enquanto a fertilização dos ovos ocorre internamente16,17. Quando o gonozooide é ≥ 6 mm de tamanho, ele libera até 6 ovos fertilizados. A cultura bem-sucedida requer o suporte às necessidades específicas de cada um desses estágios de história de vida únicos.
Devido ao significado ecológico e evolutivo de Thaliaceans, incluindo doliolids, há uma necessidade para as metodologias de cultivo para avançar o entendimento da biologia, fisiologia, ecologia e história evolutiva do único organismo19 . Os doliolids têm uma promessa considerável como organismos modelo experimentais em biologia do desenvolvimento e genômica funcional porque são transparentes e provavelmente têm genomas simplificados20,21. A falta de métodos de cultivo confiáveis, no entanto, impede sua utilidade como modelos laboratoriais. Embora um punhado dos laboratórios publiquem resultados baseados em doliolids cultivados, a nossas aproximações do cultivo do conhecimento e os protocolos detalhados não estiveram publicados previamente. Com base em anos de experiência e tentativas de cultivo experimental e de erro, o objetivo deste estudo foi revisar experiências e compartilhar protocolos para a coleta e cultivo de doliolids, especificamente a espécie Dolioletta gegenbauri.
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Protocol
1. preparação de instalações de cultivo para a criação de D. gegenbauri
Nota: todos os materiais e equipamentos exigidos estão listados na tabela de materiais.
- Prepare 1 M de hidróxido de sódio (NaOH), 0, 6 M de permanganato de potássio (KMnO4) solução. Para preparar esta solução, dissolva 400 g de NaOH em 10 L de água desionizada. Adicione 100 g de KMnO4 à solução de NaOH e misture bem.
- Prepare uma solução de 0,1 M de bissulfito de sódio (NaHSO3) dissolvendo 100 g de nahso3 em 10 L de água desionizada e misture bem.
Cuidado: estes reagentes são irritantes que podem causar problemas respiratórios se inalados. Coloc em uma área bem ventilada tal como uma capa das emanações. Evite qualquer contato com a pele. Use luvas protetoras, roupas protetoras, proteção ocular e proteção facial ao manusear. - Antes de estabelecer e de criar culturas doliolid no laboratório, limpe e esterilize os frascos da cultura.
- Enxágüe 1,9 L e 3,8 L frascos de cultura pelo menos 3 vezes com água deionizada. Deixe as tampas de rosca secar, pois as tampas não estão incluídas nas etapas de limpeza a seguir.
- Limpe e esterilize frascos de cultura de vidro de 1,9 e 3,8 L, imersando-os na solução NaOH/KMnO4 . Permitir que os frascos para mergulhar durante a noite.
- Retire os frascos da solução NaOH/KMnO4 e mergulhe os frascos na solução de bissulfito de sódio (nahso3). Permitir que os frascos para mergulhar durante a noite.
- Retire os frascos da solução NaHSO3 e enxague abundantemente com água desionizada. Deixe os frascos secar.
- Coloque a roda de plâncton (Figura 2) em um espaço controlado por temperatura (câmara ambiental). Equilibrar a temperatura a 20 ° c. Para uma descrição mais detalhada da roda de plâncton personalizado, consulte a Figura complementar 1.
2. cultura fitoplanctônica
- Obter culturas de algas do centro nacional de alga marinha e microbiota (NCMA) ou outras fontes a serem usadas como alimento para D. gegenbauri. As misturas de duas espécies flagellate que incluem o galbana do Isochrysis (ccmp 1323), o SP de Rhodomonas (CCMP 740), e um diatom pequeno, weissflogii de thalassiosira (CCMP 1051) foram obtidos do ncma e foram usados em laboratório prévio estudos a os traseiros com sucesso17.
- Prepare os meios de crescimento L1 e L1-si22 como recomendado pelo ncma.
- Siga as instruções fornecidas pelo fornecedor para iniciar as novas culturas de algas.
- Para manter as culturas de ações, usando técnicas de cultura axênica rigorosas, transfira 0,5 mL de cultura senescing antiga para 25 mL de mídia de crescimento fresco em tubos estéreis de cultura de vidro 55 mL a cada duas semanas.
Nota: não é possível armazenar culturas de algas vivas sem transferi-las regularmente. Se as culturas não serão utilizadas por longos períodos, e não é possível manter culturas durante o período de não utilização, recomenda-se a re-aquisição dessas culturas de algas comuns a partir de suas fontes originais (por exemplo, NCMA). - Prepare volumes maiores de fitoplâncton para alimentar os em frascos de cultura de tecido plástico 500 ml limpos contendo 200 ml de meios de crescimento.
- Inoculate fitoplâncton de estoques axênicos (4 mL) em 200 mL de meios de crescimento (1:50 diluição).
- Incubar a 20 ° c com uma luz de 12:12 h: ciclo escuro iluminação de luz branca fresca de 65-85 μE/m2. Lay cultura frascos plana para maximizar a iluminação. Gentilmente redemoinho cultura diariamente.
- Determine a concentração de células usando um contador de partículas ou microscópio para monitorar o crescimento das culturas.
Nota: após 7-10 dias da inoculação, as culturas flagellate conterá ~ 105-106 Cells/ml e a cultura do diatomáceas conterá ~ 104-105 Cells/ml. Estas concentrações são suficientes para manter as culturas doliolid. - Iniciar novos estoques de alimentação em um mínimo de duas semanas para fornecer biomassa algas suficiente para apoiar todas as atividades de cultura.
3. coleção de os selvagens e água do mar para a cultura
Observação: uma visão geral das abordagens de coleta e cultivo é descrita na Figura 3. Uma descrição da rede de plâncton de coleta especializada e da extremidade do bacalhau é fornecida na Figura 4.
- Localize os detectando-os usando redes de plâncton ou sistemas de imagem in situ23.
Nota: como os os raramente estão presentes nas águas superficiais e não são detectáveis pela tecnologia de sensoriamento remoto, guiados pelo conhecimento pré-requisito das condições favoráveis aos os (ver discussão), a presença de os deve ser determinada antes da amostragem. - Colete a água do mar rica em partículas antes de coletar os ao vivo em preparação para iniciar uma cultura D. gegenbauri .
- Implante garrafas de Niskin montadas em uma roseta CTD ou equipamento equivalente para coletar água do local onde os os estão localizados e da profundidade que contém as maiores estimativas de concentração de clorofila a estimada pela fluorometria in situ.
Nota: a concentração de clorofila a é usada como um indicador de concentrações de partículas. No Atlântico Sul Bight (SAB) prateleira mid-continental, a clorofila subsuperficial um máximo é geralmente perto do fundo, mas em outros locais, pode não ser.
- Implante garrafas de Niskin montadas em uma roseta CTD ou equipamento equivalente para coletar água do local onde os os estão localizados e da profundidade que contém as maiores estimativas de concentração de clorofila a estimada pela fluorometria in situ.
- Uma vez que os os estão localizados, recupere zoóides doliolid não danificados usando a rede de plâncton especializada e a extremidade do bacalhau. Antes de implantar a rede, encha a extremidade de bacalhau com água do mar.
- De um navio à deriva, abaixe e levante a rede através da coluna de água mantendo um ângulo de reboque oblíquo de ~ 15-25 ° e velocidade de implantação e recuperação vertical não superior a 15 m/min.
- Uma vez que a rede está onboard, gentilmente transferir e dividir o conteúdo do bacalhau-fim em 3, 5-galão (~ 20 L) baldes de plástico cada contendo ~ 10 L de superfície de água do mar recolhidos a partir do local.
Nota: os baldes plásticos novos devem ser condicionados pela adição de dias da água do mar antes de viver a coleção do doliolid. O objetivo é reduzir a lixiviação de produtos químicos de plástico. Se a água do mar não estiver disponível, use purificada (por exemplo, Milli Q) ou molhe a agua livre de contaminantes tóxicos para condicionar os baldes. - Isole os zoóides doliolid de outro plâncton.
- Em pequenos lotes (~ 2 L) transfira planktons mistos dos conteúdos de reboque líquido (agora em baldes de plástico de 20 L) para um copo de vidro de 2 L.
- Utilizando uma pipeta de vidro de furo largo (8 mm ID x 38 cm de comprimento), cuidadosamente sifão e transferir ativamente zoóides doliolid de natação da Taça em frascos de cultura de vidro limpo contendo água do mar rico em partículas coletadas usando garrafas de Niskin de onde os os foram Localizado.
- Solte suavemente os zoóides doliolid a superfície da água do mar.
Nota: colete gonozooides, designados contendo gonozooides em desenvolvimento em anexo e estágios de enfermeira contendo trophozooids anexados (Figura 1).
- Após a adição de doliolids, adicione a cultura Rhodomonas SP. a uma concentração final de ~ 5 x 103 – 104 Cells/ml (~ 50 ml de uma cultura contendo ~ 5 x 104 – 1 x 105 células/ml em um frasco de 3,8 L). Isto é para determinar se os os estão alimentando ativamente. Quando os ingerir Rhodomonas SP., seu trato digestivo aparecerá de cor vermelha. Remova os zoóides que não parecem estar alimentando.
- Para impedir que os os sejam prendidos na relação da ar-água, evite o headspace nos frascos da cultura enchendo completamente os frascos com a água do mar partícula-rica não filtrada e coloc uma parte de envoltório plástico sobre a abertura do frasco (89 milímetros largamente).
- Evite criar bolhas de ar que também podem danificar os animais. Parafuse com cuidado a tampa no frasco e inverta delicadamente o frasco para determinar se as bolhas estão atuais. Se as bolhas estiverem presentes, retire-as.
- Depois de frascos são preenchidos, limpe o excesso de água do lado de fora do frasco.
- Monte cada jarra na roda do plâncton (Figura 2) colocando o jarro nas barras metálicas verticais cobertas com tubos de borracha e entre uma braçadeira de mangueira em aço inoxidável.
- Assegure-se de que a parte traseira do frasco esteja amortecida de encontro à tubulação de borracha. Aperte o grampo de mangueira ao redor do frasco, ajustando o parafuso.
- Verifique se o jarro não está a mover-se uma vez que está firmemente fixado no lugar. Permita que os frascos giram em 0,3 rpm para manter os os na suspensão.
Atenção: é importante não apertar demasiado o jarro para evitar que o jarro se quebre.
- No navio, manter os vasos de cultura na roda de plâncton a 20 ° c em luz fraca até que possam ser transferidos para a instalação de cultura de laboratório.
- Ao retornar ao laboratório, transfira os frascos contendo os para a instalação de cultura preparada. Monte os frascos na roda do plâncton (veja a etapa 3,8) e permita que os frascos continuem a girar em 0,3 rpm.
Nota: toda a criação de os neste estudo foi conduzida a 20 ° c.
4. manutenção das culturas D. gegenbauri
- Do navio ao laboratório, permita que os animais aclimatar nos frascos originais às condições do laboratório por 3 dias.
- Durante o período da aclimatação, use uma pipeta de vidro larga do furo para trocar 10% da água com o seawater partícula-rico não filtrado do local da coleção cada dia por 3 dias.
- Manter vários copépodes no frasco, mas remover todos os outros zooplâncton, grandes pelotas fecais, e grandes partículas agregadas que podem obstruir o doliolid ' s filtragem de aparelhos (muco líquido). Se a cultura consistir em enfermeiras precoces, mantenha um gonozooide grande (≥ 6 mm) no frasco.
Nota: não é importante que as espécies de copépodes sejam incluídas na cultura, mas neste experimento, as espécies mais abundantes presentes de onde foram capturados os os foram utilizadas.
- Após o período de aclimatação, transfira zoóides doliolid e copépodes do frasco original para um frasco de cultivo limpo contendo 80% de filtro de fibra de vidro (GF/F) água do mar filtrada e 20% da água do mar do frasco original. Prepare a água do mar filtrada filtrando a água do mar através de um GF/F com um tamanho de poros nominal de 0,7 μm de papel filtro.
- Manter a nova cultura, trocando 10% da água com GF/F filtrado do mar a cada 3 dias e removendo agregados e pelotas fecais. Semanalmente, transfira os animais para um novo jarro, conforme descrito na etapa 4,2.
- Os da alimentação mantendo concentrações do fitoplâncton nos frascos da cultura entre 40-95 μg C/L.
Nota: estas concentrações imitam condições ambientais que são conhecidas por apoiar as condições de floração para D. gegenbauri17. A mistura de espécies de algas varia dependendo da fase de vida e do número de zoóides em cada frasco. Durante as fases iniciais da vida, adicione 1:1 mistura (por conteúdo de carbono) das algas criptomonad (Isochrysis galbana e Rhodomonas SP.) apenas. Espécies de presas maiores podem facilmente entupir o aparelho de alimentação de pequenas enfermeiras e desenvolver trophozooids. Acrescente o diatomáceo Thalassiosira weissflogii à mistura de algas, também em igual teor de carbono, quando se alimentam enfermeiras maiores, phorozooids e gonozooides.- Monitore as concentrações de algas pré e pós-alimentação para orientar a decisão de quão freqüentemente e quanta alga adicionar às culturas. Use um contador de partículas para determinar as concentrações de algas, porque as concentrações de algas nos frascos de cultura são relativamente diluir.
- Remova os zoóides suficientes para manter concentrações de algas de 40 – 95 μgc/L de modo que os os restantes terão bastante alimento a crescer.
Nota: o estágio de vida mais difícil de manter com sucesso em condições laboratoriais é o desenvolvimento de larvas e oozoide (enfermeira precoce). Durante esta fase da cultura, manter um gonozoóide grande (≥ 6 mm), além de vários copépodes no frasco com o desenvolvimento de larvas e oozooids (~ 20 por 3,8 L jar). - Transferir pelo menos 4 enfermeiros para um novo pote de cultivo, uma vez que um mínimo de 8 trofozooides são visíveis no cadóforo do enfermeiro (Figura 1b).
Nota: Trophozooids duplicará em número a cada 1 – 2 dias a 20 ° c. Trophozooids são grandes o suficiente para ser visível a olho nu.- Remova duas das enfermeiras uma vez que os enfermeiros desenvolvem 20 trophozooids.
- Remover uma enfermeira quando as enfermeiras desenvolvem > 30 trophozooids em seus cadophores. Permita que a enfermeira restante desenvolva designados em seu cadophore.
- Retire a enfermeira uma vez que a enfermeira libera até 30 phorozooids.
- Reduza o número de animais no frasco uma vez que os designados alcangam 3 milímetros no tamanho.
- Remover todos, mas quatro designados quando os designados se tornam maiores (> 5 mm) e desenvolveram aglomerados gonozoóides.
- Reduza a cultura para dois designados quando o número de gonozóoides clusters aumentar em tamanho e começar a alimentar.
- Remova os designados uma vez que os designados liberam até 30 gonozooids.
- Reduza o número de gonozóoides de 30 zoóides para 2 por frasco. Permita que os ovos fertilizados sejam liberados no frasco.
- Remova um gonozooid deixando um único gonozooid no frasco uma vez que os oozooids se desenvolvem.
Nota: enfermeiras descartadas, phorozooids e gonozóoides podem ser usadas para propagar culturas adicionais e para realizar novas experiências.
- Remova um gonozooid deixando um único gonozooid no frasco uma vez que os oozooids se desenvolvem.
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Representative Results
Seguindo os procedimentos descritos para coleta e cultivo do doliolid, d. gegenbauri delineado na Figura 3, é possível manter uma cultura de d. gegenbauri ao longo de sua história de vida complexa (Figura 1) e sustentá-lo por muitas gerações. Embora o cultivo de D. gegenbauri seja descrito aqui, esses procedimentos também devem ser relevantes para o cultivo de outras espécies de doliolid.
A captação de zoóides doliolid saudáveis e não danificados requer a aplicação de redes especializadas e procedimentos de reboque (Figura 4). Como animais delicados sem estruturas duras, deve-se tomar cuidado para minimizar os procedimentos que podem resultar em qualquer dano físico. Esses fatores podem incluir turbulência, pressão e interações com superfícies, incluindo a rede, ar e bolhas de ar. Apesar de sua natureza delicada, entretanto, os zoóides não danificados do doliolid podem ser recolhidos usando uma rede cónica do plâncton com um diâmetro da abertura à relação do comprimento de 1:5 e equipado com um COD-extremidade não-filtrando ponderado relativamente grande. Rotineiramente usamos uma malha de 202 μm de 2,5 m (comprimento) de rede de plâncton com uma abertura de 0,5 m montada em um arnês giratório e equipada com uma extremidade de bacalhau não filtrante de 4 L ponderada (Figura 4). Embora o efeito do tamanho de engranzamento do plâncton na captação de zoóides cultiváveis do D. gegenbauri não tenha sido investigado sistematicamente, teoricamente, o uso de uma rede com um tamanho de engranzamento maior pode conduzir a uma melhoria mais adicional porque o tamanho de engranzamento maior reduzir o campo de pressão gerado durante o reboque. Alternativamente, maior tamanho de malha resultará em maior fluxo de água através da rede, potencialmente prejudiciais zoóides doliolid. As velocidades de reboque e o ângulo líquido devem ser otimizados para minimizar o tempo de reboque e danos durante a coleta. Em nossa experiência, nós encontramos que as condições suficientemente delicadas do reboque podem ser conseguidas rebocando a rede obliquamente em um ângulo de 15-25 ° de um navio à deriva com velocidades verticais da distribuição e da recuperação não maiores de 15 m/min. Para orientar a rede para a direção do fluxo de água, a rede de plâncton é montada em um arnês giratório. É geralmente o caso de que a distribuição de os na coluna de água não é aleatória e geralmente maior na região com as maiores cargas particuladas24. Portanto, a coluna de água abaixo do máximo de clorofila subsuperficial à superfície deve ser amostrada. Na prateleira rasa mid-continental de SAB (20-45 m), a coluna da água de ~ 1 m acima da parte inferior à superfície é amostrada.
Uma vez que os zoóides saudáveis foram recolhidos, é fundamental para manter-los de uma forma que minimiza a exposição a superfícies. Para minimizar os encontros com as superfícies os são mantidos em frascos arredondados cheios de água do mar e suavemente caiu em uma roda de plâncton lentamente girando (Figura 2).
Embora seja teoricamente possível iniciar uma cultura com zoóides de qualquer estágio de vida, a exploração de sucessos e fracassos no estabelecimento de novas culturas de D. gegenbauri a partir de 6 tentativas entre 2015 – 2018 no Atlântico Sul Bight sugerem que o sucesso é mais frequentemente alcançada quando os zoóides são recolhidos a partir de águas que são < 21 ° c, e quando os estágios de vida que não sejam grandes gonozooides maduros são utilizados para iniciar uma nova cultura (tabela 1 e tabela 2). Na prática, é útil, ou pelo menos não prejudicial, incluir vários estágios de vida de zoóides doliolid ao iniciar uma nova cultura.
O sucesso em sustentar uma cultura de D. gegenbauri, como tem sido descrito para outras espécies de tunicados pelágicos20, depende de fornecer suficiente, mas não excessiva, a diversidade de alimentos e alimentos necessários para apoiar cada estágio de vida. Como os requisitos de dieta variam ao longo do ciclo de vida, a quantidade de algas fornecidas em cada tempo de alimentação deve ser variada para manter as concentrações alimentares nos níveis-alvo desejados (40 – 95 μg C/L) (tabela 3). As concentrações acima ou abaixo destes níveis podem resultar num aumento das taxas de mortalidade (Paffenhöfer pers. comm.). Embora a dieta natural de D. gegenbauri permaneça mal compreendida6, as culturas podem ser mantidas fornecendo misturas relativamente simples de algas cultivadas e utilizando os procedimentos que permitem que as comunidades microbianas diversas estabeleçam em a cultura. Aumentar a diversidade potencial do campo da rapina é conseguido conservando uma fração da partícula Laden-água das culturas mais velhas e a inclusão de um pequeno número de copépodes vivos e de grandes os em cada mudança ou transferência da água. Presumivelmente, esses organismos processam algas e material detrital e servem para diversificar o tamanho da partícula e o espectro de qualidade disponíveis para a nutrição doliolid, mas estudos adicionais são necessários para confirmar essa hipótese.
A disponibilidade de culturas doliolid fornece os meios para investigar, condições experimentais controladas, muitos aspectos importantes da biologia doliolid, fisiologia, ecologia e biologia molecular. Por exemplo, embora os os sejam abundantes em numerosas regiões do oceano costeiro e sejam os principais pastosos planktónicos25, os dados sobre as taxas de alimentação e crescimento permanecem escassos26. Utilizando culturas de D. gegenbauri, um foco de pesquisa baseada na cultura tem sido quantificar as taxas de alimentação e crescimento em resposta a parâmetros ambientais críticos, incluindo temperatura e concentrações alimentares26. Os resultados destes estudos indicaram que as taxas de depuração são semelhantes nas concentrações de 20 a 60 μg C/L e diminuem à medida que as concentrações alimentares aumentam (Figura 5a). As taxas de apuramento aumentam proporcionalmente sobre as faixas de temperatura que apoiam o crescimento de D. gegenbauri (Figura 5b). As taxas de crescimento (k) variam de 0,1 a 0,7/dia em função da temperatura e da disponibilidade de alimentos (Figura 6). Esses estudos, além de fornecerem informações práticas para a cultura, permitiram a determinação de relações quantitativas entre a alimentação de doliolid e as taxas de crescimento em função dos parâmetros ambientais e fornecem insights críticos sobre a biologia e a ecologia dos os exigidos para incluir este grupo importante do zooplâncton em estruturas de modelagem27.
Figura 1: o ciclo de vida de D. gegenbauri a 20 ° c.
O desenho do ciclo de vida (1A) foi modificado após Walters et al. 20186 e redesenhado com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: roda de plâncton utilizada para a cultura D. gegenbauri. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: visão geral esquemática do Coleção de D. gegenbauri e aproximação do cultivation.
Coleta no mar (a), transferência de baldes concentrados para taça de vidro pequeno em pequenos lotes (B), isolamento de zoóides doliolid em frascos de cultivo contendo água do mar rica em partículas (C), manutenção na roda de plâncton durante todo o ciclo de vida (D, E). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: rede e implantação do plâncton.
Implantação (canto superior esquerdo), recuperação (canto superior direito) e esquemático da extremidade líquida e de bacalhau (inferior). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: taxas de depuração de algas D. gegenbauri gonozooids.
(A) relação entre (a) taxas de depuração média (± S.E.) (ml/zoóide/dia) versus concentração de fitoplâncton (μg C/L) para três tamanhos de Gonozooides de D. gegenbauri . Cada ponto representa 4 – 11 observações. (B) taxas de depuração média (± S.E.) (ml/zoóide/dia) versus temperatura (° c) para três tamanhos de gonozooides de D. gegenbauri . Cada ponto representa 4 – 12 observações. Os tamanhos de gonozooids são 2,5
mm (), 4,5
mm () e 6,5 mm
(). Os números foram redesenhados com permissão26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: taxas de crescimento de D. gegenbauri gonozoóide.
Relação entre (A) médias (± S.E.) taxas de crescimento (k) versus concentração de fitoplâncton (μg C/L) para três tamanhos de Dolioletta gegenbauri gonozooids. Cada ponto representa 4 – 11 observações. (B) médias (± S.E.) taxas de crescimento (k) versus temperatura (° c) para três tamanhos de Dolioletta gegenbauri gonozooids. Cada ponto representa 4 – 12 observações. Os tamanhos de gonozooids são 2,5mm (), 4,5mm () e 6,5 mm(). As figuras foram redesenhadas com a permissão de Gibson e de Paffenhöfer26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tabela 1. Condições oceanográficas e abundância de Doliolid | |||||||||||
| Superfície | Fundo | Superfície | Fundo | Superfície | Fundo | Abundância de doliolid | |||||
| Data | ID do cruzeiro | Latitude (N) | Longitude (W) | Profundidade (m) | Temperatura (° C) | Temperatura (° C) | Salinidade (PSU) | Salinidade (PSU) | Chla (μg/L) | Chla (μg/L) | zooids/m3 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 31,1889 | 80,1527 | 41,30 | 25,26 | 22,43 | 33,58 | 36,96 | NA | 0,20 | NA |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 29,5687 | 80,3269 | 40, 0 | 26,40 | 21,75 | 36,26 | 36,32 | 1, 4 | 1,35 | 218 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 31,1674 | 80,1249 | 40,80 | 23,24 | 22,60 | 35,91 | 35,81 | 1, 6 | 1,70 | 13 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 31,2139 | 80,1823 | 41, 0 | 18,72 | 18,84 | 36, 0 | 36,12 | 0,83 | 1,50 | 3 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 31,2144 | 80,1822 | 42, 0 | 24,19 | 23,85 | 36, 0 | 36, 4 | 0,63 | 1,30 | 254 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 31,1835 | 80,1466 | 43, 0 | 16,85 | 16,45 | 36,50 | 36,48 | 0,56 | 0,89 | NA |
| NA: dados não disponíveis | |||||||||||
Tabela 1: condições oceanográficas e abundância de doliolid no Atlântico Sul Bight mid-continental prateleira no momento e local onde D. gegenbauri zoóides foram coletados e utilizados para iniciar novas culturas.
| Tabela 2. Resultados de tentativas de cultivo de D. gegenbauri | ||||
| Data | ID do cruzeiro | Zooids recolhidos | Resultado | Comentários |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | Sexualmente maduro grande (6-7 mm) gonozóoides | Falhou | Todos os gonozóoides morreram após 4 dias. Os estágios oozooid e adiantados da vida da enfermeira foram produzidos mas não prosperaram. |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | Sexualmente maduro grande (8-10 mm) gonozóoides | Falhou | Gonozooids morreu logo após a coleta. Oozooids e enfermeiras adiantadas foram produzidas mas não prosperaram. |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | Coleção mista incluindo enfermeira tardia (4-5 mm) com trophozooids em anexo, gonozooides de grande (6 mm) sexualmente maduros e oozooids (2 mm) | Bem sucedido | Cultivadas por 4 gerações, gonozóoides adicionais e enfermeiros coletados em Janeiro e março de 2016 foram adicionados à cultura. O laboratório foi evacuado por 4 dias durante o furacão Matthew em outubro de 2016 e a cultura não sobreviveu. |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | Coleção mista incluindo gonozooides (1,5-5 mm) e grandes designados (6 mm) com clusters gonozoóides anexados | Bem sucedido | Cultivadas para 4 gerações cheias, os gonozóoides adicionais coletados em abril 2017 foram adicionados à cultura. Terminada a cultura em setembro 2017 adiantado do furacão Irma. |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | Gonozooids (3-6 mm) | Falhou | Gonozooid grande morreu após 1 dia. O gonozooid imaturo sobreviveu na cultura por 14 dias. Os ovos foram liberados por ambos os gonozooids. Oozooids foram produzidos mas não se desenvolveram em estágios da enfermeira. A cultura falhou após 1 mês. |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | Grande (6-7 mm) enfermeira tardia sem trophozooids | Bem sucedido | Na cultura a enfermeira produziu trophozooids. A cultura foi mantida por 3 gerações e foi encerrada no final de junho de 2018, quando os experimentos foram concluídos. |
Tabela 2: resultado das tentativas de estabelecer culturas laboratoriais D. gegenbauri coletado do Atlântico Sul Bight mid-continental prateleira.
| Dolioletta gegenbauri | número de zooid por | número de zooid por | |||
| estágio de vida | 3,9 frasco de L | 1,9 frasco de L | Isochrysis galbana | Rhodomonas SP. | Thalassiosira weissflogii |
| oozooide | 20 | 10 | Incluem | Incluem | NÃO INCLUA |
| enfermeira precoce | 20 | 10 | Incluem | Incluem | NÃO INCLUA |
| enfermeira tardia com 8 trophozooids | 4 | 2 | Incluem | Incluem | Incluem |
| enfermeira tardia com 20 trophozooids | 2 | 1 | Incluem | Incluem | Incluem |
| enfermeira tardia com 30 trophozooids | 1 | 1 | Incluem | Incluem | Incluem |
| phorozooid (1 a 3 milímetros) | 30 | 15 | Incluem | Incluem | Incluem |
| cluster gonozoide phorozooid (> 5 mm) | 2 | 1 | Incluem | Incluem | Incluem |
| gonozooide (1 a 3 mm) | 30 | 15 | Incluem | Incluem | Incluem |
| gonozooide (> 5 mm) | 2 | 1 | Incluem | Incluem | Incluem |
| As concentrações-alvo de algas devem ser mantidas entre 40-95 μg C/L com misturas iguais (por teor de carbono) de cada espécie algas | |||||
Quadro 3: condições de cultura-alvo para cada D. gegenbauri fase do ciclo de vida.
Figura complementar 1: descrição detalhada da roda de plâncton personalizada. Por favor clique aqui para baixar esta figura.
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Discussion
A capacidade de cultura os tem sido estabelecida ao longo das últimas décadas e tem sido utilizada para apoiar a investigação em várias áreas. Estudos experimentais em nossos laboratórios têm apoiado a publicação de pelo menos 15 estudos científicos focados na alimentação e crescimento18,26, reprodução18,28, dieta6, 29, fisiologia30, ecologia31, e modelagem ecológica27 de doliolids.
Embora a cultura desses animais delicados seja atualmente trabalhosa e demorada, o cultivo de os é viável e, se empreendido pela comunidade mais ampla, promoverá o avanço da compreensão desta ecologicamente e Grupo evolutivamente importante de animais. O objetivo deste estudo foi descrever as abordagens atuais para a coleta, criação e manutenção de D. gegenbauri em cultura com o objetivo de realizar estudos laboratoriais.
O estabelecimento de uma cultura doliolid requer a coleta de animais saudáveis e não danificados e, uma vez capturado, tratamento delicado, nutrição adequada, e pecuária. Doliolids, especificamente a espécie D. gegenbauri, ocorre circumglobalmente em prateleiras continentais subtropicais, mas a abundância pode ser altamente variável. Por exemplo, em um estudo recente focado na região mid-shelf do sab, embora a abundância variou dramaticamente de < 1/m3 a > 20000/m3, os estavam presentes ao longo do ano6. Devido à alta variabilidade de os no espaço e tempo e a relativa dificuldade envolvida na amostragem de ambientes de margem de prateleira continental, o conhecimento confiável da dinâmica da Comunidade doliolid onde os estudos estão sendo conduzidos é um importante pré-requisito para o estabelecimento bem-sucedido da cultura.
Uma vez que os zoóides doliolid foram localizados e capturados, pode ser difícil determinar se os animais foram danificados. Os animais podem parecer não danificados e exibem comportamentos ativos de natação e fuga, mas mesmo a menor lesão pode resultar em sua incapacidade de prosperar. Uma característica que é especialmente pertinente para a avaliação da saúde de zoóides doliolid capturados é a sua capacidade de alimentar. A atividade de alimentação pode ser avaliada simplesmente fornecendo algas pigmentadas para animais recém-capturados. Se um animal está alimentando, o intestino se tornará colorido dentro de um curto período de tempo. Em nossa experiência, descobrimos que a adição de uma pequena quantidade de algas vermelhas pigmentadas, Rhodomonas SP., rapidamente fornece informações sobre a atividade de alimentação. Se a alimentação não for observada, é altamente improvável que uma cultura pode ser estabelecida.
A vigilância e o bom pecuária são críticos para estabelecer e sustentar os durante todo seu ciclo de vida complexo. Talvez o estágio mais problemático seja o desenvolvimento de uma enfermeira viável do estágio larval e da produção (sprouting) dos trophoozoids de alimentação. Neste estágio da vida, nós especulamos que as exigências do alimento, no que diz respeito à quantidade, à qualidade, e ao tamanho de partícula são as mais limitadas. Ao nosso conhecimento, não houve estudos prévios que investigaram a atividade alimentar de larvas de D. gegenbauri e oozooids. Por exemplo, embora os gonozóoides e os designados em desenvolvimento sejam capazes de ingerir partículas em uma ampla gama de tamanhos, a capacidade das larvas, oozooids e enfermeiros pequenos é provavelmente mais limitada. Na prática, encontramos que o cultivo bem-sucedido nessas fases da vida pode ser conseguido omitindo diatomáceas da mistura alimentar de algas, mantendo as concentrações de alimentos em níveis moderados, realizando alimentações freqüentes em concentrações mais baixas, mantendo um único gonozooid maior e alguns copépodes com a cultura, e removendo manualmente grandes agregados dos Detritus.
Embora tenhamos mantido culturas de D. gegenbauri para várias gerações provenientes de uma única coleção, quando possível, rotineiramente complementar culturas existentes com animais recém-recolhidos para aumentar a diversidade genética e robustez da cultura. Um perigo potencial desta prática é a introdução de parasitas ou doenças na cultura, mas a nosso conhecimento, nós nunca encontramos esse problema. Embora tenha havido poucos relatos de parasitas de os32, sem dúvida, eles existem. Curiosamente, em um estudo recente comparando a dieta dos gonozooides cultivados com d. gegenbauri expostos a águas naturais com gonozooides de d. gegenbauri capturados em campo, foram detectados parasitas Apicomplexa presuntivos na população selvagem que foram ausente nos animais cultivados6.
Uma limitação existente da tecnologia de cultura descrita é a limitação do volume de produção zoóide. Particularmente porque as técnicas descritas envolvem o cultivo em frascos selados em baixas densidades em uma roda giratória do plâncton, não é obscuro se esta aproximação poderia ser escalada-acima ou que o fluxo de trabalho seria passíveis à automatização. Sistemas de cultivo de maior escala, no entanto, para outra delicada espécies marinhas gelatinosas pequenas zooplâncton, o larvacean oikopleura dioica, foram descritos20,33,34, sugerindo que ele pode ser possível projetar sistemas similares para os no futuro. No entanto, a história de vida complexa de D. gegenbauri em comparação com a história de vida mais simples de o. dioica continuará a ser um desafio significativo para o cultivo em grande escala.
Em conclusão, seguindo os protocolos descritos aqui, D. gegenbauri pode ser cultivado confiantemente condições controladas do laboratório durante todo sua história de vida complexa. Esta capacidade faz com que a espécie seja capaz de uma variedade de estudos experimentais controlados, e talvez para desenvolver os como um novo modelo animal na biologia e evolução do desenvolvimento. As limitações da escala da produção, entretanto, precisarão de ser superadas antes que esta meta possa ser conseguida.
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Disclosures
Os autores não têm nada a declarar.
Acknowledgments
Agradecemos às muitas pessoas que contribuíram com o conhecimento acumulado para este projeto ao longo dos anos, incluindo a G.-A. Paffenhöfer e D. Deibel que desenvolveram originalmente estes protocolos. M. Köster, e L. Lamboley também contribuíram significativamente para o desenvolvimento desses procedimentos. N.B. López-Figueroa e Á.ee Rodríguez-Santiago geraram as estimativas de abundância de doliolid fornecidas na tabela 1. Este estudo foi apoiado em parte pela Fundação Nacional de ciência dos EUA concede OCE 082599, 1031263 para MEF, projetos colaborativos OCE 1459293 e OCE 14595010 para MEF e DMG e, o Prêmio Nacional de administração oceânica e atmosférica NA16SEC4810007 a DMG. Somos gratos à equipe trabalhadora e profissional do R/V Savannah. Lee Ann DeLeo preparou as figuras, Charles Y. Robertson revisou o manuscrito e, James (Jimmy) Williams fabricou a roda de plâncton
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T. Zooplankton body composition. Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L. Pelagic tunicates: Why gelatinous? American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. A molecular phylogeny of the Thaliacea. Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
