Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Deneysel Çalışmalar için Deniz Pelajik Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) Yetiştiriciliği

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59832
Automatic Translation
1, 2, 1
1Skidaway Institute of Oceanography, University of Georgia, 2Hampton University

Summary

Doliolidler, türleri Dolioletta gegenbauride dahil olmak üzere, dünya çapında üretken kıtaaltı raf sistemlerinde bulunan ekolojik önemi küçük jelatinimsi deniz zooplankton vardır. Bu hassas organizmaları kültüre çekmenin zorluğu araştırmalarını sınırlandırıyor. Bu çalışmada doliolid Dolioletta gegenbauri'nintoplanması, yetiştirilmesi ve bakımı için yetiştirme yaklaşımlarını açıklıyoruz.

Abstract

Jelatinimsi zooplanktonlar okyanus ekosistemlerinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, genellikle onların fizyolojisi, büyüme, fecundity ve trofik etkileşimleri öncelikle metodolojik zorluklar nedeniyle araştırmak zordur, onları kültür yeteneği de dahil olmak üzere. Bu özellikle doliolid için geçerlidir, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri genellikle üretken subtropikal kıta sahanlığı sistemlerinde dünya çapında, genellikle günlük birincil üretimin büyük bir kısmını tüketebilen çiçek konsantrasyonlarında görülür. Bu çalışmada, laboratuvar tabanlı çalışmaların yürütülmesi amacıyla D. gegenbauri'nin toplanması, yetiştirilmesi ve bakımı için yetiştirme yaklaşımları açıklanmaktadır. D. gegenbauri ve diğer doliolid türler sürüklenen bir gemiden eğik çekilmiş konik 202 μm örgü plankton ağları kullanılarak canlı olarak yakalanabilir. Su sıcaklığı 21 °C'nin altında olduğunda kültürler en güvenilir şekilde kurulur ve olgunlaşmamış gonozooidler, olgunlaşan phorozooidler ve büyük hemşirelerden başlar. Kültürler yavaş dönen plankton tekerleği üzerinde yuvarlak kültür kaplarında muhafaza edilebilir ve birçok nesiller boyunca doğal deniz suyunda kültürlü yosun bir diyet sürdürülür. D. gegenbaurilaboratuvar kültürleri kurmak için yeteneğiek olarak, biz toplama durumu, yosun konsantrasyonu, sıcaklık ve doğal olarak klimalı deniz suyuna maruz kalma tüm kültür için kritik olduğunu göstermektedir kurulması, büyüme, hayatta kalma ve D. gegenbauriüreme .

Introduction

Okyanustaki en büyük hayvan biyokütlesi için Zooplankton hesabı, deniz gıda ağları önemli bileşenleridir ve okyanus biyojeokimyasal döngüleri önemli roller oynamaktadır1,2. Zooplankton, organizmaların büyük bir çeşitlilik oluşan rağmen, brüt iki kategoriye ayrılabilir: birkaç ara taxa ile jelatinimsi ve jelatinsiz3,4. Jelatinimsi olmayan zooplankton ile karşılaştırıldığında, jelatinimsi zooplankton karmaşık yaşam geçmişleri nedeniyle çalışmak özellikle zordur5, ve onların hassas dokuları kolayca yakalama ve işleme sırasında zarar görür. Jelatinimsi zooplankton türleri, bu nedenle, laboratuvarda kültür üne sahip ve genellikle daha az jelatinimsi olmayantürler6 göre çalışılmıştır.

Jelatinimsi zooplankton grupları arasında, dünya okyanusunda bol ve ekolojik önemi olan thaliasyalılar vardır. Thaliaceans siparişleri Salpida, Pyrosomida ve Doliolida7içeren pelajik tunicates bir sınıfvardır. Doliolida, topluca doliolids olarak anılacaktır, subtropikal okyanusların üretken neritik bölgelerde yüksek bolluk ulaşabilirsiniz küçük varil şeklinde serbest yüzme pelajik organizmalardır. Doliolids tüm zooplankton gruplarının en bol arasındadır4,8. Süspansiyon besleyiciler olarak, doliolids filtre akımları oluşturarak ve mukus ağlarıonlarıyakalayarak su sütunundan gıda parçacıkları toplamak 9 . Taksonomtik olarak, doliolidler phylum Urochordata10'dasınıflandırılır. Koroata ataları ve deniz pelajik sistemlerinin temel bileşenleri olarak ekolojik önemine ek olarak, Thaliaceans sömürge yaşam tarihinin kökeni anlamak için önemi vardır10,11 ve evrim chordates5,7,10,12,13,14.

Doliolidlerin yaşam öyküsü karmaşıktır ve yaşam döngüleri boyunca onları kültürleme ve sürdürme nin zorluğuna katkıda bulunur. Doliolid yaşam döngüsü ve anatomi bir inceleme Godeaux ve ark15bulunabilir. Cinsel ve eşeysiz yaşam öyküsü aşamaları arasında zorunlu bir değişim içeren doliolid yaşam döngüsü Şekil1'de sunulmuştur. Yumurta ve sperm hermafrodit gonozooids tarafından üretilen, yaşam döngüsünün tek yalnız aşaması. Gonozooidler su sütununa sperm salgılar larvalara dönüşür ve yumurtalar içten döllenir ve larvaya dönüşür. Larvalar yumurtadan çıkar ve 1-2 mm'ye ulaşabilen oozooidlere metamorfoz. Oozooidler ventral stolonlarında eşeysiz tomurcuküretirler. Bu tomurcuklar stolonbırakın ve üç eşleştirilmiş satırlar halinde dize kadofor göç. Merkezi çift sıralar phorozooid, dıştaki iki çift sıra trophozooid olur. İkincisi hem hemşire ve phorozooids16,17gıda sağlar. Trophozooids o tüm iç organları kaybeder gibi beslenme ile hemşire kaynağı. Trophozooidlerin bolluğu arttıkça, hemşirenin büyüklüğü laboratuvarda 15 mm'ye ulaşabilir. Phorozooidler büyüdükçe, giderek planktonik av yutmak ve bireyler olarak serbest bırakılmadan önce boyutu ~ 1.5 mm ulaşmak17. Tek bir hemşire ömrü boyunca 100 phorozooids serbest bırakabilir18. Phorozooidler kadofordan salındıktan sonra büyümeye devam ederler ve yaşam döngüsünün ikinci sömürge evresiolurlar. Yaklaşık 5 mm boyutuna ulaştıklarında, her phorozooid ventral peduncle üzerinde bir küme gonozooid geliştirir. Bu gonozooidler ~ 1 mm uzunluğa ulaştıklarında parçacıkları yutabilirler. Gonozooidler ~ 2-3 mm boyutuna ulaştıktan sonra phorozooid serbest bırakılır ve yaşam döngüsünün tek yalnız aşaması haline gelir. Bir kez boyutu ~ 6 mm ulaşmak, gonozooids cinsel olgun17olur. Gonozooidler 9 mm veya daha uzunluğa ulaşabilirler. Gonozooidler hermafrodit, sperm aralıklı olarak serbest bırakılırken yumurtaların döllenmesi dahili olarak oluşur16,17. Gonozooid ≥ 6 mm boyutunda olduğunda, 6 döllenmiş yumurtaya kadar salgılar. Başarılı kültür, bu benzersiz yaşam öyküsü aşamalarının her birinin özel ihtiyaçlarını desteklemeyi gerektirir.

Doliolidler de dahil olmak üzere Thaliasyalıların ekolojik ve evrimsel önemi nedeniyle, bu organizmanın eşsiz biyolojisi, fizyolojisi, ekolojisi ve evrimsel tarihini anlamak için yetiştirme metodolojilerine ihtiyaç vardır19 . Doliolidler, gelişimbiyolojisi ve fonksiyonel genomik alanlarında deneysel model organizmalar olarak önemli bir vaatte bulunmaktadırlar çünkü şeffaftırlar ve muhtemelen genomları düzene sokmuşlar20,21. Ancak güvenilir yetiştirme yöntemlerinin eksikliği, laboratuvar modelleri olarak kullanışlılıklarını engellemez. Bir avuç laboratuvar kültürlü doliolidlere dayalı sonuçlar yayınlamış olsa da, bilgi yetiştirme yaklaşımlarımız ve ayrıntılı protokollerimiz daha önce yayınlanmamıştır. Deneyim yıl dayanarak, ve deneme yanılma yetiştirme girişimleri, Bu çalışmanın amacı deneyimleri gözden geçirmek ve doliolids toplama ve ekimi için protokolleri paylaşmak için, özellikle tür Dolioletta gegenbauri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. D. gegenbauri yetiştirme için kültür tesisleri hazırlanması

NOT: Gerekli tüm malzeme ve ekipmanlar MalzemeTablosu'nda listelenmiştir.

  1. 1 M Sodyum Hidroksit (NaOH), 0,06 M Potasyum Permanganat (KMnO4)çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi hazırlamak için 400 g NaOH'u 10 L deiyonize suya çözün. NaOH çözeltisine 100 g KMnO4 ekleyin ve iyice karıştırın.
  2. 100 g NaHSO 3'ü 10 L deiyonize suya eriterek 0,1 M Sodyum bisülfit (NaHSO3)çözeltisi hazırlayın ve iyice karıştırın.
    DİkKAT: Bu reaktifler solunduğunda solunum sorunlarına yol açabilecek tahriş edici maddelerdir. Duman kaputu gibi iyi havalandırılan bir alana yerleştirin. Herhangi bir cilt temasından kaçının. Kullanım sırasında koruyucu eldivenler, koruyucu giysiler, göz koruması ve yüz koruması giyin.
  3. Laboratuvarda doliolid kültürleri oluşturmadan ve yetiştirmeden önce kültür kavanozlarını temizleyin ve sterilize edin.
    1. 1.9 L ve 3.8 L kültür kavanozlarını deiyonize suyla en az 3 kez durulayın. Kapaklar aşağıdaki temizleme adımlarına dahil olmadığı için vida kapaklarının kurumasını bekleyin.
    2. 1.9 ve 3.8 L cam kültür kavanozlarını NaOH/KMnO4 çözeltisi içine daldırarak temizleyin ve sterilize edin. Kavanozlar bir gecede Emmek için izin verin.
    3. Kavanozları NaOH/KMnO4 çözeltisinden çıkarın ve kavanozları sodyum bisülfit (NaHSO3)çözeltisine batırın. Kavanozlar bir gecede Emmek için izin verin.
    4. NaHSO3 çözeltisinden kavanozları çıkarın ve deiyonize su yla iyice durulayın. Kavanozların kurumasını bekleyin.
  4. Plankton tekerleği (Şekil2)sıcaklık kontrollü bir alana (çevre odasına) yerleştirin. Sıcaklığı 20 °C'ye kadar dengeleyin. Özel plankton tekerleğinin daha ayrıntılı bir açıklaması için lütfen Ek Şekil1'e bakın.

2. Fitoplankton kültürü

  1. D. gegenbauriiçin gıda olarak kullanılmak üzere Ulusal Deniz Yosun ve Mikrobiyota Merkezi (NCMA) veya diğer kaynaklardan alg kültürleri edinin. Isochrysis galbana (CCMP 1323), Rhodomonas sp (CCMP 740) ve küçük bir diatom, Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) dahil olmak üzere iki kamçı türlerinin karışımları NCMA elde edilmiş ve önceki laboratuvarda kullanılmıştır arka doliolids için çalışmalar başarıyla17.
  2. NCMA tarafından önerilen L1 ve L1-Si büyüme ortamı 22'yi hazırlayın.
  3. Yeni alg kültürlerini başlatmak için tedarikçi tarafından verilen talimatları uygulayın.
  4. Stok kültürlerini korumak için, titiz axenik kültür tekniklerini kullanarak, steril 55 mL cam kültür tüplerinde her iki haftada bir 0,5 mL eski yaşlanma kültürünü 25 mL taze büyüme ortamına aktarın.
    NOT: Canlı alg kültürlerini düzenli olarak aktarmadan saklamak mümkün değildir. Kültürler uzun süre kullanılmayacaksa ve kullanılmama süresi boyunca kültürlerin korunması mümkün değilse, bu ortak alg kültürlerinin orijinal kaynaklarından (örneğin, NCMA) yeniden elde edilmesi önerilir.
  5. 200 mL büyüme ortamı içeren temiz 500 mL plastik doku kültürü şişelerinde doliolidlerin beslenmesi için daha büyük hacimlerde fitoplankton hazırlayın.
    1. Fitoplankton axenic stoklardan (4 mL) 200 mL büyüme ortamına (1:50 seyreltme) inoküle.
    2. 12:12 saat açık 20 °C'de kuluçka:65-85 μE/m2soğuk beyaz ışık aydınlatması altında karanlık döngü . Aydınlatmayı en üst düzeye çıkarmak için düz kültür şişeleri lay. Yavaşça günlük kültür girdap.
    3. Kültürlerin büyümesini izlemek için bir parçacık sayacı veya mikroskop kullanarak hücrelerin konsantrasyonu belirleyin.
      NOT: Aşılamadan itibaren 7-10 gün sonra kamçılama kültürleri ~105-106 hücre/mL ve diatom kültürü ~104-105 hücre/mL içerecektir. Bu konsantrasyonlar doliolid kültürleri korumak için yeterlidir.
    4. Tüm kültür faaliyetlerini desteklemek için yeterli alg biyokütle sağlamak için her iki haftada en az yeni beslenme stokları başlatın.

3. Kültür için yabani doliolidler ve deniz suyu koleksiyonu

NOT: Toplama ve yetiştirme yaklaşımlarına genel bir bakış Şekil3'te özetlenmiştir. Özel koleksiyon plankton net ve morina sonu açıklaması Şekil4'te verilmiştir.

  1. Plankton ağları veya yerinde görüntüleme sistemleri23kullanarak tespit ederek doliolidler bulun .
    NOT: Doliolidler yüzey sularında nadiren bulunduğundan ve uzaktan algılama teknolojisi yle tespit edilemediği için, doliolidler için uygun koşulların ön koşul bilgisi ile yönlendirilen (bkz. Tartışma), doliolidlerin varlığı belirlenmelidir örneklemeden önce.
  2. Bir D. gegenbauri kültürünü başlatmak için hazırlık canlı doliolids toplamadan önce parçacık açısından zengin deniz suyu toplamak.
    1. Doliolidlerin bulunduğu bölgeden ve klorofilin en yüksek tahminlerini içeren derinlikten su toplamak için CTD rozetine veya eşdeğer ekipmana monte edilmiş Niskin şişeleri yerinde florürler tarafından tahmin edilen bir konsantrasyonuyguluyor.
      NOT: Klorofil konsantrasyonu parçacık konsantrasyonlarının bir göstergesi olarak kullanılır. Güney Atlantik Bight (SAB) orta kıta sahanlığı, yeraltı klorofil maksimum genellikle alt yakın, ama diğer yerlerde, olmayabilir.
  3. Doliolidler bulunduğunda, özel plankton ağı ve morina ucu kullanarak hasarsız doliolid zooidleri kurtarın. Ağı dağıtmadan önce, morina ucunu deniz suyuyla doldurun.
    1. Sürüklenen bir gemiden, ~15 - 25° eğik çekme açısı nı ve 15 m/dk'dan fazla olmayan dikey dağıtım ve alma hızını koruyarak su sütunundan ağı indirin ve kaldırın.
  4. Net gemiye bir kez, yavaşça aktarmak ve morina-uç içeriğini bölmek 3, 5 galon (~ 20 L) plastik kova her içeren ~ 10 L yüzey deniz suyu siteden toplanan.
    NOT: Yeni plastik kovalar doliolid toplama yaşayan önce deniz suyu gün eklenmesi ile koşullandırılmış olmalıdır. Amaç plastikten kimyasalların leaching azaltmaktır. Deniz suyu yoksa, kovaları koşullandırmak için saflaştırılmış (örneğin, Milli Q) veya zehirli kirletici içermeyen musluk suyu kullanın.
  5. Doliolid zooidleri diğer planktonlardan ayırın.
    1. Küçük gruplar halinde (~ 2 L) net çekme içeriğinden (şimdi 20 L plastik kova) 2 L cam kabına karışık planktonları aktarın.
    2. Geniş delikli cam pipet (8 mm ID x 38 cm uzunluğunda) kullanarak, doliolidlerin bulunduğu yerden Niskin şişeleri kullanılarak toplanan parçacık açısından zengin deniz suyu içeren temiz cam kültür kavanozlarına beistediğimden aktif olarak yüzen doliolid zooidleri dikkatlice sifonlayıp aktarın Yer almaktadır.
    3. Deniz suyunun yüzeyinin altındaki doliolid zooidleri yavaşça serbest bırakın.
      NOT: Gonozooidler, bağlı gelişen gonozooidler içeren phorozooidler ve ekli tropozooidiçeren hemşire aşamaları toplamak (Şekil 1).
  6. Doliolidlerin eklenmesinden sonra, 3,8 L kavanozda ~ 5 x 103 – 104 hücre/mL (~ 5x 104 – 1 x 105 hücre/mL içeren bir kültürün ~50 mL'si) son konsantrasyonuna Rhodomonas sp. kültürünü ekleyin. Bu doliolids aktif beslenen olup olmadığını belirlemek içindir. Doliolids yutmak Rhodomonas sp. ,onların sindirim sistemi renk kırmızı görünecektir. Beslenme gibi görünmeyen zooidleri çıkarın.
  7. Doliolidlerin hava-su arabiriminde mahsur kalmalarını önlemek için, kavanozları filtrelenmemiş parçacık açısından zengin deniz suyuyla doldurarak ve kavanozun üzerine (89 mm genişliğinde) plastik bir sargı yerleştirerek kültür kavanozlarında boşluktan kaçının.
    1. Aynı zamanda hayvanlara zarar verebilir hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Kapağı kavanoza dikkatlice vidalayın ve kabarcıkların mevcut olup olmadığını belirlemek için kavanozu hafifçe ters çevirin. Kabarcıklar varsa, bunları kaldırın.
    2. Kavanozlar dolduktan sonra, kavanozun dışından fazla suyu silin.
  8. Her kavanozu, kauçuk borularla kaplıdikey metal çubuklara ve paslanmaz çelik hortum kelepçesinin arasına yerleştirerek plankton tekerleğine (Şekil 2) monte edin.
    1. Kavanozun arka sının kauçuk boruya karşı yastıklı olduğundan emin olun. Vidayı ayarlayarak kavanozun etrafındaki hortum kelepçesini sıkın.
    2. Güvenli bir şekilde sabitlendikten sonra kavanozun hareket etmediğini kontrol edin. Doliolidleri süspansiyonda tutmak için kavanozların 0.3 rpm'de dönmesine izin verin.
      DİkKAT: Kavanozun çatlamasını önlemek için kavanozu aşırı sıkmamak önemlidir.
  9. Gemide, plankton tekerleğindeki kültür gemilerini 20 °C'de, laboratuvar kültür tesisine aktarılana kadar loş ışıkta muhafaza edin.
  10. Laboratuvara döndükten sonra, doliolid içeren kavanozları hazırlanan kültür tesisine aktarın. Plankton tekerleğindeki kavanozları monte edin (bkz. adım 3.8) ve kavanozların 0,3 rpm'de dönmeye devam etmesine izin verin.
    NOT: Bu çalışmada doliolidlerin tüm yetiştirmesi 20 °C'de yapılmıştır.

4. D. gegenbauri kültürlerin korunması

  1. Gemiden laboratuvara, hayvanların orijinal kavanozlarda 3 gün boyunca laboratuvar koşullarına alışmalarına izin verin.
    1. Alışma süresi boyunca, 3 gün boyunca her gün toplama alanından filtrelenmemiş partikül açısından zengin deniz suyu ile suyun% 10 değişimi için geniş bir delik cam pipet kullanın.
    2. Kavanozda birkaç copepods tutun ama diğer tüm zooplankton, büyük dışkı pelet ve doliolid filtreleme cihazı (mukus net) tıkanabilir büyük toplu parçacıklar kaldırın. Kültür erken hemşirelerden oluşuyorsa, kavanozda büyük bir gonozooid (≥ 6 mm) bulundurun.
      NOT: Hangi kopepod türlerinin kültüre dahil olduğu önemli değildir, ancak bu deneyde doliolidlerin ele geçirildiği yerden en bol bulunan türler kullanılmıştır.
  2. Alışma süresini takiben, doliolid zooidleri ve koppodları orijinal kavanozdan %80 cam elyaf filtresi (GF/F) içeren temiz bir yetiştirme kavanozuna, deniz suyunun %20'sini ve deniz suyunun %20'sini orijinal kavanozdan aktarın. 0,7 μm filtre kağıdı nominal gözenek boyutuile bir GF / F ile deniz suyu filtreleyerek filtrelenmiş deniz suyu hazırlayın.
  3. Her 3 günde bir GF/F filtrelenmiş deniz suyu ile suyun %10'u ile suyu değiştirerek ve agregaları ve dışkı peletlerini çıkararak yeni kültürü koruyun. Haftalık, adım 4.2 açıklandığı gibi yeni bir kavanoza hayvan transferi.
  4. 40 - 95 μg C/L arasındaki kültür kavanozlarında fitoplankton konsantrasyonlarını koruyarak doliolidleri besleyin.
    NOT: Bu konsantrasyonlar D. gegenbauri17için çiçek lenme koşullarını desteklediği bilinen çevre koşullarını taklit eder. Alg türlerinin karışımı yaşam evrelerine ve her kavanozdaki zooid sayısına bağlı olarak değişir. Erken yaşam aşamalarında, sadece cryptomonad yosun(Isochrysis galbana ve Rhodomonas sp.) 1:1 karışımı (karbon içeriği ile) ekleyin. Daha büyük av türleri kolayca küçük hemşirelerin beslenme cihazları tıkanabilir ve trophozooidler gelişmekte. Daha büyük hemşireleri, phorozooidleri ve gonozooidleri beslerken eşit karbon içeriğinde olan alg karışımına diatom Thalassiosira weissflogii ekleyin.
    1. Kültürlere ne sıklıkta ve ne kadar alg ekleyeceğiniz kararını yönlendirmek için beslenme öncesi ve sonrası alg konsantrasyonlarını izleyin. Kültür kavanozlarında alg konsantrasyonları nispeten seyreltik olduğundan, alg konsantrasyonları belirlemek için bir parçacık sayacı kullanın.
  5. Kalan doliolidlerin büyümek için yeterli gıdaya sahip olması için 40 – 95 gC/L alg konsantrasyonlarını korumak için yeterli zooidleri çıkarın.
    NOT: Laboratuvar koşullarında başarılı bir şekilde sürdürülmesi en zor yaşam evresi gelişen larvalar ve oozooid (erken hemşire) dir. Kültürün bu evresinde, larva ve oozooid (3,8 L kavanozda~ 20) gelişmekte olan kavanozdaki birkaç kopepoda ek olarak bir büyük gonozooid (≥ 6 mm) bulundurun.
  6. Hemşirenin kadoforsunda en az 8 trophozooid bir kez en az 4 hemşirenin yeni bir külleyici kavanoza aktarılması (Şekil1B).
    NOT: Trophozooids 20 °C'de her 1 - 2 günde bir iki katına çıkar. Trophozooidler çıplak gözle görülebilecek kadar büyüktür.
    1. Hemşireler 20 trophozooid geliştirince iki hemşireyi çıkarın.
    2. Hemşireler kendi cadophores > 30 trophozooids geliştirmek zaman bir hemşire çıkarın. Kalan hemşirenin kadoforda phorozooidler geliştirmesine izin verin.
    3. Hemşire 30 phorozooids kadar bültenleri kez hemşire çıkarın.
  7. Phorozooidler 3 mm boyutuna ulaştıktan sonra kavanozdaki hayvan sayısını azaltın.
    1. Phorozooidler büyüdüklerinde (> 5 mm) ve gonozooid kümeleri geliştiğinde dört phorozooid hariç tüm phorozooidleri çıkarın.
    2. Gonozooid kümelerinin sayısı arttığında ve beslenmeye başladığında kültürü iki phorozooidye indirin.
    3. Phorozooidler 30 gonozooid salgıladıktan sonra phorozooidleri çıkarın.
  8. Kavanoz başına 30 zooidden 2'ye gonozooid sayısını azaltın. Döllenmiş yumurtaların kavanoza salınmasına izin verin.
    1. Oozooidler geliştikten sonra kavanozda tek bir gonozooid bırakarak bir gonozooid çıkarın.
      NOT: Atılan hemşireler, phorozooidler ve gonozooidler ek kültürleri tohumlamak ve daha fazla deney yapmak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Doliolidin toplanması ve kültüre alınış için açıklanan prosedürleri takiben, Şekil 3'te özetlenen D. gegenbauri , karmaşık yaşam tarihi boyunca D. gegenbauri kültürünü korumak mümkündür (Şekil 1) ve birçok nesiller için sürdürmek. Burada D. gegenbauri yetiştiriciliği tanımlansa da, bu prosedürler diğer doliolid türlerinin yetiştirilmesi için de geçerli olmalıdır.

Sağlıklı ve hasarsız doliolid zooidlerin yakalanması için özel ağlar ve çekme prosedürleri uygulanması gerekmektedir (Şekil 4). Sert yapıları olmayan hassas hayvanlar olarak, herhangi bir fiziksel hasara yol açabilecek prosedürleri en aza indirmeye özen verilmelidir. Bu faktörler türbülans, basınç ve net, hava ve hava kabarcıkları da dahil olmak üzere yüzeylerile etkileşimleri içerebilir. Hassas doğasına rağmen, hasarsız doliolid zooidler, açılış çapı 1:5'e kadar olan konik plankton ağı kullanılarak toplanabilir ve nispeten büyük ağırlıklı filtrelenmemiş morina ucu ile donatılmıştır. Rutin olarak döner kayışa monte edilmiş ve 4 L ağırlıklı filtrelemesiz morina ucu ile donatılmış 0,5 m açıklıklı 202 m mesh 2,5 m (uzunluk) plankton ağı kullandık (Şekil4). Yetiştirilebilir D. gegenbauri zooids yakalama üzerinde plankton örgü boyutu etkisi sistematik olarak araştırılmış olmasa da, teorik olarak, daha büyük bir örgü boyutu ile bir ağ kullanımı daha büyük örgü boyutu olarak daha fazla iyileşmeneden olabilir çekme sırasında oluşan basınç alanını azaltın. Alternatif olarak, daha fazla örgü boyutu ağ üzerinden daha fazla su akışı neden olacak, potansiyel doliolid zooids zarar. Çekme hızları ve net açı, toplama sırasında çekme süresini ve hasarı en aza indirmek için optimize edilmelidir. Deneyimlerimize göre, 15 m/dk'dan büyük olmayan dikey dağıtım ve alma hızlarına sahip sürüklenen bir gemiden 15-25° bir açıyla net eğik olarak çekilerek yeterince nazik çekme koşulları sağlanabilir bulduk. Ağı su akışı yönüne yönlendirmek için plankton ağı döner bir koşuma monte edilir. Genellikle su sütunundaki doliolidlerin dağılımının rastgele olmadığı ve genellikle en yüksek partikül yüklerinin bulunduğu bölgede en büyük olduğu durumdur24. Bu nedenle, yeraltı klorofil maksimum altından yüzeye su sütunu örneklenmelidir. Sığ SAB orta kıta sahanlığı (20 - 45 m), yüzeye ~ 1 m yukarıdasu sütunu örneklenir.

Sağlıklı zooidler toplandıktan sonra, yüzeylere maruz kalma en aza indirecek şekilde korumak için önemlidir. Yüzeylerle karşılaşmaları en aza indirmek için doliolidler deniz suyu yla dolu yuvarlak kavanozlarda tutulur ve yavaşçayavaş dönen plankton tekerleğinde yuvarlanır (Şekil 2).

Her ne kadar teorik olarak herhangi bir yaşam evresinin zooidleri ile bir kültür başlatmak mümkün olsa da, 2015 - 2018 yılları arasında Güney Atlantik Bight'inde 6 denemeden d. gegenbauri'nin yeni kültürlerinin kurulmasında başarı ve başarısızlıkların araştırılması başarının ve başarısızlıkların araştırılması başarının zooidler < 21°C olan sulardan toplandığında ve büyük olgun gonozooidler dışındaki yaşam evreleri yeni bir kültür başlatmak için kullanıldıklarında en sık elde edilir (Tablo1 ve Tablo 2). Uygulamada, yeni bir kültür başlatırken doliolid zooidlerin birden fazla yaşam evresini dahil etmek yararlı dır, ya da en azından zararlı değildir.

D. gegenbauribir kültür sürdürmek başarı , diğer pelajik tunicate türleri için açıklandığı gibi20, yeterli sağlanmasına bağlıdır, ama aşırı değil, gıda ve gıda çeşitliliği her yaşam aşamasını desteklemek için gerekli. Diyet gereksinimleri yaşam döngüsü boyunca değiştiğinden, her beslenme zamanında sağlanan yosun miktarı, gıda konsantrasyonlarını istenilen hedef seviyelerde tutmak için farklılık göstermelidir(40 – 95°G C/L) (Tablo 3). Bu seviyelerin üzerindeki veya altındaki konsantrasyonlar mortalite oranlarının artmasına neden olabilir (G.A. Paffenhöfer pers.comm.). D. gegenbauri doğal diyet kötüanlaşılmış6 kalır rağmen , kültürler kültürlü yosun nispeten basit karışımları temin ve çeşitli mikrobiyal topluluklar kurmak için izin prosedürleri kullanılarak muhafaza edilebilir kültür. Av alanının potansiyel çeşitliliğinin artırılması, eski kültürlerden gelen parçacık yüklü suyun bir kısmının korunması ve her su değişimi veya transferine az sayıda canlı kopepod ve büyük doliolidin eklenmesiyle elde edilir. Muhtemelen, bu organizmalar yosun ve zararlı malzeme işleme ve doliolid beslenme için mevcut parçacık boyutu ve kalite spektrumu çeşitlendirmek için hizmet, ancak ek çalışmalar bu hipotezi doğrulamak için gereklidir.

Doliolid kültürlerin kullanılabilirliği, kontrollü deneysel koşullar altında doliolid biyoloji, fizyoloji, ekoloji ve moleküler biyolojinin birçok önemli yönünü araştırmak için araçlar sağlar. Örneğin, doliolids kıyı okyanusunun çok sayıda bölgede bol olmasına rağmen ve büyük planktonik otlatıcılar25, besleme ve büyüme oranları verileri kıt kalır26. D. gegenbaurikültürleri kullanarak , kültür tabanlı araştırma nın odak noktası sıcaklık ve gıda konsantrasyonları 26 dahil olmaküzere kritik çevresel parametrelere yanıt olarak beslenme ve büyüme oranlarını ölçmek olmuştur. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar, temizleme oranlarının 20 ila 60°C/L arasındaki konsantrasyonlarda benzer olduğunu ve gıda konsantrasyonları arttıkça azaldığını göstermiştir (Şekil5A). Temizleme oranları D. gegenbauri büyümesini destekleyen sıcaklık aralıkları üzerinde orantılı olarak artar (Şekil5B). Büyüme oranları (k) sıcaklık ve gıda kullanılabilirliğinin bir fonksiyonu olarak 0,1 - 0,7/gün arasında değişmektedir (Şekil6). Bu çalışmalar, kültür için pratik bilgi sağlamanın yanı sıra, çevresel parametrelerin bir fonksiyonu olarak doliolid besleme ve büyüme oranları arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesine olanak sağlamış ve modelleme çerçeveleri içine bu önemli zooplankton grup dahil etmek için gerekli doliolids biyoloji ve ekoloji27.

Figure 1
Şekil 1: Yaşam döngüsü D. 20 °C'de gegenbauri.
Yaşam döngüsü çizimi (1A) Walters ve ark. 2018 6'dan sonra değiştirilmiş ve izin alınarak yeniden çizilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Kültüre alışkın plankton tekerleği D. gegenbauri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Şematik genel bakış D. gegenbauri toplama ve yetiştirme yaklaşımı.
Denizde toplama(A), küçük gruplar halinde küçük cam kabına konsantre kovalardan transfer (B ), parçacık açısından zengin deniz suyu içeren tarım kavanozlarına doliolid zooidlerin izolasyonu (C ), plankton tekerleğinde bakım yaşam döngüsü boyunca (D,E). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Plankton net ve dağıtım.
Dağıtım (sol üst), alma (sağ üst) ve net ve morina sonu şeması (altta). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Alg temizleme oranları D. gegenbauri gonozooids.
(A) (A) Ortalama (± S.E.) açıklık oranları (mL/zooid/gün) ile fitoplankton konsantrasyonu (μg C/L) arasındaki ilişki d. gegenbauri gonozooidlerin üç boyutu için. Her nokta 4-11 gözlemleri temsil eder. (B) Ortalama (± S.E.) açıklık oranları (mL/zooid/gün) karşı sıcaklık (°C) üç boy D. gegenbauri gonozooids için. Her nokta 4-12 gözlemi temsil eder. Gonozooids boyutları 2,5 mmblack circle(), 4,5 mm (),gray circlewhite circleve 6,5 mm (). Rakamlar izin 26 ileyeniden çizilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Büyüme oranları D. gegenbauri gonozooid.
(A) Ortalama (± S.E.) büyüme oranları (k) ile fitoplankton konsantrasyonu (μg C/L) arasındaki ilişki Dolioletta gegenbauri gonozooidlerin üç boyutu içindir. Her nokta 4-11 gözlemleri temsil eder. (B) Dolioletta gegenbauri gonozooids üç boyutları için ortalama (± S.E.) büyüme oranları (k) karşı sıcaklık (°C). Her nokta 4-12 gözlemi temsil eder. Gonozooids boyutları 2,5 mmblack circle(), 4,5 mm (),gray circlewhite circleve 6,5 mm (). Rakamlar Gibson ve Paffenhöfer26izni ile yeniden çizilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Oşinografik Koşullar ve Doliolid Bolluğu
Yüzey Alt Yüzey Alt Yüzey Alt Doliolid Bolluğu
Tarih Cruise Kimliği Enlem (N) Boylam (W) Derinlik (m) Sıcaklık (C) Sıcaklık (C) Tuzluluk (PSU) Tuzluluk (PSU) Chla (3g/L) Chla (3g/L) zooids/m3
20/05/2015 SAV-15-10 31.1889 80.1527 41.30 25.26 22.43 33.58 36.96 Na 0.20 Na
04/08/2015 SAV-15-19 29.5687 80.3269 40.00 26.40 21.75 36.26 36.32 1.04 1.35 218
02/12/2015 SAV-15-31 31.1674 80.1249 40.80 23.24 22.60 35.91 35.81 1.06 1.70 13
02/02/2017 SAV-17-03 31.2139 80.1823 41.00 18.72 18.84 36.00 36.12 0.83 1.50 3
07/11/2017 SAV-17-23 31.2144 80.1822 42.00 24.19 23.85 36.00 36.04 0.63 1.30 254
01/02/2018 SAV-18-02 31.1835 80.1466 43.00 16.85 16.45 36.50 36.48 0.56 0.89 Na
NA: veri Mevcut değil

Tablo 1: Güney Atlantik Bight orta kıta sahanlığında oşinografik koşullar ve doliolid bolluğu D. gegenbauri zooidler toplandı ve yeni kültürleri başlatmak için kullanıldı.

Tablo 2. D. gegenbauri Culturing Girişimleri sonuçları
Tarih Cruise Kimliği Zooidler Toplandı Sonuç Yorum
20/05/2015 SAV-15-10 Cinsel olgun büyük (6-7 mm) gonozooids Başarısız Tüm gonozooidler 4 gün sonra ölmüştü. Oozooid ve erken hemşire yaşam aşamaları üretildi ama gelişmek için başarısız oldu.
04/08/2015 SAV-15-19 Cinsel olgun büyük (8-10 mm) gonozooids Başarısız Gonozooidler koleksiyondan kısa bir süre sonra öldüler. Oozooidler ve erken hemşireler üretildi ama başarılı olamadılar.
02/12/2015 SAV-15-31 Bağlı tropozooidler, cinsel olgun büyük (6 mm) gonozooidler ve oozooidler (2 mm) ile geç hemşire (4-5 mm) dahil karışık toplama Başarılı Ocak ve Mart 2016'da toplanan ek gonozooid ler ve hemşireler kültüre eklendi. Ekim 2016'daki Matthew Kasırgası sırasında laboratuvar 4 gün boyunca boşaltıldı ve kültür ayakta kalmadı.
02/02/2017 SAV-17-03 Gonozooidler (1,5-5 mm) ve büyük phorozooidler (6 mm) ekli gonozooid kümeleri içeren karma koleksiyon Başarılı 4 tam nesil kültüre, Nisan 2017'de toplanan ek gonozooidler kültüre eklendi. Eylül 2017'de Irma Kasırgası öncesinde kültür sonlandırıldı.
07/11/2017 SAV-17-23 Gonozooidler (3-6 mm) Başarısız Büyük gonozooid 1 gün sonra öldü. Olgunlaşmamış gonozooid kültürde 14 gün hayatta kaldı. Yumurtalar her iki gonozooid tarafından serbest bırakıldı. Oozooidler üretildi ama hemşire aşamalarına dönüşemedi. Kültür 1 ay sonra başarısız oldu.
01/02/2018 SAV-18-02 Tropozooids olmadan büyük (6-7 mm) geç hemşire Başarılı Kültürde hemşire trophozooids üretti. Kültür 3 nesil boyunca sürdürüldü ve deneylerin sonuçlandırılmasıyla Haziran 2018 sonunda sonlandırıldı.

Tablo 2: Laboratuvar kültürlerini oluşturma girişimlerinin sonucu D. gegenbauri Güney Atlantik Bight orta kıta sahanlığı ndan toplandı.

Dolioletta gegenbauri zooid sayısı başına zooid sayısı başına
yaşam evresi 3.9 L kavanoz 1.9 L kavanoz Isochrysis galbana Rhodomonas sp. Thalassiosira weissflogii
oozooid 20 10 Içerir Içerir İçERMEYYY
erken hemşire 20 10 Içerir Içerir İçERMEYYY
8 trophozooids ile geç hemşire 4 2 Içerir Içerir Içerir
20 trophozooids ile geç hemşire 2 1 Içerir Içerir Içerir
30 trophozooids ile geç hemşire 1 1 Içerir Içerir Içerir
phorozooid (1 - 3 mm) 30 15 Içerir Içerir Içerir
phorozooid gonozooid kümesi (> 5 mm) 2 1 Içerir Içerir Içerir
gonozooid (1 - 3 mm) 30 15 Içerir Içerir Içerir
gonozooid (> 5 mm) 2 1 Içerir Içerir Içerir
Alglerin hedef konsantrasyonları her alg türünün eşit karışımları (karbon içeriğine göre) 40 - 95°G C/L arasında tutulmalıdır.

Tablo 3: Her biri için hedef kültür koşulları D. gegenbauri yaşam döngüsü evresi.

Ek Şekil 1: Özel plankton tekerleğinin ayrıntılı açıklaması. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kültür doliolids kapasitesi son birkaç on yıl içinde kurulmuş ve çeşitli alanlarda araştırma desteklemek için kullanılmıştır. Laboratuvarlarımızda yapılan deneysel çalışmalar, beslenme ve büyümeye odaklanan en az 15 bilimsel çalışmanın yayınlanmasını desteklemiş18,26, üreme18,28, diyet6, 29, fizyoloji30, ekoloji31, ve ekolojik modelleme27 doliolids.

Bu hassas hayvanların kültürü şu anda emek yoğun ve zaman alıcı olmasına rağmen, doliolidlerin yetiştirilmesi mümkündür ve daha geniş bir toplum tarafından üstlenilen bu ekolojik ve anlayış ilerlemesini teşvik edecektir evrimsel açıdan önemli bir hayvan grubudur. Bu çalışmanın amacı, d. gegenbauri'nin laboratuvar temelli çalışmalar yapmak amacıyla kültürde toplanması, yetiştirilmesi ve sürdürülmesi ne yönelik güncel yaklaşımları tanımlamaktır.

Doliolid bir kültürün kurulması, sağlıklı ve zarar görmemiş hayvanların toplanmasını ve bir kez yakalandığında nazik bir tedavi, uygun beslenme ve yetiştiriciliği gerektirir. Doliolids, özellikle tür D. gegenbauri, subtropikal kıta raflarında circumglobal oluşur ama bolluk son derece değişken olabilir. Örneğin, yakın zamanda yapılan bir çalışmada SAB'nin orta raf bölgesine odaklanmış, bolluk <1/m 3'ten > 20.000/m3'ekadar önemli ölçüde farklılık göstermesine rağmen, doliolidleryılboyunca 6 . Uzay ve zaman daki doliolidlerin yüksek değişkenliği ve kıta sahanlığı kenar ortamlarının örneklemesinde yer alan göreceli zorluk nedeniyle, çalışmaların yürütüldüğü doliolid toplum dinamikleri hakkında güvenilir bilgi önemli bir kültürün başarılı bir şekilde kurulmasıiçin ön koşul.

Doliolid zooidler bulunup yakalandıktan sonra hayvanların zarar görüp görmediğini belirlemek zor olabilir. Hayvanlar hasarsız gibi görünebilir ve aktif yüzme ve kaçış davranışları sergilerler, ancak en küçük yaralanmalar bile gelişmemelerine neden olabilir. Özellikle yakalanan doliolid zooidlerin sağlık değerlendirmesi ile ilgili bir özelliği beslenme yeteneğidir. Beslenme aktivitesi sadece taze yakalanan hayvanlara pigmentli alg sağlayarak değerlendirilebilir. Bir hayvan besleniyorsa, bağırsak kısa bir süre içinde renklenir. Deneyimlerimize göre, kırmızı pigmentli yosun küçük bir miktar ekleyerek bulduk, Rhodomonas sp., hızlı bir şekilde beslenme aktivitesi hakkında bilgi sağlar. Beslenme gözlenmezise, bir kültürün kurulması pek olası değildir.

Uyanıklık ve iyi hayvancılık, karmaşık yaşam döngüleri boyunca doliolidlerin kurulması ve sürdürülmesi için çok önemlidir. Belki de en sorunlu aşaması larva aşamasından canlı bir hemşire gelişimi ve üretim (filizlenme) besleme trophoozoids. Bu yaşam aşamasında, miktar, kalite ve parçacık boyutu açısından gıda gereksinimlerinin en sınırlı olduğunu tahmin ediyoruz. Bilgimiz için, D. gegenbauri larvaları ve oozooidlerin beslenme aktivitesini araştıran daha önce yapılan çalışmalar da olmamıştır. Örneğin, gelişmekte olan gonozooidler ve phorozooidler çok çeşitli boyutlarda parçacıkları yutabilseler de, larvaların, oozooidlerin ve küçük hemşirelerin kapasitesi büyük olasılıkla daha sınırlıdır. Uygulamada, bu yaşam evrelerinde başarılı ekimin alg gıda karışımından diatomlar atlayarak, gıda konsantrasyonlarını orta seviyelerde koruyarak, daha düşük konsantrasyonlarda sık sık beslenme ler yaparak, tek büyük gonozooid ve kültür ile birkaç koppods, ve el ile döküntü büyük agregalar kaldırarak.

D. gegenbauri kültürlerini tek bir koleksiyondan kaynaklanan birden fazla nesil boyunca korumuş olsak da, mümkün olduğunda genetik çeşitliliği ve sağlamlığı artırmak için mevcut kültürleri düzenli olarak taze toplanan hayvanlarla tamamlıyoruz. kültürün. Bu uygulamanın potansiyel bir tehlike kültüre parazit veya hastalıkların giriş, ama bizim bilgi, biz bu sorunla hiç karşılaşmadık. Doliolids32parazitler birkaç rapor olmasına rağmen , hiç şüphesiz, onlar var. İlginçtir, alan yakalanan D. gegenbauri gonozooids ile doğal sulara maruz kültürlü D. gegenbauri gonozooids diyet karşılaştıran yeni bir çalışmada, varsayımsal Apicomplexa parazitler vardı vahşi popülasyonda tespit edildi kültürlü hayvanlar6yok .

Açıklanan kültür teknolojisinin mevcut bir sınırlama zooid üretim hacminin sınırlamasıdır. Özellikle açıklanan teknikler, dönen plankton tekerleğinde düşük yoğunluklarda kapalı kavanozlarda ekimi içerdiğinden, bu yaklaşımın ölçeklendirilip ölçeklendirilemediği veya iş akışının otomasyona uygun olup olmadığı belirsizdir. Daha büyük ölçekli yetiştirme sistemleri, ancak, başka bir hassas küçük jelatinli deniz zooplankton türleri için, larvacean Oikopleura dioica, tarif edilmiştir20,33,34, olabilir düşündüren gelecekte doliolidler için benzer sistemler tasarlamak mümkün olacaktır. Ancak, D. gegenbauri'nin o dioica'nın daha basit yaşam öyküsüne kıyasla karmaşık yaşam öyküsü büyük ölçekli tarımiçin önemli bir sorun olmaya devam edecektir.

Sonuç olarak, burada açıklanan protokolleri izleyerek, D. gegenbauri karmaşık yaşam geçmişi boyunca kontrollü laboratuvar koşulları altında güvenilir bir şekilde yetiştirilebilir. Bu kapasite, türleri çeşitli kontrollü deneysel çalışmalara uygun hale getirir ve belki de gelişim biyolojisi ve evriminde yeni bir hayvan modeli olarak doliolidler geliştirmeyi sağlar. Ancak bu hedefe ulaşılabilmek için üretim ölçeğinin sınırlamalarının aşılması gerekecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların beyan etmek için hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

G.-A. dahil olmak üzere bu projeye yıllar içinde bilgi birikimine katkıda bulunan birçok kişiye müteşekkiriz. Paffenhöfer ve D. Deibel bu protokolleri ilk olarak geliştirmişlerdir. Mösyö Köster ve L. Lamboley de bu prosedürlerin geliştirilmesine önemli ölçüde katkıda bulunmuştur.  N.B. López-Figueroa ve Á.E. Rodríguez-Santiago Tablo 1'de sağlanan doliolid bolluğu tahminlerini ürettiler. Bu çalışma kısmen ABD Ulusal Bilim Vakfı ödülleri OCE 082599, 1031263 MEF, ortak projeler OCE 1459293 ve OCE 14595010 MEF ve DMG ve Ulusal Okyanus ve Atmosfer İdaresi ödülü NA16SEC4810007 DMG tarafından desteklenmiştir. R/V Savannah'nın çalışkan ve profesyonel ekibine minnettarız. Lee Ann DeLeo rakamlar hazırlanan, Charles Y. Robertson kanıtı el yazması ve, James (Jimmy) Williams plankton tekerlek üretti

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) Any NA For algal cultures
Autoclave Any NA For sterilizing equipment and seawater for algal cultures
Beakers (2 L glass) Any NA For sorting diluted plankton net tow contents
Buckets (5 gallon, ~20L) Any NA For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use
Carboys (20 L)  Any NA For storing seawater
Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) Qorpak GLC-01882 Container for culture
Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) Qorpak GLC-01858 Container for culture
Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) Any NA To accommodate plankton wheel and culture maintenance
Filtration apparatus for 47 mm filters Any NA For filtering seawater for cultures
Glass microfiber filters, 47 mm Whatman 1825-047 For filtering seawater for cultures
Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) Science Company NC-10894 Custom cut and edges polished
Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) Any NA For holding culturing jars to the plankton wheel
Isochrysis galbana strain CCMP1323 National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) strain CCMP1323 For feeding doliolid cultures
L1 Media Kit, 50 L National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) MKL150L For culturing algae
Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) Any NA For illuminating doliolids in the jars and beakers
Lighted temperature controlled incubator Any NA For algal cultures
Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) Any NA For algal cultures
Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and  4 L aquarium cod-end Sea-Gear Corporation 90-50x5-200-4A/BB For collecting living doliolids (see Figure 4)
Plankton Wheel NA NA Custom built (see Figure 2)
Plastic wrap Any NA To cover inside of lid of doliolid culture jars
Potassium Permanganate Fisher Scientific P279-500 Reagent for cleaning jars and glassware
Rhodomonas sp. strain CCMP740 National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) strain CCMP740 For feeding doliolid cultures
Rubber Tubing NA NA For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing)
Sodium Bisulfite Fisher Scientific S654-500 Reagent for cleaning jars and glassware
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-212 Reagent for cleaning jars and glassware
Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) Any NA For algal cultures
Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) strain CCMP1051 For feeding doliolid cultures
Tissue culture flasks (250 mL) Any NA For algal cultures

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
  2. Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
  3. Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
  4. Kiorboe, T. Zooplankton body composition. Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).
  5. Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).
  6. Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
  7. Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
  8. Acuña, J. L. Pelagic tunicates: Why gelatinous? American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).
  9. Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
  10. Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
  11. Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
  12. Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
  13. Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
  14. Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. A molecular phylogeny of the Thaliacea. Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).
  15. Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
  16. Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
  17. Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
  18. Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
  19. Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
  20. Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
  21. Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
  22. Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
  23. Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
  24. Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
  25. Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
  26. Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
  27. Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
  28. Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
  29. Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
  30. Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
  31. Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
  32. Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
  33. Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
  34. Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).

Tags

Çevre Bilimleri Sayı 150 Doliolid Kültür Yosun Deniz Kıta Sahanlığı Büyüme Laboratuvar Koleksiyon
Deneysel Çalışmalar için Deniz Pelajik Tunicate <em>Dolioletta gegenbauri</em> (Uljanin 1884) Yetiştiriciliği
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walters, T. L., Gibson, D. M.,… More

Walters, T. L., Gibson, D. M., Frischer, M. E. Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies. J. Vis. Exp. (150), e59832, doi:10.3791/59832 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter