Summary
Doliolids, inkludert arten Dolioletta gegenbauri, er små geléaktige Marine dyreplankton av økologisk betydning funnet på produktive subcontinental hylle systemer over hele verden. Vanskeligheten med å dyrking disse delikate organismer begrenser etterforskningen. I denne studien beskriver vi dyrking tilnærminger for innsamling, oppdrett og vedlikehold av doliolid Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Geléaktige zooplanktons spiller en avgjørende rolle i havet økosystemer. Imidlertid er det generelt vanskelig å undersøke deres fysiologi, vekst, fekunditet, og trofiske interaksjoner hovedsakelig på grunn av metodisk utfordringer, inkludert muligheten til å kultur dem. Dette gjelder spesielt for doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri vanligvis forekommer i produktive subtropiske kontinentalsokkel systemer over hele verden, ofte i blomst konsentrasjoner i stand til å konsumere en stor brøkdel av daglig primærproduksjon. I denne studien beskriver vi dyrking tilnærminger for innsamling, oppdrett og vedlikehold D. gegenbauri for det formål å gjennomføre laboratorie-baserte studier. D. gegenbauri og andre doliolid arter kan fanges Live ved hjelp av skrått tauet koniske 202 μm mesh plankton garn fra et drivende skip. Kulturer er mest pålitelig etablert når vanntemperaturer er under 21 ° c og er startet fra umodne gonozooids, modning phorozooids, og store sykepleiere. Kulturer kan opprettholdes i avrundet kultur fartøy på en sakte roterende plankton hjulet og opprettholdes på en diett av kultivert alger i naturlig sjøvann for mange generasjoner. I tillegg til evnen til å etablere laboratoriet kulturer av D. gegenbauri, viser vi at samlingen tilstand, alger konsentrasjon, temperatur, og eksponering for naturlig betinget sjøvann er alle kritiske til kulturen etablering, vekst, overlevelse og reproduksjon av D. gegenbauri.
Introduction
Dyreplankton står for den største animalsk biomasse i havet, er viktige komponenter i marine Food webs, og spille viktige roller i Ocean biokjemiske sykluser1,2. Dyreplankton, selv om det består av et stort mangfold av organismer, kan grovt skilles i to kategorier: geléaktige og ikke-geléaktige med noen mellomliggende dyr3,4. Sammenlignet med de ikke-geléaktige dyreplankton, geléaktige dyreplankton er spesielt vanskelig å studere på grunn av deres komplekse livshistorie5, og deres delikate vev er lett skadet under fangst og håndtering. Geléaktige dyreplankton arter er derfor notorisk vanskelig å kultur i laboratoriet og generelt mindre studert i forhold til ikke-geléaktige arter6.
Blant geléaktige dyreplankton grupper, en rik og av økologisk betydning i verdenshavet er Thaliaceans. Thaliaceans er en klasse av pelagisk kappedyr som inkluderer ordrene Salpida, Pyrosomida, og Doliolida7. Doliolida, kollektivt referert til som doliolids, er små tønne-formede fri-svømming pelagisk organismer som kan nå høy forekomster i produktive neritic regioner av subtropiske hav. Doliolids er blant de mest tallrike av alle dyreplankton grupper4,8. Som fjærings matere samler doliolids mat partikler fra vannsøylen ved å lage filter strømmer og fange dem på Slim garn9. Taksonomisk, doliolids er klassifisert i rekken Urochordata10. Ancestral til chordates, og i tillegg til deres økologiske betydning som sentrale komponenter i marine pelagisk systemer, Thaliaceans er av betydning for å forstå opprinnelsen til koloni livet historie10,11 og utviklingen av chordates5,7,10,12,13,14.
Doliolids livshistorie er kompleks og bidrar til vanskelighetene med å dyrking og oppholde dem gjennom deres livssyklus. En gjennomgang av doliolid livssyklus og anatomi finner du i Godeaux et al.15. Den doliolid livssyklusen, som innebærer en obligatorisk veksling mellom seksuelle og aseksuell livshistorie, er presentert i figur 1. Egg og sperm er produsert av hermafroditter gonozooids, den eneste ensomme fasen av livssyklusen. Gonozooids slipper sperm til vannsøylen og eggene er internt befruktet og frigitt til å utvikle seg til larver. Larvene klekkes og metamorphose inn i oozooids som kan nå 1-2 mm. forutsatt bidrar til miljøforhold og næring, oozooids blir tidlig sykepleiere innen 1-2 dager ved 20 ° c og innleder koloni fasene av livssyklusen. Oozooids asexually produserer knopper på deres ventrale stolon. Disse knopper forlate stolon og migrere til rygg cadophore der de linje opp i tre sammenkoblede rader. De sentrale doble radene blir phorozooids og de ytre to doble radene blir trophozooids. Sistnevnte gir mat til både sykepleieren og phorozooids16,17. Den trophozooids forsyne sykepleier med ernæring som hun mister alle indre organer. Som overflod av trophozooids øker, kan størrelsen på sykepleieren nå 15 mm i laboratoriet. Som phorozooids vokse, de stadig svelges planktoniske byttedyr og nå ~ 1,5 mm i størrelse før de ble utgitt som individer17. En enkelt sykepleier kan frigi > 100 phorozooids under levetiden18. Etter at phorozooids er løslatt fra cadophore, fortsetter de å vokse og er den andre koloniale fasen av livssyklusen. Når de når ~ 5 mm i størrelse, utvikler hver phorozooid en klynge av gonozooids på deres ventrale peduncle. Disse gonozooids kan svelges partikler når de når ~ 1 mm i lengde. Etter at gonozooids har nådd ~ 2 til 3 mm i størrelse de er løslatt fra phorozooid og bli den eneste ensomme fasen av livssyklusen. Når de når ~ 6 mm i størrelse, gonozooids bli seksuelt modne17. Gonozooids kan nå 9 mm eller mer i lengde. Gonozooids er hermafroditter, sperm slippes periodisk mens befruktning av eggene oppstår internt16,17. Når gonozooid er ≥ 6 mm i størrelse, frigjør den opptil 6 befruktet egg. Vellykket dyrking krever støtte de spesifikke behovene til hver av disse unike livshistorie stadier.
På grunn av den økologiske og evolusjonære betydningen av Thaliaceans, inkludert doliolids, er det behov for dyrking metoder for å fremme forståelsen av denne organismen unike biologi, fysiologi, økologi og evolusjonær historie19 . Doliolids har betydelig løftet som eksperimentell modell organismer i utviklingsmessige biologi og funksjonelle Genomics fordi de er gjennomsiktige og sannsynligvis har strømlinjeformet genomer20,21. Mangelen på pålitelige dyrking metoder, men hindrer deres nytten som laboratorie modeller. Selv om en håndfull laboratorier har publisert resultater basert på kultivert doliolids, til vår kunnskap dyrking tilnærminger og detaljerte protokoller har ikke vært tidligere publisert. Basert på mange års erfaring, og prøving og feiling dyrking forsøk, hensikten med denne studien var å vurdere erfaringer og å dele protokoller for innsamling og dyrking av doliolids, spesielt arten Dolioletta gegenbauri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjøre dyrking fasiliteter for å oppdra D. gegenbauri
Merk: alle materialer og utstyr som kreves er oppført i tabellen av materialer.
- Forbered 1 M natriumhydroksid (NaOH), 0,06 M kalium kaliumpermanganat (KMnO4) løsning. For å forberede denne løsningen, oppløse 400 g av NaOH i 10 L deionisert vann. Legg 100 g KMnO4 til NaOH løsningen og bland godt.
- Forbered en 0,1 M natrium bisulfite (NaHSO3) løsning ved å oppløse 100 g NaHSO3 i 10 L deionisert vann og bland godt.
FORSIKTIG: disse reagensene er irriterende som kan forårsake åndedretts problemer ved innånding. Plasseres i et godt ventilert område, for eksempel en avtrekksvifte. Unngå hudkontakt. Bruk vernehansker, verneklær, øyebeskyttelse og ansiktsvern ved håndtering. - Før etablering og oppdrett av doliolid kulturer i laboratoriet, ren og sterilisere kulturen krukker.
- Skyll 1,9-og 3,8 L kultur glassene minst 3 ganger med deionisert vann. La skru dekslene tørke, siden dekslene ikke er inkludert i følgende rengjørings trinn.
- Rengjør og sterilisere 1,9-og 3,8 L glass kultur krukker ved å senke dem inn i NaOH/KMnO4 -løsningen. La glassene suge over natten.
- Fjern glassene fra NaOH/KMnO4 -løsningen og senk glassene inn i natrium bisulfite (NaHSO3)-løsningen. La glassene suge over natten.
- Fjern glassene fra NaHSO3 -løsningen og skyll grundig med deionisert vann. La glassene tørke.
- Plasser plankton hjulet (figur 2) i en temperatur-kontrollerte plass (miljøkammer). Likevekt temperaturen til 20 ° c. For en mer detaljert beskrivelse av det tilpassede plankton hjulet henvises det til supplerende figur 1.
2. planteplankton kultur
- Skaff alger kulturer fra National Center for Marine alger og bakterieflora (NCMA) eller andre kilder som skal brukes som mat for D. gegenbauri. Blandinger av to flagellate arter inkludert Isochrysis galbana (CCMP 1323), RHODOMONAS SP (CCMP 740), og en liten diatomeen, Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) ble innhentet fra NCMA og har vært brukt i tidligere laboratorium studier til bakre doliolids vellykket17.
- Forbered L1 og L1-si vekst Media22 som anbefalt av NCMA.
- Følg instruksjonene fra leverandøren for å starte den nye alger kulturer.
- For å opprettholde lager kulturer, ved hjelp av strenge axenic kultur teknikker, overføring 0,5 mL gammel senescing kultur til 25 mL fersk vekst medier i steril 55 mL glass kultur rør annenhver uke.
Merk: det er ikke mulig å lagre levende alger kulturer uten å overføre dem regelmessig. Hvis kulturer ikke skal brukes i lange perioder, og det ikke er mulig å opprettholde kulturer for varigheten av ikke-bruk perioden, anbefales det å re-anskaffe disse felles alger kulturer fra sine opprinnelige kilder (f. eks NCMA). - Forbered større volumer av planteplankton for fôring doliolids i rene 500 mL plast vev kultur flasker som inneholder 200 mL vekst medier.
- Vaksinere planteplankton fra axenic bestander (4 mL) inn i 200 mL vekst medier (1:50 fortynning).
- Ruge ved 20 ° c med en 12:12 h lys: mørk syklus under kjølig hvitt lys belysning av 65-85 μE/m2. Legg kultur flasker flatt for å maksimere belysningen. Roter forsiktig kultur daglig.
- Bestem konsentrasjonen av celler ved hjelp av en partikkel teller eller mikroskop for å overvåke veksten av kulturer.
Merk: etter 7-10 dager fra inoculation, flagellate kulturer vil inneholde ~ 105-106 celler/ml og diatomeen kulturen vil inneholde ~ 104-105 celler/ml. Disse konsentrasjonene er nok til å opprettholde doliolid kulturer. - Initiere nye fôring aksjer på et minimum av annenhver uke for å gi nok alger biomasse for å støtte alle kulturaktiviteter.
3. samling av ville doliolids og sjøvann for kultur
Merk: en oversikt over metoder for innsamling og dyrking er skissert i Figur 3. En beskrivelse av den spesialiserte samlingen plankton nettet og COD-End er gitt i Figur 4.
- Finn doliolids ved å detektere dem ved hjelp av enten plankton nett eller in situ Imaging systemer23.
Merk: fordi doliolids er sjelden til stede i overflate farvann og er ikke oppdages av fjernmåling teknologi, guidet av nødvendige kunnskaper om forholdene gunstig for doliolids (se diskusjon), må tilstedeværelsen av doliolids fastsettes før prøvetaking. - Samle partikkel rikt sjøvann før du samler levende doliolids i forberedelsene til initiering av en D. gegenbauri kultur.
- Distribuer Niskin flasker montert på en CTD rosett eller tilsvarende utstyr for å samle vann fra stedet der doliolids er plassert og fra dybden som inneholder de høyeste estimatene for klorofyll en konsentrasjon estimert av in situ fluorometry.
Merk: klorofyll en konsentrasjon brukes som en indikator på partikkel konsentrasjoner. På den sør-atlantiske Bight (SAB) midt-kontinentalsokkel, undergrunnen klorofyll a Maximum er vanligvis nær bunnen, men i andre steder, kan det ikke være.
- Distribuer Niskin flasker montert på en CTD rosett eller tilsvarende utstyr for å samle vann fra stedet der doliolids er plassert og fra dybden som inneholder de høyeste estimatene for klorofyll en konsentrasjon estimert av in situ fluorometry.
- Når doliolids er plassert, gjenopprette uskadet doliolid zooids ved hjelp av spesialiserte plankton nettet og COD-end. Før distribusjon av nettet, fylle torsk-end med sjøvann.
- Fra et drivende skip, lavere og heve nettet gjennom vannsøylen opprettholde en skrå tauing vinkel på ~ 15-25 ° og vertikal distribusjon og gjenfinning hastighet ikke større enn 15 m/min.
- Når nettet er ombord, forsiktig overføre og dele innholdet i torsk-end i 3, 5-gallon (~ 20 L) plast bøtter hver inneholder ~ 10 L av overflaten sjøvann samlet inn fra området.
Merk: ny plast bøtter bør være betinget av tillegg av sjøvann dager før levende doliolid samlingen. Målet er å redusere utvasking av kjemikalier fra plast. Hvis sjøvann ikke er tilgjengelig, bruk renset (f. eks, milli Q) eller springvann fri for giftige forurensninger til tilstanden i bøtter. - Isoler doliolid zooids fra andre plankton.
- I små grupper (~ 2 L) overføre blandede planktons fra netto slep innholdet (nå i 20 L plast bøtter) til en 2 L glass beger.
- Ved hjelp av en bred-bar glass pipette (8 mm ID x 38 cm lengde), forsiktig sug og Overfør aktivt svømming doliolid zooids fra begeret til rent glass kultur krukker inneholder partikkel-rik sjøvann samlet inn ved hjelp av Niskin flasker hvor doliolids ble Ligger.
- Løsne forsiktig doliolid zooids under overflaten av sjøvannet.
Merk: samle gonozooids, phorozooids som inneholder vedlagte utviklings gonozooids, og sykepleier etapper som inneholder vedlagt trophozooids (figur 1).
- Etter tilsetning av doliolids, legge Rhodomonas Sp. kultur til en endelig konsentrasjon på ~ 5 x 103 -104 celler/ml (~ 50 ml av en kultur som inneholder ~ 5 x 104 – 1 x 105 celler/ml i en 3,8 L krukke). Dette er for å avgjøre om doliolids er aktivt fôring. Når doliolids svelges Rhodomonas SP., vil deres fordøyelseskanal vises rød i farge. Fjern zooids som ikke ser ut til å mates.
- For å hindre doliolids fra å bli fanget i luft-vann-grensesnittet, unngå Headspace i kulturen krukker ved helt å fylle glassene med ufiltrert partikkel-rik sjøvann og plassere et stykke plast brytes over glasset åpningen (89 mm bred).
- Unngå å lage luftbobler som også kan. Skru hetten forsiktig på kannen og Vend glasset forsiktig for å finne ut om det finnes bobler. Hvis det finnes bobler, fjerner du dem.
- Etter at glassene er fylt, tørk av overflødig vann fra utsiden av glasset.
- Monter hver krukke på plankton hjulet (figur 2) ved å plassere glasset på den vertikale metallstenger dekket med gummi slange, og mellom en rustfritt stål slange klemme.
- Pass på at baksiden av glasset er polstret mot gummi slangen. Stram slange klemmen rundt glasset ved å justere skruen.
- Kontroller at glasset ikke er i bevegelse når det er forsvarlig festet. La glassene rotere ved 0,3 RPM for å holde doliolids i suspensjonen.
FORSIKTIG: det er viktig ikke å stram glasset for å hindre at glasset sprekker.
- På skipet opprettholder du kultur fartøyene på plankton hjulet ved 20 ° c i svakt lys til de kan overføres til laboratoriet kultur anlegget.
- Ved retur til laboratoriet, overføre glassene som inneholder doliolids inn i det tilberedte kultur anlegget. Monter krukker på plankton hjulet (se trinn 3,8) og la glassene til å fortsette å rotere ved 0,3 RPM.
Merk: all oppdragelse av doliolids i denne studien ble utført ved 20 ° c.
4. opprettholde D. gegenbauri kulturer
- Fra skipet til laboratoriet, la dyrene acclimate i de originale glassene til laboratorie forholdene i 3 dager.
- I løpet av acclimation perioden, bruke en bred bore glass pipette å utveksle 10% av vannet med ufiltrert partikkel-rik sjøvann fra samlingen området hver dag i 3 dager.
- Oppbevare adskillige Raudåta inne glasset bortsett fra fjerne alle annet dyreplankton, stor avføring pellets, og stor aggregat partikler det kanskje tresko det doliolid ' filterene apparater (mucus nett). Hvis kulturen består av tidlig sykepleiere, Hold en stor gonozooid (≥ 6 mm) i glasset.
Merk: det er ikke viktig hvilke copepod arter er inkludert i kulturen, men i dette eksperimentet, de mest tallrike artene til stede fra der doliolids ble fanget ble brukt.
- Etter acclimation perioden, overføre doliolid zooids og Raudåta fra den opprinnelige glasset til en ren dyrking krukke som inneholder 80% glassfiber filter (GF/F) filtrert sjøvann og 20% av sjøvann fra den opprinnelige glasset. Forbered filtrert sjøvann ved å filtrere sjøvann gjennom en GF/F med en nominell pore størrelse på 0,7 μm filter papir.
- Opprettholde den nye kulturen ved å utveksle 10% av vannet med GF/F filtrert sjøvann hver 3 dager og ved å fjerne aggregater og avføring pellets. Ukentlig, Overfør dyr til en ny krukke som beskrevet i trinn 4,2.
- Fôr doliolids ved å opprettholde konsentrasjonen av planteplankton i kultur glassene mellom 40-95 μg C/L.
Merk: disse konsentrasjonene etterligner miljøforhold som er kjent for å støtte Bloom forhold for D. gegenbauri17. Blandingen av alger arter varierer avhengig av livet scenen og antall zooids i hver krukke. Under tidlige stadier av livet, tilsett 1:1 blanding (av karboninnhold) av cryptomonad alger (Isochrysis galbana og Rhodomonas Sp.) bare. Større byttedyr kan lett tette fôrings apparatet til små sykepleiere og utvikle trophozooids. Tilsett diatomeen Thalassiosira weissflogii til alger blandingen, også ved lik karboninnhold, ved mating av større sykepleiere, phorozooids og gonozooids.- Overvåk alger konsentrasjoner før og etter fôring for å veilede avgjørelsen av hvor ofte og hvor mye alger som skal legges til i kulturene. Bruk en partikkel teller til å bestemme alger konsentrasjoner, fordi alger konsentrasjoner i kultur glassene er forholdsvis fortynnede.
- Fjern nok zooids til å opprettholde alger konsentrasjoner av 40 – 95 μgC/L slik at de resterende doliolids vil ha nok mat til å vokse.
Merk: den vanskeligste livet scenen for å opprettholde vellykket under laboratorieforhold er å utvikle larver og oozooid (tidlig sykepleier). I denne fasen av kulturen, holde en stor gonozooid (≥ 6 mm) i tillegg til flere Raudåta i glasset med å utvikle larver og oozooids (~ 20 per 3,8 L jar). - Overfør minst 4 sykepleiere til en ny dyrking krukke en gang minimum 8 trophozooids er synlige på sykepleier cadophore (figur 1B).
Merk: Trophozooids vil doble i antall hver 1 – 2 dager ved 20 ° c. Trophozooids er store nok til å være synlig for det blotte øye.- Fjern to av sykepleierne når sykepleiere utvikler 20 trophozooids.
- Fjern en sykepleier når sykepleierne utvikler > 30 trophozooids på sine cadophores. La de resterende sykepleieren utvikle phorozooids på sin cadophore.
- Ta ut sykepleieren når sykepleieren har utgivelser opptil 30 phorozooids.
- Reduser antall dyr i glasset når phorozooids når 3 mm i størrelse.
- Fjern alle unntatt fire phorozooids når phorozooids blir større (> 5 mm) og har utviklet gonozooid klynger.
- Reduser kulturen til to phorozooids når antall gonozooids klynger øker i størrelse og begynner å mate.
- Fjern phorozooids når phorozooids slippes opp til 30 gonozooids.
- Reduser antall gonozooids fra 30 zooids til 2 per krukke. Tillat befruktet egg å bli sluppet inn i glasset.
- Fjern en gonozooid som etterlater en enkelt gonozooid i glasset når oozooids utvikler seg.
Merk: kasserte sykepleiere, phorozooids og gonozooids kan brukes til å frø flere kulturer og gjennomføre ytterligere eksperimenter.
- Fjern en gonozooid som etterlater en enkelt gonozooid i glasset når oozooids utvikler seg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter de beskrevne prosedyrene for innsamling og dyrking av doliolid, D. gegenbauri som er skissert i Figur 3, er det mulig å opprettholde en kultur av D. gegenbauri gjennom hele dens komplekse livshistorie (figur 1) og opprettholde den i mange generasjoner. Selv om dyrking av D. gegenbauri er beskrevet her, bør disse prosedyrene også være relevante for dyrking av andre doliolid arter.
Å fange sunne og uskadet doliolid zooids krever anvendelse av spesialiserte nett og slepe prosedyrer (Figur 4). Idet delikat dyrene med nei hard strukturer, bekymre burde være tatt å minimere prosedyrer det kanskje gir seg utslag i alle fysisk skade. Disse faktorene kan omfatte turbulens, trykk og interaksjoner med overflater, inkludert nett, luft og luftbobler. Til tross for deres delikate natur, kan imidlertid uskadet doliolid zooids samles ved hjelp av et konisk plankton nett med en åpning diameter til lengde forhold på 1:5 og utstyrt med en relativt stor vektet ikke-filtrering torsk-end. Rutinemessig har vi brukt en 202 μm mesh 2,5 m (lengde) plankton nett med en 0,5 m åpning montert i en dreibar sele og utstyrt med en 4 L vektet ikke-filtrering torsk-end (Figur 4). Selv om effekten av plankton mesh størrelse på fangst av cultivatable D. gegenbauri zooids har ikke blitt systematisk undersøkt, teoretisk, bruk av et nett med en større mesh størrelse kan resultere i ytterligere forbedring som større mesh størrelse ville redusere trykk feltet generert under tauing. Alternativt vil større mesh størrelse resultere i større vannstrømning gjennom nettet, potensielt skadelige doliolid zooids. Tauing hastigheter og netto vinkel bør optimaliseres for å minimere slep tid og skader under oppsamling. I vår erfaring har vi funnet at tilstrekkelig milde tauing forhold kan oppnås ved tauing av netto skrått i en vinkel på 15-25 ° fra et drivende skip med vertikal distribusjon og gjenfinning hastigheter ikke større enn 15 m/min. For å orientere nettet i retning av vannstrømmen, er plankton nettet montert i en dreibar sele. Det er vanligvis slik at fordelingen av doliolids i vannsøylen ikke er tilfeldig og generelt størst i regionen med de høyeste partikkel belastninger24. Derfor, vannsøylen fra under undergrunnen klorofyll maksimum til overflaten bør samples. I den grunne SAB midten av kontinentalsokkelen (20-45 m), samplet vannsøylen fra ~ 1 m over bunnen til overflaten.
Når sunne zooids har blitt samlet inn, er det avgjørende å opprettholde dem på en måte som minimerer eksponering for overflater. For å minimere møter med overflater doliolids holdes i avrundede krukker fylt med sjøvann og forsiktig ristet på en sakte roterende plankton hjulet (figur 2).
Selv om det er teoretisk mulig å starte en kultur med zooids av noe liv Stadium, utforskning av suksesser og svikt ved etablering av nye kulturer av D. gegenbauri fra 6 forsøk mellom 2015-2018 i Sør-Atlanteren Bight tyder på at suksess er oftest oppnådd når zooids er samlet inn fra farvann som er < 21 ° c, og når andre stadier enn store modne gonozooids benyttes for å starte en ny kultur (tabell 1 og tabell 2). I praksis er det nyttig, eller i det minste ikke skadelig, å inkludere flere liv stadier av doliolid zooids når initiere en ny kultur.
Suksess i å opprettholde en kultur av D. gegenbauri, som har blitt beskrevet for andre pelagisk tunicate arter20, avhenger av å gi tilstrekkelig, men ikke overdreven, mat og mat mangfold som kreves for å støtte hvert liv scenen. Etter hvert som diett kravene varierer gjennom hele livssyklusen, må mengden av alger som er gitt ved hver fôrings tid, varieres for å opprettholde mat konsentrasjoner på ønsket mål nivå (40 – 95 μg C/L) (tabell 3). Konsentrasjoner over eller under disse nivåene kan resultere i økt dødelighet (G.A. Paffenhöfer pers. Comm.). Selv om den naturlige dietten til D. gegenbauri er fortsatt dårlig forstått6, kulturer kan opprettholdes ved å forsyne relativt enkle blandinger av kulturperler alger og utnytte prosedyrer som tillater ulike mikrobielle samfunn å etablere i kulturen. Øke potensialet mangfoldet av byttedyr feltet oppnås ved å beholde en brøkdel av partikkel Laden-vann fra eldre kulturer og inkludering av et lite antall levende Raudåta og store doliolids ved hver vann endring eller overføring. Formodentlig, disse organisere forarbeide algene og avsiltede materiale og anrette å diversifisere det partikkelstørrelse og kvalitet gjenferd anvendelig for doliolid nærende, bortsett fra i tillegg studier er krevde å anerkjenne denne hypotese.
Tilgjengeligheten av doliolid kulturer gir midlene til å undersøke, under kontrollerte eksperimentelle forhold, mange viktige aspekter ved doliolid biologi, fysiologi, økologi, og molekylærbiologi. For eksempel, selv om doliolids er rikelig i mange regioner av kyst havet og er store planktoniske grazers25, data om utbredelsen av fôring og vekst forblir knappe26. Utnytte kulturer av D. gegenbauri, et fokus for kultur-basert forskning har vært å kvantifisere fôring og vekstrater som svar på kritiske miljømessige parametre inkludert temperatur og mat konsentrasjoner26. Resultatene fra disse studiene har indikert at clearance er lik ved konsentrasjoner fra 20 til 60 μg C/L og reduseres etter hvert som mat konsentrasjonen øker (figur 5a). Klarerings ratene øker proporsjonalt over temperaturområdene som støtter D. gegenbauri vekst (figur 5B). Vekstrater (k) varierer fra 0,1 – 0.7/dag som en funksjon av temperatur og mat tilgjengelighet (figur 6). Disse studiene, i tillegg til å gi praktisk informasjon for dyrking, har tillatt fastsettelse av kvantitative relasjoner mellom doliolid fôring og vekstrater som en funksjon av miljø parametre og gi kritisk innsikt i biologi og økologi av doliolids som kreves for å inkludere denne viktige dyreplankton gruppen i modellering rammeverk27.
Figur 1: livssyklusen til D. gegenbauri ved 20 ° c.
Livs løps tegningen (1A) er modifisert etter at Walters et al. 20186 og re-tegnet med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: plankton hjul brukes til kultur D. gegenbauri. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjematisk oversikt over D. gegenbauri innsamling og dyrking tilnærming.
Samling til sjøs (A), overføring fra konsentrerte bøtter til små glass beger i små grupper (B), isolering av doliolid zooids i dyrking krukker inneholder partikkel-rik sjøvann (C), vedlikehold på plankton hjulet gjennom hele livssyklusen (D, E). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: plankton netto og distribusjon.
Distribusjon (øverst til venstre), henting (øverst til høyre), og skjematisk av netto og torsk slutten (nederst). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: alger klarerings rater på D. gegenbauri gonozooids.
(A) forholdet mellom (a) middelverdi (± S.E.) klaring (ml/zooid/dag) kontra planteplankton konsentrasjon (μg C/L) i tre størrelser av D. gegenbauri gonozooids. Hvert punkt representerer 4 – 11 observasjoner. (B) middelverdi (± S.E.) klarerings rater (ml/zooid/dag) kontra temperatur (° c) i tre størrelser av D. gegenbauri gonozooids. Hvert punkt representerer 4 – 12 observasjoner. Gonozooids størrelser er 2,5 mm (
), 4,5 mm (
) og 6,5 mm (
). Tallene er trukket på nytt med tillatelse26. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: vekstrater på D. gegenbauri gonozooid.
Forholdet mellom (A) middelverdi (± S.E.) vekstrater (k) versus planteplankton konsentrasjon (μg C/L) i tre størrelser av Dolioletta gegenbauri gonozooids. Hvert punkt representerer 4 – 11 observasjoner. (B) Mean (± S.E.) vekstrater (k) versus temperatur (° c) for tre størrelser av Dolioletta gegenbauri gonozooids. Hvert punkt representerer 4 – 12 observasjoner. Gonozooids størrelser er 2,5 mm (), 4,5 mm () og 6,5 mm (). Tallene er trukket på nytt med tillatelse fra Gibson og Paffenhöfer26. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tabell 1. Oseanografiske forhold og Doliolid overflod | |||||||||||
| Overflaten | Bunnen | Overflaten | Bunnen | Overflaten | Bunnen | Doliolid overflod | |||||
| Dato | Cruise-ID | Breddegrad (N) | Lengdegrad (W) | Dybde (m) | Temperatur (⁰ C) | Temperatur (⁰ C) | Saltinnhold (PSU) | Saltinnhold (PSU) | CHLA (μg/L) | CHLA (μg/L) | zooids/M3 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 31,1889 | 80,1527 | 41,30 | 25,26 | 22,43 | 33,58 | 36,96 | Na | 0,20 | Na |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 29,5687 | 80,3269 | 40,00 | 26,40 | 21,75 | 36,26 | 36,32 | 1,04 | 1,35 | 218 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 31,1674 | 80,1249 | 40,80 | 23,24 | 22,60 | 35,91 | 35,81 | 1,06 | 1,70 | 13 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 31,2139 | 80,1823 | 41,00 | 18,72 | 18,84 | 36,00 | 36,12 | 0,83 | 1,50 | 3 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 31,2144 | 80,1822 | 42,00 | 24,19 | 23,85 | 36,00 | 36,04 | 0,63 | 1,30 | 254 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 31,1835 | 80,1466 | 43,00 | 16,85 | 16,45 | 36,50 | 36,48 | 0,56 | 0,89 | Na |
| NA: data ikke tilgjengelig | |||||||||||
Tabell 1: oseanografiske forhold og doliolid overflod på den sør-atlantiske Bight midt på kontinentalsokkelen på den tid og sted hvor D. gegenbauri zooids ble samlet inn og brukt til å initiere nye kulturer.
| Tabell 2. Utfall av D. gegenbauri dyrking forsøk | ||||
| Dato | Cruise-ID | Zooids samlet inn | Utfallet | Kommentarer |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | Seksuelt modne stor (6-7 mm) gonozooids | Mislyktes | Alle gonozooids hadde dødd etter 4 dager. Oozooid og tidlige sykepleier liv stadier ble produsert, men klarte ikke å trives. |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | Seksuelt modne stor (8-10 mm) gonozooids | Mislyktes | Gonozooids døde kort tid etter samlingen. Oozooids og tidlig sykepleiere ble produsert, men klarte ikke å trives. |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | Blandet kolleksjon inkludert sen sykepleier (4-5 mm) med vedlagt trophozooids, seksuelt modne store (6 mm) gonozooids, og oozooids (2 mm) | Vellykket | Kultivert for 4 fulle generasjoner, ytterligere gonozooids og sykepleiere samlet i januar og mars 2016 ble lagt til kulturen. Laboratoriet ble evakuert i 4 dager under orkanen Matthew i oktober 2016 og kulturen overlevde ikke. |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | Blandet samling inkludert gonozooids (1.5-5 mm) og store phorozooids (6 mm) med vedlagt gonozooid klynger | Vellykket | Kultivert for 4 fulle generasjoner, ytterligere gonozooids samlet i april 2017 ble lagt til kulturen. Avsluttet kultur i september 2017 i forkant av orkanen Irma. |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | Gonozooids (3-6 mm) | Mislyktes | Store gonozooid døde etter 1 dag. Den umodne gonozooid overlevde i kultur i 14 dager. Eggene ble utgitt av begge gonozooids. Oozooids ble produsert, men klarte ikke å utvikle seg til sykepleier etapper. Kultur mislyktes etter 1 måned. |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | Stor (6-7 mm) sen sykepleier uten trophozooids | Vellykket | I kulturen sykepleieren produserte trophozooids. Kulturen ble opprettholdt i 3 generasjoner og ble avsluttet i slutten av juni 2018 da eksperimenter ble avsluttet. |
Tabell 2: utfall av forsøk på å etablere laboratorie kulturer av D. gegenbauri innsamlet fra Sør-atlantiske Bight midt på sokkelen.
| Dolioletta gegenbauri | zooid nummer per | zooid nummer per | |||
| livet scenen | 3,9 L krukke | 1,9 L krukke | Isochrysis galbana | Rhodomonas Sp. | Thalassiosira weissflogii |
| oozooid | 20 | 10 | Inkluderer | Inkluderer | IKKE INKLUDER |
| tidlig sykepleier | 20 | 10 | Inkluderer | Inkluderer | IKKE INKLUDER |
| sent sykepleier med 8 trophozooids | 4 | 2 | Inkluderer | Inkluderer | Inkluderer |
| sent sykepleier med 20 trophozooids | 2 | 1 | Inkluderer | Inkluderer | Inkluderer |
| sent sykepleier med 30 trophozooids | 1 | 1 | Inkluderer | Inkluderer | Inkluderer |
| phorozooid (1 til 3 mm) | 30 | 15 | Inkluderer | Inkluderer | Inkluderer |
| phorozooid gonozooid klynge (> 5 mm) | 2 | 1 | Inkluderer | Inkluderer | Inkluderer |
| gonozooid (1 til 3 mm) | 30 | 15 | Inkluderer | Inkluderer | Inkluderer |
| gonozooid (> 5 mm) | 2 | 1 | Inkluderer | Inkluderer | Inkluderer |
| Mål konsentrasjoner av alger bør opprettholdes mellom 40-95 μg C/L med like blandinger (av karboninnhold) av hver alger Art | |||||
Tabell 3: Målrett mot kultur betingelser for hver D. gegenbauri livssyklus fase.
Supplerende figur 1: detaljert beskrivelse av det tilpassede plankton hjulet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kapasiteten til kultur doliolids har blitt etablert i løpet av de siste ti årene og har blitt brukt til å støtte forskning på flere områder. Eksperimentelle studier i våre laboratorier har støttet utgivelsen av minst 15 vitenskapelige studier fokusert på fôring og vekst18,26, reproduksjon18,28, Diet6, 29, fysiologi30, økologi31, og økologisk modellering27 av doliolids.
Selv om kulturen i disse delikate dyrene er arbeidskrevende og tidkrevende, dyrking av doliolids er gjennomførbart, og hvis foretas av det bredere samfunnet vil fremme fremme av forståelsen av denne økologisk og evolutionarily viktig gruppe av dyr. Målet med denne studien var å beskrive dagens tilnærminger for innsamling, oppdrett og vedlikehold av D. gegenbauri i kultur for det formål å gjennomføre laboratorie-baserte studier.
Etableringen av en doliolid kultur krever innsamling av sunne og uskadet dyr og, en gang fanget, skånsom behandling, hensiktsmessig ernæring og husdyrhold. Doliolids, spesielt arten D. gegenbauri, oppstår circumglobally på subtropiske kontinentale hyller, men overflod kan være svært variabel. For eksempel, i en fersk studie fokusert på midten av hyllen regionen i SAB, selv om overflod varierte dramatisk fra < 1/m3 til > 20000/m3, doliolids var til stede i løpet av året6. På grunn av den høye variasjonen av doliolids i rom og tid og den relative vanskeligheter involvert med prøvetaking kontinentalsokkel margin miljøer, pålitelig kunnskap om doliolid samfunnet dynamikk der studier blir gjennomført er en viktig forutsetning for vellykket etablering av kulturen.
En gang doliolid zooids ha blitt lokalisert og fanget, den kan vanskelig å avgjøre hvorvidt dyrene ha blitt sterkt skadd. Dyrene kanskje komme å bli uskadd og forevise aktiv svømmer og flukt opptreden, bortsett fra aften det minste skaden kanne gir seg utslag i deres dårlig å trives. En karakteristisk som er spesielt relevant for helse vurdering av fanget doliolid zooids er deres evne til å mate. Mate aktivitet kan vurdert bare av skaffer pigmentert algene å nylig fanget dyrene. Hvis et dyr mater, vil tarmen bli farget i løpet av kort tid. I vår erfaring, har vi funnet at å legge en liten mengde av de røde pigmentert alger, Rhodomonas Sp., raskt gir informasjon om fôring aktivitet. Hvis fôring ikke er observert, er det svært usannsynlig at en kultur kan etableres.
Årvåkenhet og god husdyrhold er avgjørende for å etablere og opprettholde doliolids gjennom hele den komplekse livssyklusen. Kanskje det mest problematiske stadiet er utviklingen av en levedyktig sykepleier fra larvestadiet scenen og produksjon (spirende) av fôring trophoozoids. På dette livet stadiet, vi spekulere i at maten krav, med hensyn til kvantitet, kvalitet, og partikkelstørrelse er mest begrenset. Til vår kunnskap har det ikke vært noen tidligere studier som har undersøkt fôring aktivitet av D. gegenbauri larver og oozooids. For eksempel, selv om utvikling av gonozooids og phorozooids er i stand til å innta partikler over et bredt spekter av størrelser, er kapasiteten til larver, oozooids og små sykepleiere sannsynligvis mer begrenset. I praksis finner vi at vellykket dyrking i disse livet stadier kan oppnås ved å utelate kiselalger fra alger mat blandingen, ved å opprettholde mat konsentrasjoner på moderate nivåer, ved å gjennomføre hyppige feedings ved lavere konsentrasjoner, ved å opprettholde en enkelt større gonozooid og et par Raudåta med kulturen, og ved å manuelt fjerne store mengder av detritus.
Selv om vi har opprettholdt kulturer av D. gegenbauri for flere generasjoner med opprinnelse fra en enkelt samling, når det er mulig vi rutinemessig supplere eksisterende kulturer med ferske innsamlede dyr for å øke genetisk mangfold og robusthet av kulturen. En potensiell fare for denne praksisen er innføringen av parasitter eller sykdommer i kulturen, men til vår kunnskap, har vi aldri støtt på dette problemet. Selv om det har vært få rapporter om parasitter av doliolids32, utvilsomt, de finnes. Interessant, i en fersk studie sammenligne dietten til kultivert d. gegenbauri gonozooids eksponert for naturlige farvann med felt-fanget D. gegenbauri gonozooids, presumptive Apicomplexa parasitter ble påvist i den ville befolkningen som var fraværende i den kultivert dyrene6.
En eksisterende begrensning av den beskrevne kultur teknologien er begrensningen av zooid produksjonsvolum. Spesielt fordi de beskrevne teknikkene involverer dyrking i forseglede krukker med lav tetthet på et roterende plankton hjul, er det uklart om denne tilnærmingen kan skaleres opp eller at arbeidsflyten ville være mottagelig for automatisering. Større skala dyrking systemer, men for en annen delikat små geléaktige Marine dyreplankton arter, den larvacean Oikopleura dioica, har blitt beskrevet20,33,34, noe som tyder på at det kan være mulig å designe lignende systemer for doliolids i fremtiden. Men den komplekse livshistorien til D. gegenbauri forhold til enklere livshistorie O. dioica vil fortsatt være en betydelig utfordring for stor skala dyrking.
Som konklusjon, etter protokollene beskrevet her, D. gegenbauri kan være pålitelig dyrket under kontrollerte laboratorieforhold gjennom sin komplekse livshistorie. Denne kapasiteten gjør arten mottagelig for en rekke kontrollerte eksperimentelle studier, og kanskje for å utvikle doliolids som en ny dyremodell i utviklingspsykologi biologi og evolusjon. Begrensninger av produksjonsskala, men må overvinnes før dette målet kan oppnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å erklære.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for de mange personene som har bidratt med akkumulert kunnskap til dette prosjektet gjennom årene, inkludert G.-A. Paffenhöfer og D. Deibel som opprinnelig utviklet disse protokollene. M. Köster, og L. Lamboley har også bidratt vesentlig til utviklingen av disse prosedyrene. NB López-Figueroa og Á.E. Rodríguez-Santiago genererte anslagene over doliolid overflod gitt i tabell 1. Denne studien ble støttet delvis av US National Science Foundation tildelinger OCE 082599, 1031263 til MEF, samarbeidsprosjekter OCE 1459293 og OCE 14595010 til MEF og DMG og, National Oceanic og Atmosfærisk administrasjon prisen NA16SEC4810007 til DMG. Vi er takknemlige for det hardt arbeidende og profesjonelle mannskapet på R/V Savannah. Lee Ann DeLeo utarbeidet tallene, Charles Y. Robertson korrekturlese manuskriptet og, James (Jimmy) Williams produserte plankton hjulet
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T. Zooplankton body composition. Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L. Pelagic tunicates: Why gelatinous? American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. A molecular phylogeny of the Thaliacea. Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
