Summary
Her præsenterer vi en automatiseret plasmaproteinfordøjelsesmetode til massespektrometribaseret kvantitativ proteomisk analyse. I denne protokol strømlines og automatiseres de væskeoverførende og inkubationstrin ne for proteindenaturering, reduktion, alkylering og trypsinfordøjelsesreaktioner. Det tager cirka fem timer at forberede en 96-brønds plade med den ønskede præcision.
Abstract
Prøveforberedelse til massespektrometrianalyse i proteomics kræver enzymatisk spaltning af proteiner i en peptidblanding. Denne proces indebærer mange inkubation og flydende overførsel skridt for at opnå denaturering, reduktion, alkylering, og spaltning. Tilpasning af denne arbejdsgang til en automatiseret arbejdsstation kan øge effektiviteten og reducere varianskoefficienterne og dermed give mere pålidelige data til statistiske sammenligninger mellem stikprøvetyper. Vi har tidligere beskrevet en automatiseret proteomisk prøveforberedelsesarbejdsproces1. Her rapporterer vi udviklingen af en mere effektiv og bedre kontrolleret arbejdsgang med følgende fordele: 1) Antallet af flydende overførselstrin reduceres fra ni til seks ved at kombinere reagenser; 2) Pipetteringstiden reduceres ved selektiv spidsrørved hjælp af et 96-positions rørhoved med flere kanaler; 3) Potentielt gennemløb øges ved tilgængeligheden af op til 45 dækpositioner; 4) Komplet kabinet af systemet giver forbedret temperatur og miljøkontrol og reducerer risikoen for forurening af prøver eller reagenser; og 5) Tilsætning af stabile isotopmærkede peptider samt β-galactosidaseprotein til hver prøve gør overvågning og kvalitetskontrol mulig under hele processen. Disse hardware- og procesforbedringer giver god reproducerbarhed og forbedrer intra-assay og inter-assay præcision (CV på mindre end 20%) for LC-MS-baseret protein- og peptidkvantificering. Hele arbejdsgangen for fordøje 96 prøver i en 96-brøndplade kan fuldføres på cirka 5 timer.
Introduction
Massespektrometribaseret protein - og peptidkvantificering anvendes i stigende grad som et bioanalytisk værktøj til plasmaanalyse i grundforskning og kliniske laboratorier2,3. Den nødvendige instrumentering og informatik er skredet hurtigt frem, efterhånden som MS er blevet den foretrukne metode til kvantificering af proteiner eller modificerede proteiner ved at målrette mod specifikke peptidsekvenser på grund af dets evne til at kvantificere hundredvis af peptider i en enkelt MS-kørsel4. Prøveforberedelse tjener som grundlag for enhver proteomisk analyse. Forud for MS-analyse, proteinerne i en biologisk prøve er typisk denatureret, reduceret, alkylerede, fordøjet i tryptiske peptider, og afsaltet5. Alkylering blokerer cysteiner for at forhindre ukontrollerede modifikationer og sikre, at alle cysteiner har samme masse. Dernæst tilsættes trypsin til fordøjeproteiner i peptider. Hvert af disse trin kræver optimering, og hele processen udføres traditionelt manuelt, hvilket giver mulighed for indførelse af analytiske fejl.
Den traditionelle biomarkør udviklingspipeline består af to hovedprocesser: shotgun proteomics for global protein opdagelse at skabe en dybdegående protein opgørelse6 og målrettet proteomics til verifikation og validering med henblik på høj præcision og høj-throughput protein kvantificering7. Uanset MS-tilgangen er prøveforberedelseden den samme og fokuserer på enzymatisk spaltning af proteiner i en peptidblanding. Som foreslået af Van Eyk og Sobhani8, der har en metode, der giver mulighed for præcis, præcis og reproducerbar analyse for både opdagelse og målrettede analyser ønskes effektivt at flytte opdagelse biomarkører til klinisk eideres. For at gøre dette vil automatisering af prøveforberedelse være nyttig og give mulighed for at øge effektiviteten til analyse af højgennemløb. Manuelle metoder indfører typisk analytiske fejl ud over acceptable grænser, der er angivet af Food and Drug Administration (FDA) i den reviderede bioanalytiske metodevalideringsvejledning, som omfatter biomarkører og diagnostik2,9. Udviklingen af en hurtig, meget præcis og håndfri ms-proteinprøveforberedelsesarbejdsproces vil være nødvendig for at lette biomarkørforskning, hvilket kræver forberedelse og analyse af tusindvis af biologiske prøver. MS prøve forberedelse har mange trin, hvor fejl kan indføres, og processen er kedelig og tidskrævende.
I vores forbedrede metode blev en automatiseret arbejdsstation programmeret til at udføre alle nødvendige procedurer for forberedelse af plasmaprøver i i alt 6 trin (figur 1) for at sikre: 1) nøjagtige væskeoverførsler; 2) reaktionen er indledt og stoppet på et sammenhængende tidspunkt; 3) reaktionen udføres ved en kontrolleret temperatur (dvs. kuvøse) og 4) reaktionen har ensartet blanding for alle reaktioner. Vi har også implementeret tilføjelse af udefrakommende kvalitetskontrolproteiner og interne standarder (stabile isotopmærkede peptidstandarder) for at sikre en kvalitet og reproducerbar gennemløb af LC-MS-baseret protein og peptidkvantificering i et 96-brøndformat. Herunder reagensforberedelse, arbejdstid stimer og i alt 1.000.000 pipetteringstrin vil være nødvendige for at behandle 96 prøver i individuelle rør. Automatisering reducerer den praktiske tid og antallet af involverede menneskelige interaktioner.
Protocol
1. Programmering af den automatiserede væskehandler
- Opret en ny metode fra menuen Filer (Fil | Ny metode)
BEMÆRK: Udfør trinnene i den angivne rækkefølge. Den kursiv skrifttype angiver tekst, der skal skrives i Biomek-softwaren. Kontakt forfatterne for at få oplysninger om pipetteringsteknikker og skabeloner. - Skriv Starttrinsvariabler og deres værdier i starttrinnet som angivet i tabel 1.
- Angiv kolonner til selektiv spidspipetting. Klik på trinnet Global på værktøjslinjen under Kontroltrin for trin 1.3-1.7, og træk det til metoden.
- Brug trinnet Angiv global værdi =FirstColumn til variabel FirstColumn_Global, værdi =LastColumn til variabel LastColumn_Global, værdi =LastColumn-FirstColumn+1 til variable kolonnerog værdi =Kolonner*8 til variable brønde.
- Vælg trinnet Script på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden. Skriv VB-scriptet som angivet i figur 2.
- Indstilling af diskenheder for blandinger Angiv global og løsninger.
- Brug trinnet Angiv globalt skal du angive de tilsvarende værdier til volumenmixvariablerne som vist i tabel 2.
- Klik på trinnet Hvis på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden. Skriv Autosampler underforhold.
- Klik Thenpå trinnet Angiv globalt på værktøjslinjen under Kontroltrin under Derefter, og træk det til metoden.
- Ved hjælp af trinnet Angiv global skal du angive værdi =(MobilePhase*Kolonner)+10 til variabel MobilePhaseWell.
- Klik på trinnet Angiv globalt på værktøjslinjen under Kontroltrin under Ellers,og træk det til metoden. Control Steps
- Brug trinnet Angiv global værdi =0 til variabel MobilePhaseWell ved hjælp af trinnet Angiv global
- Konfiguration af automatiseret labwareopsætning (GLS)
- Klik på trinnet Præsentationseditor på værktøjslinjen under Hjælpeprogrammer. Opret et nyt deck, der svarer til deckets layout i figur 3, og mærk det som dæk 1.
- Klik på trinnet Automatiseret installation på værktøjslinjen under Installation og enheder, og træk det til metoden. Træk og slip labwaretyperne i dækpositionerne som angivet i tabel 3. Fyld derefter fanerne i tabellen som vist i tabel 3 og Figur 4 (Opsætning af den styrede opsætning).
- Opsætning af procedure for optælling af tip
- Klik på trinnet Definer procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden. Navn procedure som TipCount.
- Klik Script på scripttrinnet på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden. Skriv VB-scriptet som angivet i figur 5 (script til optælling af tip).
- Klik på trinnet Hvis på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden.
- Under betingelser skal du skrive TL5 = 0.
- Klik Thenderefter på trinnet Flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Flyt labware fra TL5 til TR3. Klik på trinnet Flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Flyt labware fra TL2 til TL5. Endelig skal du klikke på trinnet Flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed og trække det til metoden. Flyt labware fra BC90 til TL2.
- Fastlæggelse af proceduren for inkubator
- Klik på trinnet Definer procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden. Navneprocedure som Inkubator.
- Skriv HalfTime som variabelnavn og 1800 som standardværdi.
- Skriv NextTemp som variabelnavn og 22 som standardværdi.
- Skriv temp som variabelnavn og 60 som standardværdi.
- Klik på trinnet Udvidet flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Flyt labware fra P11 til INHECO1.
- Klik på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden. Navneprocedure som TipCount.
- Klik på trinnet INHECO-inkubering på værktøjslinjen under Integrationer, og træk det til metoden. Indtast INHECO1 for at bruge anordningen ved position, =HalfTime for Incubate for, =Temp for °C og 3 for °C af måltemperaturen. Vælg shake mens inkubering mulighed og Orbital (med uret) ryste stil. For indstillinger skal du skrive 1,00 mm fra side til side, 6,6 gange i sekundet, 1,00 mm fremad annonce baglæns og 6,6 gange i sekundet.
BEMÆRK: Sørg for, at INHECO Incubator-softwaren er installeret. - Klik på trinnet INHECO-inkubering på værktøjslinjen under Integrationer, og træk det til metoden. Indtast INHECO1 for at bruge anordningen ved position, =HalfTime for Incubate for, =Temp for °C og 3 for °C af måltemperaturen. Vælg Shake mens inkubering mulighed og Orbital (Mod uret) ryste stil. For indstillinger skal du skrive 1,00 mm fra side til side, 6,6 gange i sekundet, 1,00 mm frem og tilbage 6,6 gange i sekundet.
- Klik på trinnet Afbryd midlertidigt på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Sæt hele systemet på pause i 1 s.
- Klik på trinnet Definer procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden. Navneprocedure som Inkubator.
- Klik på trinnet INHECO-inkubering på værktøjslinjen under Integrationer, og træk det til metoden. Indtast INHECO1 for at anvende anordningen ved position, 1 for Inkuber for, =NextTemp for °C og 3 for °C måltemperatur.
- Definition af procedure for Orbital.
- Klik på trinnet Udvidet flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Flyt labware fra P11 til Orbital1.
- Klik på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden. Vælg procedure TipCount.
- Klik på trinnet Enhedshandling på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Vælg Enhed OritalShaker0, Kommando TimedShake. Indtast rystehastighed 1000, Tid til at nå fuld hastighed 2, Tid til at ryste 30.
- Klik på trinnet Udvidet flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Flyt labware Orbital1 til P11.
- Opsætning af den første blanding
- Klik på trinnet Vælg tip på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden. Vælg omarranger position TL4.
- Klik på trinnet INHECO-inkubering på værktøjslinjen under Integrationer, og træk det til metoden. Indtast INHECO1 til brug af anordningen ved position, 1 for Inkubator for, 60 for °C og 3 for °C måltemperatur.
- Klik på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden i Trinnet Vælg tip. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som og 1 som Increment.
- Klik på trinnet Vælg tip indlæstips på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden inden for løkketrinnet. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1.
- Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkketrinnet. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =FirstMix, Aspirate i kolonne 1 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkketrinnet. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =FirstMix, dispenser i kolonne =kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip Fjern på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden inden for løkketrinnet. Vælg Fjern tip til TR1.
- Opsætning af prøverne
- Klik på trinnet Hvis på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden. Type SamplePlate som betingelse.
- Klik Thenpå trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv =tipkolonner.
- Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden indenfor. Vælg Greiner96RoundPS Labware Type og Prøver Position. Skriv i volumen =Sample, Aspirate i kolonne =FirstColumn og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden indenfor. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Skriv volumen =Prøve, dispenser i kolonne = FirstColumn og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip, aflæs på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden indenfor. Vælg Fjern tip til TR1.
- Når trinnet er afsluttet, skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække det til metoden. Vælg procedure kuvøse. Skriv HalfTime som variabelnavn og 1800 som standardværdi. Skriv NextTemp som variabelnavn og 22 som standardværdi. Skriv temp som variabelnavn og 60 som standardværdi.
- Opsætning af Cysteinblokken
- Klik på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden i Trin i Vælg tip. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End og 1 som Increment.
- Klik på trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin under Løkke,og træk det til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1.
- Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =CysteineMix, aspirat i kolonne 2 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Type i volumen = CysteineMix, dispensere i kolonne = kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip, aflæs på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden indenfor. Vælg Fjern tip til TR1.
- Når løkken er , skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække den til metoden. Vælg procedure kuvøse. Skriv HalfTime som variabelnavn og 300 som standardværdi. Skriv NextTemp som variabelnavn og 43 som standardværdi. Skriv temp som variabelnavn og 25 som standardværdi.
- Opsætning af det andet mix
- Klik på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden i Trin i Vælg tip. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End og 1 som Increment.
- Klik på trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin under Løkke, og træk det til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1.
- Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv i bind =SecondMix, Aspirate i kolonne 3 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Skriv i volumen = SecondMix, Dispenseri kolonne = kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip, aflæs på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden indenfor. Vælg Fjern tip til TR1.
- Når løkken er, skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække den til metoden. Vælg procedure Orbital.
- Klik på trinnet Afbryd midlertidigt på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Sæt hele systemet på pause i 1 s.
- Opsætning af Trypsin-tilføjelse
- Klik på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden i Trin i Vælg tip. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End og 1 som Increment.
- Klik på trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin under Løkke,og træk det til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1.
- Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =Trypsin, Aspirate i kolonne 4 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden i løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Skriv volumen =Trypsin, Dispenser i kolonne = kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip, aflæs på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden indenfor. Vælg Fjern tip til TR1.
- Når løkken er , skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække den til metoden. Vælg procedure kuvøse. Skriv HalfTime som variabelnavn og 3600 som standardværdi. Skriv NextTemp som variabelnavn og 25 som standardværdi. Skriv temp som variabelnavn og 43 som standardværdi.
- Klik på trinnet INHECO-inkubering på værktøjslinjen under Integrationer, og træk det til metoden. Sørg for, at INHECO Incubator-softwaren er installeret. Indtast INHECO1 til brug af anordningen ved position, 1 for Inkubator for, 25 for °C og 5 for °C måltemperatur.
- Opsætning af dæmpning
- Klik på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden i Trinnet Vælg tip. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End og 1 som Increment.
- Klik på trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin under Løkke,og træk det til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1.
- Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =Dæmpning, Aspirate i kolonne 5 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Skriv volumen =Dæmpning, Dispenser i kolonne = kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip Fjern på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden inden for Derefter. Vælg Fjern tip til TR1.
- Når løkken er, skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække den til metoden. Vælg procedure Orbital.
- Klik på trinnet Afbryd midlertidigt på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Sæt hele systemet på pause i 1 s.
- Klik på trinnet Afbryd midlertidigt på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Vælg Sæt hele systemet på pause, og vis denne meddelelse. Skriv meddelelsen 'Fortsæt efter centrifugering'.
- Opsætning af pladen til Autosampler
- Klik på trinnet Hvis på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden, i trinnet Vælg tip. Skriv Autosampler som betingelse.
- Klik Thenderefter på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End og 1 som Increment.
- Klik på trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin under Løkke,og træk det til metoden. Vælg BC230-tip, TL6-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1.
- Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =MobilePhase, Aspirate i kolonne 6 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg Bio_RadPCR96 Labware Type og Autosampler Plate Position. Skriv i volumen =MobilePhase, Dispensere i kolonne = kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip Fjern på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden inden for Derefter. Vælg Fjern tip til TR1.
- Når løkken er , skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække den til metoden. Vælg procedure TipCount.
- Klik på trinnet Vælg tip indlæsser tip på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv =tipkolonner.
- Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden i løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Skriv i volumen =DigestTransfer, Aspirate ved kolonne =første kolonne og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg Bio_RadPCR96 Labware Type og Autosampler Plate Position. Skriv i volumen =MobilePhase, Dispensere i kolonne =FirstColumn og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik.
- Klik på trinnet Vælg tip Fjern på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden i derefter. Vælg Fjern tip til TR1. Trinnet med valgte tip slutter her.
- Gem og navngiv metoden.
2. Klargør prøve, labware og reagenser
- 5 μL poolet sundt humant plasma overføres til en polypropylen, 96-Round Deep Well Plate.
BEMÆRK: Se Materialetabel for reagenser og forsyninger, der anvendes i denne protokol. TPCK Behandlet Trypsin blev købt og trypsin til substrat forhold og inkubationstid blev optimeret specifikt. Hvis der anvendes en anden grad af trypsin, såsom sekvenskvalitet rekombinant trypsin, bør enzymet til substratforholdet og inkubationstiden testes og optimeres.
3.
- Dobbeltklik på softwareikonet.
- Under fanen Metode skal du vælge Hjem alle akser for at orientere og forberede den automatiserede væskehandler. Sørg for, at alle arbejdsstationssprøjter ikke indeholder synlige luftbobler.
- Vælg Åbn | Metode.
- Vælg metoden (Figur 6).
- Start metoden ved at klikke på Run det grønne trekantsformede Run-ikon.
- Hvis der skal fremstilles en autosamplerplade i slutningen af metoden, skal du angive værdien 'true' i prompten Angiv en værdi, der skal bruges til prompten 'Autosampler', og derefter klikke på OK. Hvis der ikke forberedes en autosamplerplade, skal du angive værdien 'false' og derefter klikke på OK.
- Angiv værdien '1' i prompten Angiv en værdi, der skal bruges til prompten 'firstcolumn', og klik derefter på OK.
- Angiv værdien '12' i prompten Angiv en værdi, der skal bruges til prompten 'lastcolumn', og klik derefter på OK.
BEMÆRK: Dette trin og trin 4.7 fortæller arbejdsstationen at udføre en fordøjelse på 12 kolonner af en 96-brønd plade, hvilket resulterer i alle brønde af pladen, der anvendes til fordøjelsen - Hvis der bruges en prøveplade sammen med prøvemængder på mindst 20 μL, skal værdien 'true' indtastes i prompten Angiv en værdi, der skal bruges til prompten 'SamplePlate', og derefter klikke på OK. Hvis der ikke bruges en eksempelplade, skal du angive værdien 'false' og derefter klikke på OK.
BEMÆRK: Hvis der ikke anvendes en prøveplade, tilsættes der 5 μL prøve til hver tilsvarende brønd på reaktionspladen. - Følg vejledningen i vinduet Automatiseret Labware-opsætning, og klik på Fortsæt.
BEMÆRK: Det næste vindue beskriver layoutet for den "reagensplade", der skal udarbejdes (Figur 7, Supplerende tabel 1). Følgende bind vil blive aliquoted i hver af de 8 brønde af en enkelt kolonne i 1 ml Deep Round 96-brønd plade:
Kolonne 1: 540 μL reaktionsblanding 1.
Kolonne 2: 50 μL cysteinblok.
Kolonne 3: 730 μL reaktionsblanding 2.
Kolonne 4: 130 μL Trypsin.
Kolonne 5: 130 μL dæmpningsopløsning.
Kolonne 5: 1090 μL af mobil faseløsning (Hvis brugeren indtastede 'true' i trin 6). - Klik på Næste, og i det følgende vindue beskrives det mindste volumen (20 μL), der skulle aliciteres i prøvepladen. Hvis brugeren har angivet værdien 'false' for den prompt, der involverer prøvepladen (trin 9), bliver brugeren bedt om at tilføje 5 μL prøve til reaktionspladen.
- Klik på Næste.
BEMÆRK: Det næste vindue viser, at der skal placeres en tom 90 μL tipboks på det automatiske væskehåndteringsdæk. - Klik på Næste igen, udlægning af den automatiserede væskebehandlers dæk som angivet og illustreret (Figur 8), herunder reagenspladen, reaktionspladen, prøvepladen, autosamplerpladen, 6 fulde 90 μL tipkasser, en tom 90 μL tipboks og en fuld 230 μL tipboks.
- Klik på Udfør for at starte metoden.
BEMÆRK: Når du har klikket på Udfør, kan brugeren ikke nå ind i den automatiserede væskehandler. Dette vil "bryde maskinens lysgardin" og stoppe væskehåndteringen som en sikkerhedsforanstaltning. - Ved fortsæt efter centrifugeringsprompten skal reaktionspladen hentes og centrifugeres i 30 minutter ved 3.000 omdrejninger i minuttet.
- Når centrifugeringen er fuldført, returneres reaktionspladen til den automatiserede væskebehandler til den position, den befandt sig i før centrifugering, og klik på Fortsæt.
BEMÆRK: Den automatiske væskebehandler stopper igen, når metoden er færdig. Hvis brugeren har indtastet »true« for trin 6, kan autosamplerpladen fjernes fra arbejdsstationen og anbringes i autosampleren på et flydende kromatografiinstrument til analyse.
4. LC-MSMS
- Peptider på et højt flow HPLC bestående af et C18 2,1 mm x 100 mm, 3,5 μm søjle med en strømningshastighed på 0,25 ml/min og analyseret inline på et tredobbelt quadrupol massespektrometer.
BEMÆRK: Efter peptidfordøjelseer beskrives den målrettede LC-MSMS-metode til kvantificering af peptider fra robotfremstillede prøver i detaljer1 efter en kort beskrivelse af LC-MSMS. - Indstil kolonneovnstemperaturen til 40 °C. Brug buffer A (2% ACN, 98% vand, 0,1% myresyre) og buffer B (95% ACN, 5% vand, 0,1% myresyre) som de to mobile faser.
- Kolonnen skal kalibreres med 5% B i 5 minutter efter indlæsning. Elute peptiderne over 30 minutter med en lineær 5% til 35% gradient af buffer B.
- Gengør kolonnen, før den næste prøve tages i brug, ved at vaske med 98 % B i 10 minutter og derefter 5 % B i 5 minutter.
- Ved on-line-omdirigering skal du omstille eluent efter kolonnen til affald, før det kom ind i ionkilden ved hjælp af en tofaset koblingsventil.
- Behandl MRM-dataene.
Representative Results
Den automatiserede proteomics prøve forberedelse workflow på den automatiserede arbejdsstation blev tilpasset fra vores tidligere automatiserede protokol med en robust LC-SRM-MS erhvervelse metode1 for albumin, den valgte plasma protein, og β-galactosidase (β-gal), en udefrakommende protein, der anvendes til kvalitetskontrol. Efter behandling blev prøverne kørt på en tredobbelt quadrupole LC-MS i en SRM-analyse rettet mod serumalbumin, β-galactosidase. Variationskoefficienten (CV) af SRM-signal for hver overgang blev brugt til at overvåge reproducerbarheden af den automatiserede fordøjelsesprotokol.
Vi automatiserede reagenstilsætnings- og blandingstrinnene til en fordøjelse af 5 μL plasmaprøver med en 2-timers on-deck-inkubator trypsin inkubation. Til bestemmelse af reproducerbarheden blev 5 μL af en plasmapool pipetteret i flere brønde på en reaktionsplade med et flerkanalshoved (96 ben). For at overvåge for konsistens tilsatte vi β-gal-protein før reduktions- og alkyleringsreaktionsreaktionerne. Den automatiserede proteomics prøveforberedelsesarbejdsgang blev testet med en robust LC-SRM-MS-anskaffelsesmetode, herunder albumin, plasmaprotein med den højeste tæthed og β-gal-protein, der anvendes til kvalitetskontrol. Tre β-gal peptider og to albumin peptider blev overvåget fra forarbejdede plasma albumin proteiner og spiked β-gal protein (Tabel 4).
I et forsøg på at spare tid og forenkle proceduren reducerede vi de væskeoverførende trin til tilsætning/blanding/inkubation af reagens- og reaktionsblanding med arbejdsstationen fra en ni-trins arbejdsgang til en sekstrinsarbejdsproces (Figur 1). Den samlede proteomiske arbejdsgang bestod af to eksperimentelle komponenter: automatiseret prøveforberedelse og LC-MS/MS. For det første evaluerede vi præcisionen af LC-MS/MS SRM-dataindsamling med otte på hinanden følgende injektioner fra samme fordøjelsesbrønd på autosamplerpladen. Præcisionen af den automatiserede arbejdsgang for forberedelse af prøveforberedelse blev beregnet ud fra varianskoefficienten (%CV) af den samlede proteomiske SRM-arbejdsproces minus %CV for LC-MS/MS (Figur 9B). Med den strømlinede plasmafordøjelsesprocedure på den automatiserede arbejdsstation var den eksperimentelle præcision af præparatet af automatiserede prøver mindre end 11,4 % for udefrakommende spidse β-gal-proteiner (10,0 % som gennemsnit) og mindre end 14,9 % for det mest udbredte humane serumalbumin (9,9 % som gennemsnit) (figur 9). Der blev observeret gode signalintensiteter for både humant serum albumin og β-gal proteiner som forventet (Figur 9C).
For hvert pipetterings- og væskeoverførselstrin blev teknikkerne specielt optimeret. For at overvåge præcisionen af væskeoverførsel trin, vi spiked stabil isotop-mærket (SIL) peptid standarder for endogene menneskelige serum albumin protein og eksogen e-gal protein i tre uafhængige reagens overførsel trin: Reaction Mix 1, Cystein Blocker, og Reaction Mix 2 (Figur 10). MRM signaler fra disse fem SIL peptider blev erhvervet for at overvåge præcisionen af automatiserede flydende overføre trin. Den gennemsnitlige %CV for peptider, DDNPNLPR^, og GDFQFNISR^ (^ repræsenterer N15 mærket aminosyre) fra Reaction Mix 1 trin varierede fra 1,8% til 11,2%. Den gennemsnitlige %CV for et peptid (IDPNAWVER^) fra Cysteinblocker-trinnet varierede fra 6,6 % til 8,8 %. Den gennemsnitlige %CV for to peptider (WVGYGQDSR^ og LVNEVTEFAK^) varierede fra 6,2% til 11,9% (Figur 10).
For at validere den automatiserede proteomics prøveforberedelsesarbejdsgang evaluerede vi reproducerbarhed på tværs af flere proteiner og flere dage for humant serum albumin, eksogen β-gal og 40 yderligere plasmaproteiner. Vi behandlede 21 replikatprøver (samlet normalt humant plasma), godt sted vist i figur 11A,på tre forskellige dage. Intra-dag CV'er blev beregnet ud fra 21 brønde, der blev udarbejdet samme dag. Den gennemsnitlige intradag %CV'er for 40 proteiner varierede fra 4% - 20% (Figur 11B). For at evaluere kanteffekten af den pladebaserede automatiserede arbejdsgang blev %CV beregnet ud fra bestemte brønde i bestemte kolonner og rækker (Figur 12A for søjle- og rækkekort). MRM-signalintensiteterne var ens i alle kolonne- og rækkekonfigurationer med %CV fra 3 % - 22 % (figur 12B).
Sammenfattende giver den optimerede automatiserede arbejdsgang 96 ensartet behandlede prøver på mindre end fem timer med fremragende eksperimentel præcision. For kompatibilitet med en automatiseret arbejdsgang, valgte vi reagenser, der har ubetydelige ikke-specifikke sidereaktioner, er stabile i omgivende lys, er LC-MS / MS venlige, og kan opbevares som frosne aliquots.
Figur 1: Skema over arbejdsgang for forberedelse af eksempler. De vigtigste 6 væskeoverføringstrin er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tip lastning Script. VB Script-detaljerne vises her. Scriptet angiver betingelser for indlæsning af spidser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Automatiseret layout af arbejdsstationsdæk. Decket består af 1x1 ALPs, Tip Loading ALPs, Trash, Tip wash, Peltier og en inkubator. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Reagenspladens egenskaber. Viste egenskaber er nødvendige for Reagent Plate labware, når der åbnes ved hjælp af Guided Labware Setup. Vælg den tilsvarende kolonne, og skriv variablerne som angivet i figuren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Tip optælling script. Dette script hjælper med at holde styr på antallet af tips på dækket. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Oversigt over metoden til fordøjelse og aliquoting af plasmaprøver. Trin til reagensberegninger, labwareopsætning og flydende manipulationer i væskebehandlerens metode. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Reagenspladens opstilling. Vist er de kemiske reagenser er nødvendige for plasma fordøjelse og autosampler forberedelse og fordelt på tværs af reagensplade labware. Dette tal er blevet ændret ud fra en teknisk note10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Layout til labware på dækket af den automatiserede arbejdsstation. Vist er dækket layout for plasma fordøjelse metode til flydende handleren. Dette tal er blevet ændret ud fra en teknisk note10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Præcisionen af den samlede proteomiske arbejdsgang består af arbejdsstations-CV og målrettet LC MS/MS CV.
Fem peptider fra β-gal og albumin blev overvåget, kromatogrammer og peptid retention tid for hvert peptid er vist (A), Precision blev bestemt fra 30 brønde / prøver forarbejdning repræsentative eksperiment, CV'er% for total proteomic workflow, LC MS / MS analyse og automatiseret prøve behandling blev beregnet (B). Samlet set viste de fordøjede peptider gode signaler varierede fra 1x105 op til 1x108. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Bestemmelse af præcision for væskeoverførende trin. Syntetiske peptider blev spiked i trin specifikke reagenser, og automatiseret væskeoverførsel blev bestemt af total%CV. Fra 30 brønde / prøver eksperiment minus% CV LC MSMS (bestemt af 8 gentage LC MSMS injektioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Multi-dages reproducerbarhed af automatiseret proteomisk prøveforberedelsesarbejdsgang med 42 protein MRM-analyse. (A) Reaktionsplade kort for hver af tre dage er vist her, 5 μL plasma blev tilføjet til hver af 21 brønde. 3 brønde modtaget 5 ul vand blev brugt som negative / blankkontrol. (B) Den gennemsnitlige intensitet af 190 overgange består af 75 peptider og 42 proteiner (venstre) og%CV for hver MRM overgang blev beregnet fra 21 brønde fordøjelse for hver dag (højre). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: Reproducerbarhed af bestemte steder af brønde (placering af kolonner og rækker). (A) Kolonner og rækker placering med en plade kort vises her. (B) Kolonne- og rækkeplaceringsspecifikke MRM-signaler med gennemsnitlige intensiteter fra bestemte brønde (venstre) og cv% (højre) fra en enkelt pladefordøjelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 13: Skærmbillede af teknikeditor. For hver Pipetting skabelon, definere egenskaberne for væskeniveau sensing, Clot afsløring, Piercing, Flydende Type, General, Aspirate, Dispensere, Mix og Kalibrering. Den skabelon og de teknikker, der anvendes i denne protokol, er vist i supplerende tabel 2). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Variabel | Variabel | Værdi | Beskrivelse |
| Autosampler | Boolesk | Sandt | Brug autosampler |
| Betagal | Heltal | 5 | Betagalvolumen |
| BG1 (BG1) | Heltal | 0.8 | BG1 volumen |
| BG2 (BG2) | Heltal | 0.8 | BG2-volumen |
| BG3 (BG3) | Heltal | 0.8 | BG3-volumen |
| CysteinBlocker (CysteinBlocker) | Heltal | 1.25 | Cystein blokker volumen |
| CysteineBuffer | Heltal | 0.45 | Cysteinbufferdiskenhed |
| Denatureringsmiddel | Heltal | 5 | Denatureringsvolumen |
| DigestTransfer | Heltal | 10 | Fordøje overførselsvolumen |
| Første buffer | Heltal | 25.9 | Første bufferdiskenhed |
| Første kolonne | Heltal | 1 | Første kolonne |
| HSA1 (HSA1) | Heltal | 0.8 | HSA1-volumen |
| HSA2 (HSA2) | Heltal | 0.8 | HSA2-volumen |
| sidstekolonne | Heltal | 12 | Sidste kolonne |
| MobilePhase (Mobilfase) | Heltal | 90 | Lydstyrke for mobil fase |
| Slukke | Heltal | 10 | Forsudt-kolonne |
| ReducingAgent | Heltal | 5 | Kolonnen Reduktion af agent |
| Prøve | Heltal | 5 | Eksempel kolonne |
| PrøvePlade | Boolesk | Sandt | Brug prøveplade |
| AndenBuffer | Heltal | 58.4 | Anden bufferdiskenhed |
| Trypsin | Heltal | 10 | Kolonnen Trypsin |
Tabel 1: Variabler for starttrin
| Værdi | Variabel |
| =FirstBuffer+Denaturant+ReducingAgent+Betagal+BG1+HSA1 | FirstMix |
| =CysteineBlocker+CysteineBuffer+BG2 | CysteineMix (CysteineMix) |
| =SecondBuffer+BG3+HSA2 | AndenBlanding |
| =(FirstMix*Kolonner)+30 | FirstMixWell (FirstMixWell) |
| = (Cysteinmix*Kolonner)+20 | CysteineWell (CysteineWell) |
| =(SecondMix*Kolonner)+10 | SecondMixWell (SecondMixWell) |
| =(Trypsin*Kolonner)+10 | TrypsinWell |
| =(Dæmpning*Kolonner)+10 | QuenchWell |
| =(FirstMixWell*8)+100 | FirstMixStock |
| =CysteineWell*8+20 | CysteineMixStock |
| =(SecondMixWell*8)+100 | AndenBlandelager |
Tabel 2: Volumenmixvariabler
| Type | Navn | Position | Dybde | Egenskaber | Bruge? |
| BCDeep96Rund | Reagensplade | Kr. | 1(øverst) | # | =ikke SamplePlate |
| BCDeep96Rund | Reagensplade | Kr. | 1(øverst) | # | =PrøvePlade |
| BCDeep96Rund | Reaktionsplade | Kr. | 1(øverst) | Sandt | |
| Bio_RadPCR96* | Prøver | Kr. | 1(øverst) | =PrøvePlade | |
| Bio_RadPCR96* | Autosampler plade | Kr. | 1(øverst) | =Autosampler | |
| kr. | Tom | 1(øverst) | Sandt | ||
| kr. | 1(øverst) | Sandt | |||
| kr. | 1(øverst) | Sandt | |||
| kr. | 1(øverst) | =Autosampler | |||
| kr. | 1(øverst) | =Kolonner>1 | |||
| kr. | 1(øverst) | =Kolonner>3 | |||
| kr. | 1(øverst) | =Kolonner>5 | |||
| kr. | 1(øverst) | =Kolonner>7 | |||
| kr. | 1(øverst) | =Kolonner>9 | |||
| Bemærk: *: Svarer til 96 brønden Bio-Rad plade. #: Klik på egenskaber, og angiv derefter volumenvariablerne som angivet i figur 6. |
|||||
Tabel 3: Opsætning af den styrede opsætning
| Protein ID | Peptid sekvens | Q1 Masse (Da) | Q3 Masse (Da) | Tid (min) | Fragment Ion | Potentiale for declusterering | Kollisionsenergi | Potentiale for afslutning af kollisionscelle |
| sp| P00722. BGAL_ELOCI | GDFQFNISR | 542.3 | 262.1 | 19.7 | +2y2 | 61 | 21 | 8 |
| 542.3 | 636 | 19.7 | +2y5 | 61 | 25 | 12 | ||
| 542.3 | 764.2 | 19.7 | +2y6 | 61 | 25 | 18 | ||
| IDPNAWVER delte et link. | 550.3 | 436.1 | 18.1 | +2y7+2 | 61 | 23 | 8 | |
| 550.3 | 871.2 | 18.1 | +2y7 | 61 | 25 | 18 | ||
| 550.3 | 774.2 | 18.1 | +2y6 | 61 | 33 | 8 | ||
| WVGYGQDSR delte et antal fejl | 534.3 | 782.1 | 12.1 | +2y7 | 51 | 25 | 6 | |
| 534.3 | 562.1 | 12.1 | +2y5 | 51 | 27 | 6 | ||
| 534.2 | 505.2 | 12.1 | +2y4 | 90 | 25 | 8 | ||
| sp| P02768. ALBU_HUMAN | DDNPNLPR | 470.8 | 596.2 | 9.2 | +2y5 | 61 | 27 | 16 |
| 470.8 | 499.3 | 9.2 | +2y4 | 61 | 27 | 18 | ||
| 470.8 | 710.4 | 9.2 | +2y6 | 61 | 27 | 18 | ||
| LVNEVTEFAK (LVNEVTEFAK) | 575.3 | 694.4 | 18.2 | +2y6 | 73.1 | 29.6 | 18 | |
| 575.3 | 937.5 | 18.2 | +2y8 | 73.1 | 29.6 | 18 | ||
| 575.3 | 823.4 | 18.2 | +2y7 | 73.1 | 29.6 | 18 |
Tabel 4: MRM-parametre
Supplerende tabel 1: Reagensplade Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2: Protokolskabelon Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Prøvebehandling for massespektrometri kræver proteindenaturering, reduktion og alkylering for at blokere cysteiner og trypsinfordøjelse for at kløve proteiner til peptider. Hver kemisk eller enzymatisk reaktion skal påbegyndes på et bestemt tidspunkt og udføres ved en kontrolleret temperatur, og hvert trin i processen omfatter flere væskeoverførselstrin, hvor der kan indføres eksperimentel variation. Automatiseret prøvebehandling giver en løsning på dette dilemma. I øjeblikket er der tilgængelige væskehåndteringssystemer, der kan overføre reagenser til 96 brøndsplader med en nøjagtighed og præcision på mindre end 5 %, afhængigt af den anvendte hoved- og spidstype, og til at inkubere prøver med omgivelse, hvis det ønskes, under kontrollerede temperaturer fra 14 °C til 70 °C. Vi brugte en automatiseret væskehandler til at behandle plasma til SRM-analyser i et 96-brøndformat.
Der er mange tusinde protease spaltning steder inden for de komplekse blandinger af proteiner i serum, plasma og andre biologiske prøver; og hver af disse proteiner har unikke egenskaber, der påvirker disspaltende site tilgængelighed og stabiliteten af de resulterende peptider. Det er derfor umuligt at designe en prøvebehandlingsprocedure, der er optimal for hvert protein. Det bedste alternativ er at være så konsekvent som muligt.
For at opnå konsistens optimerede vi hvert pipetteringstrin udført af den automatiserede væskehandler. Vi overvejede først den nødvendige mængde og de begrænsninger, der blev pålagt af væskens type (plasma, vandige eller organiske) og tilsvarende egenskaber (viskositet, samhørighed og volatilitet), hardware (arbejdsstation pipettering-hoved og plade-sensationsprægede arme) og labware. Vi varierede derefter hastighed og efterfølgende lufthul for aspiration, hastighed og blowout volumen for dispensering, og den kraft og varighed af blanding, samtidig med at en spids touch efter aspiration og / eller udlevering, hvis det er nødvendigt, at fjerne væske, der tilfalder ydersiden af spidserne (Figur 13, Supplerende Tabel 1). Et unikt SIL peptid, forscreenet for stabilitet, blev sat ind i hvert reagens for at gøre det muligt at overvåge præcisionen af hvert væskehåndteringstrin. Efter optimering var proces-CV'erne for de fleste overgange mindre end 10 %, hvilket viser god reproducerbarhed med den automatiserede arbejdsstation (figur 9, figur 10, figur 11 og figur 12).
Den automatiserede arbejdsgang, der præsenteres her, giver mulighed for ensartet enzymatisk fordøjelse med forbedret reproducerbarhed og gennemløb sammenlignet med manuelle metoder (figur 9, figur 10). Denne tilgang lover at forbedre nøjagtigheden og pålideligheden af biomarkør opdagelse og validering af massespektrometri.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A Pooled healthy human plasma | Bioreclamation Inc. | human plasma tested in the manuscript | |
| Acetonitrile, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | A998SK1 | LC MS/MS solvent |
| B-Galactosidase Recombinant from E.Coli | Sigma-Aldrich | G3153-5MG | exogenous control proteins. |
| Biomek i7 Automated Workstation | Beckman Coulter, Inc. | The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions | |
| Biomek i-Series Tips 230µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85903 | Tips, i7 consumable |
| Biomek i-Series Tips 90µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85881 | Tips, i7 consumable |
| FG, Kit Trypsin TPCK | Sciex | 4445250 | Trypsin used in digestion |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | #hsp9641 | Autosampler plate |
| Octyl B-D-Glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O9882-5G | detergent used in digestion |
| Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile | Beckman Coulter, Inc. | 267007 | Reagent and digestion plate |
| Prominence UFLCXR HPLC system | Shimadzu, Japan | High flow LC sytem | |
| QTRAP 6500 | SCIEX | Mass spectrometer | |
| Water, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | W54 | LC MS/MS solvent |
| Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm | Waters | 186003564 | LC MSMS column |
References
- Fu, Q., et al. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Lehmann, S., et al. Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold? Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Yates, J. R. 3rd Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).
- Nilsson, T., et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).
- Van Eyk, J. E., Sobhani, K.
- Hoofnagle, A. N., et al. Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays. Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).
- Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series. Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).
