Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/59842
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Advanced Clinical Biosystems Institute, Smidt Heart institute, Cedars Sinai Medical Center, 2Beckman Coulter Life Sciences

Summary

כאן, אנו מציגים שיטת העיכול האוטומטית של חלבון פלזמה לניתוח מבוסס ספקטרומטר מערכות מבוססות-פרוטאומית כמותית. בפרוטוקול זה, שלבי העברת הנוזלים והדגירה עבור הדנטורציה של חלבונים, הפחתה, האלקילציה וטריפסין תגובות לעיכול הם יעילים ואוטומטיים. זה לוקח בערך חמש שעות להכין צלחת 96-באר עם דיוק הרצוי.

Abstract

הכנה לדוגמא לניתוח ספקטרומטר המסה בפרוטאומניקס דורשת מחשוף אנזימטי של חלבונים לתערובת פפטיד. תהליך זה כולל מספר רב של תהליכי דגירה והעברת נוזלים על מנת להשיג דנטורציה, הפחתה, האלקילציה והמחשוף. התאמת זרימת עבודה זו לתחנת עבודה אוטומטית יכולה להגביר את היעילות ולצמצם את מקדמי השונות, ובכך לספק נתונים אמינים יותר להשוואות סטטיסטיות בין סוגי דגימה. בעבר תיארנו הכנה לדוגמה של פרוטאומית אוטומטית1. כאן, אנו מדווחים על פיתוח של זרימת עבודה יעילה ומבוקרת יותר עם היתרונות הבאים: 1) מספר צעדי ההעברה הנוזליים מצטמצם מ -9 עד 6 על-ידי שילוב ריאגנטים; 2) זמן הליטוף מופחת באמצעות טיפ סלקטיבי ליטוף באמצעות מ96 מיקום מראש עם ערוצים מרובים; 3) תפוקה פוטנציאלית מוגברת על-ידי הזמינות של עד 45 עמדות הסיפון; 4) המארז המלא של המערכת מספק טמפרטורה משופרת בקרת הסביבה ומפחית את הפוטנציאל לזיהום של דגימות או ריאגנטים; ו-5) התוספת של איזוטופ יציב המכונה פפטידים, כמו גם חלבון β-גלטוסידאז, לכל מדגם עושה ניטור ובקרת איכות אפשרי בכל התהליך כולו. שיפורים אלה בחומרה ובתהליך מספקים מענה טוב לתוכנה ומשפרים את הדיוק בתוך הספק והאיכות הבין-שיטת (CV) של פחות מ -20%) עבור מבוסס LC-MS חלבון וכימות פפטיד. את זרימת העבודה כולה לעיכול 96 דגימות בצלחת 96-באר ניתן להשלים בערך 5 שעות.

Introduction

חלבון מבוסס ספקטרומטריה (MS) מבוססי חלבונים וכימות פפטיד מיושם יותר ויותר ככלי יואנליטיים עבור ניתוח פלזמה במחקר בסיסי מעבדות קליני2,3. מיכשור ואינפורמטיקה המחויבים יש מתקדמים במהירות כמו MS הפכה את השיטה של בחירה עבור כימות חלבונים או חלבונים שונה על ידי התמקדות רצפי פפטיד ספציפיים בשל יכולתה לכמת מאות פפטידים בהפעלה אחת MS4. ההכנה לדוגמא משמשת כבסיס לניתוח הפרוטאומית כלשהו. לפני הניתוח MS, החלבונים במדגם ביולוגי הם בדרך כלל באופן מצומצם, מופחת, האלקין, מתעכל לתוך פפטידים טריפטיים, ו התפלה5. אלקיללציה חוסם cysteines כדי למנוע שינויים בלתי מבוקרת ולהבטיח לכל cysteines יש מסה זהה. לאחר מכן, טריפסין מתווסף כדי לעכל חלבונים לתוך פפטידים. כל אחד מהצעדים הללו מחייב אופטימיזציה, והתהליך כולו מבוצע באופן מסורתי ידנית, ומאפשר הקדמה של שגיאות אנליטיות.

צינור הפיתוח המסורתי בסמנים מורכב משני תהליכים עיקריים: פרוטאומיקס רובה עבור גילוי חלבון גלובלי כדי ליצור מלאי חלבון מעמיק6 ו פרוטמרים ממוקדות עבור אימות ואימות מכוון בדיוק גבוהה ותפוקה גבוהה של חלבון ככמת7. ללא קשר לגישה MS, הכנת המדגם הוא אותו ומרכזים על מחשוף אנזימטי של חלבונים לתוך תערובת פפטיד. כפי שהוצע על ידי ואן Eyk ו סוהני8, לאחר שיטה המאפשרת ניתוח מדויק, מדויק, ולאחר החשיפה הן לגילוי ממוקד הרצוי ביעילות לעבור בדיקות ביואריטים של גילוי קליני מיושם. לשם כך, אוטומציה של הכנה לדוגמה תהיה מועילה ותספק את היכולת להגביר את היעילות לניתוח בתפוקה גבוהה. שיטות ידניות מציגות בדרך כלל שגיאות אנליטיות מעבר למגבלות המקובלות שנקבעו על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) בהנחיות אימות השיטות הביואנליטיות המתוקנים, הכוללות סמנים ודיאגנוסטיקה2,9. הפיתוח של מהיר, מאוד מדויק, ואת הידיים ללא מדגם MS חלבון הכנה לדוגמה יהיה צורך להקל על מחקר ביולוגי, אשר דורש הכנת וניתוח אלפי דגימות ביולוגיות. הכנה לדוגמה MS יש שלבים רבים שבהם ניתן להציג שגיאות, והתהליך הוא מייגע וגוזלת זמן.

בשיטה המשופרת שלנו, תחנת עבודה אוטומטית הייתה מתכנתים לבצע את כל הליכי ההכנה לדגימת פלזמה הדרושים בסך של 6 צעדים (איור 1) כדי להבטיח: 1) העברות נוזלים מדויקות; 2) התגובה מתחילה ומופסקת בזמן עקבי; 3) התגובה מבוצעת בטמפרטורה מבוקרת (כלומר, חממה); ו -4) לתגובה יש ערבוב אחיד לכל התגובות. אנו מיושמים גם הוספת בקרת איכות אקסוגני חלבונים ותקנים פנימיים (תקני האיזוטופ מסומן על-ידי האיזוטופים) כדי להבטיח תפוקה באיכות ובלתי מזדהות של חלבון מבוסס LC-MS ו-פפטיד לכמת בפורמט 96. כולל הכנה מגיב, שעות של זמן עבודה וכולל סך של 1,000,000 ליטוף צעדים יידרש לעבד 96 דגימות בצינורות בודדים. אוטומציה מפחיתה את הזמן ומספר האינטראקציות האנושיות הכרוכות בכך.

Protocol

1. תכנות למטפל בנוזלים אוטומטי

  1. צור שיטה חדשה מתפריט קובץ (קובץ | שיטה חדשה)
    הערה: השלם את השלבים בסדר הנתון. הגופן הנטוי מציין טקסט להקלדה בתוכנת ביוסק. אנא צרו קשר עם המחברים לקבלת מידע אודות טכניקות ליטוף ותבניות.
  2. הקלד משתני שלב התחלה וערכיהם בשלב ההתחלה כמפורט בטבלה 1.
  3. קבע עמודות לליטוף עצות סלקטיבי. עבור השלבים 1.3-1.7, לחץ על הגדרת שלב גלובלי בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות.
    1. באמצעות הגדרת שלב גלובלי , הגדר ערך = העמודה הראשונה למשתנה FirstColumn_Global, ערך = משפחה1 למשתנה LastColumn_Global, ערך = עמודה ראשונה בעמודה מרבית + 1 לעמודותמשתנה וערך = עמודות * 8 לבארותמשתנים.
    2. בחר בשלב ה- Script בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. הקלד את ה-VB script כפי שמצוין באיור 2.
  4. הגדרת אמצעי אחסון עבור מתערבב הגדרת פתרונות כוללים וכלליים.
    1. באמצעות ההגדרה שלב גלובלי , הגדר את הערכים המתאימים למשתני ערבוב אמצעי האחסון כפי שמוצג בטבלה 2.
    2. לחץ על הלחצן אם שלב בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. תחת תנאים, הקלד דוגם אוטומטי.
    3. תחת לאחר מכן, לחץ על הגדרת השלב הכללי בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותה לפעולת השירות.
    4. באמצעות ' קבע שלב גלובלי ', הגדר ערך =(mobilephase עמודות *)+ 10 כדי משתנה mobilephaseבאר.
    5. תחת אחר, לחץ על הגדרת השלב הכללי בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות.
    6. שימוש בקביעת השלב הגלובלי , הגדרת ערך = 0 למשתנה מובייל הוסבאר
  5. הגדרת תצורה של התקנה מודרכת לכלי (GLS)
    1. לחץ על השלב ' עורך הסיפון ' בסרגל הכלים תחת כלי שירות. צור חפיסה חדשה שיתאימו לפריסת החפיסה באיור 3 ותייג אותה כחפיסה 1.
    2. לחץ על שלב ההתקנה המודרכת בסרגל הכלים תחת ההתקנה & התקנים וגרור אותו לפעולת השירות. גרור ושחרר את סוגי עבדה אספקה בעמדות הסיפון כפי שמצוין בטבלה 3. לאחר מכן, מלא את הכרטיסיות בטבלה כפי שמוצג בטבלה 3 ובאיור 4 (הגדרת הכיוונון המודרך).
  6. הגדרת פרוצדורה עבור ספירת עצות
    1. לחץ על הגדרת שלב הפרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותה לפעולת השירות. הליך שמות כמונה עצות.
    2. לחץ על שלב ה-Script בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. הקלד את ה-VB script כפי שמצוין באיור 5 (קובץ script של ספירת עצות).
    3. לחץ על הלחצן אם שלב בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות.
    4. תחת תנאים, הקלד TL5 = 0.
    5. תחת לאחר מכן, לחץ על המהלך שלב labware בסרגל הכלים תחת התקנה & שלבי התקן שלבים וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה מ TL5 כדי TR3. לחץ על הזזת שלב Labware בסרגל הכלים, תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה מ TL2 כדי TL5. לבסוף, לחץ על העבר שלב Labware בסרגל הכלים תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה מ BC90 כדי TL2.
  7. הגדרת נוהל לחממה
    1. לחץ על הגדרת שלב הפרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותה לפעולת השירות. הליך שמות כחממה.
    2. הקלד במחצית כשמות משתנים ו- 1800 כערך ברירת מחדל.
    3. הקלד בטמפ ' הזמן הבא כשמות משתנים ו- 22 כערך ברירת מחדל.
    4. הקלד temp כשם משתנה ו- 60 כערך ברירת מחדל.
    5. לחץ על צעד Labware המשופר בסרגל הכלים תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה מ P11 כדי INHECO1.
    6. לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. הליך שמות כמונה עצות.
    7. לחץ על הצעד הנמצא בתוך הסרגל הכלים מתחת לתוספות וגרור אותו לפעולת השירות. סוג ב INHECO1 עבור השימוש במכשיר במיקום, = המחצית עבור מודטה עבור, = Temp עבור ° צ' ו 3 עבור ° c של טמפרטורת היעד. בחרו באפשרות ' טלטול ' ובסגנון הטלטול האורביטל (כיוון השעון). עבור הגדרות, הקלד 1.00 mm מצד לצד, 6.6 פעמים בשנייה, 1.00 mm העברת מודעות לאחור ו 6.6 פעמים בשניה.
      הערה: ודא כי תוכנת החממה INהאו מותקנת.
    8. לחץ על הצעד הנמצא בתוך הסרגל הכלים מתחת לתוספות וגרור אותו לפעולת השירות. סוג ב INHECO1 עבור השימוש במכשיר במיקום, = המחצית עבור מודטה עבור, = Temp עבור ° צ' ו 3 עבור ° c של טמפרטורת היעד. בחר את הניעור תוך כדי האפשרות לנער את סגנון הטלטול והכיוון האורביטל (נגד כיוון השעון). עבור הגדרות, הקלד 1.00 mm מצד לצד, 6.6 פעמים בשנייה, 1.00 mm הלוך ושוב ב 6.6 פעמים בשנייה.
    9. לחץ על שלב ההשהיה בסרגל הכלים תחת תוכנית ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. השהה את כל המערכת עבור 1 s.
    10. לחץ על הגדרת שלב הפרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותה לפעולת השירות. הליך שמות כחממה.
    11. לחץ על הצעד הנמצא בתוך הסרגל הכלים מתחת לתוספות וגרור אותו לפעולת השירות. סוג ב INHECO1 עבור השימוש בהתקן במיקום, 1 עבור מודל עבור, = השעה הראשונה עבור ° צ' ו 3 עבור ° c של טמפרטורת היעד.
  8. . הגדרת נוהל לאורביטל
    1. לחץ על צעד Labware המשופר בסרגל הכלים תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה מ P11 כדי Orbital1.
    2. לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר את ספירת העצות של השגרה.
    3. לחץ על שלב הפעולה של ההתקן בסרגל הכלים תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. בחר התקן OritalShaker0, מחיצת זמן פקודה. הזן מהירות לרעוד 1000, הזמן להגיע מהירות מלאה 2, זמן לנער 30.
    4. לחץ על צעד Labware המשופר בסרגל הכלים תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה Orbital1 כדי P11.
  9. הגדרת התמהיל הראשון
    1. לחץ על הצעד בחירת עצה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות. בחר סידור מחדש של מיקום TL4.
    2. לחץ על הצעד הנמצא בתוך הסרגל הכלים מתחת לתוספות וגרור אותו לפעולת השירות. סוג ב INHECO1 לשימוש המכשיר במיקום, 1 עבור מודטה עבור, 60 עבור ° צ' ו 3 עבור ° c של טמפרטורת היעד.
    3. לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך שלב בחירת עצה. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    4. לחץ על השלב בחירת עצות לטעינת עצות בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות, בשלב הלולאה. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    5. לחצו על הצעד ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' תחת ' שלבי ניהול נוזלים ' וגררו אותה לשיטה, בשלב הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. הקלד ב-volume = התמהילהראשון, שליף בטור 1 ובשורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    6. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בשלב הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. סוג ב-volume = התמהיל הראשון, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    7. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בשלב הלולאה. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
  10. התקנת הדגימות
    1. לחץ על הלחצן אם שלב בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. הקלד סמלפלייט כתנאי.
    2. תחת לאחר מכן, לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינת טיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) בודדת והקלד = עמודותמסוג.
    3. לחצו על הצעד ' בחר עצות לגבי השלבים ' בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך אז. בחר Greiner96RoundPS סוג Labware ומיקום דגימות. הקלד באמצעי אחסון = מדגם, שולי העמודה הראשונה ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    4. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר BCDeep96Round Labware סוג ולוחית התגובה מיקום. סוג באמצעי אחסון = לדוגמה, מוותר על עמודה = עמודה ראשונה ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    6. לאחר סיום ה- If step, לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר באפשרות ' חממה '. הקלד במחצית כשמות משתנים ו- 1800 כערך ברירת מחדל. הקלד בטמפ ' הזמן הבא כשמות משתנים ו- 22 כערך ברירת מחדל. הקלד temp כשם משתנה ו- 60 כערך ברירת מחדל.
  11. הגדרת בלוק ציסטאין
    1. לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך שלב העצה בחר. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    2. תחת לולאה, לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינת טיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    3. לחצו על השלב ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' מתחת לצעדים באמצעות מענה נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. סוג בכרך = Cysteinemix, משבית בטור 2 ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    4. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round סוג Labware התגובה צלחת מיקום. סוג בכרך = Cysteinemix, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    6. לאחר סיום הלולאה If , לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי הבקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר באפשרות ' חממה '. הקלד במחצית כשמות משתנים ו- 300 כערך ברירת מחדל. הקלד בטמפ ' הזמן הבא כשמות משתנים ו- 43 כערך ברירת מחדל. הקלד temp כשם משתנה ו- 25 כערך ברירת מחדל.
  12. הגדרת התמהיל השני
    1. לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך שלב העצה בחר. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    2. תחת לולאה, לחץ על השלב בחירת עצות לטעינת עצות בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    3. לחצו על השלב ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' מתחת לצעדים באמצעות מענה נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. סוג בכרך = שניות לערבב, ומערבביםבטור 3 ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    4. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ולוחית התגובה מיקום. סוג באמצעי אחסון = שניות לערבב, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    6. לאחר סיום הלולאה If , לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי הבקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר פרוצדורה מסלולית.
    7. לחץ על שלב ההשהיה בסרגל הכלים תחת תוכנית ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. השהה את כל המערכת עבור 1 s.
  13. הקמת הוספת טריפסין
    1. לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך שלב העצה בחר. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    2. תחת לולאה, לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינת טיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    3. לחצו על השלב ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' מתחת לצעדים באמצעות מענה נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. סוג באמצעי האחסון = טריפסין, ומטה בטור 4 ובשורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    4. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ולוחית התגובה מיקום. סוג באמצעי אחסון = טריפסין, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    6. לאחר סיום הלולאה If , לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי הבקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר באפשרות ' חממה '. הקלד במחצית כשמות משתנים ו- 3600 כערך ברירת מחדל. הקלד בטמפ ' הזמנית כשמות משתנים ו- 25 כערך ברירת מחדל. הקלד temp כשם משתנה ו- 43 כערך ברירת מחדל.
    7. לחץ על הצעד הנמצא בתוך הסרגל הכלים מתחת לתוספות וגרור אותו לפעולת השירות. ודא שתוכנת החממה INהאו מותקנת. סוג ב INHECO1 לשימוש המכשיר במיקום, 1 עבור מודטה עבור, 25 עבור ° צ' ו 5 עבור ° צ' של טמפרטורת היעד.
  14. הגדרת מקוצ'ינג
    1. לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך שלב בחירת עצה. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    2. תחת לולאה, לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינת טיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    3. לחצו על השלב ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' מתחת לצעדים באמצעות מענה נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. סוג באמצעי אחסון = כיבוי, שליף בטור 5 ובשורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    4. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round סוג Labware התגובה צלחת מיקום. סוג באמצעי אחסון = כיבוי, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    6. לאחר סיום הלולאה If , לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי הבקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר את מסלולהפרוצדורה.
    7. לחץ על שלב ההשהיה בסרגל הכלים תחת תוכנית ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. השהה את כל המערכת עבור 1 s.
    8. לחץ על שלב ההשהיה בסרגל הכלים תחת תוכנית ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. בחר השהה את המערכת כולה והצג הודעה זו. הקלד את ההודעה ' המשך אחרי צנטריפוגה '.
  15. הגדרת הצלחת עבור דוגם אוטומטי
    1. לחץ על ' אם שלב ' בסרגל הכלים תחת ' שלבי בקרה ' וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך השלב ' בחר עצה ' . הקלד מסמפלר אוטומטי כתנאי.
    2. תחת לאחר מכן, לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    3. תחת לולאה, לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינת טיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC230 עצות, TL6 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    4. לחצו על השלב ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' מתחת לצעדים באמצעות מענה נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round סוג Labware ומיקום לוחית מגיב. סוג ב-volume = Mobilephase, מותחת בטור 6 ובשורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך הלולאה. בחר Bio_RadPCR96 סוג Labware ומיקום לוחית זיהוי אוטומטי. סוג ב-volume = מובייל, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    6. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    7. לאחר סיום הלולאה If , לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי הבקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר את ספירת העצותשל השגרה.
    8. לחץ על השלב בחירת עצות לטעינת עצות בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) בודדת והקלד = עמודותמסוג.
    9. לחצו על הצעד ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' תחת ' שלבי ניהול נוזלים ' וגררו אותו לשיטה שבלולאה. בחר BCDeep96Round סוג Labware התגובה צלחת מיקום. הקלד את עוצמת הקול = העברת מעכל, העמודה הראשונה ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    10. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך הלולאה. בחר Bio_RadPCR96 סוג Labware ומיקום לוחית זיהוי אוטומטי. הקלד בכרך = מוביילה-it, מוותר על עמודה = עמודה ראשונה ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    11. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1. השלב של עצות הבחירה מסתיים כאן.
    12. שמור ושנה את שם השיטה.

2. להכין דגימה, labware, ו ריאגנטים

  1. העברה 5 μL של פלזמה אדם בריא במאגר לתוך פוליפרופילן, 96 בצלחת הבאר עמוק.
    הערה: ראה טבלת חומרים לריאגנטים ואספקה המשמשת בפרוטוקול זה. TPCK טיפל טריפסין נרכש ו טריפסין ליחס המצע וזמן דגירה היה מיטבי באופן ספציפי. אם כיתה שונה של טריפסין משמש, כגון כיתה רצף רקומביננטי טריפסין, האנזים ליחס המצע וזמן דגירה צריך להיבדק ואופטימיזציה.

3. הליכי ניתוח

  1. לחץ פעמיים על סמל התוכנה.
  2. תחת הכרטיסיה שיטה , בחר בבית כל הצירים כדי לכוון ולהכין את המטפל הנוזלי האוטומטי. ודא שכל מזרקים בתחנת העבודה אינם מכילים בועות אוויר גלויות.
  3. תחת קובץ, בחר באפשרות ' פתח ' | . שיטת השירות
  4. בחר את השיטה (איור 6).
  5. הפעל את השיטה על-ידי לחיצה על סמל הפעלה בצורת משולש ירוק.
  6. כדי שלוח אוטומטי יהיה מוכן בסוף השיטה, הזן את הערך ' true ' באפשרות ' הזן ערך לשימוש עבור ' שורת הפקודה ' דוגם אוטומטי ' ולאחר מכן לחץ על ' אישור'. אם לוחית הדוגם האוטומטית אינה מוכנה, הזן את הערך ' false ' ולאחר מכן לחץ על ' אישור'.
  7. הזן את הערך ' 1 ' בשורת הפקודה ' הזן ערך לשימוש עבור ' בעמודה הראשונה ' ולחץ על ' אישור'.
  8. הזן את הערך ' 12 ' בשורת הפקודה הזן ערך לשימוש עבור ' העמודה האחרון ' ולאחר מכן לחץ על אישור.
    הערה: שלב זה וצעד 4.7 מספרים לתחנת העבודה לבצע עיכול ב -12 עמודות של צלחת 96-באר, וכתוצאה מכך כל הבארות של הצלחת המשמשת לעיכול
  9. אם לוחית לדוגמה משמשת עם כרכים לדוגמה של לפחות 20 μL, הזן את הערך ' true ' באפשרות ' הזן ערך לשימוש ' בשורת הפקודה ' סמלילוח ' ולאחר מכן לחץ על ' אישור'. אם לא נעשה שימוש בצלחת לדוגמה, הזן את הערך ' false ' ולאחר מכן לחץ על ' אישור'.
    הערה: אם לא נעשה שימוש בצלחת לדוגמה, הוסף 5 μL של דגימה לכל אחד מתאים ללוח התגובות.
  10. בצע את ההוראות בחלון ' הגדרת מונחה לכלי ' ולחץ על ' המשך'.
    הערה: החלון הבא מתאר את הפריסה עבור "הלוח המיגיב" להיות מוכן (איור 7, טבלה משלימה 1). הכרכים הבאים יהיו מצוטט לכל אחת מתוך 8 בארות של עמודה אחת ב-1 mL עיגול עמוק 96-ובכן:
    טור 1:540 μL של התגובה מיקס 1.
    טור 2:50 μL של בלוק של Cysteine.
    טור 3:730 μL של מיקס התגובה 2.
    טור 4:130 μL של טריפסין.
    עמודה 5:130 μL של ' פתרון כיבוי '.
    טור 5:1090 μL של פתרון שלב נייד (אם המשתמש הוזן ' true ' בשלב 6).
  11. לחץ על הבא והחלון הבא מתאר את אמצעי האחסון המינימלי (20 μl) הדרושים למרכאות בלוח הדגימה. אם המשתמש הכניסה את הערך ' false ' לקבלת הבקשה הכרוכה בלוח המדגם (שלב 9), המשתמש יתבקש להוסיף בדוגמה 5 μL ללוח התגובות.
  12. לחץ על הבא.
    הערה: החלון הבא מראה שיש למקם תיבת קצה 90 μL ריקה בחפיסה האוטומטית של המטפל בנוזלים.
  13. לחץ שוב על הבא , הנחת הסיפון האוטומטי של המטפל הנוזלי כפי שצוין ומומחש (איור 8) כולל את הלוח מגיב, את הצלחת התגובה, את הצלחת לדוגמה, הלוח autosampler, 6 מלא 90 μl תיבות עצה, תיבת הקצה הריק 90 μl, ותיבת הקצה מלא 230 μl.
  14. לחץ על ' סיום ' כדי להתחיל בפעולת השירות.
    הערה: לאחר לחיצה על סיום, למשתמש אין אפשרות להגיע למטפל הנוזלי האוטומטי. זה יהיה "לשבור את הווילון האור" של המכונה ולעצור את המטפל נוזלי כאמצעי זהירות.
  15. ב להמשיך לאחר צנטריפוגה בקשה, לאחזר את הצלחת התגובה ואת צנטריפוגה אותו 30 דקות ב 3,000 סל ד.
  16. לאחר השלמת הצנטריפוגה, החזר את לוחית התגובה למטפל הנוזלי האוטומטי למיקום שבו היה לפני הצנטריפוגה ולחץ על המשך.
    הערה: המטפל בנוזל האוטומטי יעצור שוב כאשר פעולת השירות תושלם. אם המשתמש הוזן ' true ' לשלב 6, לאחר מכן ניתן להסיר את הלוח האוטומטי מתחנת העבודה ולהציב לתוך הדוגם האוטומטי של כלי כרומטוגרפיה נוזלי לניתוח.

4. ממדי מועד

  1. לפתור פפטידים על בעלי זרימה גבוהה הכוללת של a סי18 2.1 mm x 100 מ"מ, 3.5 יקרומטר עמודה עם קצב זרימה של 0.25 mL/min ומנותח בתוך מוטבע על ספקטרומטר המסה פי ארבעה משולשת מוט.
    הערה: לאחר העיכול פפטיד, המוקד LC-MSMS השיטה כדי לכמת פפטידים מדגימות רובוטית מוכן מתוארת בפירוט1 בעקבות תיאור קצר של LC-msms.
  2. הגדר את טמפרטורת תנור העמודה ל-40 ° c. השתמש במאגר A (2% acn, 98% מים, 0.1% פורמית חומצה) ו מאגר B (95% acn, 5% מים, 0.1% החומצה פורמית) כמו שני השלבים הניידים.
  3. העמודה באמצעות 5% B עבור 5 דקות לאחר הטעינה. אליוט הפפטידים מעל 30 דקות עם ליניארי 5% עד 35% הדרגתי של מאגר B.
    1. מחזר את העמודה לפני טעינת המדגם הבא על ידי שטיפת עם 98% B עבור 10 דקות ולאחר מכן 5% B עבור 5 דקות.
    2. לצורך הסחה מקוונת, הפנה את החומק שלאחר העמודה לבזבוז לפני שנכנס למקור היונים באמצעות שסתום מיתוג של שני שלבים.
  4. עבד את נתוני ה-MRM.

Representative Results

שיטת ההכנה לדוגמה האוטומטית של פרוטקומניקס בתחנת העבודה האוטומטית הותאמה מהפרוטוקול האוטומטי הקודם שלנו בשיטת הרכישה האיתנה LC-SRM-MS1 ל-אלבומין, חלבון הפלזמה הנבחר, ו-β-גלטוסידאז (β-gal), חלבון אקסוגני המשמש לבקרת איכות. לאחר העיבוד, הדגימות הופעל על משולש פי ארבעה משולשת מוט-MS ב-שיטת SRM מיקוד הסרום אלבומין, β-גלטוסידאז. מקדם הווריאציה (CV) של אות SRM עבור כל מעבר שימש כדי לנטר את הצורה התוכונות של פרוטוקול העיכול האוטומטי.

אנו מאוטומטיים את התוספת הכימית וערבוב צעדים לעיכול של 5 מדגימות פלזמה μL עם טריפסין של 2 שעות הסיפון-החממה. כדי לקבוע את השגות, 5 μL של בריכת פלזמה היה מחבר בארות מרובות של צלחת התגובה עם ראש רב-ערוצית (96 סיכה). כדי לפקח על עקביות, הוספנו חלבון β-גל לפני הפחתת תגובות האלליציה. התהליך האוטומטי של ההכנה לדוגמה פרוטאומניקס נבדק בשיטת הרכישה החזקה LC-SRM-MS, כולל אלבומין, חלבון הפלזמה הגבוה ביותר, וחלבון β-gal, המשמש לבקרת איכות. שלושה פפטידים β-גל ו שני פפטידים אלבומין היו מנוטרים של חלבונים מעובד החלבון אלבומין ומחודדים β-gal חלבון (שולחן 4).

במאמץ לחסוך זמן ולפשט את ההליך, הפחיתו את הנוזל המעביר את השלבים של הוספה/ערבוב/דגירה של תערובת מגיב ותגובה עם תחנת העבודה מתוך זרימת עבודה של תשעה צעדים לזרימת עבודה של שישה שלבים (איור 1). זרימת העבודה פרוטמית הכולל היתה מורכבת משני רכיבים ניסיוניים: הכנה לדוגמה אוטומטית ו-LC-MS/MS. ראשית, הערכנו את הדיוק של LC-MS/MS הנתונים הרכישה על ידי שמונה זריקות רצופות מאותה עיכול היטב של הצלחת אוטומטית הדוגם. הדיוק של זרימת העבודה האוטומטית הכנה לדוגמה חושבה על-ידי אחוז מקדם הסטייה (% CV) של זרימת העבודה הכוללת של SROMIC מינוס% CV של ה-LC-MS/MS (איור 9ב). עם הליך העיכול יעיל פלזמה בתחנת העבודה האוטומטית, דיוק ניסיוני של הכנה דגימות אוטומטיות היה פחות מ 11.4% עבור אקסוגני β-גל חלבונים (10.0% כממוצע), ופחות מ 14.9% עבור החלבון הנפוץ ביותר אלבומין האנושי (9.9% כממוצע) (איור 9). עוצמות האות הטובות נצפו עבור חלבון האלבומין האנושי והβ-גל כצפוי (איור 9ג).

עבור כל צעד ליטוף העברת נוזלי, טכניקות היו אופטימיזציה במיוחד. כדי לנטר את הדיוק של העברת הצעדים הנוזליים, היינו מחודדים בתקנים מבוססי איזוטופ (SIL) בעלי התווית האנדוגניים של חלבון אלבומין ומβ-גל חלבון בשלושה שלבי העברת מגיב עצמאיים: התגובה מיקס 1, חוסם Cysteine, ו מיקס התגובה 2 (איור 10). אותות MRM מחמשת פפטידים SIL אלה נרכשו כדי לפקח על הדיוק של שלבי העברת נוזל אוטומטי. הממוצע% CV עבור פפטידים, DDNPNLPR ^, ו GDFQFNISR ^ (^ מייצג את N15 חומצה אמינית) מן התגובה ערבוב 1 צעד נע בין 1.8% כדי 11.2%. הממוצע% CV של פפטיד אחד (IDPNAWVER ^) מן חוסם Cysteine נע בין 6.6 ל 8.8%. הממוצע% CV של שני פפטידים (WVGYGQDSR ^) נע בין 6.2% כדי 11.9% (איור 10).

כדי לאמת את זרימת העבודה האוטומטית פרוטאומניקס לדוגמה, אנו הערכנו הנוזלוניים על פני מספר חלבונים ומספר ימים עבור אלבומין סרום אנושי, אקסוגני β – גל, ו 40 חלבונים נוספים פלזמה. הצלחנו לעבד 21שכפולדגימות (פלזמה במאגר אנושי רגיל), מיקום טוב המוצג באיור 11א, בשלושה ימים שונים. קורות חיים בתוך יום חושבו מ -21 בארות שהוכנו באותו יום. הממוצע היומיומי% קורות החיים עבור 40 חלבונים נע בין 4%-20% (איור 11ב). כדי להעריך את אפקט הקצה של זרימת העבודה האוטומטית המבוססת על הלוח,% CV חושב מבארות ספציפיות בתוך עמודות ושורות מוגדרות (איור 12A עבור מפת עמודה ושורה). העוצמות של אותות MRM היו דומות בכל תצורות הטורים והשורות עם% CV החל מ-3%-22% (איור 12ב').

לסיכום, זרימת העבודה האוטומטית הממוטבת מניבה 96 דגימות מעובדות בצורה אחידה תוך פחות מחמש שעות עם דיוק ניסיוני מעולה. עבור תאימות עם זרימת עבודה אוטומטית, בחרנו ריאגנטים כי יש זניח תופעות לוואי לא ספציפיות, הם יציבים באור הסביבה, הם LC-MS/MS ידידותית, והוא יכול להיות מאוחסן כמו הקפואים ali,.

Figure 1
איור 1: סכימת זרימת העבודה של הכנת המדגם. 6 השלבים העיקריים בתהליך העברת הנוזלים מפורטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עצה טעינת סקריפט. פרטי ה-VB Script מוצגים כאן. קובץ ה-script מציין תנאי טעינת קצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הרחבה אוטומטית של תחנת עבודה. החפיסה כוללת של 1x1 האלפים, טיפ טעינת האלפים, אשפה, שטיפת טיפים, פלטייר ואינקובטור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מאפייני הלוחית הכימית. מוצגים הם המאפיינים הדרושים עבור לוחית מגיב עבדה אספקה בעת הגישה באמצעות ההתקנה מודרך עבדה אספקה. בחר את העמודה המתאימה והקלד את המשתנים כפי שמצוין באיור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תסריט ספירת טיפים. קובץ script זה מסייע לעקוב אחר מספר עצות בחפיסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: סקירה של השיטה לעיכול ומצטט דגימות פלזמה. שלבים לחישוב מגיב, התקנת עבדה אספקה ומניפולציות נוזלים בשיטת המטפל הנוזלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: פריסת הלוחית הכימית. מוצגים הם ריאגנטים כימי הדרושים לעיכול פלזמה הכנה אוטומטית ומופץ על פני הצלחת מגיב labware. איור זה שונה מפתק טכני10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: פריסת עבור עבדה אספקה על הסיפון של תחנת העבודה האוטומטית. מוצג הוא פריסת החפיסה עבור שיטת עיכול הפלזמה עבור המטפל הנוזלי. איור זה שונה מפתק טכני10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: הדיוק של זרימת העבודה פרוטמית הכוללת מורכב קורות חיים של תחנת העבודה ו-LC MS/MS קורות חיים.
חמישה פפטידים מ-β-gal ו אלבומין הפיקוח, כרומטוגרמות ו פפטיד זמן ההחזקה עבור כל פפטיד מוצג (א), דיוק נקבע מ 30 בארות/דגימות עיבוד מייצג, קורות חיים% עבור זרימת עבודה פרוטמית סה, הניתוח LC MS/ms ועיבוד לדוגמה אוטומטית שחושבו (ב). בסך הכל, פפטידים מתעכל הראה אותות טובים נע מ 1x105 עד 1x108. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: קביעת דיוק של שלבי העברת נוזלים. פפטידים סינתטיים היו מחודדים בשלב מסוים ריאגנטים, והעברת נוזל אוטומטי נקבע על ידי סך% CV. מ 30 בארות/דגימות ניסוי מינוס% CV LC MSMS (נקבע על ידי 8 לחזור על זריקות LC MSMS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 11
איור 11: מספר ימים של הצגת הזמן של זרימת העבודה לדוגמה פרוטמית אוטומטית עם 42 בדיקת MRM חלבון. (A) לוחית התגובה מפה עבור כל אחד משלושת הימים הוא להראות כאן, 5 μl פלזמה נוספה לכל אחד 21 בארות. 3 בארות שהתקבלו 5 מים שימשו כפקדים שליליים/ריקים. (ב) עוצמות ה190 הממוצעות של מעברים מורכבים מ-75 פפטידים ו 42 חלבונים (משמאל) ו-% CV עבור כל מעבר MRM חושבה מ -21 בארות העיכול עבור כל יום (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 12
איור 12: משוב של מיקומים ספציפיים של בארות (מיקום של עמודות ושורות). (A) עמודות ומיקום שורות עם מפת צלחת מוצגים כאן. (ב) מיקום שורה מציין אותות MRM ספציפיים של עוצמות ממוצעות מבארות שצוינו (משמאל) וקורות חיים% (מימין) מעיכול בודד לצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 13
איור 13: צילום מסך של עורך טכניקה. עבור כל תבנית Pipetting יטוף, להגדיר את המאפיינים של חישה ברמה נוזלית, זיהוי קריש, פירסינג, נוזל סוג, כללי, מנושף, לוותר, לערבב וכיול. התבנית והטכניקות המשמשות בפרוטוקול זה מוצגות בטבלה משלימה 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שתנה שתנה ערך תיאור/
תעשיה בוליאני נכון השתמש בדוגם אוטומטי
בצלאל ספר שלם מיכל 5 כרך הבטאל
BG1 ספר שלם 0.8 BG1 אמצעי אחסון
BG2 ספר שלם 0.8 BG2 אמצעי אחסון
BG3 ספר שלם 0.8 BG3 אמצעי אחסון
שטיינחוסמי ספר שלם 1.25 כמות חוסם cysteine
מאגר כתמים ספר שלם 0.45 נפח מאגר ציסטיין
דאטוורנט ספר שלם מיכל 5 נפח דנאטנט
העברת מעכל ספר שלם 10 נפח העברה לתקציר
המאגר הראשון ספר שלם 25.9 נפח מאגר ראשון
העמודה הראשונה ספר שלם 1 העמודה הראשונה
HSA1 ספר שלם 0.8 HSA1 אמצעי אחסון
HSA2 ספר שלם 0.8 HSA2 אמצעי אחסון
טור מאחרון ספר שלם 12 העמודה האחרונה
מובייל ה. א. ה ספר שלם 90 נפח בפאזה ניידת
הרוות ספר שלם 10 עמודת כיבוי
הסוכן המורד ספר שלם מיכל 5 הפחתת עמודת סוכן
דוגמה ספר שלם מיכל 5 העמודה ' דוגמה '
סמליצלחת בוליאני נכון השתמש בצלחת לדוגמה
מאגר שניות ספר שלם 58.4 נפח מאגר שני
טריפסין ספר שלם 10 טריפסין

טבלה 1: משתני שלב התחלה

ערך שתנה
= מאגר ראשון + מBG1 + מHSA1 תערובת ראשונה
= מBG2 כתמים + מאגר שקופיות + ציסטיישטייקס
= מאגר שניות + BG3 + HSA2 מיקס שנייה
= (התמהיל הראשון * עמודות) + 30 המיערבל הראשון
= (CysteineMix * עמודות) + 20 ליבסטבאר
= (מיקס שניות * עמודות) + 10 מערבל שניות
= (טריפסין * טורים) + 10 טריסינבאר
= (כיבוי * עמודות) + 10 קובצ'באר
= (מערבל לראשונה * 8) + 100 המימלאי הראשון
* 8 + 20 ציסטיישטיינמסטוק
= (שניות * 8) + 100 שניות

טבלה 2: משתני שילוב אמצעי אחסון

סוג שם עמדה עומק אפייני השתמש?
BCDeep96Round לוחית מגיב P5 1 (למעלה) # = לא סמליפלייט
BCDeep96Round לוחית מגיב P5 1 (למעלה) # = סמליצלחת
BCDeep96Round לוחית תגובה P11 1 (למעלה) נכון
Bio_RadPCR96 * דגימות P9 1 (למעלה) = סמליצלחת
Bio_RadPCR96 * הלוח ' דוגם אוטומטי ' P10 1 (למעלה) = דוגם אוטומטי
BC90 ריק 1 (למעלה) נכון
BC90 1 (למעלה) נכון
BC90 1 (למעלה) נכון
BC230 1 (למעלה) = דוגם אוטומטי
BC90 1 (למעלה) = טורים > 1
BC90 1 (למעלה) = טורים > 3
BC90 1 (למעלה) = טורים > 5
BC90 1 (למעלה) = טורים > 7
BC90 1 (למעלה) = טורים > 9
הערה
*: מתאים 96 הטוב ביותר ביו-ראד צלחת.
: לחץ על מאפיינים ולאחר מכן הזן את משתני אמצעי האחסון כפי שמצוין באיור 6.

שולחן 3: הגדרת הכיוונון המודרך

חלבון ID רצף פפטיד מיסת Q1 (Da) מיסת רבעון 3 (Da) זמן (מזערי) קטע יון פוטנציאל לשרת אנרגיית התנגשות תא התנגשות יציאה פוטנציאלית
התקן התקן | P00722 | BGAL_ELOCI מיכל שפיר 542.3 262.1 19.7 + 2y2 61 21 8
542.3 636 19.7 + 2y5 61 25 12
542.3 764.2 19.7 + 2y6 61 25 18
מיכל כנעני 550.3 436.1 18.1 + 2y7 + 2 61 23 8
550.3 871.2 18.1 שישי השביעי 61 25 18
550.3 774.2 18.1 + 2y6 61 33 8
מיכל שוונגאר 534.3 782.1 12.1 שישי השביעי 51 25 6
534.3 562.1 12.1 + 2y5 51 27 6
534.2 505.2 12.1 + שנייה 90 25 8
התקן התקן | P02768 | ALBU_HUMAN מיכל הגלעדי 470.8 596.2 9.2 + 2y5 61 27 16
470.8 499.3 9.2 + שנייה 61 27 18
470.8 710.4 9.2 + 2y6 61 27 18
LVNEVTEFAK 575.3 694.4 18.2 + 2y6 73.1 29.6 18
575.3 937.5 18.2 שמונה בתים 73.1 29.6 18
575.3 823.4 18.2 שישי השביעי 73.1 29.6 18

שולחן 4: פרמטרי MRM

טבלה משלימה 1: הצלחת מגיב אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן.

טבלה משלימה 2: תבנית פרוטוקול אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.

Discussion

עיבוד לדוגמה לספקטרומטר מסה דורש הדנטורציה של חלבונים, הפחתה והאלדילציה כדי לחסום את הציסטנים, וטריפסין העיכול לקליב חלבונים לתוך פפטידים. כל תגובה כימית או אנזימטית צריכה להיות מאותחלת בזמן ייעודי ומבוצעת בטמפרטורה מבוקרת, וכל צעד בתהליך כרוך בצעדים מרובים של העברת נוזלים שבהם ניתן להציג וריאציה ניסיונית. עיבוד לדוגמה אוטומטי מספק פתרון לדילמה זו. כיום זמין מערכות טיפול נוזלי יש את היכולת להעביר ריאגנטים לתוך 96-היטב צלחות עם דיוק ודיוק של פחות מ 5%, בהתאם לראש וסוג טיפ בשימוש, וכלה בדגימות דגירה, עם טלטול במידת הצורך, תחת טמפרטורות מבוקרת הנע בין 14 ° צ' ל 70 ° c. השתמשנו במטפל נוזלי אוטומטי כדי לעבד פלזמה עבור srm בחני בפורמט 96.

ישנם אלפי אתרי מחשוף הפרוטאז בתוך תערובות מורכבות של חלבונים בסרום, פלזמה, ודגימות ביולוגיות אחרות; וכל אחד מחלבונים אלה יש מאפיינים ייחודיים המשפיעים על נגישות אתר המחשוף ואת היציבות של הפפטידים הנובעים. לכן, אי אפשר לעצב תהליך עיבוד לדוגמה אופטימלי לכל חלבון. החלופה הטובה ביותר. היא להיות עקבית ככל האפשר

כדי להשיג עקביות, היינו ממוטבים לכל צעד שבוצע על ידי המפעיל הנוזלי האוטומטי. לראשונה שקלנו את אמצעי האחסון הנדרש ואילוצים המוטלים על ידי סוג של נוזל (פלזמה, מים, או אורגני) ומאפיינים המקביל (צמיגות, לכידות, ותנודתיות), חומרה (תחנת עבודה ליטוף ראש וצלחת לתפוס זרועות), ו labware. לאחר מכן השתנו המהירות והפער האווירי הנגרר לשאיפה, המהירות ונפח ההתפרצות לחילוק, והכוח והמשך של ערבוב, תוך שילוב של מגע התשר לאחר שאיפה ו/או מחלק, במידת הצורך, כדי לסלק נוזלים הקפדה על החלק החיצוני של הטיפים (איור 13, תוספת טבלה 1) פפטיד SIL ייחודי, מראש הוקרן ליציבות, היה מחודדים לכל מגיב כדי לאפשר לעקוב אחר הדיוק של כל שלב טיפול נוזלי. לאחר האופטימיזציה, תהליך קורות החיים עבור רוב המעברים היו פחות מ 10%, הפגנת השגות טוב עם תחנת העבודה האוטומטית (איור 9, איור 10, איור 11 ואיור 12).

זרימת העבודה האוטומטית המוצגת כאן מספקת את העיכול האנזימטי העקבי באמצעות שיפור ותפוקה משופרות בהשוואה לשיטות ידניות (איור 9, איור 10). גישה זו מבטיחה לשפר את הדיוק והמהימנות של גילוי ביומיקר ואימות באמצעות ספקטרומטר מסה.

Disclosures

לא.

Acknowledgments

לא.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A Pooled healthy human plasma Bioreclamation Inc. human plasma tested in the manuscript
Acetonitrile, HPLC Grade Thermo Fisher Scientific A998SK1 LC MS/MS solvent
B-Galactosidase Recombinant from E.Coli Sigma-Aldrich G3153-5MG exogenous control proteins.
Biomek i7 Automated Workstation Beckman Coulter, Inc. The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions
Biomek i-Series Tips 230µL Non-Sterile Beckman Coulter, Inc. B85903  Tips, i7 consumable
Biomek i-Series Tips 90µL Non-Sterile Beckman Coulter, Inc. B85881  Tips, i7 consumable
FG, Kit Trypsin TPCK Sciex 4445250 Trypsin used in digestion
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear  Bio-Rad #hsp9641 Autosampler plate
Octyl B-D-Glucopyranoside Sigma-Aldrich O9882-5G detergent used in digestion
Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile Beckman Coulter, Inc. 267007 Reagent and digestion plate
Prominence UFLCXR HPLC system Shimadzu, Japan High flow LC sytem
QTRAP 6500 SCIEX Mass spectrometer
Water, HPLC Grade Thermo Fisher Scientific W54 LC MS/MS solvent
Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm Waters 186003564 LC MSMS column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fu, Q., et al. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
  2. Lehmann, S., et al. Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold? Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).
  3. Abbatiello, S. E., et al. Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).
  4. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).
  5. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
  6. Yates, J. R. 3rd Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).
  7. Nilsson, T., et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).
  8. Van Eyk, J. E., Sobhani, K. Precision Medicine. Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).
  9. Hoofnagle, A. N., et al. Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays. Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).
  10. Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series. Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).

Tags

ביוכימיה סוגיה 158 כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרוספקטוריקה מסה (LC/MS/MS) כרומטוגרפיה נוזלית ניטור התגובה שנבחרו (LC-SRM) אוטומציה הכנה לדגימת חלבון מנפיקים תפוקה גבוהה
הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fu, Q., Johnson, C. W.,… More

Fu, Q., Johnson, C. W., Wijayawardena, B. K., Kowalski, M. P., Kheradmand, M., Van Eyk, J. E. A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation. J. Vis. Exp. (158), e59842, doi:10.3791/59842 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter