Summary

Analyse comparative des lésions par une approche de séquençage ciblée

Published: November 05, 2019
doi:

Summary

Cet article décrit une méthode pour identifier des altérations clonales et subclonales parmi différents spécimens d’un patient donné. Bien que les expériences décrites ici se concentrent sur un type spécifique de tumeur, l’approche est largement applicable à d’autres tumeurs pleines.

Abstract

L’évaluation de l’hétérogénéité intratumorale (ITH) est d’une importance primordiale pour anticiper l’échec des thérapies ciblées et concevoir en conséquence des stratégies antitumorales efficaces. Bien que des soucis soient fréquemment soulevés en raison des différences dans le traitement d’échantillon et la profondeur de la couverture, le séquençage de prochaine génération des tumeurs pleines ont démêlé un degré fortement variable d’ITH à travers des types de tumeur. La capture de la parenté génétique entre les lésions primaires et métastatiques par l’identification des populations clonales et subconaux est essentielle à la conception de thérapies pour les maladies à un stade avancé. Ici, nous rapportons une méthode pour l’analyse comparative de lésions qui permet l’identification des populations clonales et subconales parmi différents spécimens du même patient. L’approche expérimentale décrite ici intègre trois approches bien établies : l’analyse histologique, le séquençage multilésion à haute couverture et les analyses immunophénotypiques. Afin de réduire au minimum les effets sur la détection des événements sous-clonal par le traitement inapproprié d’échantillon, nous avons soumis des tissus à l’examen pathologique soigneux et à l’enrichissement néoplastique de cellules. L’ADN contrôlé de qualité des lésions néoplastiques et des tissus normaux a alors été soumis au séquençage de couverture élevé, ciblant les régions codantes de 409 gènes de cancer pertinents. Tout en ne regardant qu’un espace génomique limité, notre approche permet d’évaluer l’étendue de l’hétérogénéité parmi les altérations somatiques (mutations mononucléotides et variations de nombre de copies) dans des lésions distinctes d’un patient donné. Grâce à l’analyse comparative des données de séquençage, nous avons pu distinguer les altérations clonales par rapport aux altérations subclonales. La majorité de l’ITH est souvent attribuée à des mutations de passagers; par conséquent, nous avons également employé l’immunohistochimie pour prévoir des conséquences fonctionnelles des mutations. Tandis que ce protocole a été appliqué à un type spécifique de tumeur, nous prévoyons que la méthodologie décrite ici est largement applicable à d’autres types de tumeur pleine.

Introduction

L’avènement du séquençage de nouvelle génération (NGS) a révolutionné la façon dont les cancers sont diagnostiqués et traités1. NGS couplé au séquençage multirégional ont exposé un degré élevé d’hétérogénéité intra-tumorale (ITH) dans les tumeurs solides2, ce qui explique en partie l’échec de la thérapie ciblée due à la présence de sous-clones avec une sensibilité médicamenteuse différente2 . Un défi important posé par les études de séquençage à l’échelle du génome est la nécessité de faire la distinction entre les mutations des passagers (c.-à-d. neutres) et des mutations du conducteur dans les cancers individuels3. Plusieurs études ont en effet montré que, dans certaines tumeurs, les mutations des passagers représentent la majorité de l’ITH, tandis que les altérations du conducteur ont tendance à être conservées parmi les lésions du même individu4. Il est également important de noter que la charge mutationnelle importante (comme on le voit dans les cancers du poumon et le mélanome) n’implique pas nécessairement un grand fardeau mutationnel subclonal2. Par conséquent, un degré élevé d’ITH peut être trouvé dans les tumeurs avec le bas fardeau mutationnel.

Les métastases sont responsables de plus de 90 % des décès liés au cancer dans le monde5; par conséquent, la capture de l’hétérogénéité mutationnelle des gènes de conducteur parmi les lésions primaires et métastatiques est essentielle à la conception des thérapies efficaces pour les maladies de stade avancé. Le séquençage clinique est généralement effectué sur les acides nucléiques des tissus fixes, ce qui rend l’exploration à l’échelle du génome difficile en raison de la mauvaise qualité de l’ADN. D’autre part, l’intention du séquençage clinique est d’identifier les mutations actionnables et/ou les mutations qui pourraient prévoir la réactivité/insensibilité à un régime thérapeutique donné. Dans l’état actuel des choses, le séquençage peut être limité à une plus petite fraction du génome pour l’extraction en temps opportun d’informations cliniquement pertinentes. La transition du profilage de l’ADN à faible débit (p. ex., séquençage de sanger) à NGS a permis d’analyser des centaines de gènes cancer-pertinents à une profondeur élevée de couverture, ce qui permet la détection d’événements sous-clonaux. Ici, nous rapportons une méthode pour l’analyse comparative des lésions qui permet l’identification des populations clonales et subconales parmi différents spécimens d’un même individu. La méthode décrite ici intègre trois approches bien établies (analyse histologique, séquençage multilésion à haute couverture et analyses immunophénotypiques) pour prédire les conséquences fonctionnelles des variations identifiées. L’approche est décrite schématiquement dans la figure 1 et a été appliquée à l’étude de 5 cas métastatiques de néoplasmes pseudopapillaires solides (SPN) du pancréas. Tandis que nous décrivons le traitement et l’analyse des spécimens de tissu paraffins-incorporés formalin-fixes (FFPE), la même procédure peut être appliquée au matériel génétique du tissu fraîche-congelé.

Protocol

Le matériel utilisé dans l’étude a été recueilli en vertu d’un protocole spécifique, qui a été approuvé par le comité d’éthique local. Le consentement éclairé écrit de tous les patients était disponible. 1. Révision histologique et immunophénotypique des spécimens de tissus REMARQUE : Un pathologiste expert est responsable des activités décrites ci-après. Révision histopathologique des cas choisis selon des critères diagnostiques bie…

Representative Results

Le flux de travail de l’étude est illustré à la figure 1. Multi-lésions (n – 13) séquençage de 5 cas SPN ciblant les séquences de codage de 409 gènes liés au cancer identifié un total de 27 mutations somatiques dans 8 gènes (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1, et FGFR3). Les mutations ont été définies comme fondateur/clonal lorsqu’elles sont partagées entre toutes les lésions d’un patient donné…

Discussion

Notre méthode permet l’identification des altérations moléculaires impliquées dans la progression des tumeurs solides par l’intégration des données verticales (c.-à-d., morphologie, séquençage d’ADN, et immunohistochimie) des lésions distinctes d’un patient donné. Nous avons démontré la capacité de notre méthode pour détecter des événements clonal et subclonal dans un type de tumeur silencieuse mutationnelle (c.-à-d., SPN, néoplasme solide-pseudopapillary du pancréas) en interrogeant les séquences d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’étude a été soutenue par le projet italien de génome du cancer (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Subvention no 12182 à AS et 18178 à VC), FP7 European Community Grant (Cam-Pac No 602783 à AS). Les organismes de financement n’ont joué aucun rôle dans la collecte, l’analyse et l’interprétation des données ou dans la rédaction du manuscrit.

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies G2939BA  Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit Fisher Scientific NC9959336 Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4627 Library quantification
Anti-BAP1 Santa Cruz Biotechnology sc-28383 Antibody
Anti-GLUT1 Thermo Scientific RB-9052 Antibody
Anti-KDM6A Cell Signaling #33510 Antibody
Anti-p53 Novocastra NCL-L-p53-DO7 Antibody
Anti-βcatenin Sigma-Aldrich C7207 Antibody
Blocking Solution home made 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution home made 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra Leica 70937891 Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1 Leica Biosystems AR9961 Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2 Leica Biosystems AR9640 EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear Eppendorf 951010006 Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021 Tubes
Ethanol DIAPATH A0123 IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H­4000 Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Laboratories SK­4105 HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7401­50 Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7402­50 Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV) Broad Institute https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Thermofisher Scientific 4477685 Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermofisher Scientific 4480441 Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument Thermofisher Scientific 4484177 Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip Thermofisher Scientific A26771 or A27766 Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef Thermofisher Scientific A27198 or A30011 Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit Thermofisher Scientific A26433 or A30011 Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System Thermofisher Scientific 4476610 or A38196 Sequencing system
Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair Thermofisher Scientific 4487118 Workflow
Ion Reporter Software – uploader plugin Thermofisher Scientific 4487118 Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit Thermofisher Scientific 4474517 Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermofisher Scientific ND-2000 DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity Fisher Scientific 12532-016 or 12532-024 SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit Quiagen 51106 0r 51104 DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue Quiagen 56404 DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer Thermofisher Scientific Q32866 DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermofisher Scientific Q32850 Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST home made Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film Sakura Europe 6172 Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software EMBI-EBI http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres Carlo Erba 492306 IHC deparaffinization reagent

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Cite This Article
Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).

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