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Behavior

通过有针对性的测序方法进行比较病变分析

doi: 10.3791/59844 Published: November 5, 2019

Summary

本文介绍了一种识别特定患者不同标本之间的克隆和亚克隆变化的方法。虽然此处描述的实验侧重于特定的肿瘤类型,但该方法广泛适用于其他实体肿瘤。

Abstract

评估肿瘤内异质性(ITH)对于预测靶向疗法的失败并相应地设计有效的抗肿瘤策略至关重要。尽管由于样品处理和覆盖深度的差异,人们经常引起关注,但下一代实体肿瘤测序已经解开了肿瘤类型中高度可变的ITH程度。通过识别克隆和亚克隆种群来捕捉原发性病变和转移性病变之间的遗传关联性,对于设计早期疾病的治疗方法至关重要。在这里,我们报告一种比较病变分析的方法,该方法允许在同一患者的不同标本中识别克隆和亚克隆种群。本文描述的实验方法集成了三种成熟的方法:组织分析、高覆盖率多病变测序和免疫表位分析。为了尽量减少通过不适当的样品处理对亚克隆事件检测的影响,我们让组织进行仔细的病理检查和肿瘤细胞富集。然后,对肿瘤病变和正常组织进行质量控制的DNA,以409个相关癌症基因的编码区域为目标进行高覆盖率测序。虽然只看有限的基因组空间,我们的方法能够评估体细胞变化(单核苷酸突变和拷贝数变异)与给定患者不同病变的异质程度。通过对测序数据的比较分析,我们可以区分克隆与亚克隆的变化。大多数 ITH 通常归因于乘客突变;因此,我们还使用免疫组化学来预测突变的功能后果。虽然此协议已应用于特定的肿瘤类型,我们预计此处描述的方法广泛适用于其他实体肿瘤类型。

Introduction

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下一代测序(NGS)的出现彻底改变了癌症的诊断和治疗方式。与多区域测序结合的NGS在实体肿瘤2中暴露了高度的肿瘤内异质性(ITH),这在一定程度上解释了靶向治疗的失败,因为存在具有不同药物敏感性的亚克隆2.全基因组测序研究提出的一个重要挑战是必须区分个别癌症的乘客(即中性)和驾驶员突变3。几项研究确实表明,在某些肿瘤中,乘客突变占ITH的大部分,而驾驶员的改变往往在同一个体的病变中保存。同样重要的是要注意,大突变负担(如肺癌和黑色素瘤所示)并不一定意味着一个大的亚克隆突变负担2。因此,在突变性低的肿瘤中可以发现高度的ITH。

转移导致全世界90%以上的癌症相关死亡5;因此,在原发性病变和转移性病变中捕捉驱动基因的突变异质性,对于设计治疗晚期疾病的有效疗法至关重要。临床测序一般对固定组织的核酸进行,由于DNA质量差,使得全基因组的探索变得困难。另一方面,临床测序的目的是识别可操作的突变和/或突变,这些突变可能预测对给定治疗方案的响应/反应能力。就目前情况而言,测序可以限制在基因组的较小部分,以便及时提取临床相关信息。从低通量DNA分析(例如,桑格测序)到NGS的转变使得在高深度下分析数百个与癌症相关的基因成为可能,从而能够检测亚克隆事件。在这里,我们报告一种比较病变分析的方法,该方法允许在同一个体的不同标本中识别克隆和亚克隆种群。此处描述的方法集成了三种成熟的方法(组织分析、高覆盖率多病变测序和免疫表位分析),以预测所识别变异的功能后果。该方法在图1中进行了原理图描述,并应用于胰腺5个固体伪皮毛肿瘤(SPN)转移病例的研究。虽然我们描述正式固定石蜡嵌入 (FFPE) 组织标本的处理和分析,但同样的过程可以应用于来自新鲜冷冻组织的遗传物质。

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Protocol

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研究中使用的材料是根据当地道德委员会批准的一项特定协议收集的。所有患者均可获得书面知情同意。

1. 组织标本的组织学和免疫本型修正

注:专家病理学家负责下面描述的活动。

  1. 根据既定的诊断标准对选定病例进行组织病理学修订。
    1. 使用微体从代表性的FFPE组织块中切割4⁄5μm厚的组织部分,并将部分安装在标准组织学幻灯片上。
    2. 使用自动组织滑动染色机(材料表)对每张幻灯片执行血氧林和欧辛染色。
    3. 根据世卫组织诊断标准,审查所选肿瘤病例的组织病理学诊断。
      注:在此阶段,病理学家可能在同一组织部分内识别肿瘤的形态上不同的区域。可以单独收获这些区域(见第2节)。图2提供了SPN肿瘤与正常细胞的相似性。
    4. 对已建立的标记物执行免疫组织化学染色,以补充组织分析并估计免疫电位异质性。
      注:病理学家可能在同一组织部分内识别肿瘤的免疫性不同区域。可以单独收获这些区域(见第2节)。
  2. 评估肿瘤组织部分的肿瘤细胞性,并相应地计划手动微分法。
    注:这是病理学家生成的肿瘤细胞性估计值。
    1. 如果组织部分的肿瘤细胞含量高于70%,则不强制进行人工微解剖;直接移动到步骤 3.1。
      注:目标为70%的肿瘤细胞含量,以便(i) 确保突变等位基因频率估计有足够的灵敏度,以及 (ii) 可能通过较不敏感的方法(例如毛细管测序)验证克隆突变。
    2. 如果组织部分的肿瘤细胞含量低于70%,则需要进行微解剖,并移动到步骤2。
  3. 从已取样的非肿瘤组织FFPE块评估组织部分。这种组织被用作生殖系DNA的来源。
    注:血液是生殖系DNA的替代来源。在这种情况下,按照步骤 4.1 的说明中的建议进行 DNA 提取。
    1. 如果组织部分只可以看到非肿瘤组织(图2D),则不需要手动微解剖;直接移动到步骤 3.1。
    2. 如果组织部分存在肿瘤细胞的大量污染,则需要手动进行微解剖;移至第2节。

2. 手动微解剖

注:该方法适用于各种固体肿瘤类型,旨在增加组织标本的肿瘤细胞含量。或者,这种方法可用于收获形态和/或免疫性不同区域在同一组织部分。

  1. 使用微缩器,切割多达10个4⁄6 μm厚的FFPE肿瘤组织部分,并将其安装在未充电的幻灯片上。
    注:如果标本中只可以看到一个1毫米2窝的癌细胞,应切割10个组织幻灯片,进行人工微分切,以获得目标量的DNA(40 ng);假设1毫米2簇包含700到1000个肿瘤核。
  2. 在 60°C 孵育幻灯片 10 分钟。
  3. 将滑梯放入机架中,进行以下处理:二甲苯20分钟,10分钟乙醇100%,乙醇80%10分钟,乙醇70%10分钟,蒸馏水1分钟,血氧素配色10秒,自来水1分钟。
  4. 在标准倒置显微镜上,使用注射器上的27G针头作为微解剖工具,并收集具有代表性的肿瘤细胞簇。至少收获10个1毫米2组细胞,以确保测序所需的DNA量。
    注:如果形态上不同的区域打算作为不同的实体进行分析,则使用微分法工具分别采集这些区域。
  5. 将收获的簇放入1.5 mL管(材料表)中,以前填充了20μL蛋白酶K和180μL的解酶缓冲液(材料表,均包含在DNA提取试剂盒中),并通过涡旋混合。

3. 处理没有事先微分的组织

注:本程序用于仅包含非肿瘤细胞(生殖系DNA来源)或至少70%形态均质癌细胞的组织块。

  1. 使用微体从选定的FFPE组织块中切割多达6个4⁄5μm厚的组织部分。如步骤 2.5 所述,将组织滚动放入 1.5 mL 管中。

4. 从正常细胞和肿瘤细胞中提取DNA

  1. 根据制造商的说明,使用DNA FFPE组织提取试剂盒(材料表)从正常和肿瘤组织中纯化DNA。
    注:当血液用作生殖系核酸来源时,使用DNA血液提取试剂盒(材料表)纯化DNA。
  2. DNA定量和质量检查
    1. 要量化双链 (dsDNA) 的量,在含有荧光核酸染色(材料表)的溶液中添加 DNA 样本的等分,并使用台式荧光计(材料表)测量发射的荧光).
      注:测定测量附着在dsDNA上的荧光染料发出的荧光信号的强度,并使用标准曲线确定DNA的量。
    2. 使用微体积分光光度计(材料表)测量样品的260/280和260/230比例,以鉴定DNA。"纯"DNA应具有 260/280 的 1.8 和 260/230 的范围在 1.8×2.2。
      注:样品的分光光度评估旨在证明存在影响下游反应的化学污染物(如苯酚)。如果化学试剂造成污染,请使用基于柱的试剂盒执行清理步骤。

5. 图书馆准备和量化

注:图3中报告了库准备和量化步骤的原理图流程图。

  1. DNA库制备(为每个样本设置4个引出池)
    注:4个引水池属于癌症小组报告材料表.每个池包含为 409 个基因的多路复用目标选择而设计的引基对。与组成NGS面板的基因列表的链接在材料表.
    1. 为每个样品准备四个DNA靶点扩增反应,每个引体池一个。对于每个引物池(材料表),加入 0.2 mL 管(材料表):4μL 的主组合(材料表,包含在库套件中),10 μL 的高保真底漆池组合(材料表,包含在癌症面板库),和6 μL的DNA(10纳克总)。
    2. 在运行以下程序的四个 1.5 mL 管中分别放大每个引物池的目标区域:在 99°C 保持 2 分钟(激活热启动聚合酶),16 个周期(在 99°C 下变性 15 秒,退火并在 60°C 下延伸 8 分钟),保持在 4 °C。
      注:停止点。将目标扩增反应储存在4°C过夜或-20°C以上。
    3. 部分消化的放大组结束
      注:NGS 制造商套件提供的手册预见了在部分消化之前将每个样品的不同扩增反应组合起来的步骤。避免这一步,并保持分别处理每个扩增消化。
      1. 在每个样品的每个放大池中加入 2 μL 的特定消化混合物(材料表,包含在库套件中)(每个 0.2 mL 管的总体积为 22 μL)。涡旋彻底和离心每个管收集液滴。
      2. 将管装入热循环器并运行以下程序:50°C 10 分钟,55°C 10 分钟,60°C 20 分钟,10°C 保持(长达 1 小时)。
        注:停止点。将板在-20°C下存放更长时间。
    4. 利盖特适配器,以放大和净化。
      注:在单个芯片上对多个库进行测序时,每个样本使用不同的条形码适配器。同一样品的所有四个放大反应必须收到相同的条形码。
      1. 准备适配器(材料表,条形码适配器套件)。对于每个条形码 X,在最终稀释 1:4 时,准备 P1 适配器和唯一条形码适配器(材料表)的组合。将 4 μL 的水与 2 μL 的 P1 适配器和 2 μL 的唯一条形码适配器混合。将此条形码适配器组合的 2 μL 用于下游通道。
      2. 通过按此顺序将每个样品的放大池添加到每个扩增池中执行结扎反应:4 μL 开关溶液(材料表,包含在库套件中),2 μL 条形码适配器混合物和 2 μL DNA 连带酶(材料表,包含在库套件)(总体积 = 30 μL)。
      3. 涡旋彻底和短暂地离心收集液滴。
      4. 将每根管装入热循环器并运行以下程序:22 °C 30 分钟,68°C 5 分钟,72°C 5 分钟,4 °C 保持(长达 24 小时)。
        注:停止点。将板在-20°C下存放更长时间。
    5. 图书馆纯化和放大
      1. 将每个管离心,然后将每个条形码样品转移到 1.5 mL 管中。在每个样品的池中加入45μL的基于珠子的纯化试剂(材料表)。上下移管5倍,将珠子悬浮液与DNA混合。
      2. 在室温(RT)下孵育混合物5分钟,然后将每根管子放入磁性机架中,孵育2分钟。 小心地取出并丢弃上清液,而不会干扰颗粒。
      3. 在每个管中加入150μL的新鲜70%乙醇。清洗磁体两个位置的两个管的侧对侧移动的珠子。丢弃上清液,注意不要干扰颗粒。
      4. 重复步骤 5.1.5.3 中描述的步骤,然后将管放在磁铁中,并在 RT 处将磁珠空气干燥 5 分钟。
      5. 从磁体中取出每个引物池的纯化库的管,并将 50 μL 的高保真 PCR 混合物(材料表)和 2 μL 的库扩增引物混合物(材料表,包含在库套件中)添加到每个管。
      6. 涡旋每个1.5 mL管和短暂离心收集液滴。
      7. 将 1.5 mL 管放入磁铁中 2 分钟,并小心地将上清液 (±50 μL) 从每个管转移到新的 0.2 mL 管,而不会干扰颗粒。
      8. 放大运行以下程序的每个引物池的库:在 98°C 保持 2 分钟以激活酶,5 个周期(在 98°C 处变性 15 秒,退火并在 64°C 1 分钟延长),在 4°C 保持。将样品储存在-20°C。
    6. 放大库的纯化
      1. 离心每个管收集底部的内容,并将每个放大的库样品转移到1.5 mL管中。
      2. 加入25μL的基于珠子的纯化试剂。上下移管5倍,将珠子悬浮液与DNA混合。
      3. 在RT处孵育混合物5分钟,然后将管子放入磁铁中5分钟。
      4. 小心地将含有增压剂的上清液从每个管转移到新管中,而不会干扰颗粒。
      5. 将60μL的基于珠子的纯化试剂加入每个管的上清液中,上下移液,以混合珠悬浮液和DNA。
      6. 在RT处孵育混合物5分钟,然后将管子放入磁铁中3分钟。
      7. 从每个管子中丢弃上清液,注意不要干扰颗粒。
        注: 放大子与珠子绑定。
      8. 在每个管中加入150μL的新鲜70%乙醇。在磁体的两个位置中,将管侧向移动的珠子清洗。丢弃上清液,注意不要干扰颗粒。
      9. 在步骤 5.1.6.8 中重复此步骤,并在 RT 处将珠子晾干 3 分钟,避免珠子过度干燥。
      10. 从磁铁中取出管子,向颗粒中加入 50 μL 的低 Tris EDTA (TE)(材料表,包含在库套件中),以分散珠子。
      11. 将混合物上下移管几次,在RT处孵育2分钟。
      12. 将管子放入磁铁中至少 2 分钟,并小心地将含有放大器的上清液转移到新管中,而不会干扰磁珠。
  2. 库量化
    1. 使用片段分析仪器 (材料表) 根据高灵敏度 DNA 试剂盒协议运行 DNA 芯片.

6. 库池和排序运行

  1. 用无核酸酶水将每个库稀释至100 pM。将每个 100 pM 库的 10 μL 组合在单个管中进行一次运行。通过移液混合组合库,然后进行模板和排序。
  2. 计划运行创建
    注:典型运行包括四个样品,可基于实验室提供的定序器(Ion质子系统或GeneStudio S5系统,材料表)加载到两种不同类型的半导体芯片(Ion PI芯片或Ion 540芯片) 上。这些系统通常每次运行产生 8000 万次读取。
    1. 在连接到排序系统(例如,Ion Chef 系统)的计算机上打开 Torrent 浏览器,并使用所选应用程序的通用模板(AmpliSeqDNA)计划新的运行。
    2. 切换到计划的"套件"选项卡。根据所使用的测序系统,从仪器下拉列表中选择Ion 质子系统Ion GeneStudio S5 系统。
    3. 根据测序系统,从芯片类型下拉列表中选择合适的芯片(Ion 质子系统的PI芯片;用于Ion GeneStudio S5系统的540芯片)。
    4. 从"库套件"下拉列表中选择Ion AmpliSeq 2.0 库套件。
    5. 模板套件下拉列表中选择模板套件的Ion Chef按钮,然后选择相应的Chef 工具包(用于 PI 芯片的 Ion PI Hi-Q 厨师套件或 Ion 540 Kit-Chef 540 芯片)。
    6. 测序套件下拉列表中选择适当的测序套件(用于 PI 芯片的 Ion PI Hi-Q 测序 200 套件或用于 540 芯片的 Ion S5 测序套件),然后从条形码集下拉列表中选择IonXpress。
    7. 切换到"插件"选项卡并选择"覆盖范围分析"插件。
    8. 切换到"计划"选项卡。从参考库下拉列表中选择GRCh37/hg19基因组。从"目标区域"下拉列表中,选择要排序的相应面板。
    9. 将要测序的条形码数和库样本管的标签设置为相应的字段。
    10. 设置每个库的条形码名称和示例名称。
  3. 示例库稀释和加载。
    1. 将无核酸酶水稀释库存库至 PI 芯片的 25 pM 或 540 芯片的 32 pM。
    2. 将每个稀释的库的 50 μL 移至相应库样品管的底部。
    3. 打开测序系统,按照屏幕上的说明加载所有必需的试剂并导入运行计划。
    4. 加载包含池库的库样本管,并启动克隆扩增程序。
      注: Ion Chef 系统需要每次运行准备两个芯片。
  4. 对Ion质子或Ion基因工作室S5进行测序。
    1. 打开排序系统,按照屏幕上的说明初始化排序并导入运行计划。
    2. 从测序系统取出测序芯片后加载。
      注:在拿起芯片之前接地,以避免静电放电造成芯片损坏。芯片处理/定位以及成功/不成功的加载示例在图4中报告。
    3. 关闭芯片室盖并等待,直到芯片状态图标指示"就绪"。
    4. 第一次运行完成后清空废物容器,然后尽快对剩余芯片进行排序。

7. 突变和拷贝数变化 (CNV) 分析

注:测序数据与GRCh37/hg19人类参考基因组的一致性在计划(步骤6.2.8)中设置后自动执行。

  1. 使用覆盖分析插件 (材料表) 输出来验证覆盖范围的深度和均匀性.
  2. 使用 Torrent 变体调用插件 (材料表)执行变体调用,根据需要选择生殖线体细胞工作流程。
  3. 下载筛选的变体变体呼叫格式 (VCF) 文件。使用变体效应预测器 (VEP) 软件6和 NCBI RefSeq 数据库对变体进行分页。
  4. 使用 Ion 报告器上传插件加载 Ion 报告器软件上的测序数据,并使用综合癌症面板肿瘤正常对工作流分析数据,以估计 CNV。
  5. 根据软件分配的分数手动过滤突变和 CNV,并通过集成基因组查看器 (IGV)7进行视觉验证。
    1. 目视检查对齐方式,看出异常读取(例如,由于误吸、过度放大或读取软剪辑),这些读取可能会生成技术事实调用。
    2. 通过对照基线的标准化覆盖检查给定基因中所有放大器的标准化覆盖率,验证 CNV。
      注:这有助于纠正由于分割软件引起的假调用,它有时调用 CNV 基于对称异常覆盖几个放大器在一个基因的末尾和在连续基因的开头。
  6. 体细胞突变的索引
    1. 对于每个病例,指数突变来自正常组织/血液、原发性肿瘤和转移的测序。
    2. 标为生殖系,并丢弃从生殖系DNA测序数据中也明显的调用。
    3. 标记为克隆/创始人在给定患者的所有病变之间共享的突变。
    4. 标记为亚克隆/进展或在给定患者的某些(但不是所有)病变中检测到的突变。

8. 免疫性光型分析:相关蛋白质表达的免疫性化学

注:免疫组化学用于验证肿瘤抑制基因中灭活突变的功能后果。

  1. 使用微托姆,切割3⁄4μm厚的FFPE组织部分,并将其安装在带电的幻灯片上,并在60°C下孵育幻灯片10分钟。
  2. 将幻灯片放入机架中,执行以下步骤:二甲苯10分钟,二甲苯10分钟,95%乙醇4分钟,95%乙醇4分钟,70%乙醇4分钟,70%乙醇4分钟,蒸馏水4分钟。
  3. 根据抗体制造商的指示(材料表)执行抗原检索。
    1. 将滑梯放入带有特定抗原回收溶液的机架中,并在水浴中以低于沸点的温度浸入水中。
    2. 从浴缸中取出滑梯,并运行自来水冷却 10 分钟。
  4. 在 RT 处将幻灯片放入带有 3% H2O2的 1x Tris 缓冲盐水 (TBS) 的新机架中 20 分钟,以便灭活内源性过氧化物酶。
  5. 将幻灯片放入新机架中,用 TBS 和 0.1% 的 Tween 20 (TBST) 清洗 3 倍。
  6. 使用PAP笔 (材料表) 在滑动安装的组织周围绘制一个疏水性圆圈.
  7. 将幻灯片放在潮湿的腔室中,在 RT 处使用 TBST 中的 5% 牛血清白蛋白 (BSA) 作为阻滞溶液执行阻塞 1 小时。
  8. 在4°C的潮湿腔室中用原抗体(材料表)孵育幻灯片。按照建议用阻滞溶液稀释原抗体。
  9. 将幻灯片放入新机架中,使用 TBST 清洗 3 倍。
  10. 在潮湿室的 RT 下,用特定的二级抗体(抗小鼠或抗兔子)(4⁄5 滴,1 次滑动)孵育幻灯片 30 分钟。
  11. 将滑梯放入新机架中,用 TBST 清洗 3 倍,然后放入蒸馏水中。
  12. 制备3,3'-二氨基苯甲酸(DAB)溶液稀释1分1升稀释缓冲液(材料表)。孵育幻灯片最多在显微镜下进行 5 分钟的检查。
  13. 使用正对照,通过跟踪显微镜下的反应的发展来计算孵育时间。
    注:每种抗体都需要特定的孵育时间。
  14. 非活性 DAB(停止色原沉淀),通过将滑流浸入蒸馏水中。
  15. 将滑轨浸入新机架中,用血氧林冲洗 10 s,然后用自来水冲洗。
  16. 将滑轨放入机架中,执行以下步骤:70% 乙醇 4 分钟,70% 乙醇 4 分钟,95% 乙醇 4 分钟,95% 乙醇 4 分钟,二甲苯 10 分钟,二甲苯 10 分钟。
  17. 密封滑片将几滴安装介质 (材料表) 放在每个组织幻灯片和盖上盖上。
  18. 对盖玻片施加压力,以便将多余的介质和气泡从组织中移开,从盖玻片和空气干燥中移出。
  19. 与专家病理学家一起,在倒置显微镜下评估和评分染色结果。
    注:评分系统将取决于特定的抗原,文献中的信息可能已经存在。如果文献中没有信息,则利用正常组织中抗原的表达作为参考,得出一个评分系统。

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Representative Results

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研究工作流如图1所示。针对409个癌症相关基因的编码序列的5个SPN病例的多病变(n = 13)测序共确定了8个基因中的27个体细胞突变(CTNNB1,KDM6A,BAP1,TET1,SMAD4,TP53), FLT1FGFR3)。当突变在给定患者的所有病变之间共享时,突变被定义为创始人/克隆,当在给定患者的某些(但不是所有病变)中检测到进展者/子克隆时,突变被定义为创始人/克隆(图5A,B)。总体而言,在整个队列中识别的大多数点突变是克隆事件,包括CTNNB1、KDM6A、TET1和FLT1的突变。 在不同病变的病例中,β-卡泰宁(CTNNB1蛋白产物)和KDM6A的免疫组织化学染色在相应基因突变的病例的不同病变中是同质的(图6A,B)。突变标本中KDM6A的中度染色表明,基因改变可能会改变功能,而不是蛋白质表达。胰腺肿瘤的KDM6A功能丧失与缺氧标记GLUT18的向上调节有关,因此在具有KDM6A突变的病例中,GLUT1被过度表达(图6C)。亚克隆突变被发现影响BAP1,SMAD4,TP53和FGFR3。 BAP1和TP53的免疫组织化学证实这些基因的突变是亚克隆的(图6D,E)。拷贝数变异(CNV)分析是使用测序数据进行的,并揭示了所有样本的变化,如图7A所示。与点突变不同,大多数CNV突变是亚克隆的(图7B)。

Figure 1
图1:对转移性病变进行分析的流程图。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:正常和肿瘤组织代表性组织学。
A, B)邻近正常组织 (N) 的肿瘤组织 (T)。在这两个组织部分,肿瘤和正常组织可识别为单独的和封闭的区域。(C) 正常胰腺细胞 (N+) 的簇可视为嵌入肿瘤组织 (T)。(D) 正常胰腺组织的形态。刻度条表示 1 毫米。

Figure 3
图3:库准备和定量协议步骤的原理图流程图。

Figure 4
图4:Ion质子芯片加载和运行。
A) 芯片方向和位置在芯片夹中(左)。金属制表符背面更换(右侧)。(B) 显示两个不同芯片加载项中库密度的热图。库的克隆放大导致切屑表面加载率达到 94%(1.39 亿次读取,自动质量滤波后最终输出 9000 万次读取)。库的克隆放大导致切屑表面加载不良(底部),导致40%的芯片表面加载,具有测序粒子(5900 万次读取,自动质量过滤后最终输出 1200 万次读取)。

Figure 5
图5:转移性病变的躯体变化。
A) 在匹配的原发性/转移性病变中识别的体细胞突变.(B) 每个病例显示全部体细胞突变,包括所有病变(创始人/克隆)和在一个或多个(但不是所有样本)中检测到的病变(进展者/子克隆)。指示每个病例测序的个体转移性病变 (m) 的数量。这个数字已由阿马托等人8重新公布。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:在原发性病变和转移性病变中,对β-卡腾宁、KDM6A、GLUT1、BAP1和TP53进行免疫染色。
A) 具有代表性的免疫组织化学图像显示,从CTNNB1 的SPN 轴承突变(B) 在所有标本中,β-catenin 的核累积(初级和转移)KDM6A的转移性SPN轴承克隆突变。(C) 在一个带有KDM6A突变的SPN中,GLUT1的过度表达,而在野生型组织中未观察到免疫反应。(D, E)BAP1和TP53表达数据表示这两个基因的突变是亚克隆的。比例尺表示 100 μm,内设放大倍数为 600 倍。这个数字已由阿马托等人8修改。

Figure 7
图7:转移性病变的躯体拷贝数变化。
A) 虚拟核核型视图显示在代表性情况下更改基因的位置、接近度和拷贝数状态。染色体带的着色方案如下:黑色和灰色 = 吉姆萨正,浅红色 = 中心,紫色 = 可变区域。更改根据图中所示的颜色代码进行点号。缩写:CNV,拷贝数变化;P,主 SPN;L(a-c),肝脏转移。(B) 每个病例显示所有体细胞变化(受CNV影响的基因),包括所有病变(创始人/克隆)和在一个或多个(但不是全部)标本中检测到的病变(进展者/子克隆)。指示每个病例测序的个体转移性病变 (m) 的数量。这个数字已由阿马托等人8重新公布。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

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我们的方法通过整合垂直数据(即形态学、DNA测序和免疫组织化学)与特定患者的不同病变,识别实体肿瘤进展中涉及的分子变化。通过查询409个癌症相关基因8的编码序列,我们证明了我们的方法检测突变沉默肿瘤类型(即胰腺的SPN、固体伪皮毛肿瘤)的克隆和亚克隆事件的能力。此处使用的基于放大素的靶向测序方法的一个优点是覆盖均匀性(90% 的目标碱基覆盖 100 倍,95% 覆盖 20 倍),跨被询问区域(15,992),典型平均覆盖深度为 1000 倍。通过微分切与肿瘤细胞富集相结合,具有很高的覆盖深度,保证了低等位基因频率事件检测的高灵敏度。正如我们之前已经表明的9,靶向测序方法允许从FFPE组织的DNA样本上检测突变频率降至2%的等位基因。例如,在本项工作中,我们能够将4%等位基因频率TP53误感突变确定为转移标本中的亚克隆事件(图5),并通过免疫组织化学验证了这一现象(图6)。我们的协议设想对匹配的肿瘤和生殖系DNA进行测序,以识别体细胞事件,从而降低癌症单线10的亚克隆突变的假检测率。当匹配的生殖系DNA不可用时,可以考虑在测序数据分析中采用更保守的参数,包括基于最小覆盖深度的严格过滤器,以及限制称为"热点突变"的变异和在可用数据库中广泛修饰的突变。对生殖系DNA与匹配肿瘤进行测序,还具有准确检测拷贝数变异(CNV)的优点。或者,可以使用性别匹配的二倍体基因组池来减少测序数据产生的噪音,并方便CNV的检测。除了包含生殖系DNA外,我们修改了库协议,以减少引物池不平衡,并改善CNV调用。根据原始协议,在多倍 PCR 后,从每个 DNA 样本中产生的四个放大素池应混合在一起,其余步骤将在每个样本的一个管中执行。但是,由于多路PCR在不同管中可能有不同的效率,这会导致每个池平均覆盖深度的波动。在原始协议中没有池量化/规范化步骤来说明此影响。为了避免上述波动,我们决定在整个库生产协议中将四个放大子池分开,直到它们能够量化为止。量化后,每个DNA样本的四个池中的每一个的相同数量可以添加到最终库池中,确保最终的平均覆盖率尽可能均匀。

在遗传水平上评估肿瘤内异质性(ITH)具有重要的临床意义,但同样提出了新的挑战2。一个主要的挑战确实是区分驾驶员突变和随机事件(即乘客突变)的必要性。驾驶员乘客突变之间的区别通常是计算实现的,但并非没有偏差。虽然检测到的变异的系统功能化既昂贵又耗时,但至少对基因的一部分,可以通过对相应蛋白质进行免疫组织化学分析,或间接地评估基因变异的功能后果,通过测量蛋白质功能障碍的代理标记物的表达。我们的方案已应用于FFPE组织,它是临床环境中的主要材料来源,但对测序提出了挑战;在测序11之前,应始终评估分离核酸的质量。虽然靶向测序的主要优点是具有成本效益,在计算要求方面要求不高,但它的主要缺点是只询问基因组的有限部分,这可能导致低估肿瘤内异质性。此外,这种方法没有考虑到转移和原发性肿瘤之间的相关表观遗传和转录组差异,最近已经证明,在某些肿瘤类型4,12的遗传差异。 13.然而,人们设想,技术进步将很快使更丰富的纵向数据组合得以整合,以便更好地评估国际数据资料。我们的方法更喜欢深度而不是基因组的物理覆盖,这限制了我们建立基于SNV的专有技术的能力。然而,由于分子病理学分析与组织病理学分析的整合,我们的方法提供了探索临床标本中遗传相关性的机会,具有适当的敏感性和特异性。我们已经成功地将该协议应用于特定的肿瘤类型(例如SPN),并预测该方法同样适用于其他固体肿瘤类型。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了意大利癌症基因组计划的支持。FIRB RBAP10AHJB),意大利协会,意大利皇家空军(AIRC;第12182号给AS,18178号给VC),FP7欧洲共同体赠款(Cam-Pac No 602783到AS)。供资机构在收集、分析和解释数据或编写手稿方面没有作用。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies G2939BA  Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit Fisher Scientific NC9959336 Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4627 Library quantification
Anti-BAP1 Santa Cruz Biotechnology sc-28383 Antibody
Anti-GLUT1 Thermo Scientific RB-9052 Antibody
Anti-KDM6A Cell Signaling #33510 Antibody
Anti-p53 Novocastra NCL-L-p53-DO7 Antibody
Anti-βcatenin Sigma-Aldrich C7207 Antibody
Blocking Solution home made - 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution home made - 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra Leica 70937891 Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1 Leica Biosystems AR9961 Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2 Leica Biosystems AR9640 EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear Eppendorf 951010006 Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021 Tubes
Ethanol DIAPATH A0123 IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H­4000 Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Laboratories SK­4105 HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7401­50 Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7402­50 Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV) Broad Institute - https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Thermofisher Scientific 4477685 Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermofisher Scientific 4480441 Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument Thermofisher Scientific 4484177 Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip Thermofisher Scientific A26771 or A27766 Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef Thermofisher Scientific A27198 or A30011 Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit Thermofisher Scientific A26433 or A30011 Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System Thermofisher Scientific 4476610 or A38196 Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair Thermofisher Scientific 4487118 Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin Thermofisher Scientific 4487118 Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit Thermofisher Scientific 4474517 Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermofisher Scientific ND-2000 DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity Fisher Scientific 12532-016 or 12532-024 SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit Quiagen 51106 0r 51104 DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue Quiagen 56404 DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer Thermofisher Scientific Q32866 DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermofisher Scientific Q32850 Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST home made - Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film Sakura Europe 6172 Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software EMBI-EBI - http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres Carlo Erba 492306 IHC deparaffinization reagent

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References

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通过有针对性的测序方法进行比较病变分析
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Cite this Article

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).More

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).

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