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Behavior

Analyse comparative des lésions par une approche de séquençage ciblée

doi: 10.3791/59844 Published: November 5, 2019

Summary

Cet article décrit une méthode pour identifier des altérations clonales et subclonales parmi différents spécimens d'un patient donné. Bien que les expériences décrites ici se concentrent sur un type spécifique de tumeur, l'approche est largement applicable à d'autres tumeurs pleines.

Abstract

L'évaluation de l'hétérogénéité intratumorale (ITH) est d'une importance primordiale pour anticiper l'échec des thérapies ciblées et concevoir en conséquence des stratégies antitumorales efficaces. Bien que des soucis soient fréquemment soulevés en raison des différences dans le traitement d'échantillon et la profondeur de la couverture, le séquençage de prochaine génération des tumeurs pleines ont démêlé un degré fortement variable d'ITH à travers des types de tumeur. La capture de la parenté génétique entre les lésions primaires et métastatiques par l'identification des populations clonales et subconaux est essentielle à la conception de thérapies pour les maladies à un stade avancé. Ici, nous rapportons une méthode pour l'analyse comparative de lésions qui permet l'identification des populations clonales et subconales parmi différents spécimens du même patient. L'approche expérimentale décrite ici intègre trois approches bien établies : l'analyse histologique, le séquençage multilésion à haute couverture et les analyses immunophénotypiques. Afin de réduire au minimum les effets sur la détection des événements sous-clonal par le traitement inapproprié d'échantillon, nous avons soumis des tissus à l'examen pathologique soigneux et à l'enrichissement néoplastique de cellules. L'ADN contrôlé de qualité des lésions néoplastiques et des tissus normaux a alors été soumis au séquençage de couverture élevé, ciblant les régions codantes de 409 gènes de cancer pertinents. Tout en ne regardant qu'un espace génomique limité, notre approche permet d'évaluer l'étendue de l'hétérogénéité parmi les altérations somatiques (mutations mononucléotides et variations de nombre de copies) dans des lésions distinctes d'un patient donné. Grâce à l'analyse comparative des données de séquençage, nous avons pu distinguer les altérations clonales par rapport aux altérations subclonales. La majorité de l'ITH est souvent attribuée à des mutations de passagers; par conséquent, nous avons également employé l'immunohistochimie pour prévoir des conséquences fonctionnelles des mutations. Tandis que ce protocole a été appliqué à un type spécifique de tumeur, nous prévoyons que la méthodologie décrite ici est largement applicable à d'autres types de tumeur pleine.

Introduction

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L'avènement du séquençage de nouvelle génération (NGS) a révolutionné la façon dont les cancers sont diagnostiqués et traités1. NGS couplé au séquençage multirégional ont exposé un degré élevé d'hétérogénéité intra-tumorale (ITH) dans les tumeurs solides2, ce qui explique en partie l'échec de la thérapie ciblée due à la présence de sous-clones avec une sensibilité médicamenteuse différente2 . Un défi important posé par les études de séquençage à l'échelle du génome est la nécessité de faire la distinction entre les mutations des passagers (c.-à-d. neutres) et des mutations du conducteur dans les cancers individuels3. Plusieurs études ont en effet montré que, dans certaines tumeurs, les mutations des passagers représentent la majorité de l'ITH, tandis que les altérations du conducteur ont tendance à être conservées parmi les lésions du même individu4. Il est également important de noter que la charge mutationnelle importante (comme on le voit dans les cancers du poumon et le mélanome) n'implique pas nécessairement un grand fardeau mutationnel subclonal2. Par conséquent, un degré élevé d'ITH peut être trouvé dans les tumeurs avec le bas fardeau mutationnel.

Les métastases sont responsables de plus de 90 % des décès liés au cancer dans le monde5; par conséquent, la capture de l'hétérogénéité mutationnelle des gènes de conducteur parmi les lésions primaires et métastatiques est essentielle à la conception des thérapies efficaces pour les maladies de stade avancé. Le séquençage clinique est généralement effectué sur les acides nucléiques des tissus fixes, ce qui rend l'exploration à l'échelle du génome difficile en raison de la mauvaise qualité de l'ADN. D'autre part, l'intention du séquençage clinique est d'identifier les mutations actionnables et/ou les mutations qui pourraient prévoir la réactivité/insensibilité à un régime thérapeutique donné. Dans l'état actuel des choses, le séquençage peut être limité à une plus petite fraction du génome pour l'extraction en temps opportun d'informations cliniquement pertinentes. La transition du profilage de l'ADN à faible débit (p. ex., séquençage de sanger) à NGS a permis d'analyser des centaines de gènes cancer-pertinents à une profondeur élevée de couverture, ce qui permet la détection d'événements sous-clonaux. Ici, nous rapportons une méthode pour l'analyse comparative des lésions qui permet l'identification des populations clonales et subconales parmi différents spécimens d'un même individu. La méthode décrite ici intègre trois approches bien établies (analyse histologique, séquençage multilésion à haute couverture et analyses immunophénotypiques) pour prédire les conséquences fonctionnelles des variations identifiées. L'approche est décrite schématiquement dans la figure 1 et a été appliquée à l'étude de 5 cas métastatiques de néoplasmes pseudopapillaires solides (SPN) du pancréas. Tandis que nous décrivons le traitement et l'analyse des spécimens de tissu paraffins-incorporés formalin-fixes (FFPE), la même procédure peut être appliquée au matériel génétique du tissu fraîche-congelé.

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Protocol

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Le matériel utilisé dans l'étude a été recueilli en vertu d'un protocole spécifique, qui a été approuvé par le comité d'éthique local. Le consentement éclairé écrit de tous les patients était disponible.

1. Révision histologique et immunophénotypique des spécimens de tissus

REMARQUE : Un pathologiste expert est responsable des activités décrites ci-après.

  1. Révision histopathologique des cas choisis selon des critères diagnostiques bien établis.
    1. Utilisez le microtome pour couper des sections de tissu de 4 à 5 m d'épaisseur à partir de blocs de tissu FFPE représentatifs et montez les sections sur des diapositives d'histologie standard.
    2. Effectuer l'hématoxylin et la coloration de l'éosine pour chaque diapositive à l'aide d'un colorant automatique de glissement de tissu (Tableau des matériaux).
    3. Passez en revue le diagnostic histopathologique des cas de tumeur choisis selon des critères diagnostiques de l'OMS.
      REMARQUE : À ce stade, le pathologiste pourrait identifier les secteurs morphologiquement distincts de la tumeur dans la même section de tissu. Il est possible de récolter ces zones séparément (voir la section 2). La ressemblance histologique de tumeur et de cellules normales pour des SPN est fournie dans la figure 2.
    4. Effectuer la coloration immunohistochimique pour les marqueurs établis pour compléter l'analyse histologique et estimer l'hétérogénéité immunophenotypic.
      REMARQUE : Le pathologiste pourrait identifier les secteurs immunophénotypiquement distincts de la tumeur dans la même section de tissu. Il est possible de récolter ces zones séparément (voir la section 2).
  2. Évaluer la cellularité néoplastique de la section de tissu de tumeur et planifier la microdissection manuelle en conséquence.
    REMARQUE : Il s'agit d'une estimation de la cellularité tumorale générée par le pathologiste.
    1. Si la teneur en cellules néoplastiques de la section tissulaire est supérieure à 70 %, la microdissection manuelle n'est pas obligatoire; passer directement à l'étape 3.1.
      REMARQUE : Ciblez 70 % de la teneur en cellules néoplastiques afin d'assurer une sensibilité adéquate aux estimations de la fréquence des allèles mutants et (ii) de valider éventuellement les mutations clonales par des méthodologies moins sensibles (p. ex., le séquençage capillaire).
    2. Si la teneur en cellules néoplastiques de la section tissulaire est inférieure à 70 %, la microdissection est nécessaire et passer à l'étape 2.
  3. Évaluer les sections tissulaires du bloc FFPE où le tissu non néoplastique a été échantillonné. Ce tissu est utilisé comme source d'ADN germinal.
    REMARQUE : Le sang est une source alternative d'ADN germinal. Dans ce cas, procéder à l'extraction de l'ADN comme le recommande la note de l'étape 4.1.
    1. Si seulement le tissu non néoplastique est visible dans la section tissulaire(figure 2D),la microdissection manuelle n'est pas nécessaire; passer directement à l'étape 3.1.
    2. Si une contamination importante par les cellules néoplastiques est présente dans la section tissulaire, une microdissection manuelle est nécessaire; passer à l'article 2.

2. Microdissection manuelle

REMARQUE: Cette méthode est applicable à divers types de tumeurs solides, et il est destiné à augmenter la teneur en cellules néoplastiques des spécimens de tissus. Alternativement, cette méthode peut être employée pour moissonner morphologiquement et/ou immunophénotypiquement des secteurs distincts dans la même section de tissu.

  1. À l'aide d'un microtome, couper jusqu'à dix sections de tissu tumoral FFPE d'une épaisseur de 4 à 6 m et les monter sur des glissières non chargées.
    REMARQUE : Si un seul nid de 1 mm2 de cellules cancéreuses est visible dans le spécimen, 10 lames de tissu doivent être coupées et soumises à une microdissection manuelle afin d'obtenir la quantité ciblée d'ADN (40 ng); ceci supposant que le cluster de 1 mm2 contient entre 700 et 1000 noyaux tumoraux.
  2. Incuber les toboggans à 60 oC pendant 10 min.
  3. Placez les lames dans une grille et effectuez les lavages suivants : xylène pendant 20 min, 100 % d'éthanol pour 10 min, 80 % d'éthanol pour 10 min, 70 % d'éthanol pour 10 min, eau distillée pendant 1 min, hématoxyline contre-tache pendant 10 s, eau du robinet pendant 1 min.
  4. Sur un microscope inversé standard, utilisez une aiguille de 27 G sur une seringue comme outil de microdissection et collectez des grappes représentatives de cellules tumorales. Récoltez un minimum de dix grappes de cellules de 1 mm2 pour assurer la quantité d'ADN requise pour le séquençage.
    REMARQUE : Si les zones morphologiquement distinctes sont destinées à être analysées en différentes entités, utilisez l'outil de microdissection pour récolter ces zones séparément.
  5. Placer les grappes récoltées dans des tubes de 1,5 ml(tableau des matériaux)précédemment remplis de 20 l de protéase K et 180 l de tampon de lyse(tableau des matériaux, tous deux inclus dans le kit d'extraction de l'ADN) et mélanger par vortexing.

3. Traitement des tissus sans microdissection préalable

REMARQUE : Cette procédure est utilisée pour les blocs tissulaires qui ne contiennent que des cellules non néoplastiques (source d'ADN germinal) ou qui contiennent au moins 70 % des cellules cancéreuses morphologiquement homogènes.

  1. À l'aide d'un microtome coupé jusqu'à six sections de tissu de 4 à 5 m d'épaisseur provenant de blocs de tissu FFPE sélectionnés. Placez les rouleaux de tissu dans des tubes de 1,5 ml tels que décrits à l'étape 2.5.

4. Extraction d'ADN à partir de cellules normales et néoplastiques

  1. Purifie l'ADN à partir de tissus normaux et néoplastiques à l'aide du kit d'extraction de tissus FFPE de l'ADN(tableau des matériaux)selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Lorsque le sang est utilisé comme source d'acide nucléique germinal, purifier l'ADN à l'aide d'une trousse d'extraction de sang d'ADN(Tableau des matériaux).
  2. Quantification de l'ADN et contrôle de la qualité
    1. Pour quantifier la quantité de double brin (dsDNA), ajouter un aliquot de l'échantillon d'ADN à une solution contenant une tache d'acide nucléique fluorescente (Tableau des matériaux) et mesurer la fluorescence émise à l'aide d'un fluoromètre de banc(Tableau des matériaux ).
      REMARQUE : L'analyse mesure l'intensité du signal fluorescent émis par les colorants fluorescents attachés à l'ADN et détermine la quantité d'ADN à l'aide d'une courbe standard.
    2. Utilisez un spectrophotomètre microvolume(Tableau des matériaux)pour mesurer les ratios 260/280 et 260/230 de l'échantillon afin de qualifier l'ADN. L'ADN « pur » devrait avoir un 260/280 de 1,8 et un 260/230 dans la gamme de 1,8 à 2,2.
      REMARQUE : L'évaluation spectrophotométrique de l'échantillon vise à établir la présence de contaminants chimiques (p. ex. phénol) qui ont un impact sur les réactions en aval. En cas de contamination due à des réactifs chimiques, effectuez une étape de nettoyage à l'aide d'un kit à colonnes.

5. Préparation et quantification des bibliothèques

REMARQUE : Le diagramme schématique des étapes de préparation et de quantification des bibliothèques est indiqué à la figure 3.

  1. Préparation de la bibliothèque d'ADN (4 bassins d'amorce mis en place pour chaque échantillon)
    REMARQUE : Les 4 bassins d'amorce appartiennent au panel de cancerTableau des matériaux. Chaque pool contient des paires d'amorces conçues pour une sélection de cibles multiplexées de 409 gènes. Un lien vers la liste des gènes composant le panel NGS est fourni dansTableau des matériaux.
    1. Préparer quatre réactions d'amplification de cible d'ADN pour chaque échantillon, un par pool d'amorce. Pour chaque piscine d'amorce (Table des Matériaux), ajouter dans un tube de 0,2 ml (Tableau des Matériaux):4 'L de master mix (Table of Materials, inclus dans le kit de la bibliothèque), 10 'L de haute fidélité primer pool mix ( Tableof Materials, inclus dans le la bibliothèque de panneau de cancer), et 6 l de l'ADN (10 ng total).
    2. Amplifier les régions cibles de chaque bassin d'amorce séparément dans quatre tubes de 1,5 ml exécutant le programme suivant : tenir à 99 oC pendant 2 min (activation de la polymérase à démarrage à chaud), 16 cycles (dénature à 99 oC pour 15 s, anneale et étendre à 60 oC pendant 8 min) , tenir à 4 oC.
      REMARQUE : Point d'arrêt. Stockez les réactions d'amplification ciblées à 4 oC pendant la nuit ou à -20 oC pendant une plus longue période.
    3. Fin de la digestion partielle des amplicons
      REMARQUE : Le manuel fourni par le kit du fabricant NGS prévoit une étape dans laquelle les différentes réactions d'amplification de chaque échantillon sont combinées avant la digestion partielle. Évitez cette étape et continuez à traiter chaque digestion d'amplification séparément.
      1. Ajouter 2 ll de mélange de digestion spécifique(tableau des matériaux, inclus dans le kit de bibliothèque) à chaque pool amplifié de chaque échantillon (le volume total de chaque tube de 0,2 ml est de 22 l). Vortex soigneusement et centrifuger chaque tube pour recueillir les gouttelettes.
      2. Chargez les tubes dans le cycleur thermique et exécutez le programme suivant : 50 oC pendant 10 min, 55 oC pour 10 min, 60 oC pour 20 min, 10 oC (jusqu'à 1 h).
        REMARQUE : Point d'arrêt. Conserver l'assiette à -20 oC pendant de plus longues périodes.
    4. Adaptateurs de ligate pour amplifier et purifier.
      REMARQUE : Utilisez un adaptateur de code à barres différent pour chaque échantillon lors du séquençage de plusieurs bibliothèques sur une seule puce. Les quatre réactions d'amplification d'un même échantillon doivent recevoir le même code-barres.
      1. Préparer des adaptateurs(Table des Matériaux, kit d'adaptateurs de codes à barres). Pour chaque code-barres X, préparez un mélange d'adaptateur P1 et d'adaptateurs de codes à barres uniques (Table of Materials) à une dilution finale de 1:4. Mélanger 4 ll d'eau avec 2 l d'adaptateur P1 et 2 l d'adaptateurs de codes à barres uniques. Utilisez 2 ll de ce mélange d'adaptateur de code à barres pour les passages en aval.
      2. Effectuer la réaction de ligature en ajoutant à chaque pool amplifié de chaque échantillon dans cet ordre : 4 l de solution de commutateur(Tableau des matériaux, inclus dans le kit de bibliothèque), 2 l de mélange d'adaptateur de code à barres et 2 l de ligase d'ADN (Tableau des matériaux, inclus dans le kit de la bibliothèque) (volume total de 30 l).
      3. Vortex soigneusement et brièvement centrifugeuse pour recueillir les gouttelettes.
      4. Chargez chaque tube dans le cycleur thermique et exécutez le programme suivant : 22 oC pendant 30 min, 68 oC pour 5 min, 72 oC pour 5 min, 4 oC (jusqu'à 24 h).
        REMARQUE : Point d'arrêt. Conserver l'assiette à -20 oC pendant de plus longues périodes.
    5. Purification et amplification des bibliothèques
      1. Centrifuger chaque tube, puis transférer chaque échantillon à code à barres dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 45 ll de réactif de purification à base de perles (Tableau des matériaux) à chaque pool de chaque échantillon. Pipet up and down 5x pour mélanger la suspension de perle avec l'ADN.
      2. Incuber le mélange pendant 5 minutes à température ambiante (RT), puis placer chaque tube dans un support magnétique et couver pendant 2 min. Retirez soigneusement et jetez le supernatant sans déranger le granule.
      3. Ajouter chaque tube 150 'L d'éthanol frais de 70%. Laver les perles en déplaçant chaque tube d'un côté à l'autre des deux positions de l'aimant. Jeter le supernatant et faire attention à ne pas déranger la boulette.
      4. Répétez les procédures décrites à l'étape 5.1.5.3, puis gardez les tubes dans l'aimant et séchez les perles à RT pendant 5 min.
      5. Retirez les tubes avec des bibliothèques purifiées de chaque pool d'amorce de l'aimant et ajoutez 50 l de MIX PCR haute fidélité(Tableau des Matériaux) et 2 l de mélange d'apprêt d'amplification de bibliothèque(Tableau des matériaux, inclus dans le kit de bibliothèque) aux boulettes de perles de chaque tube.
      6. Vortex chaque tube de 1,5 ml et brièvement centrifugeuse pour recueillir les gouttelettes.
      7. Placer 1,5 ml de tubes dans l'aimant pendant 2 min et transférer délicatement le supernatant (50 l) de chaque tube à un nouveau tube de 0,2 ml sans déranger la pastille.
      8. Amplifier les bibliothèques de chaque piscine d'amorce exécutant le programme suivant : tenir à 98 oC pendant 2 min pour activer l'enzyme, 5 cycles (dénature à 98 oC pour 15 s, anneale et étendre à 64 oC 1 min), tenir à 4 oC. Entreposer les échantillons à -20 oC.
    6. Purification de la bibliothèque amplifiée
      1. Centrifuger chaque tube pour recueillir le contenu au fond et transférer chaque échantillon de bibliothèque amplifié à un tube de 1,5 ml.
      2. Ajouter 25 l de réactif de purification à base de perles. Pipet up and down 5x pour mélanger la suspension de perle avec l'ADN.
      3. Incuber le mélange pendant 5 min à RT, puis placer les tubes dans l'aimant pendant 5 min.
      4. Transférer soigneusement le supernatant, qui contient les amplicons, de chaque tube à de nouveaux tubes sans déranger la pastille.
      5. Ajoutez 60 ll de réactif de purification à base de perles au supernatant de chaque tube et de chaque tuyau tupé vers le haut et vers le bas afin de mélanger la suspension de perle et l'ADN.
      6. Incuber le mélange pendant 5 min à RT, puis placer les tubes dans l'aimant pendant 3 min.
      7. Jeter le supernatant de chaque tube et faire attention à ne pas déranger la pastille.
        REMARQUE : Les amplicons sont liés aux perles.
      8. Ajouter chaque tube 150 'L d'éthanol frais de 70%. Laver les perles en déplaçant les tubes d'un côté à l'autre dans les deux positions de l'aimant. Jeter le supernatant et faire attention à ne pas déranger la boulette.
      9. Répétez la procédure à l'étape 5.1.6.8 et séchez les perles à RT pendant 3 min. Éviter un séchage excessif des perles.
      10. Retirez les tubes de l'aimant et ajoutez 50 l de Tris EDTA (TE)(tableau de matériaux, inclus dans le kit de bibliothèque) à la pastille pour disperser les perles.
      11. Pipet le mélange de haut en bas plusieurs fois et incuber à RT pendant 2 min.
      12. Placer les tubes dans l'aimant pendant au moins 2 min et transférer soigneusement le supernatant, qui contient les amplicons, dans de nouveaux tubes sans déranger les perles.
  2. Quantification des bibliothèques
    1. Utilisez un instrument d'analyse de fragments(Tableau des matériaux) pour exécuter une puce d'ADN selon le protocole de kit d'ADN à haute sensibilité.

6. Les bibliothèques mise en commun et séquençage s'exécutent

  1. Diluer chaque bibliothèque à 100 pM avec de l'eau sans nucléarnie. Combinez 10 l de chaque bibliothèque de 100 pM pour une seule course dans un seul tube. Mélanger les bibliothèques combinées par pipetting et procéder à la tempéture et le séquençage.
  2. Création d'exécution planifiée
    REMARQUE : Une exécution typique comprend quatre échantillons qui peuvent être chargés sur deux types différents de puce semi-conductrice (puce Ion PI ou puce Ion 540) basé sur le séquenceur disponible en laboratoire (Ion Proton System ou GeneStudio S5 System, Table of Materials). Ces systèmes produisent généralement 80 millions de lectures par exécution.
    1. Ouvrez le navigateur Torrent sur un ordinateur connecté au système de séquençage (par exemple, Ion Chef System) et planifiez une nouvelle exécution en utilisant le modèle générique pour l'application sélectionnée (AmpliSeqDNA).
    2. Passez à l'onglet Kits du plan. Sélectionnez Ion Proton System ou Ion GeneStudio S5 System de la liste de décapage des instruments en fonction du système de séquençage utilisé.
    3. Selon le système de séquençage, sélectionnez la puce appropriée (puce PI pour Ion Proton Systems; 540 puce pour Ion GeneStudio S5 Systems) à partir de la liste de déclassement chip Type.
    4. Sélectionnez Ion AmpliSeq 2.0 Bibliothèque Kit de la liste de déroulant sa trousse de bibliothèque.
    5. Sélectionnez le bouton Ion Chef pour Template Kit, puis sélectionnez le Kit Chef approprié (Ion PI Hi-Q Chef Kit pour la puce PI ou Ion 540 Kit-Chef pour 540 jetons) à partir de la liste de déclassement du Kit Template.
    6. Sélectionnez le kit de séquençage approprié (Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit pour la puce PI ou Ion S5 Squencing Kit pour 540 jetons) à partir de la liste de déclassement du kit de séquençage, puis sélectionnez IonXpress dans la liste de déclassement de Barcode Set.
    7. Passez à l'onglet Plugin et sélectionnez le plugin d'analyse de couverture.
    8. Passez à l'onglet Plan. Sélectionnez le génome GRCh37/hg19 de la liste de dépouillement de la bibliothèque de référence. À partir de la liste de déroulant des régions cibles, sélectionnez le panneau approprié à séquencer.
    9. Définir le nombre de codes à barres à séquencer et l'étiquette des tubes d'échantillon de bibliothèque dans les champs appropriés.
    10. Définir le nom du code-barres et l'exemple de chaque bibliothèque.
  3. Exempledez la dilution et le chargement des bibliothèques.
    1. Diluer la bibliothèque de stock avec de l'eau sans nucléane à 25 pM pour la puce PI ou 32 pM pour 540 puces.
    2. Pipet 50 'L de chaque bibliothèque diluée au fond du tube d'échantillon de bibliothèque approprié.
    3. Activez le système de séquençage et suivez les instructions à l'écran pour charger tous les réactifs requis et importer le plan d'exécution.
    4. Chargez le tube d'échantillon de bibliothèque contenant les bibliothèques mises en commun et commencez le programme d'amplification clonale.
      REMARQUE : Le système Ion Chef nécessite deux jetons à préparer par course.
  4. Séquençage sur Ion Proton ou Ion GeneStudio S5.
    1. Activez le système de séquençage et suivez les instructions à l'écran pour initialiser le séquençage et importer le plan d'exécution.
    2. Chargez la puce de séquençage après l'avoir retirée du système de séquençage.
      REMARQUE : Soyez mis à la terre avant de ramasser une puce afin d'éviter les dommages causés par les copeaux en raison d'une décharge électrostatique. La manipulation/positionnement des copeaux ainsi que des exemples de chargement réussi ou infructueux sont rapportés à la figure 4.
    3. Fermez le couvercle du compartiment à puces et attendez que l'icône de l'état des puces indique « Prêt ».
    4. Videz le conteneur à déchets lorsque la première exécution est terminée, puis séquencez la puce restante dès que possible.

7. Analyse des mutations et des variations du nombre de copies (CNV)

REMARQUE : L'alignement des données de séquençage sur le génome de référence humain GRCh37/hg19 est automatiquement effectué une fois établi dans le Plan (étape 6.2.8).

  1. Utilisez le plugin d'analyse de couverture (tableau des matériaux) sortie pour vérifier la profondeur de la couverture et l'uniformité.
  2. Effectuer l'appel de variante à l'aide du plugin d'appelant de variante torrent (Tableau des matériaux), en sélectionnant la ligne germinale ou le flux de travail somatique le cas échéant.
  3. Téléchargez des variantes filtrées Variant Call Format (VCF) fichiers. Annotate variantes à l'aide du logiciel Variant Effect Predictor (VEP)6 et de la base de données NCBI RefSeq.
  4. Chargez les données de séquençage sur le logiciel Ion Reporter à l'aide du plugin de téléchargeur Ion Reporter et utilisez le flux de travail de paire tumeur-normale du Groupe complet sur le cancer pour analyser les données afin d'estimer les VNC.
  5. Filtrer manuellement les mutations et les CNV en fonction des scores attribués par le logiciel et les vérifier visuellement avec le Visualiseur de Génomique Intégrative (IGV)7.
    1. Inspecter visuellement l'alignement à la recherche de lectures inhabituelles (en raison, par exemple, d'une mauvaise réprimande, d'une suramplification ou d'une lecture de coupures de doux) qui peuvent générer des appels artéfactuels.
    2. Vérifier les VNC en inspectant la couverture normalisée de tous les amplicons à travers un gène donné par rapport à la couverture normalisée de la ligne de base.
      REMARQUE : Cela permet de corriger les faux appels dus au logiciel de segmentation, qui appelle parfois un CNV basé sur une couverture symétriquement anormale de quelques amplicons à la fin d'un gène et au début du gène successif.
  6. Indexation des mutations somatiques
    1. Pour chaque cas, la mutation d'index appelle du séquençage du tissu/sang normal, de la tumeur primaire et des métastases.
    2. Drapeau comme germline et jeter les appels qui sont également évidents à partir des données de séquençage de l'ADN germinal.
    3. Drapeau comme clonal/fondateur les mutations qui sont partagées entre toutes les lésions d'un patient donné.
    4. Drapeau comme subclonal/progresseur les mutations qui sont détectées dans quelques-unes mais pas toutes les lésions d'un patient donné.

8. Analyse immunophénotypique : immunohistochimie pour l'expression protéique pertinente

REMARQUE : L'immunohistochimie a été employée pour valider les conséquences fonctionnelles des mutations inactivantes dans des gènes suppresseurs de tumeur.

  1. À l'aide d'un microtome, couper des sections de tissu FFPE d'une épaisseur de 3 à 4 m et les monter sur des lames chargées et incuber des lames à 60 oC pendant 10 min.
  2. Placez les lames dans une grille et effectuez les étapes suivantes : xylène pendant 10 min, xylène pendant 10 min, 95 % d'éthanol pour 4 min, 95 % d'éthanol pour 4 min, 70 % d'éthanol pour 4 min, 70 % d'éthanol pour 4 min, eau distillée pendant 4 min.
  3. Effectuer la récupération d'antigène basée sur l'indication des fabricants d'anticorps (Tableau des matériaux).
    1. Placez les glissières dans une grille avec la solution spécifique de récupération d'antigène et plongez dans un bain d'eau à des températures inférieures à l'ébullition.
    2. Retirer les lames du bain et faire couler l'eau du robinet pour refroidir pendant 10 min.
  4. Placez les toboggans dans un nouveau rack avec 3% H2O2 en 1x Tris-buffered saline (TBS) pendant 20 min à RT afin d'inactiver les peroxidases endogènes.
  5. Placez les glissières dans un nouveau rack et lavez 3x avec le SCT et 0,1 % de l'entredeux 20 (TBST).
  6. Utilisez un stylo PAP(Table of Materials)pour dessiner un cercle hydrophobe autour de tissus montés sur glissière.
  7. Placez les diapositives dans une chambre humide et effectuez le blocage pendant 1 h à RT en utilisant 5% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans TBST comme solution de blocage.
  8. Incuber des toboggans avec des anticorps primaires (Table of Materials) dans une chambre humide pendant la nuit à 4 oC. Diluer l'anticorps primaire avec la solution de blocage comme recommandé.
  9. Placer les toboggans dans une nouvelle grille et laver 3x avec TBST.
  10. Incuber des toboggans avec des anticorps secondaires spécifiques (anti-souris ou anti-lapin) (4 à 5 gouttes pour 1 toboggan) pendant 30 min à RT dans une chambre humide.
  11. Placer les toboggans dans une nouvelle grille et laver 3x avec tBST et après dans l'eau distillée.
  12. Préparer 3,3'-diaminobenzidine (DAB) solution diluant 1 goutte dans 1 ml de tampon de dilution (Tableau des matériaux). Incubate glisse au maximum pendant 5 min sous le microscope.
  13. Utilisez un contrôle positif pour calculer le temps d'incubation en suivant le développement de la réaction au microscope.
    REMARQUE : Chaque anticorps a besoin d'un temps d'incubation spécifique.
  14. DAB inactif (arrêt des précipitations chromogènes) en submergeant les toboggans dans l'eau distillée.
  15. Counterstain glisse en les immerger dans une nouvelle grille avec de l'hématoxyline pour 10 s, puis rincer à l'eau du robinet.
  16. Placez les lames dans une grille et effectuez les étapes suivantes : 70 % d'éthanol pour 4 min, 70 % d'éthanol pour 4 min, 95 % d'éthanol pour 4 min, 95 % d'éthanol pour 4 min, xylène pendant 10 min, xylène pendant 10 min.
  17. Scellez les glissières mettant quelques gouttes de support de montage(Tableau des matériaux)sur chaque lame de tissu et couvrir avec coverslip.
  18. Appliquer la pression sur le bordereau afin de déplacer l'excès de bulles moyennes et d'air loin du tissu et de la couverture et l'air sec.
  19. Évaluer et marquer les résultats de coloration sous microscope inversé avec un pathologiste expert.
    REMARQUE : Le système de notation dépendra des antigènes spécifiques, pour lesquels l'information dans la littérature pourrait déjà exister. Si l'information n'est pas disponible dans la littérature, dérivez un système de notation utilisant l'expression de l'antigène dans le tissu normal comme référence.

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Representative Results

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Le flux de travail de l'étude est illustré à la figure 1. Multi-lésions (n - 13) séquençage de 5 cas SPN ciblant les séquences de codage de 409 gènes liés au cancer identifié un total de 27 mutations somatiques dans 8 gènes (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1, et FGFR3). Les mutations ont été définies comme fondateur/clonal lorsqu'elles sont partagées entre toutes les lésions d'un patient donné, et progresseur/subclonal lorsqu'elles sont détectées chez certaines lésions, mais pas toutes, d'un patient donné(figure 5A,B). Dans l'ensemble, la majorité des mutations ponctuelles identifiées dans l'ensemble de la cohorte étaient des événements clonaux, qui comprenaient des mutations de CTNNB1, KDM6A, TET1, et FLT1. De façon constante, la coloration immunohistochimique de la caténine (produit protéique de CTNNB1)et du KDM6A était homogène parmi les diverses lésions de cas avec des mutations des gènes correspondants (Figure 6A,B). La coloration modérée pour KDM6A dans les spécimens mutés a suggéré que l'altération génétique était susceptible de modifier la fonction plutôt que l'expression de protéine. La perte de fonction de KDM6A dans les tumeurs pancréatiques est associée à la mise en régulation du marqueur d'hypoxie GLUT18, et par conséquent GLUT1 a été surexprimé dans les cas portant des mutations de KDM6A (figure 6C). Des mutations subclonal se sont avérées affecter BAP1, SMAD4, TP53, et FGFR3. L'immunohistochimie pour BAP1 et TP53 a confirmé que les mutations de ces gènes étaient sous-clonales (Figure 6D,E). L'analyse de la variation du nombre de copies (CNV) a été effectuée à l'aide de données de séquençage et a révélé des altérations dans tous les spécimens analysés comme le montre la figure 7A. Contrairement aux mutations ponctuelles, la majorité des altérations du VNC étaient sous-clonales (figure 7B).

Figure 1
Figure 1 : Graphique de flux de l'analyse effectuée sur les lésions métastatiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Histologie représentative des tissus normaux et tumoraux.
(A, B) Tissu tumoral (T) adjacent au tissu normal (N). Dans ces deux sections de tissu, la tumeur et les tissus normaux sont identifiables en tant que secteurs séparés et bien confinés. (C) Les grappes de cellules pancréatiques normales (N) peuvent être considérées comme incorporées dans le tissu tumoral (T). (D) Morphologie du tissu pancréatique normal. La barre d'échelle représente 1 mm.

Figure 3
Figure 3 : Graphique des flux schématiques de l'étape du protocole de préparation et de quantification de la bibliothèque.

Figure 4
Figure 4 : Chargement et fonctionnement de puces à protons ionieux.
(A) Direction et placement des copeaux dans la pince à puce (à gauche). Remplacement du dos de l'onglet en métal (à droite). (B) Heatmaps affichant la densité des bibliothèques dans deux chargements de puces différents. Exemple d'une bonne densité de chargement (en haut) due à une amplification clonale réussie des bibliothèques, résultant en 94% de chargement de la surface de la puce avec des particules de séquençage (139 millions de lectures, sortie finale 90 millions de lectures après filtrage automatique de la qualité). Exemple d'un mauvais chargement (en bas) dû à une amplification clonale inefficace des bibliothèques, ce qui entraîne un chargement de 40 % de la surface des copeaux avec des particules de séquençage (59 millions de lectures, sortie finale 12 millions de lectures après filtrage automatique de la qualité).

Figure 5
Figure 5 : Altérations somatiques dans les lésions métastatiques.
(A) Mutations somatiques identifiées dans les lésions primaires/métastatiques assorties. (B) Des mutations somatiques totales sont affichées par cas, y compris les altérations partagées entre toutes les lésions (fondateur/clonal) et celles détectées dans un ou plusieurs spécimens, mais pas tous, pour un cas donné (progresseur/sous-clonal). Le nombre de lésions métastatiques individuelles (m) séquencés par cas est indiqué. Ce chiffre a été republié à partird'Amato et al.8 . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Immunostaining pour la caténine, KDM6A, GLUT1, BAP1 et TP53 dans les lésions primaires et métastatiques.
(A) Images immunohistochimiques représentatives montrant l'accumulation nucléaire de la caténine dans tous les spécimens (primaire et métastatique) d'une mutation portant sPN de CTNNB1. (B) coloration immunohistochimique des lésions d'un mutation clonale métastatique de Roulement de SPN de KDM6A. (C) Surexpression de GLUT1 dans une mutation DeNS portant KDM6A, alors qu'aucune immunoréactivité n'a été observée dans les tissus sauvages de type. (D, E) Les données d'expression BAP1 et TP53 indiquent que les mutations de ces deux gènes sont sous-clonales. Les barres d'échelle représentent 100 m et le grossissement enfoui est de 600X. Ce chiffre a été modifié à partird'Amato et d'al.8 .

Figure 7
Figure 7 : Changements de nombre de copies somatiques dans les lésions métastatiques.
(A) La vue karyotype virtuelle montre l'emplacement, la proximité et l'état du numéro de copie des gènes modifiés dans un cas représentatif. Le schéma de coloration des bandes chromosomiques est le suivant: noir et gris - Giemsa positif, rouge clair - centromere, violet - région variable. Les modifications sont annotées selon les codes de couleur présentés dans la figure. Abréviations : CNV, variation du nombre de copies; P, SPN primaire; L(a-c), métastases hépatiques. (B) Des altérations somatiques totales (gènes affectés par le CNV) sont affichées par cas, y compris les altérations partagées entre toutes les lésions (fondateur/clonal) et celles détectées dans un ou plusieurs (mais pas tous) des spécimens pour un cas donné (progresseur/subclonal). Le nombre de lésions métastatiques individuelles (m) séquencés par cas est indiqué. Ce chiffre a été republié à partird'Amato et al.8 . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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Notre méthode permet l'identification des altérations moléculaires impliquées dans la progression des tumeurs solides par l'intégration des données verticales (c.-à-d., morphologie, séquençage d'ADN, et immunohistochimie) des lésions distinctes d'un patient donné. Nous avons démontré la capacité de notre méthode pour détecter des événements clonal et subclonal dans un type de tumeur silencieuse mutationnelle (c.-à-d., SPN, néoplasme solide-pseudopapillary du pancréas) en interrogeant les séquences de codage de 409 gènes cancer pertinents8. Un avantage de l'approche de séquençage ciblé à base d'amplicon utilisée ici est l'uniformité de la couverture (90% des bases cibles sont couvertes 100x, 95% sont couverts 20x) dans les régions interrogées (15 992) à une profondeur de couverture moyenne typique de 1000x. La profondeur élevée de la couverture couplée à l'enrichissement néoplastique de cellules par microdissection garantit une sensibilité élevée pour la détection des événements de basse fréquence d'allèle. Comme nous l'avons déjà montré9, l'approche de séquençage ciblée permet la détection de mutations jusqu'à une fréquence allèle de 2% sur des échantillons d'ADN provenant de tissus FFPE. À titre d'exemple, dans le présent travail, nous avons pu identifier une mutation de 4 % de la fréquence d'allèle TP53 comme un événement sous-clonal dans un spécimen métastatique (figure 5) et validé cette occurrence par immunohistochimie (figure 6). Notre protocole envisage le séquençage de l'ADN apparié de tumeur et de germline afin d'identifier des événements somatiques et donc de réduire le taux de détection faux des mutations sous-clonal des cancers seulement pipeline10. Lorsque l'ADN germinal apparié n'est pas disponible, on peut envisager d'adopter des paramètres plus prudents dans l'analyse des données de séquençage, y compris des filtres rigoureux basés sur une profondeur minimale de couverture ainsi que des variantes limitant les « mutations des points chauds » et les mutations largement annotées dans les bases de données disponibles. Le séquençage de l'ADN germinal aux côtés des tumeurs appariées a également l'avantage de permettre une détection précise des variations du nombre de copies (CNV). Alternativement, des pools de génomes diploïdes sexués pourraient être utilisés pour réduire le bruit provenant des données de séquençage et faciliter la détection de la VNT. En plus de l'inclusion de l'ADN germinal, nous avons modifié le protocole de bibliothèque afin de réduire le déséquilibre des piscines d'amorce et d'améliorer les appels CNV. Selon le protocole original, les quatre bassins d'amplicônes produits à partir de chaque échantillon d'ADN après le multiplex PCR devraient être mélangés et les étapes restantes seraient exécutées dans un tube par échantillon. Cela provoque cependant des fluctuations dans la profondeur de couverture moyenne par pool en raison du fait que le multiplex PCR peut avoir une efficacité différente entre les différents tubes. Il n'y avait pas d'étape de quantification/normalisation de pool pour tenir compte de cet effet dans le protocole original. Pour éviter les fluctuations décrites ci-dessus, nous avons décidé de garder chacune des quatre piscines d'amplicon séparées tout au long du protocole de production de la bibliothèque, jusqu'à ce qu'elles puissent être quantifiées. Lors de la quantification, la même quantité de chacun des quatre bassins pour chaque échantillon d'ADN pourrait être ajoutée au pool final de la bibliothèque, ce qui garantirait que la couverture moyenne finale était aussi uniforme que possible.

L'évaluation de l'hétérogénéité intratumorale (ITH) au niveau génétique a des implications cliniques importantes mais pose également de nouveaux défis2. Un défi majeur est en effet la nécessité de faire la distinction entre les mutations du conducteur et les événements stochastiques (c.-à-d. les mutations des passagers). La distinction entre les mutations du conducteur et du passager est souvent accomplie par calcul, mais non sans biais. Bien que la fonctionnalisation systématique des variantes détectées soit coûteuse et longue, les conséquences fonctionnelles des variantes génétiques pourraient être évaluées, du moins pour un sous-ensemble de gènes, par analyse immunohistochimique de la protéine correspondante ou, indirectement, en mesurant l'expression des marqueurs de substitution du dysfonctionnement de protéine. Notre protocole a été appliqué aux tissus FFPE, qui représentent la principale source de matériaux en milieu clinique tout en posant des défis pour le séquençage; la qualité des acides nucléiques isolés doit toujours être évaluée avant le séquençage11. Bien que le séquençage ciblé ait l'avantage majeur d'être rentable et peu exigeant en termes d'exigences informatiques, il a l'inconvénient majeur d'interroger seulement une partie limitée du génome, ce qui conduit probablement à sous-estimer hétérogénéité intratumorale. En outre, cette approche n'examine pas les différences épigénétiques et transcriptomiques pertinentes entre la métastasie et les tumeurs primaires qui ont été récemment montrées pour l'emporter sur les différences génétiques dans certains types de tumeur4,12, 13. Cependant, on pourrait envisager que les progrès technologiques permettront bientôt l'intégration d'un ensemble de données verticales plus riche pour une meilleure évaluation de l'ITH. Notre approche préfère la profondeur à la couverture physique du génome, ce qui limite notre capacité à construire des phylogénies snV appropriées. Pourtant, notre méthode offre la possibilité d'explorer la parenté génétique chez les spécimens cliniques avec une sensibilité et une spécificité appropriées grâce à l'intégration d'analyses moléculaires et histopathologiques. Nous avons appliqué avec succès ce protocole sur un type spécifique de tumeur (par exemple, SPN) et prédisons que la méthode fonctionnera de la même façon sur d'autres types de tumeur pleine.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

L'étude a été soutenue par le projet italien de génome du cancer (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Subvention no 12182 à AS et 18178 à VC), FP7 European Community Grant (Cam-Pac No 602783 à AS). Les organismes de financement n'ont joué aucun rôle dans la collecte, l'analyse et l'interprétation des données ou dans la rédaction du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies G2939BA  Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit Fisher Scientific NC9959336 Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4627 Library quantification
Anti-BAP1 Santa Cruz Biotechnology sc-28383 Antibody
Anti-GLUT1 Thermo Scientific RB-9052 Antibody
Anti-KDM6A Cell Signaling #33510 Antibody
Anti-p53 Novocastra NCL-L-p53-DO7 Antibody
Anti-βcatenin Sigma-Aldrich C7207 Antibody
Blocking Solution home made - 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution home made - 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra Leica 70937891 Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1 Leica Biosystems AR9961 Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2 Leica Biosystems AR9640 EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear Eppendorf 951010006 Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021 Tubes
Ethanol DIAPATH A0123 IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H­4000 Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Laboratories SK­4105 HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7401­50 Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7402­50 Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV) Broad Institute - https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Thermofisher Scientific 4477685 Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermofisher Scientific 4480441 Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument Thermofisher Scientific 4484177 Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip Thermofisher Scientific A26771 or A27766 Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef Thermofisher Scientific A27198 or A30011 Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit Thermofisher Scientific A26433 or A30011 Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System Thermofisher Scientific 4476610 or A38196 Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair Thermofisher Scientific 4487118 Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin Thermofisher Scientific 4487118 Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit Thermofisher Scientific 4474517 Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermofisher Scientific ND-2000 DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity Fisher Scientific 12532-016 or 12532-024 SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit Quiagen 51106 0r 51104 DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue Quiagen 56404 DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer Thermofisher Scientific Q32866 DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermofisher Scientific Q32850 Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST home made - Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film Sakura Europe 6172 Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software EMBI-EBI - http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres Carlo Erba 492306 IHC deparaffinization reagent

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References

  1. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155, (1), 27-38 (2013).
  2. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, (4), 613-628 (2017).
  3. Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458, (7239), 719-724 (2009).
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  13. Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. (2018).
Analyse comparative des lésions par une approche de séquençage ciblée
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Cite this Article

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).More

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