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Behavior

एक लक्षित अनुक्रमण दृष्टिकोण के माध्यम से तुलनात्मक Lesions विश्लेषण

doi: 10.3791/59844 Published: November 5, 2019

Summary

यह लेख किसी दिए गए रोगी से विभिन्न नमूनों के बीच क्लोनल और subclonal परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. हालांकि यहाँ वर्णित प्रयोगों एक विशिष्ट ट्यूमर प्रकार पर ध्यान केंद्रित, दृष्टिकोण मोटे तौर पर अन्य ठोस ट्यूमर के लिए लागू होता है.

Abstract

अंतर-ट्यूमर विषमता (ITH) का आकलन लक्षित उपचार की विफलता की आशा करने के लिए सर्वोपरि महत्व का है और तदनुसार प्रभावी विरोधी ट्यूमर रणनीतियों डिजाइन। हालांकि चिंताओं अक्सर नमूना प्रसंस्करण और कवरेज की गहराई में मतभेद के कारण उठाया जाता है, ठोस ट्यूमर की अगली पीढ़ी अनुक्रमण ट्यूमर प्रकार भर में ITH के एक उच्च चर डिग्री unraveled है. क्लोनल और subclonal आबादी की पहचान के माध्यम से प्राथमिक और मेटास्टैटिक घावों के बीच आनुवंशिक संबंधितता पर कब्जा अग्रिम चरण के रोगों के लिए उपचार के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम तुलनात्मक घावों के विश्लेषण के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं जो एक ही रोगी से विभिन्न नमूनों के बीच क्लोनल और सबक्लोनल आबादी की पहचान के लिए अनुमति देता है। यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण तीन अच्छी तरह से स्थापित दृष्टिकोण को एकीकृत करता है: हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, उच्च कवर बहु-लेशन अनुक्रमण, और इम्यूनोफेनोटाइपिक विश्लेषण। आदेश में अनुचित नमूना प्रसंस्करण द्वारा subclonal घटनाओं का पता लगाने पर प्रभाव को कम करने के लिए, हम सावधान रोग परीक्षा और neoplastic सेल संवर्धन के लिए ऊतकों के अधीन. neoplastic घावों और सामान्य ऊतकों से गुणवत्ता नियंत्रित डीएनए तो उच्च कवरेज अनुक्रमण के अधीन था, 409 प्रासंगिक कैंसर जीन की कोडिंग क्षेत्रों को लक्षित. जबकि केवल एक सीमित जीनोमिक अंतरिक्ष को देख, हमारे दृष्टिकोण दैहिक परिवर्तन के बीच विषमता की हद तक मूल्यांकन सक्षम बनाता है (एकल-न्यूक्लिओटाइड उत्परिवर्तनों और कॉपी संख्या विविधताओं) एक दिए गए रोगी से अलग घावों में. अनुक्रमण डेटा के तुलनात्मक विश्लेषण के माध्यम से, हम क्लोनल बनाम subclonal परिवर्तन भेद करने में सक्षम थे. आईआईटीएच के बहुमत अक्सर यात्री उत्परिवर्तनों के लिए जिम्मेदार है; इसलिए, हम उत्परिवर्तनों के कार्यात्मक परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का भी उपयोग करते हैं। हालांकि इस प्रोटोकॉल एक विशिष्ट ट्यूमर प्रकार के लिए लागू किया गया है, हम आशा करते हैं कि यहाँ वर्णित पद्धति मोटे तौर पर अन्य ठोस ट्यूमर प्रकार के लिए लागू है.

Introduction

अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) के आगमन ने कैंसर का निदान और इलाज करने के तरीके में क्रांति ला दीहै 1. बहुक्षेत्रीय अनुक्रमण के साथ मिलकर एनजीएस ने ठोस ट्यूमर 2 में इंट्रा-ट्युमल विषमता (आईआईटीएच) की एक उच्च डिग्री को उजागर किया है, जो अलग दवा संवेदनशीलताकेसाथ subclones की उपस्थिति के कारण लक्षित चिकित्सा की विफलता के हिस्से में बताते हैं2 . जीनोम व्यापक अनुक्रमण अध्ययन द्वारा उत्पन्न एक महत्वपूर्ण चुनौती यात्री (यानी, तटस्थ) और व्यक्तिगत कैंसर में ड्राइवर उत्परिवर्तनों के बीच अंतर करने की आवश्यकता है3. कई अध्ययनों से वास्तव में पता चला है कि, कुछ ट्यूमर में, यात्री उत्परिवर्तन ों आईआईटीएच के बहुमत के लिए खाते हैं, जबकि ड्राइवर परिवर्तन एक ही व्यक्ति4के घावों के बीच संरक्षित किया जा करने के लिए करते हैं। यह भी ध्यान दें कि बड़े उत्परिवर्तन बोझ (के रूप में फेफड़ों के कैंसर और मेलेनोमा में देखा) जरूरी एक बड़े subclonal उत्परिवर्तन बोझ2मतलब नहीं है महत्वपूर्ण है. इसलिए, ITH के एक उच्च डिग्री कम उत्परिवर्तन बोझ के साथ ट्यूमर में पाया जा सकता है.

मेटास्टेसिस दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मौत के 90% से अधिक के लिए जिम्मेदार हैं5; इसलिए, प्राथमिक और मेटास्टैटिक घावों के बीच ड्राइवर जीन ों की उत्परिवर्तन विषमता पर कब्जा उन्नत चरण के रोगों के लिए प्रभावी उपचार के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है। नैदानिक अनुक्रमण आम तौर पर निश्चित ऊतकों से न्यूक्लिक एसिड पर किया जाता है, जो खराब डीएनए गुणवत्ता की वजह से जीनोम व्यापक अन्वेषण मुश्किल renders. दूसरी ओर, नैदानिक अनुक्रमण का उद्देश्य कार्रवाई योग्य उत्परिवर्तनों और/या उत्परिवर्तनों की पहचान करना है जो किसी दिए गए चिकित्सीय आहार के लिए प्रतिक्रियाकी प्रतिक्रिया/अक्रियाशीलता की भविष्यवाणी कर सकते हैं। के रूप में यह खड़ा है, अनुक्रमण नैदानिक रूप से प्रासंगिक जानकारी के समय पर निष्कर्षण के लिए जीनोम के एक छोटे अंश के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है. NGS के लिए कम throughput डीएनए प्रोफाइलिंग (उदाहरण के लिए, Sanger अनुक्रमण) से संक्रमण यह कवरेज की एक उच्च गहराई पर कैंसर से संबंधित जीन के सैकड़ों का विश्लेषण करने के लिए संभव प्रदान की गई है, जो subclonal घटनाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. यहाँ, हम तुलनात्मक घावों के विश्लेषण के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं जो एक ही व्यक्ति से विभिन्न नमूनों के बीच क्लोनल और सबक्लोनल आबादी की पहचान के लिए अनुमति देता है। यहाँ वर्णित विधि की पहचान की विविधताओं के कार्यात्मक परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए तीन अच्छी तरह से स्थापित दृष्टिकोण (हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, उच्च कवर बहु-लेशन अनुक्रमण, और इम्यूनोफेनोटाइपिक विश्लेषण) को एकीकृत करता है। दृष्टिकोण योजनाबद्ध रूप से चित्र 1 में वर्णित है और अग्न्याशय के ठोस छद्म स्तंभीय नियोप्लाज्म (एसपीएन) के 5 मेटास्टैटिक मामलों के अध्ययन के लिए लागू किया गया है। जब तक हम फार्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) ऊतक नमूनों के प्रसंस्करण और विश्लेषण का वर्णन करते हैं, तो उसी प्रक्रिया को ताजा-फ्रोज़न ऊतक से आनुवंशिक सामग्री पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

अध्ययन में प्रयुक्त सामग्री एक विशिष्ट प्रोटोकॉल के तहत एकत्र की गई थी, जिसे स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति उपलब्ध थी।

1. ऊतक नमूनों के ऊतकीय और इम्यूनोफेनोटाइपिक संशोधन

नोट: इसके बाद वर्णित गतिविधियों के लिए एक विशेषज्ञ पैथोलॉजिस्ट जिम्मेदार है।

  1. अच्छी तरह से स्थापित नैदानिक मानदंडों के अनुसार चयनित मामलों के हिस्टोपैथोलॉजिकल संशोधन।
    1. प्रतिनिधि FFPE ऊतक ब्लॉकों से 4 "5 मीटर मोटी ऊतक वर्गों में कटौती और मानक ऊतक स्लाइड पर वर्गों माउंट करने के लिए microtome का प्रयोग करें.
    2. एक स्वचालित ऊतक स्लाइड स्टेनलेस(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर प्रत्येक स्लाइड के लिए hematoxylin और eosin धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
    3. डब्ल्यूएचओ नैदानिक मानदंडों के अनुसार चयनित ट्यूमर मामलों के हिस्टोपैथोलॉजिकल निदान की समीक्षा करें।
      नोट: इस स्तर पर, पैथोलॉजिस्ट एक ही ऊतक अनुभाग के भीतर ट्यूमर के रूपात्मक रूप से अलग क्षेत्रों की पहचान कर सकता है। यह अलग से उन क्षेत्रों फसल के लिए संभव है (अनुभाग 2 देखें). एसपीएन के लिए ट्यूमर और सामान्य कोशिकाओं की हिस्टोलॉजिकल समानता चित्र 2में प्रदान की गई है।
    4. स्थापित मार्करों के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला प्रदर्शन करने के लिए हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के पूरक हैं और इम्यूनोफेनोटाइपिक विषमता का अनुमान है।
      नोट: पैथोलॉजिस्ट एक ही ऊतक अनुभाग के भीतर ट्यूमर के इम्यूनोफेनोआमी अलग क्षेत्रों की पहचान कर सकता है। यह अलग से उन क्षेत्रों फसल के लिए संभव है (अनुभाग 2 देखें).
  2. ट्यूमर ऊतक अनुभाग के neoplastic सेलुलरता का मूल्यांकन और योजना मैनुअल microdissection तदनुसार.
    नोट: यह ट्यूमर सेलुलरता का एक पैथोलॉजिस्ट जनित अनुमान है।
    1. यदि ऊतक अनुभाग की neoplastic सेल सामग्री 70% से अधिक है, तो मैनुअल माइक्रोडिसेक्शन अनिवार्य नहीं है; 3.1 कदम के लिए सीधे ले जाएँ.
      नोट: करने के लिए (i) उत्परिवर्ती allele आवृत्ति अनुमान के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता सुनिश्चित करने के क्रम में neoplastic सेल सामग्री के 70% लक्ष्य और (ii) संभवतः कम संवेदनशील तरीके (उदाहरण के लिए, केशिका अनुक्रमण) द्वारा क्लोनल उत्परिवर्तनों को मान्य करने के लिए।
    2. यदि ऊतक अनुभाग की neoplastic कोशिका सामग्री 70% से कम है, microdissection आवश्यक है और चरण 2 के लिए कदम.
  3. FFPE ब्लॉक से ऊतक वर्गों का मूल्यांकन जहां गैर-neoplastic ऊतक नमूना किया गया है. इस ऊतक का उपयोग जर्मलाइन डीएनए के स्रोत के रूप में किया जाता है।
    नोट: रक्त germline डीएनए का एक वैकल्पिक स्रोत है. इस मामले में, चरण 4.1 के नोट में सिफारिश के रूप में डीएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें।
    1. यदि ऊतक अनुभाग (चित्र 2D) में केवल गैर-नियोप्लास्टिक ऊतक दिखाई देता है , तो मैनुअल माइक्रोडिसेक्शन की आवश्यकता नहीं है; 3.1 कदम के लिए सीधे ले जाएँ.
    2. यदि ऊतक अनुभाग में neoplastic कोशिकाओं से पर्याप्त संदूषण मौजूद है, तो मैनुअल microdissection आवश्यक है; अनुभाग 2 के लिए ले जाएँ।

2. मैनुअल microdissection

नोट: इस विधि विभिन्न ठोस ट्यूमर प्रकार के लिए लागू है, और यह ऊतक नमूनों की neoplastic कोशिकाओं सामग्री को बढ़ाने का इरादा है. वैकल्पिक रूप से, इस विधि का उपयोग एक ही ऊतक अनुभाग के भीतर आकृति विज्ञान और/या इम्यूनोफेनोआमली अलग क्षेत्रों को काटने के लिए किया जा सकता है।

  1. एक microtome का उपयोग करना, दस करने के लिए कटौती 4 "6 मीटर मोटी FFPE ट्यूमर ऊतक वर्गों और उन्हें uncharged स्लाइड पर माउंट.
    नोट: यदि केवल एक 1 मिमी2 कैंसर कोशिकाओं के घोंसले के नमूने में दिखाई देता है, 10 ऊतक स्लाइड में कटौती की जानी चाहिए और मैनुअल microdissection के अधीन क्रम में डीएनए के लक्षित राशि प्राप्त करने के लिए (40 एनजी); यह मानते हुए कि 1 मिमी2 क्लस्टर 700 और 1000 ट्यूमर नाभिक के बीच होता है।
  2. 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट स्लाइड।
  3. एक रैक में स्लाइड प्लेस, और निम्नलिखित washes प्रदर्शन: 20 मिनट के लिए xylene, 10 मिनट के लिए 100% इथेनॉल, 10 मिनट के लिए 80% इथेनॉल, 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल, 1 मिनट के लिए आसुत पानी, 10 s के लिए hematoxylin counterstain, 1 मिनट के लिए नल का पानी.
  4. एक मानक उल्टे माइक्रोस्कोप पर, microdissection उपकरण के रूप में एक सिरिंज पर एक 27 जी सुई का उपयोग करें और ट्यूमर कोशिकाओं के प्रतिनिधि समूहों को इकट्ठा। अनुक्रमण के लिए डीएनए की आवश्यक मात्रा सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं के कम से कम दस 1 मिमी2 समूहों फसल।
    नोट: यदि morphologically अलग क्षेत्रों के लिए विभिन्न संस्थाओं के रूप में विश्लेषण किया जा करने का इरादा कर रहे हैं, तो microdissection उपकरण का उपयोग करने के लिए उन क्षेत्रों अलग से फसल.
  5. 1.5 एमएल ट्यूबों (सामग्री की तालिका) में 1.5 एमएल ट्यूबों में जगह फसली क्लस्टर ( सामग्री की तालिका ) पहले प्रोटीज़ के 20 डिग्री एल और लाइसिस बफर के 180 डिग्री एल से भरा हुआ है ( सामग्री कीतालिका, दोनों डीएनए निष्कर्षण किट में शामिल) और भंवर द्वारा मिश्रण।

3. पूर्व microdissection के बिना ऊतकों के प्रसंस्करण

नोट: इस प्रक्रिया ऊतक ब्लॉक है कि केवल गैर neoplastic कोशिकाओं (germline डीएनए के स्रोत) होते हैं या morphologically समरूप कैंसर कोशिकाओं के कम से कम 70% होते हैं के लिए प्रयोग किया जाता है.

  1. चयनित FFPE ऊतक ब्लॉकों से छह 4 डिग्री 5 मीटर मोटी ऊतक वर्गों के लिए एक microtome कटौती का उपयोग करना. चरण 2.5 में वर्णित के रूप में 1.5 एमएल ट्यूबों में ऊतक स्क्रॉल रखें।

4. सामान्य और neoplastic कोशिकाओं से डीएनए निष्कर्षण

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए FFPE ऊतक निष्कर्षण किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर सामान्य और neoplastic ऊतक से डीएनए शुद्ध।
    नोट: जब रक्त का उपयोग जर्मलाइन न्यूक्लिक एसिड के स्रोत के रूप में किया जाता है, तो डीएनए रक्त निष्कर्षण किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें।
  2. डीएनए परिमाणीकरण और गुणवत्ता की जांच
    1. डबल-स्ट्रेंड्ड (dsDNA) की मात्रा को मापने के लिए, एक फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग युक्त समाधान के लिए डीएनए नमूने का एक alicot जोड़ें (सामग्री की तालिका) और एक बेंचटॉप फ्लोरोमीटर का उपयोग कर उत्सर्जित फ्लोरोसेंट को मापने ( सामग्री कीतालिका) ).
      नोट: परख dsDNA से जुड़े फ्लोरोसेंट रंगों से उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता के उपाय और एक मानक वक्र का उपयोग कर डीएनए की मात्रा निर्धारित करता है.
    2. डीएनए को अर्हता प्राप्त करने के लिए नमूने के 260/280 और 260/230 अनुपातों को मापने के लिए माइक्रो-मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (सामग्री की तालिका)का उपयोग करें। "शुद्ध" डीएनए 1.8 की एक 260/
      नोट: नमूने के स्पेक्ट्रोफोटोमीट्रिक मूल्यांकन रासायनिक contaminants की उपस्थिति सबूत करने के लिए करना है (उदा., फिनोल) कि प्रभाव बहाव प्रतिक्रियाओं. रासायनिक अभिकर्मकों के कारण संदूषण की स्थिति में, स्तंभ-आधारित किट का उपयोग करके क्लीनअप चरण निष्पादित करें.

5. पुस्तकालय की तैयारी और परिमाणीकरण

नोट: पुस्तकालय तैयारी और परिमाणीकरण चरणों के योजनाबद्ध प्रवाह चार्ट चित्र 3में सूचित किया गया है।

  1. डीएनए पुस्तकालय तैयारी (4 प्राइमर पूल प्रत्येक नमूने के लिए स्थापित)
    नोट: 4 प्राइमर पूल में रिपोर्ट कैंसर पैनल के हैंसामग्री की तालिका. प्रत्येक पूल में प्राइमर जोड़े होते हैं जो 409 जीनों के बहुसंकेतित लक्ष्य चयन के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। NGS पैनल रचना जीन की सूची के लिए एक लिंक में प्रदान की जाती हैसामग्री की तालिका.
    1. प्रत्येक नमूने के लिए चार डीएनए लक्ष्य प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं को तैयार, प्राइमर पूल प्रति एक. प्रत्येक प्राइमर पूल (सामग्री की तालिका) के लिए , 0.2 एमएल ट्यूब ( सामग्री कीतालिका) में जोड़ें : मास्टर मिश्रण का 4 डिग्री एल ( पुस्तकालय किट में शामिल सामग्रीकी तालिका),उच्च निष्ठा प्राइमर पूल मिश्रण के 10 डिग्री एल (सामग्री की तालिका, में शामिल कैंसर पैनल पुस्तकालय), और डीएनए के 6 जेडएल (10 एनजी कुल).
    2. निम्नलिखित कार्यक्रम चल रहे चार 1.5 एमएल ट्यूबों में अलग से प्रत्येक प्राइमर पूल के लक्ष्य क्षेत्रों को बढ़ाना: 2 मिनट के लिए 99 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ (गर्म शुरू polymerase के सक्रियण), 16 चक्र (15 s के लिए 99 डिग्री सेल्सियस पर denature, anneal और 8 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार) , 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
      नोट: रोक बिंदु. लक्ष्य प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं को रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर या लंबे समय तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
    3. amplicons के आंशिक पाचन समाप्त होता है
      नोट: NGS निर्माता किट द्वारा प्रदान की पुस्तिका एक कदम है जिसमें प्रत्येक नमूने से विभिन्न प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं आंशिक पाचन से पहले संयुक्त कर रहे हैं की उम्मीद है. उस कदम से बचें और प्रत्येक प्रवर्धन पाचन अलग से प्रसंस्करण रखने के लिए.
      1. प्रत्येक नमूने के प्रत्येक प्रवर्धित पूल में विशिष्ट पाचन मिश्रण(सामग्री की तालिका,पुस्तकालय किट में शामिल) का 2 डिग्री एल जोड़ें (प्रत्येक 0ण्2 एमएल ट्यूब की कुल मात्रा 22 डिग्री सेल्सियस है)। भंवर अच्छी तरह से और अपकेंद्रण प्रत्येक ट्यूब बूंदों को इकट्ठा करने के लिए।
      2. ट्यूबों को थर्मल साइकिलर में लोड करें और निम्नलिखित प्रोग्राम चलाएं: 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 10 डिग्री सेल्सियस पकड़ (1 ज तक) के लिए।
        नोट: रोक बिंदु. लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट स्टोर करें।
    4. amplicons और शुद्ध करने के लिए लिगेट एडाप्टर।
      नोट: एक एकल चिप पर एकाधिक लायब्रेरी अनुक्रमण करते समय प्रत्येक नमूने के लिए एक भिन्न बारकोड एडाप्टर का उपयोग करें। एक ही नमूने से सभी चार प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं एक ही बारकोड प्राप्त करना होगा.
      1. एडाप्टर तैयार करें (सामग्री की तालिका, बारकोड एडाप्टर किट). प्रत्येक बारकोड एक्स के लिए, 1:4 के एक अंतिम कमजोर पड़ने पर P1 एडाप्टर और अद्वितीय बारकोड एडाप्टर (सामग्री की तालिका)का एक मिश्रण तैयार करते हैं। P1 एडाप्टर के 2 $L और अद्वितीय बारकोड एडाप्टर के 2 डिग्री एल के साथ पानी के 4 डिग्री एल मिलाएं। डाउनस्ट्रीम मार्ग के लिए इस बारकोड एडाप्टर मिश्रण के 2 $L का उपयोग करें।
      2. इस क्रम में प्रत्येक नमूने के प्रत्येक प्रवर्धित पूल में जोड़कर लिगेशन अभिक्रिया करें: स्विच समाधान के 4 डिग्री एल (सामग्री की तालिका, पुस्तकालय किट में शामिल), बारकोड एडाप्टर मिश्रण का 2 डिग्री एल और डीएनए लिगेज़ का 2 डिग्री एल(सामग्री की तालिका, में शामिल पुस्तकालय किट) (कुल मात्रा $ 30 $L).
      3. बूंदों को इकट्ठा करने के लिए भंवर अच्छी तरह से और संक्षेप में अपकेंद्रण।
      4. थर्मल साइकिलर में प्रत्येक ट्यूब लोड और निम्नलिखित कार्यक्रम चलाने: 30 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ (24 ज तक के लिए)।
        नोट: रोक बिंदु. लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट स्टोर करें।
    5. पुस्तकालय शोधन और प्रवर्धन
      1. प्रत्येक ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें और फिर 1.5 एमएल ट्यूब में प्रत्येक बारकोड किए गए नमूने को स्थानांतरित करें। प्रत्येक नमूने के प्रत्येक पूल में मोती आधारित शोधन अभिकर्मक(सामग्री की तालिका)का 45 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। डीएनए के साथ मनका निलंबन मिश्रण करने के लिए 5x ऊपर और नीचे पाइप.
      2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें, फिर प्रत्येक ट्यूब को चुंबकीय रैक में रखें और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सावधानी से गोली को हटाने और छोड़ें।
      3. ताजा 70% इथेनॉल के प्रत्येक ट्यूब 150 डिग्री एल में जोड़ें। चुंबक की दो स्थितियों के प्रत्येक ट्यूब साइड-टू-साइड ले जाने वाले मोतियों को धो लें। महादलित को छोड़ दें और गोली को परेशान न करें।
      4. चरण 5.1.5.3 में वर्णित प्रक्रियाओं को दोहराएँ और फिर ट्यूबों को चुंबक में रखें और 5 मिनट के लिए आरटी पर मोती को हवा में सुखाएं।
      5. चुंबक से प्रत्येक प्राइमर पूल के शुद्ध पुस्तकालयों के साथ ट्यूब निकालें और उच्च निष्ठा पीसीआर मिक्स (सामग्री की तालिका) और पुस्तकालय प्रवर्धन प्राइमर मिश्रण के 2 डिग्री एल के 50 डिग्री एल जोड़ें(सामग्री की तालिका, पुस्तकालय किट में शामिल) के मोती गोली के लिए प्रत्येक ट्यूब.
      6. प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब और छोटी बूंदों को इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र भंवर।
      7. 2 मिनट के लिए चुंबक में 1.5 एमएल ट्यूब रखें और ध्यान से गोली परेशान किए बिना एक नया 0.2 एमएल ट्यूब के लिए प्रत्येक ट्यूब से supernatant ($50 $L) हस्तांतरण।
      8. निम्नलिखित कार्यक्रम चल रहे प्रत्येक प्राइमर पूल के पुस्तकालयों को बढ़ाना: एंजाइम को सक्रिय करने के लिए 2 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर पकड़, 5 चक्र (15 s, anneal के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर विकृत और 64 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट पर विस्तार), 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़। -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
    6. प्रवर्धित पुस्तकालय का शुद्धिकरण
      1. नीचे की सामग्री को इकट्ठा करने और प्रत्येक प्रवर्धित पुस्तकालय नमूना एक 1.5 एमएल ट्यूब के लिए हस्तांतरण करने के लिए प्रत्येक ट्यूब सेंट्रीफ्यूज।
      2. मोती आधारित शुद्धि अभिकर्मक के 25 डिग्री एल जोड़ें. डीएनए के साथ मनका निलंबन मिश्रण करने के लिए 5x ऊपर और नीचे पाइप.
      3. आरटी में 5 मिनट के लिए मिश्रण इनक्यूबेट करें, और फिर 5 मिनट के लिए चुंबक में ट्यूब रखें।
      4. ध्यान से गोली परेशान किए बिना नई ट्यूबों के लिए प्रत्येक ट्यूब से, amplicons शामिल हैं जो supernatant, हस्तांतरण।
      5. मनका निलंबन और डीएनए मिश्रण करने के क्रम में प्रत्येक ट्यूब के supernatant करने के लिए मोती आधारित शुद्धि अभिकर्मक के 60 डिग्री एल जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपेट।
      6. आर टी पर 5 मिनट के लिए मिश्रण इनक्यूबेट और फिर 3 मिनट के लिए चुंबक में ट्यूब जगह है।
      7. प्रत्येक ट्यूब से supernatant छोड़ ें और गोली परेशान करने के लिए नहीं ध्यान देना.
        नोट: amplicons मोती करने के लिए बाध्य कर रहे हैं.
      8. ताजा 70% इथेनॉल के प्रत्येक ट्यूब 150 डिग्री एल में जोड़ें। चुंबक की दो स्थितियों में ट्यूब ों को साइड-टू-साइड ले जाने वाले मोतियों को धो लें। महादलित को छोड़ दें और गोली को परेशान न करें।
      9. प्रक्रिया को चरण 5.1.6.8 में दोहराएं और 3 मिनट के लिए आरटी में मोती को हवा दें। मोतियों के अत्यधिक सुखाने से बचें।
      10. चुंबक से ट्यूब निकालें और मोती फैलाने के लिए गोली के लिए कम Tris EDTA (टीई)(सामग्री की तालिका,पुस्तकालय किट में शामिल) के 50 डिग्री एल जोड़ें।
      11. मिश्रण को कई बार ऊपर और नीचे पाइप करें और 2 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें।
      12. कम से कम 2 मिनट के लिए चुंबक में ट्यूब रखें और ध्यान से मोती परेशान किए बिना नई ट्यूबों के लिए, जो amplicons शामिल supernatant हस्तांतरण।
  2. पुस्तकालय परिमाणीकरण
    1. उच्च संवेदनशीलता डीएनए किट प्रोटोकॉल के अनुसार एक डीएनए चिप को चलाने के लिए एक टुकड़ा विश्लेषण साधन(सामग्री की तालिका)का प्रयोग करें।

6. पुस्तकालय पूलिंग और अनुक्रमण रन

  1. nuclease मुक्त पानी के साथ 100 पीएम के लिए प्रत्येक पुस्तकालय को पतला। एक एकल ट्यूब में एक ही चलाने के लिए प्रत्येक 100 पी एम पुस्तकालयों के 10 $L का मिश्रण. पाइपिंग द्वारा संयुक्त पुस्तकालयों मिक्स और templating और अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ना।
  2. नियोजित रन निर्माण
    नोट: एक ठेठ रन चार नमूने है कि अर्धचालक चिप के दो अलग अलग प्रकार पर लोड किया जा सकता है शामिल (आयन PI चिप या आयन 540 चिप) प्रयोगशाला में उपलब्ध seuencer के आधार पर (आयन Proton प्रणाली या GeneStudio S5 प्रणाली, सामग्री की तालिका). इन प्रणालियों आमतौर पर 80 लाख रन प्रति पढ़ता उत्पादन.
    1. अनुक्रमण प्रणाली (उदाहरण के लिए, आयन बावर्ची प्रणाली) से जुड़े कंप्यूटर पर टोरेंट ब्राउज़र खोलें और चयनित आवेदन (AmpliSeQDNA) के लिए सामान्य टेम्पलेट का उपयोग कर एक नया चलाने की योजना है।
    2. योजना के किट टैब पर स्विच करें. इस्तेमाल किया जा रहा अनुक्रमण प्रणाली के आधार पर साधन ड्रॉपडाउन सूची से आयन प्रोटोन सिस्टम या आयन GeneStudio S5 प्रणाली का चयन करें।
    3. अनुक्रमण प्रणाली के आधार पर, उपयुक्त चिप का चयन करें (आयन Proton सिस्टम के लिए PI चिप; 540 चिप आयन GeneStudio S5 सिस्टम के लिए) चिप प्रकार ड्रॉपडाउन सूची से.
    4. लाइब्रेरी किट ड्रॉपडाउन सूची से आयन AmpliSeQ 2.0 लाइब्रेरी किट का चयन करें।
    5. टेम्पलेट किट के लिए आयन बावर्ची बटन का चयन करें, फिर टेम्पलेट किट ड्रॉपडाउन सूची से उपयुक्त बावर्ची किट (PI Hi-Q बावर्ची किट PI चिप के लिए या आयन 540 किट-चेफ 540 चिप के लिए) का चयन करें।
    6. उपयुक्त अनुक्रमण किट का चयन करें (Ion PI हाय-क्यू अनुक्रमण 200 किट PI चिप के लिए या आयन S5 अनुक्रमण किट 540 चिप के लिए) अनुक्रमण किट ड्रॉपडाउन सूची से, तो बारकोड सेट ड्रॉपडाउन सूची से IonXpress का चयन करें।
    7. प्लगइन टैब पर स्विच करें और कवरेज विश्लेषण प्लगइन का चयन करें.
    8. योजना टैब पर स्विच करें. संदर्भ लाइब्रेरी ड्रॉपडाउन सूची से GRCh37/hg19 जीनोम का चयन करें. लक्ष्य क्षेत्र ड्रॉपडाउन सूची से, अनुक्रम किए जाने के लिए उपयुक्त पैनल का चयन करें.
    9. अनुक्रम किया जा करने के लिए बारकोड की संख्या और उपयुक्त फ़ील्ड में लायब्रेरी नमूना ट्यूबों के लेबल सेट करें।
    10. प्रत्येक लायब्रेरी के लिए बारकोड नाम और नमूना नाम सेट करें.
  3. नमूना पुस्तकालयों कमजोर पड़ने और लोड हो रहा है.
    1. पीआई चिप के लिए 25 पीएम या 540 चिप के लिए 32 पीएम के लिए न्यूक्लेस-मुक्त पानी के साथ स्टॉक लाइब्रेरी को पतला करें।
    2. उपयुक्त पुस्तकालय नमूना ट्यूब के नीचे करने के लिए प्रत्येक पतला पुस्तकालय के पाइप 50 डिग्री एल।
    3. अनुक्रमण सिस्टम को चालू करें और सभी आवश्यक अभिकर्मकों को लोड करने के लिए और रन योजना को आयात करने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
    4. पूल्ड पुस्तकालयों युक्त पुस्तकालय नमूना ट्यूब लोड और क्लोनल प्रवर्धन कार्यक्रम शुरू करते हैं।
      नोट: आयन बावर्ची प्रणाली रन प्रति तैयार किया जा करने के लिए दो चिप्स की आवश्यकता है।
  4. आयन Proton या आयन GeneStudio S5 पर अनुक्रमण.
    1. अनुक्रमण प्रणाली को चालू करें और अनुक्रमण प्रारंभ करने के लिए और रन योजना आयात करने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
    2. अनुक्रमण प्रणाली से इसे हटाने के बाद अनुक्रमण चिप लोड .
      नोट: इलेक्ट्रोस्टैटिक निर्वहन के कारण चिप क्षति से बचने के लिए एक चिप उठा से पहले जमीन हो। चिप हैंडलिंग/स्थिति के साथ-साथ सफल/असफल लदान के उदाहरणोंको चित्र 4 में सूचित किया गया है।
    3. चिप डिब्बे ढक्कन बंद करें और चिप स्थिति आइकन इंगित करता है जब तक प्रतीक्षा करें "तैयार".
    4. पहले रन पूरा हो गया है जब अपशिष्ट कंटेनर खाली है, तो जितनी जल्दी हो सके शेष चिप अनुक्रम।

7. उत्परिवर्तन और प्रतिलिपि संख्या विविधताओं (CNVs) विश्लेषण

नोट: GRCh37/hg19 मानव संदर्भ जीनोम करने के लिए अनुक्रमण डेटा के संरेखण स्वचालित रूप से एक बार योजना में सेट किया जाता है (चरण 6.2.8).

  1. कवरेज विश्लेषण प्लगइन (सामग्री की तालिका) आउटपुट का उपयोग कवरेज और एकरूपता की गहराई को सत्यापित करने के लिए करें।
  2. धार संस्करण कॉलर प्लगइन(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर संस्करण बुला प्रदर्शन, उचित के रूप में germline या दैहिक कार्यप्रवाह का चयन.
  3. डाउनलोड फ़िल्टर किए गए भिन्न भिन्न संस्करण कॉल प्रारूप (VCF) फ़ाइलें। भिन्न प्रभाव predictor (VEP) सॉफ्टवेयर6 और NCBI refSeQ डेटाबेस का उपयोग कर भिन्न रूपों एनोटेट।
  4. आयन रिपोर्टर अपलोडर प्लगइन का उपयोग कर आयन रिपोर्टर सॉफ्टवेयर पर अनुक्रमण डेटा लोड और व्यापक कैंसर पैनल ट्यूमर सामान्य जोड़ी कार्यप्रवाह का उपयोग करने के लिए आदेश CNVs अनुमान लगाने के लिए डेटा का विश्लेषण.
  5. मैनुअल फिल्टर उत्परिवर्तनों और CNVs सॉफ्टवेयर द्वारा सौंपा स्कोर के आधार पर और उन्हें एकीकृत जीनोमिक्स दर्शक (आईजीवी)7के साथ नेत्रहीन सत्यापित करें।
    1. नेत्रहीन असामान्य पढ़ता के लिए संरेखण का निरीक्षण (उदाहरण के लिए, mispriming, overamplification या पढ़ता नरम-क्लिपिंग) कि artefactual कॉल उत्पन्न कर सकते हैं.
    2. आधार रेखा के सामान्यीकृत कवरेज के विरुद्ध किसी दिए गए जीन में सभी amplicons के लिए सामान्यीकृत कवरेज का निरीक्षण करके CNVs सत्यापित करें.
      नोट: यह विभाजन सॉफ्टवेयर है, जो कभी कभी एक जीन के अंत में और क्रमिक जीन की शुरुआत में कुछ amplicons के सममित असामान्य कवरेज के आधार पर एक CNV कॉल की वजह से झूठी कॉल को सही करने में मदद करता है.
  6. कायिक उत्परिवर्तनों का अनुक्रमण
    1. प्रत्येक मामले के लिए, सूचकांक उत्परिवर्तन सामान्य ऊतक के अनुक्रमण से कॉल /
    2. germline के रूप में फ्लैग करें और कॉल है कि भी germline डीएनए के अनुक्रमण डेटा से स्पष्ट कर रहे हैं त्यागें.
    3. किसी रोगी के सभी घावों के बीच साझा किए गए उत्परिवर्तनों के रूप में क्लोनल/संस्थापक के रूप में फ्लैग करें।
    4. किसी दिए गए रोगी के सभी घावों को कुछ लेकिन नहीं में पाए जाने वाले उत्परिवर्तनों के रूप में सबक्लोनल/प्रगतिकर्ता के रूप में फ्लैग करें।

8. इम्यूनोफेनोटाइपिक विश्लेषण: प्रासंगिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

नोट: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ट्यूमर निरोधक जीन में उत्परिवर्तनों को निष्क्रिय करने के कार्यात्मक परिणामों को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

  1. एक microtome का उपयोग करना, 3 "4 मीटर मोटी FFPE ऊतक वर्गों में कटौती और उन्हें चार्ज स्लाइड पर माउंट और 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट स्लाइड.
  2. एक रैक में स्लाइड प्लेस, और निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन: 10 मिनट के लिए xylene, 10 मिनट के लिए xylene, 4 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 4 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 4 मिनट के लिए 70% इथेनॉल, 4 मिनट के लिए 70% इथेनॉल, 4 मिनट के लिए आसुत पानी.
  3. एंटीबॉडी के निर्माताओं के संकेत के आधार पर प्रतिजन पुनर्प्राप्ति निष्पादित करें (सामग्री की तालिका)।
    1. विशिष्ट प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान के साथ एक रैक में स्लाइड प्लेस और उप-बोइलिंग तापमान पर एक पानी के स्नान में डूब.
    2. स्नान से स्लाइड निकालें और 10 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए नल का पानी चलाते हैं।
  4. एंडोजेनस peroxidases निष्क्रिय करने के क्रम में आरटी पर 20 मिनट के लिए 1x Tris-buffered नमकीन (टीबीएस) में 3% एच22 के साथ एक नई रैक में स्लाइड रखें।
  5. एक नई रैक में स्लाइड प्लेस और टीबीएस और ट्वीन 20 (TBST) के 0.1% के साथ 3x धोने.
  6. स्लाइड-माउंटेड टिश्यू के चारों ओर हाइड्रोफोबिक वृत्त बनाने के लिए पीएपी पेन(सामग्री तालिका)का उपयोग करें।
  7. एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड प्लेस और समाधान अवरुद्ध के रूप में TBST में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) का उपयोग कर आरटी पर 1 एच के लिए अवरुद्ध प्रदर्शन करते हैं।
  8. एक आर्द्र कक्ष में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के साथ इनक्यूबेट स्लाइड। सिफारिश के रूप में समाधान अवरुद्ध के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
  9. एक नए रैक में स्लाइड प्लेस और TBST के साथ 3x धो लें।
  10. विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट स्लाइड (एंटी-माउस या एंटी-रैबिट) (4 "5 बूँदें 1 स्लाइड के लिए) एक आर्द्र कक्ष में आरटी में 30 मिनट के लिए।
  11. एक नई रैक में स्लाइड प्लेस और TBST के साथ 3x धोने और आसुत पानी में बाद.
  12. तैयार 3,3'-diaminobenzidine (DAB) समाधान कम 1 mL में 1 l कमजोर पड़ने बफर(सामग्री की तालिका) कीतालिका). माइक्रोस्कोप के तहत 5 मिनट की जांच के लिए इन्क्यूबेट स्लाइड अधिकतम।
  13. सूक्ष्मदर्शी के नीचे अभिक्रिया के विकास का अनुसरण करते हुए ऊष्मायन समय की गणना करने के लिए धनात्मक नियंत्रण का उपयोग कीजिए।
    नोट: प्रत्येक एंटीबॉडी एक विशिष्ट ऊष्मायन समय की जरूरत है।
  14. निष्क्रिय DAB (रोक क्रोमोगेन वर्षा) आसुत पानी में स्लाइड submerging द्वारा.
  15. 10 s के लिए hematoxylin के साथ एक नए रैक में उन्हें immerging द्वारा स्लाइड काउंटर और फिर नल के पानी के साथ कुल्ला.
  16. एक रैक में स्लाइड प्लेस, और निम्नलिखित चरणों का पालन करें: 70% इथेनॉल 4 मिनट के लिए, 70% इथेनॉल 4 मिनट के लिए, 4 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 4 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 10 मिनट के लिए xylene, 10 मिनट के लिए xylene.
  17. सील स्लाइड प्रत्येक ऊतक स्लाइड पर बढ़ते माध्यम (सामग्री की तालिका) की बूंदों की एक जोड़ी डाल और कवरपर्ची के साथ कवर.
  18. अतिरिक्त मध्यम और हवा के बुलबुले को ऊतक से दूर ले जाने के लिए और कवरस्लिप और हवा सूखी से बाहर करने के लिए कवरस्लिप पर दबाव लागू करें।
  19. मूल्यांकन और एक विशेषज्ञ पैथोलॉजिस्ट के साथ उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत दाग परिणाम स्कोर।
    नोट: स्कोरिंग प्रणाली विशिष्ट प्रतिजनों पर निर्भर करेगा, जिसके लिए साहित्य में जानकारी पहले से मौजूद हो सकती है। यदि सूचना साहित्य में उपलब्ध नहीं है, संदर्भ के रूप में सामान्य ऊतक में प्रतिजन की अभिव्यक्ति का उपयोग कर एक स्कोरिंग प्रणाली प्राप्त.

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Representative Results

अध्ययन कार्यप्रवाह चित्र 1में सचित्र है। मल्टी-लेसिस (एन जेड 13) 409 कैंसर से संबंधित जीनों के कोडन अनुक्रमों को लक्षित करने वाले 5 एसपीएन मामलों के अनुक्रमण में 8 जीनों में कुल 27 कायिक उत्परिवर्तनों की पहचान की गई(CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1, और FGFR3). उत्परिवर्तनों को किसी रोगी के सभी घावों के बीच साझा किए जाने पर संस्थापक/क्लोनल के रूप में परिभाषितकिया गया था, और किसी दिए गए रोगी के सभी घावों का पता लगने पर प्रतक/ कुल मिलाकर, सहगण भर में पहचान की बिंदु उत्परिवर्तनों के बहुमत क्लोनल घटनाओं, जो CTNNB1, KDM6A, TET1, और FLT1के उत्परिवर्तन शामिल थे. लगातार, $-कैटिनिन (CTNNB1के प्रोटीन उत्पाद ) और केडीएम6ए के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला इसी जीनके उत्परिवर्तन के साथ मामलों के विभिन्न घावों के बीच समरूप था (चित्र 6ए, बी) । उत्परिवर्तित नमूनों में KDM6A के लिए मध्यम धुंधला सुझाव दिया है कि आनुवंशिक परिवर्तन प्रोटीन अभिव्यक्ति के बजाय समारोह में परिवर्तन की संभावना थी. अग्नाशयी ट्यूमर में समारोह के KDM6A हानि hypoxia मार्कर GLUT18के upgation से जुड़ा हुआ है , और तदनुसार GLUT1 KDM6A उत्परिवर्तन ों वाले मामलों में overexpressed था (चित्र 6C) सबक्लोनल उत्परिवर्तनों को बीएपी1, SMAD4, TP53, और FGFR3 को प्रभावित पाया गया। BAP1 और TP53 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने पुष्टि की है कि उन जीनों में उत्परिवर्तन सबक्लोनल थे (चित्र 6D,E)। प्रतिलिपि संख्या भिन्नता (CNV) विश्लेषण अनुक्रमण डेटा का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था और सभी नमूनों में परिवर्तन का पता चला विश्लेषण के रूप में चित्र 7कमें दिखाया गया. बिंदु उत्परिवर्तनों से भिन्न, CNV परिवर्तन के बहुमत subclonal थे (चित्र 7B).

Figure 1
चित्र 1: मेटास्टेटिक घावों पर किए गए विश्लेषण का प्रवाह चार्ट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सामान्य और ट्यूमर ऊतकों के प्रतिनिधि ऊतक.
(ए, बी) ट्यूमर ऊतक (टी) सामान्य ऊतक के निकट (एन). इन दो ऊतक वर्गों में, ट्यूमर और सामान्य ऊतकों को अलग और अच्छी तरह से सीमित क्षेत्रों के रूप में पहचाने जाते हैं। (सी) सामान्य अग्नाशय ी कोशिकाओं के क्लस्टर (एन *) ट्यूमर ऊतक (टी) के भीतर एम्बेडेड के रूप में देखा जा सकता है। (घ)सामान्य अग्नाशयके ऊतक का रूप विज्ञान. स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Figure 3
चित्र 3: पुस्तकालय की तैयारी और परिमाणीकरण प्रोटोकॉल चरण का Schematic प्रवाह चार्ट.

Figure 4
चित्रा 4: आयन प्रोटॉन चिप लोड हो रहा है और चल रहा है।
(ए)चिप दिशा और चिप दबाना (बाएं) में नियुक्ति। धातु टैब वापस प्रतिस्थापन (दाएं)। (बी)दो अलग-अलग चिप लोडिंग में पुस्तकालयों के घनत्व को प्रदर्शित करने वाले हीटमैप। पुस्तकालयों के एक सफल क्लोनल प्रवर्धन के कारण एक अच्छा लोड िंग घनत्व (ऊपर) का उदाहरण, अनुक्रमण कणों के साथ चिप सतह के 94% लोड िंग में जिसके परिणामस्वरूप (139 मिलियन पढ़ता है, अंतिम उत्पादन 90 मिलियन स्वचालित गुणवत्ता फ़िल्टरिंग के बाद पढ़ता है)। पुस्तकालयों की एक अक्षम क्लोनल प्रवर्धन के कारण एक गरीब लोड हो रहा है (नीचे) का उदाहरण, अनुक्रमण कणों के साथ चिप सतह के 40% लोड हो रहा है में जिसके परिणामस्वरूप (59 लाख पढ़ता है, अंतिम उत्पादन 12 मिलियन स्वत: गुणवत्ता फ़िल्टरिंग के बाद पढ़ता है).

Figure 5
चित्र 5: मेटास्टेटिक घावों में कायिक परिवर्तन।
(क)मिलान प्राथमिक/मेटास्टेटिक घावों में पहचाने गए कायिक उत्परिवर्तन। (ख) कुल कायिक उत्परिवर्तन प्रति केस प्रदर्शित किए जाते हैं, जिसमें सभी घावों (संस्थापक/क्लोनल) के बीच साझा परिवर्तन और एक या अधिक में पाए गए सभी नमूनों (प्रगतिर/ व्यक्तिगत मेटास्टैटिक घाव (m) प्रति मामले अनुक्रम की संख्या संकेत दिया है. यह आंकड़ा Amato एट अलसेपुनर्प्रकाशित किया गया है 8 . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: प्राथमिक और मेटास्टैटिक घावों में जेड-कैटेनिन, केडीएम6ए, GLUT1, BAP1 और TP53 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग।
(क) प्रतिनिधि इम्यूनोहिस्टोकेमिकल छवियों को CTNNB1 के SPN असर उत्परिवर्तन से सभी नमूनों (प्राथमिक और मेटास्टैटिक) में जेड-कैटिन का परमाणु संचय दिखा रहा है । (बी) प्रतिरक्षाहिस्टोकेमिकल एक से घावों के धुंधला मेटास्टैटिक SPN KDM6A के क्लोनल उत्परिवर्तन असर. (ग)एक स्पीएन में GLUT1 का अतिअभिव्यक्ति, जिसमें KDM6A उत्परिवर्तन होता है, जबकि जंगली प्रकार के ऊतकों में कोई इम्यूनोरेक्टीय नहीं पाई गई. (डी, ई) BAP1 और TP53 अभिव्यक्ति डेटा का अर्थ है कि इन दो जीनों में उत्परिवर्तन subclonal हैं. स्केल बार 100 डिग्री मीटर का प्रतिनिधित्व करते हैं और इनसेट आवर्धन 600X है। यह आंकड़ा Amato एट अल से संशोधित किया गयाहै 8.

Figure 7
चित्र ााालः कायिक प्रति-संख्या मेटास्टेटिक घावों में परिवर्तित होती है.
(ए)आभासी कारियोटाइप दृश्य प्रतिनिधि मामले में परिवर्तित जीनों के स्थान, निकटता और प्रतिलिपि संख्या की स्थिति को दर्शाता है। गुणसूत्र बैंड की रंग योजना निम्नलिखित है: काले और भूरे रंग - Giemsa सकारात्मक, हल्के लाल ] centromere, बैंगनी ] चर क्षेत्र. परिवर्तन आंकड़ा में प्रस्तुत रंग कोड के अनुसार एनोटेट कर रहे हैं. संक्षिप्त नाम: CNV, प्रतिलिपि संख्या भिन्नता; पी, प्राथमिक SPN; एल (ए-सी), जिगर मेटास्टेसिस। (ख) कुल कायिक परिवर्तन (CNV द्वारा प्रभावित जीन) प्रति मामले प्रदर्शित किए जाते हैं, जिसमें सभी घावों (संस्थापक/क्लोनल) के बीच साझा परिवर्तन और किसी दिए गए मामले (प्रगतिर/सबक्लोनल) के नमूनों में पाए गए (लेकिन सभी नहीं) के बीच साझा परिवर्तन शामिल हैं। व्यक्तिगत मेटास्टैटिक घाव (m) प्रति मामले अनुक्रम की संख्या संकेत दिया है. यह आंकड़ा Amato एट अलसेपुनर्प्रकाशित किया गया है 8 . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमारी विधि किसी दिए गए रोगी के अलग घावों से ऊर्ध्वाधर डेटा (यानी, आकृति विज्ञान, डीएनए अनुक्रमण, और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री) के एकीकरण के माध्यम से ठोस ट्यूमर की प्रगति में शामिल आणविक परिवर्तन की पहचान सक्षम बनाता है। हमने 409 कैंसर प्रासंगिकजीनोंके कोडन दृश्यों के बारे में पूछताछ करके उत्परिवर्तन मूक ट्यूमर प्रकार (यानी, एसपीएन, ठोस-स्यूडोपैपिलरी नियोप्लाज्म) में क्लोनल और सबक्लोनल घटनाओं का पता लगाने की अपनी विधि की क्षमता का प्रदर्शन किया। यहाँ इस्तेमाल किया amplicon आधारित लक्षित अनुक्रमण दृष्टिकोण का एक लाभ कवरेज की एकरूपता है (90% लक्ष्य ठिकानों 100x कवर कर रहे हैं, 95% पूछताछ क्षेत्रों में 20x कवर कर रहे हैं (15,992) 1000x की एक ठेठ मतलब कवरेज गहराई पर. microdissection के माध्यम से neoplastic सेल संवर्धन के लिए युग्मित उच्च गहराई के कवर कम allele आवृत्ति घटनाओं का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता की गारंटी देता है. जैसा कि हम पहले से पता चला है9, लक्षित अनुक्रमण दृष्टिकोण FFPE ऊतक से डीएनए नमूने पर एक 2% एलील आवृत्ति के लिए नीचे उत्परिवर्तनों का पता लगाने की अनुमति देता है. एक उदाहरण के रूप में, वर्तमान कार्य में हम एक 4% allele आवृत्ति TP53 missense उत्परिवर्तन एक मेटास्टैटिक नमूना में एक subclonal घटना के रूप में पहचान करने में सक्षम थे (चित्र 5) और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा इस घटना को मान्य (चित्र 6) . हमारे प्रोटोकॉल में दैहिक घटनाओं की पहचान करने और तदनुसार कैंसर-केवल पाइपलाइन10के उप-क्लोनल उत्परिवर्तनों की झूठी पहचान दर को कम करने के लिए मिलान किए गए ट्यूमर और जर्मलाइन डीएनए के अनुक्रमण की परिकल्पना की गई है। जब मिलान germline डीएनए उपलब्ध नहीं है, एक अनुक्रमण डेटा के विश्लेषण में अधिक रूढ़िवादी मानकों को अपनाने पर विचार हो सकता है, कवरेज की न्यूनतम गहराई के आधार पर कड़े फिल्टर सहित के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सीमित वेरिएंट "हॉट स्पॉट उत्परिवर्तनों के लिए बुला" और उत्परिवर्तनों बड़े पैमाने पर उपलब्ध डेटाबेस में एनोटेट. मिलान ट्यूमर के साथ germline डीएनए अनुक्रमण भी कॉपी संख्या विविधताओं (CNV) का सही पता लगाने को सक्षम करने का लाभ है। वैकल्पिक रूप से, लिंग-मिलान द्विगुणित जीनोम के पूल अनुक्रमण डेटा से शोर को कम करने और CNV का पता लगाने की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. germline डीएनए के शामिल किए जाने के अलावा, हम प्राइमर पूल असंतुलन को कम करने और CNV बुला में सुधार करने के लिए पुस्तकालय प्रोटोकॉल संशोधित. मूल प्रोटोकॉल के अनुसार, मल्टीप्लेक्स पीसीआर के बाद प्रत्येक डीएनए नमूने से उत्पादित चार amplicon पूल एक साथ मिलाया जाना चाहिए और शेष कदम प्रति नमूने एक ट्यूब में किया जाएगा। हालांकि यह इस तथ्य के कारण प्रति-पूल माध्य कवरेज गहराई में उतार-चढ़ाव का कारण बनता है कि मल्टीप्लेक्स पीसीआर में विभिन्न ट्यूबों में अलग-अलग दक्षता हो सकती है। मूल प्रोटोकॉल में इस आशय के लिए कोई पूल परिमाणीकरण/सामान्यीकरण चरण नहीं था। उपरोक्त वर्णित उतार-चढ़ाव से बचने के लिए, हमने पूरे पुस्तकालय उत्पादन प्रोटोकॉल में अलग किए गए चार amplicon पूलों में से प्रत्येक को रखने का निर्णय लिया, जब तक कि उन्हें मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता। परिमाणीकरण पर, प्रत्येक डीएनए नमूने के लिए चार पूल में से प्रत्येक की एक ही राशि अंतिम पुस्तकालय पूल में जोड़ा जा सकता है, यह सुनिश्चित करना है कि अंतिम औसत कवरेज के रूप में संभव के रूप में वर्दी था.

आनुवंशिक स्तर पर अंतर-ट्यूमर विषमता (आईआईटीएच) के मूल्यांकन के महत्वपूर्ण नैदानिक निहितार्थ हैं लेकिन इसी तरह नई चुनौतियां2बन गई हैं। एक बड़ी चुनौती वास्तव में ड्राइवर उत्परिवर्तनों और स्टोचैस्टिक घटनाओं (यानी, यात्री उत्परिवर्तनों) के बीच भेद करने की आवश्यकता है। ड्राइवर और यात्री उत्परिवर्तनों के बीच अंतर अक्सर गणना के साथ पूरा किया जाता है, लेकिन पूर्वाग्रहों के बिना नहीं। जबकि पता चला वेरिएंट के व्यवस्थित कार्यात्मकमहंगा और समय लेने वाली है, आनुवंशिक वेरिएंट के कार्यात्मक परिणामों का मूल्यांकन किया जा सकता है, कम से कम जीन के एक सबसेट के लिए, इसी प्रोटीन के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण द्वारा या, परोक्ष रूप से, प्रोटीन रोग के सरोगेट मार्करों की अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा. हमारे प्रोटोकॉल FFPE ऊतकों के लिए लागू किया गया है, जो नैदानिक सेटिंग में सामग्री के प्रमुख स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है अभी तक अनुक्रमण के लिए चुनौतियों प्रस्तुत; अनुक्रमण11से पहले पृथक न्यूक्लिक अम्लों की गुणवत्ता का मूल्यांकन हमेशा किया जाना चाहिए . हालांकि लक्षित अनुक्रमण लागत प्रभावी होने का प्रमुख लाभ है और गणनात्मक आवश्यकताओं के मामले में अत्यधिक मांग नहीं है, यह जीनोम के केवल एक सीमित हिस्से से पूछताछ का प्रमुख नुकसान है, जो संभावना को कम करके आंका जाता है अंत:ट्यूमर विषमता. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण मेटास्टेसिस और प्राथमिक ट्यूमर है कि हाल ही में कुछ ट्यूमर प्रकार4,12में आनुवंशिक अंतर पल्ला झुकना दिखाया गया है के बीच प्रासंगिक epigenetic और transcriptomic मतभेद पर विचार नहीं कर रहा है, 13. हालांकि, एक कल्पना की जाएगी कि तकनीकी प्रगति जल्द ही आईटीएच के बेहतर मूल्यांकन के लिए एक अमीर ऊर्ध्वाधर डेटा पहनावा के एकीकरण को सक्षम करेगा। हमारा दृष्टिकोण जीनोम के भौतिक कवरेज के लिए गहराई को पसंद करता है, जो उचित SNV-आधारित phylogenies के निर्माण की हमारी क्षमता को सीमित करता है। फिर भी, हमारी विधि आणविक और हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषणों के एकीकरण के कारण उचित संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ नैदानिक नमूनों में आनुवंशिक ताश की खोज करने का अवसर प्रदान करती है। हम सफलतापूर्वक एक विशिष्ट ट्यूमर प्रकार पर इस प्रोटोकॉल लागू किया है (उदा., SPN) और भविष्यवाणी है कि विधि इसी तरह अन्य ठोस ट्यूमर प्रकार पर काम करेंगे.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

अध्ययन इतालवी कैंसर जीनोम परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था (ग्रेंट नहीं. FIRB RBAP10AHJB), एसोसिएजिन इटालियना राइसरका कांक्रो (एआईआरसी; अनुदान संख्या 12182 AS और 18178 को कुलपति के लिए), FP7 यूरोपीय समुदाय अनुदान (कैम-पैक नहीं 602783 AS के लिए). धन एजेंसियों के संग्रह, विश्लेषण और डेटा की व्याख्या में या पांडुलिपि के लेखन में कोई भूमिका नहीं थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies G2939BA  Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit Fisher Scientific NC9959336 Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4627 Library quantification
Anti-BAP1 Santa Cruz Biotechnology sc-28383 Antibody
Anti-GLUT1 Thermo Scientific RB-9052 Antibody
Anti-KDM6A Cell Signaling #33510 Antibody
Anti-p53 Novocastra NCL-L-p53-DO7 Antibody
Anti-βcatenin Sigma-Aldrich C7207 Antibody
Blocking Solution home made - 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution home made - 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra Leica 70937891 Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1 Leica Biosystems AR9961 Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2 Leica Biosystems AR9640 EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear Eppendorf 951010006 Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021 Tubes
Ethanol DIAPATH A0123 IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H­4000 Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Laboratories SK­4105 HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7401­50 Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7402­50 Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV) Broad Institute - https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Thermofisher Scientific 4477685 Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermofisher Scientific 4480441 Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument Thermofisher Scientific 4484177 Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip Thermofisher Scientific A26771 or A27766 Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef Thermofisher Scientific A27198 or A30011 Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit Thermofisher Scientific A26433 or A30011 Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System Thermofisher Scientific 4476610 or A38196 Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair Thermofisher Scientific 4487118 Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin Thermofisher Scientific 4487118 Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit Thermofisher Scientific 4474517 Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermofisher Scientific ND-2000 DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity Fisher Scientific 12532-016 or 12532-024 SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit Quiagen 51106 0r 51104 DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue Quiagen 56404 DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer Thermofisher Scientific Q32866 DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermofisher Scientific Q32850 Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST home made - Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film Sakura Europe 6172 Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software EMBI-EBI - http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres Carlo Erba 492306 IHC deparaffinization reagent

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एक लक्षित अनुक्रमण दृष्टिकोण के माध्यम से तुलनात्मक Lesions विश्लेषण
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Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).More

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).

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