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目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析

doi: 10.3791/59844 Published: November 5, 2019

Summary

この記事では、所定の患者から異なる検体間のクローンおよびサブクローンの変化を同定する方法について説明する。ここで説明する実験は特定の腫瘍タイプに焦点を当てていますが、このアプローチは他の固形腫瘍に広く適用可能です。

Abstract

腫瘍内不均一性(ITH)を評価することは、標的治療の失敗を予測し、それに応じて効果的な抗腫瘍戦略を設計することが最も重要です。サンプル処理とカバレッジの深さの違いにより懸念が頻繁に生じますが、固形腫瘍の次世代シーケンシングは、腫瘍タイプ全体で非常に可変的なITH程度を解明しています。クローン集団とサブクローナル集団の同定を通じて原発性病変と転移性病変の間の遺伝的関連性を捉えることは、前段階疾患の治療法の設計に不可欠である。ここでは、同じ患者の異なる検体間のクローン集団とサブクローナル集団の同定を可能にする比較病変解析の方法を報告する。ここで説明する実験的アプローチは、組織学的分析、高カバレッジ多病変シーケンシング、免疫表現型解析の3つの確立されたアプローチを統合しています。不適切なサンプル処理によるサブクローナル事象の検出への影響を最小限に抑えるために、慎重な病理学的検査と腫瘍細胞濃縮に組織を行った。腫瘍性病変および正常組織からの品質管理されたDNAは、その後、409の関連する癌遺伝子のコード領域を標的とする高カバレッジシーケンシングを行った。限られたゲノム空間だけを見ながら、当社のアプローチは、所定の患者とは異なる病変における体性変化(単一ヌクレオチド突然変異およびコピー数変動)間の不均一性の程度を評価することを可能にする。シーケンシングデータの比較分析により、クローンとサブクローナルの変化を区別することができました。ITHの大部分は、多くの場合、乗客の突然変異に起因します。そこで、免疫ヒストケミストリーを用いて、突然変異の機能的影響を予測しました。このプロトコルは特定の腫瘍タイプに適用されているが、ここで説明する方法論は他の固形腫瘍タイプに広く適用可能であると予想される。

Introduction

次世代シーケンシング(NGS)の出現は、癌の診断と治療方法に革命をもたらした1.多地域シーケンシングに結合したNGSは、固形腫瘍2において高い腫瘍内不均一性(ITH)を露呈しており、これは薬物感受性の異なるサブクローンの存在による標的治療の失敗を部分的に説明している2.ゲノムワイドシーケンシング研究によって提起される重要な課題は、個々の癌における乗客(すなわち中性)と運転者の突然変異を区別する必要性である3。いくつかの研究は確かに、特定の腫瘍において、乗客の突然変異がITHの大部分を占める一方で、運転者の変化は同じ個体4の病変の間で保存される傾向があることを示している。また、大きな突然変異負担(肺癌および黒色腫に見られる)は、必ずしも大きな鎖下突然変異負担2を意味するわけではないことに注意することも重要である。したがって、高い程度のITHは、突然変異の負担が低い腫瘍に見出すことができる。

転移は、世界中の癌関連死の90%以上を占めています5;したがって、原発性病変および転移性病変の間でドライバ遺伝子の突然変異不均一性を捕捉することは、進行期疾患に対する有効な治療法の設計に不可欠である。臨床シーケンシングは、一般に固定組織からの核酸に対して行われ、DNA品質が悪いためゲノム全体の探査が困難になります。一方、臨床シーケンシングの目的は、所定の治療レジメンに対する応答性/応答を予測する可能性のある実用的な突然変異および/または突然変異を特定することです。現状では、シーケンシングは、臨床的に関連する情報をタイムリーに抽出するために、ゲノムの小さな割合に制限することができます。低スループットDNAプロファイリング(例えば、サンガーシーケンシング)からNGSへの移行により、数百のがん関連遺伝子を高いカバレッジで分析することができ、サブクローナルイベントの検出が可能になります。ここでは、同一個体の異なる検体間のクローン集団とサブクローナル集団の同定を可能にする比較病変解析方法を報告する。ここで説明する方法は、同定された変動の機能的な結果を予測するために、3つの確立されたアプローチ(組織学的分析、高カバレッジマルチレションシーケンシング、および免疫表現型解析)を統合します。このアプローチは図1に概略的に記述され、膵臓の固体偽毛細血管新生物(SPN)の5つの転移症例の研究に適用されている。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織標本の処理と解析について説明する一方で、同じ手順を新凍結組織の遺伝物質にも適用できます。

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Protocol

研究で使用された材料は、地元の倫理委員会によって承認された特定のプロトコルの下で収集されました。すべての患者からの書面によるインフォームド・コンセントが利用可能であった。

1. 組織学的・免疫性体型組織標本の改訂

注:専門家の病理学者は、以下に説明する活動を担当しています。

  1. 十分に確立された診断基準に従って選択された症例の組織病理学的改訂。
    1. マイクロトームを使用して、代表的なFFPE組織ブロックから4-5μmの厚い組織切片を切断し、標準的な組織学スライドにセクションを取り付けます。
    2. 自動組織スライド染色剤(材料表)を使用して、各スライドに対してヘマトキシリンおよびエオシン染色を行う。
    3. WHO診断基準に従って、選択した腫瘍症例の組織病理学的診断を確認する。
      注:この段階では、病理学者は、同じ組織セクション内の腫瘍の形態学的に異なる領域を同定し得る。これらの領域を別々に収穫することが可能です(セクション2を参照)。SPNに対する腫瘍および正常細胞の組織学的類似性を図2に示す。
    4. 確立されたマーカーに対して免疫組織化学的染色を行い、組織学的分析を補完し、免疫フェノチピック不均一性を推定する。
      注:病理学者は、同じ組織セクション内の腫瘍の免疫フェノノタイプの典型的な異なる領域を同定する可能性がある。これらの領域を別々に収穫することが可能です(セクション2を参照)。
  2. 腫瘍組織セクションの腫瘍性細胞性を評価し、それに応じて手動マイクロセクションを計画する。
    注:これは、腫瘍細胞の病理学者によって生成された推定値です。
    1. 組織切片の腫瘍性細胞含有量が70%より高い場合、手動マイクロセクションは必須ではありません。ステップ 3.1 に直接移動します。
      注:(i)変異対立遺伝子周波数推定に対して十分な感度を確保するために、(i)および(ii)感度の低い方法論(例えば、毛細血管シーケンシング)によってクローン突然変異を検証するために、腫瘍性細胞含有量の70%をターゲットにする。
    2. 組織切片の腫瘍性細胞含有量が70%より低い場合は、マイクロ分片が必要であり、ステップ2に移動する。
  3. 非腫瘍組織がサンプリングされたFFPEブロックから組織切片を評価します。この組織は、生殖細胞系DNAの供給源として使用される。
    注:血液は生殖細胞系DNAの代替源である。この場合、ステップ4.1のノートで推奨されているようにDNA抽出を続行します。
    1. 非腫瘍組織のみが組織セクション(図2D)に見える場合、手動マイクロセクションは必要ありません。ステップ 3.1 に直接移動します。
    2. 腫瘍細胞からの実質的な汚染が組織セクションに存在する場合は、手動マイクロセクションが必要です。セクション 2 に移動します。

2. 手動マイクロダイセクション

注:この方法は、様々な固形腫瘍タイプに適用可能であり、組織標本の腫瘍細胞含有量を増加させることを意図している。あるいは、この方法は、同じ組織セクション内の形態学的および/または免疫フェノノ的に典型的に異なる領域を収穫するために使用することができる。

  1. ミクロトームを使用して、厚さ10μmのFFPE腫瘍組織切片を10個までカットし、未充電スライドに取り付けます。
    注:癌細胞の1つの1mm2の巣のみが標本に見える場合、10個の組織スライドを切断し、DNAの標的量(40ng)を得るために手動マイクロセクションを施す必要があります。これは、1mm2クラスターが700〜1000個の腫瘍核を含むと仮定する。
  2. 60°Cで10分間スライドをインキュベートします。
  3. スライドをラックに入れ、次のスイッシュを行います:キシレン(20分)、10分間のエタノール100%、10分間のエタノール80%、1分間のエタノール70%、蒸留水1分、ヘマトキシリンカウンターステイン(1分間)、水道水を1分間行います。
  4. 標準的な反転顕微鏡では、マイクロジ剖ツールとして注射器に27G針を使用し、腫瘍細胞の代表的なクラスターを収集します。少なくとも11mm2個の細胞を採取し、シーケンシングに必要な量のDNAを確保します。
    注: 形態学的に異なる領域を異なるエンティティとして解析する場合は、マイクロディセクション ツールを使用してそれらの領域を別々に収穫します。
  5. 収穫したクラスターを1.5 mLチューブ(材料表)に1.5μLのチューブに入れ、以前は20°LのプロテアーゼKと180μLの分解緩衝液(材料表、いずれもDNA抽出キットに含まれる)を充填し、ボルテックスで混合します。

3. 事前のマイクロセクションのない組織の処理

注:この手順は、非腫瘍性細胞(生殖細胞の供給源)のみを含む組織ブロック、または形態学的に均質な癌細胞の少なくとも70%を含む組織ブロックに使用されます。

  1. 選択したFFPE組織ブロックから最大6つの4−5μmの厚い組織切片を切断するミクロトームを使用する。ステップ2.5で説明したように、組織の巻物を1.5 mLチューブに入れます。

4. 正常細胞および腫瘍細胞からのDNA抽出

  1. 製造元の指示に従って、DNA FFPE組織抽出キット(材料表)を使用して、正常および腫瘍組織からDNAを精製します。
    注:血液を生殖細胞核酸の供給源として使用する場合は、DNA血液抽出キット(物質表)を用いてDNAを精製する。
  2. DNA定量と品質チェック
    1. 二本鎖(dsDNA)の量を定量化するには、蛍光核酸染色(材料テーブル)を含む溶液にDNAサンプルのアリコートを添加し、ベンチトップ蛍光計(材料表)を用いて蛍光を測定する。).
      注:アッセイは、dsDNAに付着した蛍光色素から放出される蛍光シグナルの強度を測定し、標準曲線を用いてDNAの量を決定します。
    2. マイクロボリューム分光光度計(材料表)を使用して、DNAを修飾するためにサンプルの260/280および260/230比を測定します。「純粋な」DNAは、1.8の260/280と1.8−2.2の範囲の260/230を持つ必要があります。
      注:試料の分光光測定評価は、下流反応に影響を与える化学汚染物質(例えばフェノール)の存在を証拠とするものであり、その。化学試薬による汚染の場合は、カラムベースのキットを使用してクリーンアップステップを実行します。

5. 図書館の準備と定量化

注: ライブラリの準備と定量化の手順の概略フローチャートを図 3に報告します。

  1. DNAライブラリ調製(サンプルごとに4つのプライマープールを設置)
    注:4つのプライマープールは、材料表.各プールには、409個の遺伝子の多重ターゲット選択用に設計されたプライマーペアが含まれています。NGSパネルを構成する遺伝子のリストへのリンクは、材料表.
    1. 各サンプルに対して4つのDNA標的増幅反応を準備し、プライマープールごとに1つずつ作成します。各プライマープール(材料の表)、0.2 mLチューブ(材料の表):マスターミックスの4°L(材料のテーブル、ライブラリキットに含まれる材料のテーブル)、高忠実度プライマープールミックスの10°L(材料の表、に含まれる)に含まれていますがんパネルライブラリ)、およびDNAの6μL(合計10ng)を示します。
    2. 次のプログラムを実行している4つの1.5 mLチューブで各プライマープールのターゲット領域を別々に増幅する:99°Cで2分間保持(ホットスタートポリメラーゼの活性化)、16サイクル(15sの99°Cでの変性、アニール、8分間60°Cで延長)、4°Cで保持します。
      注: 停止点。標的増幅反応を4°Cで一晩または-20°Cで長時間保存します。
    3. アンプリコンの部分的な消化が終了する
      注:NGSメーカーキットが提供するマニュアルは、部分消化の前に各サンプルからの異なる増幅反応を組み合わせるステップを予見します。そのステップを避け、各増幅消化を別々に処理し続けます。
      1. 各サンプルの各増幅プールに、特定の消化ミックス(材料の表、ライブラリキットに含まれる)の2μLを追加します(各0.2 mLチューブの総体積は22°Lです)。渦を徹底的に遠心分離し、液滴を収集する。
      2. サーマルサイクラーにチューブをロードし、次のプログラムを実行します:50°Cで10分、55°Cで10分、60°Cで20分、10°Cホールド(最大1時間)。
        注: 停止点。プレートを -20 °C で長期間保存します。
    4. アダプタをアンプリコンと浄化します。
      メモ:1つのチップで複数のライブラリをシーケンスする場合は、サンプルごとに異なるバーコードアダプタを使用します。同じサンプルからの4つの増幅反応はすべて、同じバーコードを受け取る必要があります。
      1. アダプターを準備します (材料の表、バーコード アダプター キット)。バーコード X ごとに、P1 アダプタと一意のバーコード アダプタ (材料テーブル) を 1:4 の最終希釈で組み合わせて準備します。P1アダプタ2μL、ユニークなバーコードアダプタ2°Lで4μLの水を混ぜます。下流の通路には、このバーコードアダプタミックスの2°Lを使用します。
      2. 各サンプルの各増幅プールにこの順序でライゲーション反応を行う:4μLのスイッチ溶液(材料表、ライブラリキットに含まれる)、バーコードアダプタミックスの2μLおよびDNAリガーゼの2μL(材料表、に含まれる)ライブラリキット)(総体積= 30°L)。
      3. 渦は、液滴を収集するために徹底的かつ短時間遠心分離します。
      4. サーマルサイクラーに各チューブをロードし、次のプログラムを実行します:22°Cで30分、68°Cで5分、72°C(5分)、4°Cホールド(最大24時間)。
        注: 停止点。プレートを -20 °C で長期間保存します。
    5. 図書館の精製と増幅
      1. 各チューブを遠心分離し、各バーコードサンプルを1.5 mLチューブに移します。各サンプルの各プールに45μLのビーズベースの精製試薬(材料表)を加えます。5倍上下にピペットを組み、ビーズ懸濁液とDNAを混合します。
      2. 混合物を室温(RT)で5分間インキュベートし、各チューブを磁気ラックに入れ、2分間インキュベートします。
      3. 新鮮な70%エタノールの各チューブ150°Lに追加します。磁石の2つの位置の各チューブを左右に動かすビーズを洗います。上清を捨て、ペレットを乱さないよう注意してください。
      4. 手順5.1.5.3で説明した手順を繰り返し、チューブを磁石に入れ、ビーズを5分間RTで空気乾燥させます。
      5. 磁石から各プライマープールの精製ライブラリを含むチューブを取り除き、50°Lの高忠実度PCRミックス(材料テーブル)と2μLのライブラリ増幅プライマーミックス(材料の表、ライブラリキットに含まれる)をビーズペレットに追加します。各チューブ。
      6. ボルテックス各1.5 mLチューブと短時間遠心分離機は、液滴を収集します。
      7. 1.5 mLチューブを磁石に2分間置き、ペレットを乱すことなく、各チューブから新しい0.2 mLチューブに上清(約50°L)を慎重に移します。
      8. 次のプログラムを実行している各プライマープールのライブラリを増幅する:酵素を活性化するために2分間98°Cで保持し、5サイクル(15sの98°Cで変性、アニールと64°1分で伸びる)、4°Cで保持します。サンプルは-20°Cで保存します。
    6. 増幅ライブラリーの精製
      1. 各チューブを遠心分離して底部の内容物を収集し、各増幅ライブラリーサンプルを1.5 mLチューブに移します。
      2. ビーズベースの精製試薬を25μL添加します。5倍上下にピペットを組み、ビーズ懸濁液とDNAを混合します。
      3. 混合物をRTで5分間インキュベートし、5分間磁石にチューブを入れます。
      4. アンプリコンを含む上清を各チューブからペレットを邪魔することなく新しいチューブに慎重に移します。
      5. ビーズベースの精製試薬60μLを各チューブとピペットの上清に加え、ビーズ懸濁液とDNAを混ぜ合わせます。
      6. 混合物をRTで5分間インキュベートし、3分間磁石にチューブを入れます。
      7. 各チューブから上清を捨て、ペレットを乱さないよう注意してください。
        メモ:アンプリコンはビーズにバインドされています。
      8. 新鮮な70%エタノールの各チューブ150°Lに追加します。磁石の2つの位置でチューブを左右に動かすビーズを洗います。上清を捨て、ペレットを乱さないよう注意してください。
      9. 手順5.1.6.8の手順を繰り返し、ビーズをRTで3分間空気で乾燥させます。
      10. 磁石からチューブを取り出し、50°Lの低トリスEDTA(TE)(資料の表、ライブラリキットに含まれる材料の表)をペレットに追加してビーズを分散させます。
      11. 混合物を数回上下にパイプし、2分間RTでインキュベートします。
      12. 少なくとも2分間磁石にチューブを置き、アンプリコンを含む上清をビーズを邪魔することなく新しいチューブに慎重に移します。
  2. ライブラリ定量
    1. フラグメント解析装置 (材料の表) を使用して、高感度 DNA キット プロトコルに従って DNA チップを実行します。

6. ライブラリのプールとシーケンス実行

  1. 各図書館をヌクレアーゼフリー水で100pMに希釈します。各 100 pM ライブラリの 10 μL を組み合わせて、1 本のチューブで 1 回の実行を行います。パイプで結合されたライブラリをミックスし、テンプレートとシーケンスに進みます。
  2. 計画実行の作成
    注:典型的な実行には、実験室で利用可能なシーケンサー(イオンプロトンシステムまたはGeneStudio S5システム、材料のテーブル)に基づいて、2種類の半導体チップ(イオンPIチップまたはイオン540チップ)にロードできる4つのサンプルが含まれます。これらのシステムは通常、実行あたり 8,000 万回の読み取りを生成します。
    1. シーケンスシステムに接続されているコンピュータ(Ion Chefシステムなど)でトレントブラウザを開き、選択したアプリケーションの汎用テンプレート(AmpliSeqDNA)を使用して新しい実行を計画します。
    2. プランの[キット]タブに切り替えます。使用しているシーケンスシステムに基づいて、計測器のドロップダウンリストから[イオンプロトンシステム]または[イオンGeneStudio S5システム]を選択します。
    3. シーケンスシステムに応じて、[チップタイプ]ドロップダウンリストから適切なチップ(イオンプロトンシステム用のPIチップ、イオンGeneStudio S5システム用540チップ)を選択します。
    4. [ライブラリ キット]ドロップダウン リストから[イオン ampliSeq 2.0 ライブラリキット]を選択します。
    5. テンプレートキットのIon Chefボタンを選択し、テンプレートキットのドロップダウンリストから適切なシェフキット(PIチップ用Ion PI Hi-Q ChefキットまたはIon 540キットシェフ(540チップ用Ion PI Hi-Q Chefキット)を選択します。
    6. [シーケンス キット]ドロップダウンリストから適切なシーケンス キット (PI チップ用の Ion PI Hi-Q シーケンシング 200 キットまたは Ion S5 シーケンシング キット (540 チップ用) を選択し、[バーコード セット] ドロップダウン リストから[IonXpress]を選択します。
    7. プラグイン」タブに切り替え、カバレッジ分析プラグインを選択します。
    8. [プラン]タブに切り替えます。[ターゲット領域]ドロップダウン リストから、順序付けする適切なパネルを選択します。
    9. 順序付けするバーコードの数とライブラリ サンプル チューブのラベルを適切なフィールドに設定します。
    10. 各ライブラリのバーコード名とサンプル名を設定します。
  3. サンプル ライブラリの希釈と読み込み。
    1. ストックライブラリをヌクレアーゼフリーウォーターで25 pMに希釈するか、540チップの場合は32 pMにします。
    2. 各希釈ライブラリのピペット50°Lを適切なライブラリサンプルチューブの底部に。
    3. シーケンスシステムの電源を入れ、画面の指示に従って必要なすべての試薬をロードし、実行計画をインポートします。
    4. プールされたライブラリを含むライブラリサンプルチューブをロードし、クローン増幅プログラムを開始します。
      メモ:イオンシェフシステムでは、1回の実行につき2つのチップを用意する必要があります。
  4. イオンプロトンまたはイオンジェネスタジオS5のシーケンシング。
    1. シーケンス システムの電源を入れ、画面の指示に従ってシーケンスを初期化し、実行計画をインポートします。
    2. シーケンス システムからシーケンス チップを取り外した後、シーケンス チップを読み込みます。
      メモ:静電気放電によるチップの損傷を避けるため、チップを拾う前に接地してください。チップの取り扱い/位置決め、成功/失敗した読み込みの例を図4に示します。
    3. チップコンパートメントの蓋を閉じ、チップステータスアイコンに「準備完了」と表示されるまで待ちます。
    4. 最初の実行が完了したら廃棄物コンテナを空にし、残りのチップをできるだけ早くシーケンスします。

7. 突然変異とコピー数変動(CCV)解析

注:GRCh37/hg19ヒト参照ゲノムへのシーケンシングデータの位置合わせは、プランで設定すると自動的に実行されます(ステップ6.2.8)。

  1. カバレッジ分析プラグイン (材料テーブル)出力を使用して、カバレッジの深さと均一性を検証します。
  2. Torrent バリアント呼び出し元プラグイン (材料の表) を使用してバリアント呼び出しを実行し、必要に応じて生殖細胞または体性ワークフローを選択します。
  3. フィルター処理されたバリアント バリアント呼び出し形式 (VCF) ファイルをダウンロードします。バリアント効果予測 (VEP) ソフトウェア6および NCBI RefSeq データベースを使用してバリアントに注釈を付けます。
  4. イオンレポーターアップローダプラグインを使用してイオンレポーターソフトウェアにシーケンスデータをロードし、包括的ながんパネル腫瘍と正常対のワークフローを使用してデータを分析し、CCVを推定します。
  5. ソフトウェアによって割り当てられたスコアに基づいて突然変異とCCVを手動でフィルタリングし、統合ゲノムビューア(IGV)7でそれらを視覚的に検証します。
    1. アーティフリカル呼び出しを生成する可能性がある異常な読み取り (誤ったプリミング、過剰増幅、ソフト クリッピングの読み取りなど) がないか、アライメントを視覚的に検査します。
    2. 特定の遺伝子全体のすべてのアンプリコンの正規化カバレッジをベースラインの正規化カバレッジに照らして検査して、CCV を検証します。
      注:これは、1つの遺伝子の終わりと連続する遺伝子の開始時に少数のアンプリコンの対称的に異常なカバレッジに基づいてCNVを呼び出すことがあるセグメンテーションソフトウェアによる誤った呼び出しを修正するのに役立ちます。
  6. 体性突然変異のインデックス作成
    1. 各症例について、インデックス突然変異は、正常組織/血液、原発性腫瘍および転移のシーケンシングから呼び出される。
    2. 生殖細胞系としてフラグを付け、生殖細胞DNAのシーケンシングデータからも明らかな呼び出しを破棄します。
    3. クローン/創設者としてのフラグは、特定の患者のすべての病変の間で共有される突然変異を。
    4. サブクローナル/プログレスとしてのフラグは、特定の患者のすべての病変ではなく、一部で検出される突然変異を示します。

8. 免疫表現型解析:関連タンパク質発現のための免疫ヒスト化学

注:免疫ヒストケミストリーは、腫瘍抑制遺伝子の不活性化変異の機能的結果を検証するために使用された。

  1. ミクロトームを使用して、厚さ3-4μmのFFPE組織切片をカットし、充電スライドに取り付け、60°Cで10分間インキュベートします。
  2. スライドをラックに入れ、次の手順を実行します:キシレン10分、キシレン10分、4分間のキシレン、4分間の95%エタノール、4分間のエタノール70%、4分間のエタノール70%、4分間の蒸留水。
  3. 抗体の製造業者の指示に基づいて抗原検索を行う(材料表)。
    1. スライドを特定の抗原検索液をラックに入れ、過熱温度で水浴に沈めます。
    2. お風呂からスライドを取り出し、水道水を流して10分間冷やします。
  4. 内因性ペルオキシダーゼを不活性化するために、RTで20分間、3%H2O2を含む新しいラックにスライドを置きます。
  5. 新しいラックにスライドを配置し、TBSとTween 20(TBST)の0.1%で3xを洗浄します。
  6. PAP ペン (材料表) を使用して、スライドに取り付けられた組織の周囲に疎水性の円を描画します。
  7. 湿気の多いチャンバーにスライドを配置し、ブロッキング溶液としてTBSTで5%ウシ血清アルブミン(BSA)を使用してRTで1時間ブロッキングを行います。
  8. 湿気の多いチャンバーで一次抗体(材料テーブル)を用いてスライドを4°Cで一晩インキュベートする。推奨されるブロッキング溶液で一次抗体を希釈します。
  9. スライドを新しいラックに入れ、TBST で 3x を洗浄します。
  10. 湿度の高いチャンバーのRTで30分間、特定の二次抗体(抗マウスまたは抗ウサギ)(1スライドで4−5滴)でスライドをインキュベートします。
  11. スライドを新しいラックに入れ、TBSTで3xを洗浄し、蒸留水で洗浄します。
  12. 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液を希釈緩衝液1mLに1滴希釈して調製する(材料表)。インキュベートスライドは、顕微鏡下で最大5分のチェックのためにスライドします。
  13. 顕微鏡下での反応の発達に従ってインキュベーション時間を計算するには、陽性対照を用いる。
    注:各抗体は、特定のインキュベーション時間を必要とします。
  14. 不活性DAB(染色物質沈殿を停止する)を、蒸留水中にスライドを沈めることで行う。
  15. 10sのためのヘマトキシリンと新しいラックにそれらを浸漬し、水道水でリンスすることにより、スライドをカウンターステイン。
  16. スライドをラックに入れ、次の手順を実行します:4分間のエタノール70%、4分間のエタノール70%、4分間の95%エタノール、4分間の95%エタノール、10分間のキシレン、10分間のキシレン。
  17. シールスライドは、各ティッシュスライドに取り付け媒体(材料のテーブル)の滴を入れて、カバースリップでカバーします。
  18. 余分な媒体と気泡を組織から離れ、カバースリップと空気乾燥から外に移動させるために、カバースリップに圧力をかけます。
  19. 専門家の病理学者と逆顕微鏡下で染色結果を評価し、スコア付けする。
    注:スコアリングシステムは、文献の情報が既に存在する可能性がある特定の抗原に依存します。文献に情報が得られなかった場合は、正常組織における抗原の発現を参考にしてスコアリングシステムを導出する。

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Representative Results

スタディ ワークフローを図 1に示します。409個の癌関連遺伝子のコード配列を標的とする5つのSPN症例のマルチ病変(n=13)シーケンシングは、8遺伝子で合計27個の体系変異を同定した(CTNNB1、KDM6A、BAP1、TET1、SMAD4、TP53、 FLT1、およびFGFR3)。突然変異は、所定の患者のすべての病変の間で共有された場合の創設者/クローン、および特定の患者の一部の病変で検出された場合の進行/サブクローンとして定義された(図5A,B)。全体として、コホート全体で同定された点突然変異の大部分はクローン事象であり、これにはCTNNB1、KDM6A、TET1、FLT1の変異が含まれていた。 一貫して、β-カテニン(CTNNB1のタンパク質産物)およびKDM6Aに対する免疫ヒスト化学的染色は、対応する遺伝子の変異を有する症例の多様な病変の中で均質であった(図6A,B)。変異した検体におけるKDM6Aの適度な染色は、遺伝子改変がタンパク質発現ではなく機能を変化させる可能性が高いことを示唆した。膵腫瘍におけるKDM6A機能の喪失は、低酸素マーカーGLUT18のアップレギュレーションに関連しており、それに応じてGLUT1はKDM6A突然変異を有する症例において過剰発現した(図6C)。サブクローナル突然変異はBAP1、SMAD4、TP53、およびFGFR3に影響を及ぼすことが判明した。 BAP1およびTP53の免疫ヒストケミストリーは、これらの遺伝子の変異がサブクローナルであることを確認した(図6D,E)。コピー数変動(CNV)解析はシーケンシングデータを用いて行い、図7Aに示すように分析されたすべての検体の変化を明らかにした。点突然変異とは異なり、CNV改変の大部分はサブクローナルであった(図7B)。

Figure 1
図1:転移性病変に対して行われた分析のフローチャートこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:正常組織および腫瘍組織の代表的な組織学。
(A, B)腫瘍組織(T)は正常組織に隣接する(N)。これら2つの組織切片では、腫瘍および正常組織は、別々の、十分に閉じ込められた領域として識別可能である。(C)正常膵細胞のクラスター(N*)は、腫瘍組織(T)内に埋め込まれたものとして見ることができる。(D)正常膵臓組織の形態。スケール バーは 1 mm を表します。

Figure 3
図3:ライブラリ調製および定量プロトコルステップの概略フローチャート

Figure 4
図4:イオン陽子チップのロードと実行
(A) チップクランプ内のチップ方向と配置(左)。メタルタブバック交換(右)。(B) 2つの異なるチップローディングにおけるライブラリの密度を表示するヒートマップ。ライブラリのクローン増幅が成功したための良好な積載密度(上)の例は、シーケンシング粒子(1億3900万読み取り、自動品質フィルタリング後の最終出力9,000万読み取り)を伴うチップ表面の94%の負荷をもたらしました。ライブラリの非効率的なクローン増幅による不良なローディング(底部)の例は、シーケンシング粒子(5900万読み取り、自動品質フィルタリング後の最終出力1,200万読み取り)を伴うチップ表面の40%の負荷をもたらす結果である。

Figure 5
図5:転移性病変における体性変化
(A)一致した一次/転移性病変で同定された体性突然変異。(B)全ての体性突然変異は、すべての病変(創設者/クローン)と1つ以上で検出されたが、特定の症例(進行/サブクローナル)の全ての検体で検出されたものを含む、ケースごとに表示される。1症例当たりに配列された個々の転移病変(m)の数が示される。この数字はアマトら8から再出版されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:一次および転移性病変におけるβ-カテニン、KDM6A、GLUT1、BAP1およびTP53に対する免疫染色。
(A)CTNNB1のSPN耐性変異から全検体(一次および転移性)におけるβ-カテニンの核蓄積を示す代表的な免疫局化学的画像(B)からの病変の免疫ヒスト化学的染色KDM6Aの転移性SPNベアリングクローン変異。(C)KDM6A突然変異を有する1つのSPNにおけるGLUT1の過剰発現は、一方、野生型組織では免疫反応性は認められなかった。(D, E)BAP1およびTP53発現データは、これら2つの遺伝子における突然変異がサブクローナルであることを示す。スケールバーは100μmを表し、差し込み倍率は600Xです。この図はアマトら8から改変された。

Figure 7
図7:転移性病変における体学的コピー数の変化
(A) 仮想核型ビューは、代表的な症例における改変遺伝子の位置、近接性およびコピー数の状態を示す。染色体バンドの配色スキームは、黒と灰色= ギムサ陽性、明るい赤=セントロメア、紫=可変領域です。変更は、図に示す色コードに従って示されます。省略形: CNV、コピー数のバリエーション。P、 プライマリ SPN;L(a-c)、肝転移。(B)全体学的変化(CNVの影響を受ける遺伝子)は、すべての病変(創設者/クローン)と、所定の症例(プログレッサー/サブクローナル)の検体の1つ以上(すべてではない)で検出されたものの間で共有される変化を含む、1症例ごとに表示される。1症例当たりに配列された個々の転移病変(m)の数が示される。この数字はアマトら8から再出版されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

我々の方法は、特定の患者の異なる病変から垂直データ(すなわち、形態、DNAシーケンシング、免疫ヒスト化学)の統合を通じて固形腫瘍の進行に関与する分子変化の同定を可能にする。409のがん関連遺伝子8のコード配列を調問することにより、変異サイレント腫瘍型(すなわち、SPN、膵臓の固体偽毛細血管新生物)におけるクローンおよびサブクローナル事象を検出する方法を実証した。ここで使用されるアンプリコンベースのターゲットシーケンシングアプローチの利点は、カバレッジの均一性(90%のターゲットベースは100xをカバーし、95%は20倍)の範囲で、尋問対象地域(15,992)全体で、典型的な平均カバレッジ深度1000xです。マイクロディセクションを介して新生物細胞濃縮に結合された高い被覆量は、低いアレー周波数イベントの検出のための高い感度を保証します。前に示したように、標的シーケンシングアプローチは、FFPE組織からのDNAサンプル上の2%のアle周波数までの突然変異の検出を可能にします。一例として、本研究では転移標本におけるサブクローナル事象として4%対立遺伝子周波数TP53ミスセンス変異を同定することができ(図5)、免疫ヒストケミストリーによりこの事象を検証した(図6)。我々のプロトコルは、体細胞事象を同定し、それに応じて癌のみのパイプライン10のサブクローナル突然変異の誤検出率を減少させるために、一致した腫瘍および生殖細胞DNAのシーケンシングを想定する。一致した生殖細胞系DNAが利用できない場合、カバレッジの最小深度に基づく厳格なフィルタや「ホットスポット突然変異」を呼び出すバリアントの制限など、シーケンシングデータの分析において、より保守的なパラメータを採用することを検討する場合があります。使用可能なデータベースで広範囲にアトネアされた突然変異。一致した腫瘍と一緒に生殖細胞系列DNAをシーケンシングすることは、コピー数変動(CNV)の正確な検出を可能にするという利点もあります。あるいは、性別に一致したジプロイドゲノムのプールは、シーケンシングデータからのノイズを低減し、CNVの検出を容易にするために使用される可能性があります。生殖細胞系DNAの包含に加えて、プライマープールの不均衡を低減し、CNV呼び出しを改善するためにライブラリプロトコルを変更しました。元のプロトコルによると、多重PCRの後に各DNAサンプルから生成された4つのアンプリコンプールを一緒に混合し、残りのステップはサンプルごとに1つのチューブで行われます。ただし、マルチプレックス PCR の効率がチューブによって異なる可能性があるため、プールごとの平均カバレッジ深さの変動が発生します。元のプロトコルでこの影響を説明するプールの定量化/正規化手順はありませんでした。上記の変動を避けるために、4 つのアンプリコン プールのそれぞれをライブラリプロダクションプロトコル全体で分離し、定量化することにしました。定量化時に、各DNAサンプルの4つのプールのそれぞれを最終的なライブラリプールに追加することができ、最終的な平均カバレッジが可能な限り均一であることを確認できます。

遺伝的レベルでの腫瘍内不均一性(ITH)の評価は重要な臨床的意味を有するが、同様に新たな課題をもたらす2.大きな課題は、ドライバーの突然変異と確率的事象(乗客の突然変異)を区別する必要性です。ドライバー乗客の突然変異の違いは、多くの場合、計算上達成されますが、バイアスがないわけではありません。検出された変異体の系統的機能化はコストと時間がかかるが、遺伝的変異体の機能的結果は、少なくとも遺伝子のサブセットに対して、対応するタンパク質の免疫ヒスト化学的分析によって、または間接的に、タンパク質機能障害の代理マーカーの発現を測定することによって。当社のプロトコルは、臨床設定における材料の主要な供給源を表すFFPE組織に適用され、シーケンシングのための課題を提起しています。単離された核酸の品質は、シーケンシング11の前に常に評価されるべきである。ターゲットシーケンシングは、計算要件の面で費用対効果が高く、非常に要求の厳しくないという大きな利点がありますが、ゲノムの限られた部分のみを問い合わせるという大きな欠点があり、過小評価につながる可能性があります。腫瘍内不均一性。さらに、このアプローチは、特定の腫瘍タイプ4、12における遺伝的差異を上回ることを最近示されている転移および原発腫瘍との間の関連するエピジェネティックおよび転写学的差異を考慮していない。 13.しかし、技術の進歩は、ITHのより良い評価のために、より豊かな垂直データアンサンブルの統合をすぐに可能にすることを想像するでしょう。私たちのアプローチは、適切なSNVベースの系統を構築する能力を制限するゲノムの物理的なカバレッジよりも深さを好みます。しかし、我々の方法は、分子と組織病理学的分析の統合による適切な感受性および特異性を有する臨床検体における遺伝的関連性を探求する機会を提供する。特定の腫瘍タイプ(例えばSPN)にこのプロトコルを適用し、この方法が他の固形腫瘍タイプでも同様に機能すると予測しました。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

この研究は、イタリアのがんゲノムプロジェクト(グラント番号)FIRB RBAP10AHJB), アソシアツィオーネ イタリアナ リケルカ カンクロ (AIRC;ASにNo.12182を付与し、18178をVCに付与し、FP7欧州コミュニティ補助金(カムパックNo 602783からAS)。資金調達機関は、データの収集、分析、解釈、または原稿の執筆に何の役割も持っていませんでした。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies G2939BA  Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit Fisher Scientific NC9959336 Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4627 Library quantification
Anti-BAP1 Santa Cruz Biotechnology sc-28383 Antibody
Anti-GLUT1 Thermo Scientific RB-9052 Antibody
Anti-KDM6A Cell Signaling #33510 Antibody
Anti-p53 Novocastra NCL-L-p53-DO7 Antibody
Anti-βcatenin Sigma-Aldrich C7207 Antibody
Blocking Solution home made - 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution home made - 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra Leica 70937891 Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1 Leica Biosystems AR9961 Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2 Leica Biosystems AR9640 EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear Eppendorf 951010006 Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021 Tubes
Ethanol DIAPATH A0123 IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H­4000 Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Laboratories SK­4105 HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7401­50 Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7402­50 Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV) Broad Institute - https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Thermofisher Scientific 4477685 Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermofisher Scientific 4480441 Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument Thermofisher Scientific 4484177 Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip Thermofisher Scientific A26771 or A27766 Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef Thermofisher Scientific A27198 or A30011 Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit Thermofisher Scientific A26433 or A30011 Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System Thermofisher Scientific 4476610 or A38196 Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair Thermofisher Scientific 4487118 Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin Thermofisher Scientific 4487118 Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit Thermofisher Scientific 4474517 Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermofisher Scientific ND-2000 DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity Fisher Scientific 12532-016 or 12532-024 SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit Quiagen 51106 0r 51104 DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue Quiagen 56404 DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer Thermofisher Scientific Q32866 DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermofisher Scientific Q32850 Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST home made - Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film Sakura Europe 6172 Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software EMBI-EBI - http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres Carlo Erba 492306 IHC deparaffinization reagent

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References

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目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析
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Cite this Article

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).More

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