Summary
Rahim kasılmaları dişilerin refahı için önemlidir. Ancak, patolojik olarak artan kontraktilite dismenore neden olabilir, özellikle genç kadınlarda. Burada, dismenore tedavisinde kullanılabilecek düz kas gevşeticilerin etkinliğinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan basit bir ex vivo hazırlık tarif ediyoruz.
Abstract
Dismenore, ya da ağrılı kramp, kadınlarda adet ile ilişkili en yaygın belirti ve şiddeti kadınların günlük yaşamlarını engelleyebilir. Burada, rahim kontraktilliğini azaltan yeni ilaçların test edilmesinde etkili olacak kolay ve ucuz bir yöntem salıyoruz. Bu yöntem, oksijenli Krebs tampon içeren bir Petri kabında ex vivo muhafaza zaman spontan hareketlilik sergilemek için tüm fare üreme yolu benzersiz yeteneğini kullanır. Bu spontan hareketlilik insan rahminin endometrial dalgalar olarak adlandırılan dalga benzeri miyomsal aktivitesine benzer. Yöntemin etkinliğini göstermek için, biz iyi bilinen bir rahim gevşetici ilaç istihdam, epinefrin. Bu Petri çanak modelinde fare üreme yollarının tamamının spontan hareketliliğinin 1 μM epinefrin tarafından hızlı ve geri döndürülebilir. Rahim motilitesi değişiklikleri belgeleme kolayca sıradan bir akıllı telefon veya sofistike bir dijital kamera kullanılarak yapılabilir. Rahim boynuzu hareketlerinin hızını ölçerek spontan rahim hareketliliği değişikliklerini ölçmek için hareket izlemesağlayan MATLAB tabanlı bir algoritma geliştirdik. Bu ex vivo yaklaşımın önemli bir avantajı, üreme yolu tüm deney boyunca bozulmadan kalır, tüm içsel intrauterin hücresel etkileşimleri koruyarak. Bu yaklaşımın en önemli sınırlaması, uterusun %10-20'sine kadar spontan hareketlilik gösteremeyebileceğidir. Şimdiye kadar, bu petri çanak modelinde spontan rahim motilitesini değerlendirmek için ilk kantitatif ex vivo yöntemidir.
Introduction
Önemli bir kadın organı olarak, rahim üreme için çok önemlidir vefetusun beslenmesi için gerekli 1. Rahim üç tabakadan oluşur: perimetrium, miyometrium ve endometrium. Miyometrium rahimin en önemli kontraktil tabakasıdır ve fetusun doğumda önemli bir rol oynar. Endometrium rahim boşluğunu kaplayan en içteki tabakadır ve embriyo implantasyonu için gereklidir. Üreme çağındaki gebe olmayan kadınlarda, endometrial tabaka adet döngüsünün başlangıcında aylık olarak dökülür. Nekrotik endometriyal dokuyu rahimden temizlemek için gerekli spontan miyomtriyal kasılmaları koruyarak bu dökülme sürecinde miyometrium yardımcı olur1.
Ne yazık ki, artan miyomtriyal kontrility gibi olumsuz yan etkilere neden olabilir, veya ağrılı adet krampları. Bu özellikle genç kadınlarda ve nulliparous kadınlarda görülür2. Ancak, dismenore her kadın için farklıdır ve miyomtriyal kasılmaları gücüne bağlıdır; güçlü kasılmalar genellikle şiddetli kramp hissi ile ilişkilidir3. Miyomtriyal kontrility rahim ultrasonu ile görselleştirilebilir ve genellikle endometrial dalgalar olarak kabul edilir. Endometriyal sloughing geçiren bir rahim4 adet sırasında prostaglandinlerin geliştirilmiş salınımı artmış miyomtriyal hiperkontilite katkıda, rahim kası iskemi ve hipoksi ile sonuçlanan ve böylece artmış ağrı3.
Şiddetli dismenore bazı kadınların günlük aktivite engelleyebilir ve kadınların% 3-33 çok şiddetli ağrı var, hangi bir kadın için yatalak neden olabilir 1 için 3 gün her adet döngüsü5. Dismenore ne olursa olsun yaş, milliyet ve ekonomik durumu5üreme çağındaki kadınlarda jinekolojik morbidite önde gelen nedenidir. Dismenore tahmini yaygınlığı hem yüksek hem de değişkendir, üreme çağındaki kadınlarda %45 ile %93 arasında değişmektedir5. Dismenore ilişkili ağrı kadınların günlük yaşam üzerinde bir etkisi vardır ve ergenlerde kötü akademik performans neden olabilir, uyku düşük kalite, günlük aktivite kısıtlaması, ve duygudurum değişiklikleri5.
Şiddetli dismenore deneyimi birçok kadın ağrılarını hafifletmek için over-the-counter ilaçlar başvurmak. Bu tür over-the-counter ilaçlar siklooksijenaz içeren (COX) prostaglandins oluşumunu önlemek inhibitörleri6. Ancak, COX inhibitörleri olumsuz kardiyovasküler olaylar ile ilişkilidir, ve dismenore olan kadınların yaklaşık% 18 bu inhibitörleri yanıt vermiyor7. Bu nedenle, adet krampları azaltmak için yeni ilaçlar için bir ihtiyaç vardır. Rahim kontrility üzerinde dismenore patogenezi katkıda olduğundan, olası bir strateji rahim gevşetici kullanımı olabilir.
Bu doğal olarak meydana gelen spontan miyomtriyal dalga benzeri kasılmalar bir model potansiyel gevşetici ilaçların etkilerini ölçmek için yararlıdır. Ancak, şimdiye kadar, bozulmamış rahim kas rahatlatıcı ilaçlar test etmek için hiçbir etkili ex vivo yöntemi tarif edilmiştir. Şu anda, isometrik gerilim ölçümleri gevşetici ilaç etkilerini değerlendirmek için kullanılır. Bu ölçümler sırasında, rahim kas şeridi bir doku banyosunda ön yük altında sabit bir uzunlukta tutulurken, rahim kas kasılmaları kuvveti gevşetici bir ilacın varlığında veya yokluğunda oksitosin stimülasyonundan önce ve sonra kaydedilir. Bu yaklaşım çok yararlı olmasına rağmen, pahalı ekipman gerektirir. Ayrıca, isometrik kasılmalar doğal olarak bozulmamış rahim meydana spontan miyomtriyal dalga benzeri kasılmalar benzemez. Benzersiz, kemirgenler rahim miyomtrial dalgalar tüm üreme yolu (yumurtalıklar, yumurtalıklar, rahim ve vajina) bir tampon çözeltisi muhafaza edildiğinde rahim boynuzu hareketliliği olarak görselleştirilmiş olabilir. Burada, oksijenli Krebs tamponiçeren bir Petri kabına yerleştirilen sağlam fare rahminin spontan hareketliliğini izlemek için bir ex vivo yöntemi salıyoruz. Ayrıca MATLAB hareket izleyicisini kullanan bir hareketlilik nicelik algoritması tanımlıyoruz. Bu yeni yaklaşım doğal ilaçlar ve sentetik bileşiklerin rahatlatıcı potansiyelini test etmek için kolay ve daha az pahalı bir alternatif sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki (Indianapolis, IN) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Çalışmada 2-5 aylık F2-129S-C57BL/6 cinsel olgun kadın fareler kullanıldı.
DİkKAT: Hayvanlar ve biyolojik tehlikeli maddelerle çalışırken laboratuvar önlüğü, maske ve eldiven giyerek güvenliği sağlayın.
1. Çözüm Hazırlama
- 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.2 mM NaH2PO4, 0.56 mM MgCl2, 25 mM NaHCO3ve 5 mM glikoz, pH 7.4 içeren Krebs Tampon hazırlayın. Krebs tamponuna %5 CO2 ve %95 O2 içeren sıkıştırılmış gazların karışımıyla sürekli oksijen lendirin ve sirkülasyon lu su banyosu kullanarak 37 °C'de tampon sıcaklığını koruyun.
- 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, 136.89 mM NaCl ve 8.1 mM NaCl, ve 8.1 mM Na2HPO4, pH 7.4içeren Dulbecco Fosfat-Tamponlu Salin (DPBS) hazırlayın.
2. Hayvan Hazırlığı
- Isofluran inhalasyonu kullanarak fareleranestezi (%3) atık gaz atma ile. Çekilme reflekslerini değerlendirerek yeterli anesteziyi sağlayın. Herhangi bir hareket ortaya olduğunu doğrulamak için arka ayak çim çimdik, refleks yanıtları kaybı gösteren. Derin anestezi sağlandıktan sonra, decapitation tarafından hayvan ötenazi.
NOT: Isofluran düz kas genişlemesine neden olabilir. Bu nedenle, üreme yolu hazırlığı ex vivo deneylere başlamadan önce krebs tamponunda en az 15-30 dakika boyunca yoğun olarak yıkanmalı ve kuluçkaya yatırılmalıdır. Isoflurane cilt ile temas halinde tahriş ve rahatsızlık neden olabilir, bu yüzden dikkatli devam edin. - Bir kağıt havlu ile kaplı büyük bir tartma tekne üzerinde vücut yerleştirin.
NOT: Gebe kadın laboratuvar personeli, fetal ağırlığı azaltabildiği, fetal iskelet kemikleşmeyi azaltabileceği ve spontan abortus riskini artırabileceği nden isofluran ile deneylere katılmamalıdır8,9. CO2 inhalasyonu farelerin ötenaziiçin bir yedek olarak kullanılabilir.
3. Estrous Döngüsü Evresinin Belirlenmesi
- Küçük forsepslerle, vajinal ostiuma erişmek için klitorisi kaldırın ve vajinaya 10 μL DPBS içeren bir mikropipet ucu yavaşça takın.
- Vajinal duvarı delmemek için mikropipet ucunun ostiumdan 10 - 30° bir açıyla yerleştirildiğinden emin olun. Sıvı yerleştirildikten sonra uçta görünmeye devam etmelidir. Sıvı görünmüyorsa, ucu vajinaya çok fazla yerleştirilir ve vajinanın paraservikal alanı delikli olabilir.
- Hafifçe vajinadan çıkmak için hava sağlamak için mikropipet ucu ile vajinal ostium kasları aşağı çekin.
- 10 μL DPBS ile 2-3 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak vajinal boşluğu yavaşça temizler ve çekilen hücre süspansiyonuna cam bir kaydırak yerleştirin.
- Sitolojik analiz yoluyla estrous döngüsü aşamasını belirlemek için ters faz kontrast mikroskobu kullanın. Prosedür başka bir yerde açıklandığı gibi yapılır10,11. Sitolojik analiz yapılmadan hücre süspansiyonunun kurumadığından emin olun. Süspansiyon gerekirse taze DPBS ile seyreltilebilir.
4. Fare Üreme Yolu Disseksiyonu
- Bir supine pozisyonda fare düzenleyin ve abdominopelvik bölge ortaya çıkarmak için ekstremiteleri yayıldı.
- Abdominopelvik bölgeyi nemlendirmek ve dezenfekte etmek için %70 etanol ile püskürtün.
- Forseps kullanarak, klitorisüstün bulunan cildi dikkatlice kaldırın. Alt karın bölgesinin lateral yönleri üzerinde küçük enine kesiler yapın, üst ekstremitelere kadar periton ortaya çıkarmak için (Şekil 1A). Bu işlem sırasında harici bir flep oluşur. Küçük kesiler sürekli olarak yapıldıkça flep boyutu artacaktır.
- Gastrointestinal sistemi ortaya çıkarmak için peritondan dikkatlice kesilir (Şekil 1B). Bu rahim boynuzları genellikle periton altında doğrudan yer olabilir dikkat etmek önemlidir, bu yüzden dikkatli kesiler yapmak ve bu rahim motilitesi etkileyebilir gibi boynuzları dokunmayın.
- Forceps kullanarak, fasya ve gastrointestinal sistemi kapsayan yağ dokusu kaldırın. Aşağıdaki gastrointestinal sistem segmentlerini karın boşluğundan çıkarın: duodenum, jejunum, ileum, çekum, yükselen ve enine kolon (Şekil1C).
- Üreme organlarını bulmak için, önce ötanazi sonrası boşluk nedeniyle sönmüş bir görünüme sahip olabilecek idrar kesesini (Şekil1C, "4") tanımlayın. Vajina idrar kesesi altında olacak.
- Kasık kemikleri (caudally mesane) kesiştiği de kasık symphysis bulun.
- Makas kullanarak, girdap fibrokardik doku yoluyla lateral yanlarında dikkatlice kesiler yaparak kasık symphysis kaldırmak ve vajina ekstraksiyon için bir yol sağlamak (Şekil1D).
- Vulvanın anüs ve alt kısmı arasında bulunan perineyi kesin.
- Forseps kullanarak, vajina kaldırın ve yavaş yavaş rektum çıkarmak.
- Bir çatal içine çatal içine çataliki rahim boynuzları tanımlayın, vajina ya rostrally. Kalan gastrointestinal sistem segmentleri altında gizli olabilir her boynuz sonunda bir kıvrık oviduct ve yumurtalık bulun. Karın boşluğu içinde boynuzları, oviducts ve yumurtalıklar bağlamak ve desteklemek herhangi bir bağ kaldırmak için küçük diseksiyon makas kullanın.
- Vajina, rahim, oviducts ve yumurtalıklar içeren üreme yolu, karın boşluğundan çıkarın.
- İzole üreme yolunu (Şekil1E) 10 mL DPBS ile doldurulmuş 100 mm Petri kabına aktarın. Miyometriuma zarar vermemek için rahim boynuzlarını sıkıştırmayın.
- Tervenat boynuzları ve vajina çevreleyen herhangi bir bağ ve yağ dokusu yanı sıra görüntü kalitesini engelleyebilir kasık bölgesinde herhangi bir kürk kaldırmak için forceps ve cerrahi makas kullanın. Rahim boynuzları hareketlilik sağlamak için geniş bağ kaldırın.
- İzole üreme yollarını taze DPBS ile iki kez yıkayın ve 3 mL oksijenli Krebs çözeltisi ile dolu 35 mm Petri kabına aktarın.
5. Doku Görüntüleme
- Üreme sistemi içeren Petri kabını oksijenli Krebs tamponuna siyah bir yüzeye yerleştirin. Çanak oda sıcaklığında muhafaza edin.
NOT: 37 °C'de dokuyu korumak için kızılötesi ısınma yastığı kullanmak mümkündür. - Spontan kasılmalar başlamak için 15-30 dk bekleyin. Herhangi bir dijital video ekipmanı kullanarak eksenel bir uçaktan 10 dakika boyunca spontan rahim hareketliliğini kaydedin.
- Bir test bileşiği ile desteklenen oksijenli Krebs tampon içeren bir Petri kabına hazırlık aktarın. Herhangi bir dijital video ekipmanı kullanarak eksenel bir uçaktan yaklaşık 10 dakika boyunca spontan rahim hareketliliğini kaydedin.
- Tedavinin geri döndürülebilirliğini değerlendirmek için tüm üreme yollarını 100 mm Petri kabında 10 mL DPBS ile yıkayın.
- Taze oksijenli Krebs tamponu ile bir Petri kabına hazırlık aktarın. Herhangi bir dijital video ekipmanı kullanarak eksenel bir uçaktan yaklaşık 10 dakika boyunca spontan rahim hareketliliğini kaydedin.
- Spontan rahim motilitesinde mekanik olarak indüklenen değişiklikler olmadığından emin olmak için, preparatı test bileşiği için araçla birlikte oksijenli Krebs tamponuyla dolu başka bir 35 mm Petri kabına aktarın. Bu önemli bir kontrol.
- Video görüntülerini bilgisayarın sabit diskine aktarın.
6. Veri Analizi
- Orijinal video görüntülerindeki kontrol, tedavi ve yıkama bölümlerini içeren video düzenleme yazılımLarını kullanarak klipler yapın.
- Spontan rahim hareketliliğini ölçmek için MATLAB yazılımını ve sağlanan komut dosyasını (çevrimiçi Ek malzemeye bakın) kullanın.
NOT: Komut dosyasının tam olarak işlevsel olabilmesi için MATLAB için Computer Vision Toolbox eklentisinin yüklenmesi gerekir.- MATLAB komut dosyasını açın, Düzenleyici sekmesine gidin ve Çalıştır'ı tıklatın.
- İlk video dosyasını seçin ve Aç'ı tıklatın.
- Açılan iletişim kutusuna video dosyası için bir etiket girin ve Tamam'ıtıklatın.
- Boynuz hareketinin oranını hesaplamak için gereken zaman aralığını (s) girin (Δ Öklid mesafesi / Δs).
- Videonun ilk karesine iki nokta seçmek için fare imlecini kullanın. Açılır pencere, seçili noktaların izleme için kullanılması gerektiğini doğrulamak ister. Açılan pencerede görüntülenecek gerçek zamanlı izleme işlemini başlatmak için Başlat'ı tıklatın. Alternatif olarak, iki noktayı yeniden seçmek için Noktaları Yeniden Seç'i tıklatın.
- Açılır pencerede izleme işleminin doğruluğunu izleyin.
- Yeni bir açılır pencerede bir oran ve zaman dağılım çizimi ve mesafe vs zaman dağılım çizimi gözlemleyin. Dosya'yı seçerek iki rakamı kaydet | Verileri belgelemek için aynı pencerede Olduğu Gibi'yi kaydedin.
- MATLAB komut dosyasının bulunduğu aynı dizinde, MATLAB tarafından otomatik olarak oluşturulan PointTrackerDataadlı klasörü bulun. İki ayrı çalışma sayfası sekmesinde videodan toplanan veri noktalarını içeren label_Data adlı bir Excel dosyasını tanımlayın.
NOT: Herhangi bir alternatif hareket izleme yazılımı spontan rahim hareketliliğini ölçmek için kullanılabilir.
- İstatistiksel analizi gerçekleştirmek için uygun bir yazılım (örn. Excel veya SigmaPlot 13) kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, bu protokolde açıklanan tüm üreme yolu izolasyon prosedürü sırasında çekilen temsili görüntüleri gösterir. Tamponu kürkle kirletmemek için, video kalitesini düşürecek, fare gövdesini %70 etanol ile nemlendirdik. Protokolün diseksiyon bölümü için en önemli kriter idrar kesesini bulmaktır. Rahim ve vajina idrar kesesi alt yer olacaktır.
Protokolü test etmek için tüm üreme bölgesini epinefrinle tedavi ettik. Epinefrin iyi rahim düz kas gevşemesine neden olduğu bilinmektedir. Bu hormon endojen adrenal medulla üretilen ve memelilerde bir stres hormonu olarak hizmet vermektedir. Deneylerimizde 1 μM epinefrin kullandık. Bu maksimal yanıt12neden olduğu bilinen doyuryan bir konsantrasyondur. Dört deney den oluşan bir dizi yapıldı. Tüm çalışmalarda, 1 μM epinefrin geri döndürülür spontan rahim motilitesi inhibe (Şekil2).
Üreme yollarının spontan hareketliliğini ölçmek için, fare üreme sisteminde seçilen iki nokta arasındaki Öklid uzaklığındaki ortalama değişim oranını değerlendirmemize olanak tanıyan bir algoritma tasarladık. Nokta konumları MATLAB yazılımının hareket izleme modülü kullanılarak izlenir. Öklid mesafelerini hesaplamak için kullandığımız MATLAB için karşılık gelen komut dosyası, Ek malzeme çevrimiçi olarak sağlanır. Puanların konumu başarılı bir hareket izleme yordamı için önemlidir. Petri kabının duvarındaki ışık yansımaları hareket izleyicisinin dikkatini dağıtabileceğinden ve ışıktan birine noktayı yeniden atayarak boynuz hareketini izlemeyi durdurabileceğinden, videoların kalitesine dikkat edilmelidir. Yansımalar. Petri çanak duvar yansımalarından yeterince uzak olduğundan emin olmak için bir kornanın ortasına noktalardan birini yerleştirmeyi seçtik. İkinci nokta genellikle vajinada spontan hareketlilik sergilemediği için seçilmiştir. Şekil 3 veri analizi nin bir örneğini sağlar ve Ek şekil 1 hareket izleme sırasında elde edilen temsili görüntüleri gösterir.
Şekil 1 : Tüm üreme yolu izolasyon adımları. (A) Deride bir kesi yapıldı ve abdominopelvik bölge periton üzerinde maruz kaldı (1). (B) Seröz membran gastrointestinal sistemi ortaya çıkarmak için yavaş yavaş açıldı (2). (C) Gastrointestinal sistem rahim boynuzları ortaya çıkarmak için taşınmıştır (3). İdrar kesesi (4) boynuzları bağlaç yakınında görüntülenebilir. (D) Rahim boynuzları serbest bırakılmış ve vajinayı ortaya çıkarmak için kasık symphysisin (5) yan taraflarında kesikler yapılmıştır (6). (E) İzole üreme yollarının çıkarılması ve DPBS çözeltisine yerleştirilmesi. Herhangi bir aşırı kürk veya bağ dokusu çıkarıldı. (F) Rektum çıkarıldıktan sonra vajinada (sağda) derin bir girintisi görülebilir (sol, 7). (G) Çevredeki bağ dokusu çıkarılır. Bir dijital fotoğraf makinesi ve Application Suite yazılımı (sürüm 3.7.0) diseksiyon sırasında gerçek zamanlı görüntüler elde etmek için kullanıldı (kamera ayarı: ton 20/doygunluk 80). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Tüm izole üreme yolu ile temsili bir deney gösterilir. Görüntüler 1 μM epinefrin uygulamasından önce (A), sırasında (B) ve (C) uygulamasından önce 15 s arayla alınmıştır. Üreme sistemi hazırlığı epinefrin yokluğunda A ve C panellerinde yüksek hareketlilik sergiledi, ancak 1 μM epinefrin varlığı ile B panelinde quiescent olduğunu. Düzenlenmemiş video görüntüleri Ek videolar 1-3olarak sağlanmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : Açıklanan ex vivo deneyinde veri analizi Şekil 2. (A) Öklid mesafe değişim hızının bir zaman seyri gösterilir. Spontan rahim hareketliliği sırasında mesafenin belirlendiği referans noktaları inset'te yeşil noktalar olarak gösterilir. Noktaları vajinanın proksimal kısmında ve tasvir edildiği gibi bir rahim boynuzu orta kesiminde seçildi. Mavi dolgulu daireler epinefrin eklemeden önce spontan hareketlilik oranı değerlerini gösterir, kırmızı daireler 1 μM epinefrin varlığında spontan hareketlilik oranlarını gösterir, ve yeşil dolgulu daireler bir yıkama dan sonra spontan hareketlilik oranlarını gösterir. (B) Epinefrin (mavi çubuk) eklenmeden önce, 1 μM epinefrin (kırmızı çubuk) varlığında ve yıkamadan (yeşil çubuk) sonra ortalama Öklid mesafe değişim oranlarının (piksel/s) karşılaştırılması. MATLAB yazılımı rahim motilitesini ölçmek için kullanılmıştır. Δt aralığı 5 s olarak ayarlanmıştır. "ΔDistance" ilk kare mesafesi ile 5 s sonraki kare mesafesi arasındaki fark olarak hesaplanır. İstatistiksel analiz, SigmaPlot 13 kullanılarak Dunn'S Method'a göre tüm çift yönlü çoklu karşılaştırma prosedürleri nin ardından Sıralar Üzerinde Kruskal-Wallis One Way Analysis of Varyans kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yıldız işareti, diğer deneysel veri kümelerinden önemli ölçüde farklı olan veri kümesini gösterir (P = <0.001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek film 1: 1 μM epinefrin eklemeden önce spontan rahim hareketliliğini gösteren hızlandırılmış video klip. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Ek film 2: Krebs tamponu 1 μM epinefrin ile takviye edildiğinde spontan rahim hareketliliğini gösteren hızlandırılmış video klip. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Ek film 3: Yıkama dan sonra spontan rahim hareketliliğini gösteren hızlandırılmış video klip. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Ek Şekil 1: Hareket takibi sırasında her 15 s'de bir alınan temsili görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı Malzeme: MATLAB tabanlı izleme algoritması komut dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, yumurtalıklar, oviducts, rahim boynuzları ve vajina içeren tüm kemirgen üreme sistemi, spontan kontraktür değerlendirmek için bir yöntem açıklanmıştır. Biz spontan rahim motilitesi üzerinde fenilefrin rahatlatıcı etkisini göstermek için benzer bir yöntem kullanılan13, Ancak, geçmişte biz verilerin kantitatif analizi sağlamak mümkün değildi. Bu çalışmada, MATLAB hareket izleme modüllerini kullanarak nicel hareketlilik veri analizi için bir algoritma geliştirdik. Bu ilaçlar dinlenmek veya rahim düz kasları daraltmak olup olmadığına bakılmaksızın rahim kontraktilitedüzenleyen yeni ilaçlar test etmek için yararlı bir tekniktir. Bu modelin önemli bir avantajı üreme sistemi bozulmamış olmasıdır, tüm içsel intrauterin hücresel etkileşimleri koruyarak. Özellikle, bu protokol herhangi bir özel ekipman gerektirmez. Rahim izolasyonbasit bir büyüteç ile yapılabilir ve herhangi bir sofistike video kayıt ekipmanları için bir gereklilik yoktur. Görüntüleme için yüksek çözünürlüklü bir dijital kamera yoksa, alternatif olarak kişisel bir cep telefonu kamerası kullanılabilir.
Üreme yolu hareketliliğini değerlendirmek için protokolün en kritik adımı canlı rahim dokusu elde etmektir. Miyometrium, rahim boynuzları içinde, üreme yollarının hareketli bir unsurudur. Bu nedenle, izolasyon sırasında boynuzları aşırı germe veya sıkıştırma önlemek için önemlidir. Ayrıca rahim dokusu nun deney boyunca iyi oksijenli olduğundan emin olmak da önemlidir. Rahim boynuzları herhangi bir zarar görmesini önlemek için en iyi yolu rahim temizlik veya üreme sistemi hareket ederken sadece komşu bağ dokusu ile temas yapmaktır. Vajina deney sırasında kendiliğinden basılmadığından, üreme yollarını bir tabaktan diğerine hareket ettirirken onu forceps ile sıkıştırmak kabul edilebilir. Tüm üreme yolu deneyleri, ön yük ve/veya oksitosin kaynaklı rahim kontrülitlüğünü değerlendiren isometrik gerilim kayıtlarıyla birlikte yapılabilir. Ancak, bir tel miyograf her zaman ortak bir laboratuvar ortamında mevcut olmayan ekipman pahalı bir parçadır.
Açıklanan yöntemin birkaç sınırlaması vardır. Miyometrium sıkıştırma veya çeker e çok duyarlı olduğundan, bu üreme yolu diseksiyon sürecini zorlaştırır. Diseksiyon sırasında boynuzlar hasar görmüşse, spontan kontraktür gözlenmez. Bu protokolün önemli bir sınırlamasıdır, çünkü kontraktil düz kas hücrelerinin uygun bakım ve ihtiyat kullanımına rağmen bilmeden hasar görüp görmediğini veya doğal bir nedenden dolayı hareketlilikten yoksun olup olmadıkları belirsizdir. Nitekim bu çalışmada üreme sistemi preparatlarının %10-20'sinde hareketlilik gözlenmemiştir. Vajinanın çıkarılması belirgin rahim boynuzları spontan hareketliliğini azaltır, çünkü üreme yollarının vajinal segment bozulmamış kalır sağlamak önemlidir. Buna karşılık, yumurtalıkların ve/veya oviductların yokluğu tüm üreme yolu hareketliliğini bozmaz. Buna ek olarak, bazı bileşikleroksidasyon duyarlı olduğunu dikkat edilmelidir. Örneğin, epinefrin kolayca oksitlenebilir. Bu tür bileşiklerin etkileri test aşırı oksidasyon önlenmesi daha kısa kuluçka süresi gerektirir. Ancak, daha kısa kuluçka süreleri verimli rahim duvarının kalınlığı nüfuz etmek için bir ilacın yeteneğini engelleyebilir. Yöntemin bir başka sınırlama boynuzları 3 boyutlu hareketleri değerlendirilmesi içerir. Boynuzlar 3 boyutlu bir düzleme kıvrılma doğuştan gelen bir doğaya sahip, analiz karmaşık. Bu sorunun üstesinden gelmek için Petri kabındaki Krebs tampon hacmi 2 mL'ye düşebilir.
Dişi fareler için en uygun yaş aralığının 2-5 ay olduğunu bulduk. İzofluran anestezisinin azalmış motiliteye yol açabileceğini ve bu izoflurankaynaklı komplikasyonu önlemek için ek yıkarlıkların gerekli olabileceğini belirttik. Alternatif olarak, bir fareler ötenazi için karbondioksit kullanabilirsiniz. Diseksiyon sırasında zorluklar ortaya çıkarsa, idrar kesesi gibi simge yapılara odaklanmak yardımcı olabilir. Elde edilen hareketlilik verilerini ölçmek için MATLAB yazılımını kullandık. MATLAB'da hareket takibindeki en büyük sorun, izleyicinin Petri kabının duvarına yaklaştıklarında boynuzları düzgün bir şekilde bulamamasıydı. Adobe Premier Element, video görüntülerini kliplemek ve video dosyalarının boyutunu azaltmak için kullanıldı. Olağanüstü bir yazılım paketi olmasına rağmen, her zaman tipik bir laboratuvar ortamında mevcut olmayabilir. Alternatif bir seçenek ImageJ yazılımının serbest hareket izleme modülü veya aynı aralıklarla alınan görüntülerin hatta basit manuel değerlendirme ve bir segmentasyon ızgara üzerinde rahim boynuzları konumunu karşılaştırarak kullanmak olabilir. Şekil 2 spontan rahim hareketliliğinin basit bir değerlendirmesini gösterir ve 15 s aralığında üreme yolu hareketlerinin karşılaştırılmasını içerir.
Petri kabı ortamında rahim motilitesi değerlendirilen basit bir yöntem şimdiye kadar rapor edilmemiştir. Ultrason ve intrauterin basınç sensörleri insan rahim kontraktility14izlemek için kullanılabilir. Ancak, bozulmamış insan rahminde altta yatan mekanizmaları incelemek zordur. Bu nedenle, spontan rahim kontraktürü araştırmak için hayvan modellerinin kullanımı önemlidir. Kadın üreme sistemi, doğurganlık ve doğum da dahil olmak üzere bir kadının refahı için kritik olan spontan miyomtriyal kasılmalar sergiler15. Bu kasılmalar ultrason muayenesi sırasında endometrial dalgalar olarak görüntülenebilir. Ancak, adet sırasında, rahim kontrüzyon üzerinde rahatsızlık oluşturabilir ve dismenore yol açabilir, veya adet krampları. Dismenore bazı belirtileri hafifletmeye yardımcı olmak için, rahim düz kasları rahatlatıcı hedefleyen yeni ilaçlar gereklidir. Bizim basit yöntem rahim kontraktür çeşitli bileşiklerin etkilerini değerlendirmek için bir yol sağlar.
Bu çalışmada, biz epinefrin etkinliğini onaylamak için kolay Petri çanak modeli kullanılır, bir rahim gevşetici hormon12, izole fare üreme yollarının spontan rahim hareketliliğini önlemek için. Yöntemimiz aynı zamanda rahim inkişkinliğini artırabilir gibi bileşiklerin test etmek için kullanılabilir. Daha da önemlisi, bu yöntem altı kuyulu plaka formatı kullanılarak üretim uyuşturucu taraması için yükseltilme potansiyeline sahip olabilir. Bu nedenle, burada sunduğumuz yöntem endüstriyel ölçekli tarama prosedürleri için optimize edilebilir yeteneğine sahip olabilir. Daha büyük kemirgenlerde benzer deneyler yapmaya çalışmadık, ancak izole edilmiş sıçan uterusunda da benzer spontan hareketliliğin olacağını ugörüyoruz. Sıçanların büyük üreme sistemi daha belirgin rahim hareketliliği sergileyebilir. Biz hamile fare uteri de bu ex vivo uterin motiity Petri çanak modeli kullanılarak değerlendirilebilir bulundu. Beklendiği gibi, gebe rahim spontan hareketlilik bir quiescent durumda olduğu için azaltıldı. Ancak fetal doku tarafından eklenen artan ağırlık da hareketlilik tıkanıklığına katkıda bulunabilir. Yine de daha fazla tocolitic etkisini değerlendirmek için tüm üreme yolu modelinin uygunluğunu keşfetmek için yararlı olabilir (gevşetici) veya rahim (uyarıcı) gebelik ve emek bağlamında bileşikler. Böylece, burada bozulmamış üreme yollarının spontan hareketliliğini değerlendirmek için kolay bir ex vivo modeli sundu. Bu yaklaşım uyuşturucu taraması için benimsenebilir ve yeni uyuşturucu keşfi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma iç IU fonları tarafından desteklenmiştir. AGO çalışma gebe. XC ve AGO açıklanan deneylerin tasarımında yer aldı. FL ve AGO verileri analiz etti ve yorumladı. KLL, JOB, FL tüm ex vivo deneylerini gerçekleştirdi. FL MATLAB komut dosyası yazdı. KLL, Eyüp ve AGO el yazması yazdı. Tüm yazarlar makalenin son halini okudu ve onayladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2- 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
- Kuijsters, N. P. M., et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).
- Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls. Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).
- Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study. Journal of education and health promotion. 7, 3 (2018).
- Lindner, H. R., et al. Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus. Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).
- Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. Dysmenorrhea and related disorders. F1000 research. 6, 1645 (2017).
- Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea. The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751 (2015).
- Oladosu, F. A., et al. Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea. American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91 (2018).
- Lawson, C. C., et al. Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion. American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).
- Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. Fetal development in mice exposed to isoflurane. Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).
- Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus. Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).
- Chen, X., et al. Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling. Scientific reports. 8 (1), 11666 (2018).
- Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus. PLoS One. 12 (3), 0173452 (2017).
- Crane, L. H., Martin, L. Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy. Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).
