Summary
Las contracciones uterinas son importantes para el bienestar de las hembras. Sin embargo, el aumento patológicamente de la contractilidad puede resultar en dismenorrea, especialmente en las hembras más jóvenes. Aquí, describimos una preparación ex vivo simple que permite una evaluación rápida de la eficacia de los relajantes musculares lisos que se pueden utilizar para el tratamiento de la dismenorrea.
Abstract
La dismenorrea, o calambres dolorosos, es el síntoma más común asociado con la menstruación en las mujeres y su gravedad puede obstaculizar la vida cotidiana de las mujeres. Aquí, presentamos un método fácil y barato que sería instrumental para probar nuevos fármacos disminuyendo la contractilidad uterina. Este método utiliza la capacidad única de todo el tracto reproductivo del ratón para exhibir motilidad espontánea cuando se mantiene ex vivo en una placa Petri que contiene tampón Krebs oxigenado. Esta motilidad espontánea se asemeja a la actividad miometrial similar a una onda del útero humano, conocida como ondas endometriales. Para demostrar la eficacia del método, empleamos un conocido medicamento relajante uterino, la epinefrina. Demostramos que la motilidad espontánea de todo el tracto reproductivo del ratón puede ser inhibida de forma rápida y reversible por 1 m de epinefrina en este modelo de plato Petri. Documentar los cambios de la motilidad uterina se puede hacer fácilmente usando un teléfono inteligente ordinario o una sofisticada cámara digital. Desarrollamos un algoritmo basado en MATLAB que permite el seguimiento del movimiento para cuantificar los cambios espontáneos de motilidad uterina midiendo la velocidad de los movimientos del cuerno uterino. Una ventaja importante de este enfoque ex vivo es que el tracto reproductivo permanece intacto durante todo el experimento, preservando todas las interacciones celulares intrauterinas intrínsecas. La principal limitación de este enfoque es que hasta el 10-20% de los úteros puede no presentar motilidad espontánea. Hasta ahora, este es el primer método cuantitativo ex vivo para evaluar la motilidad uterina espontánea en un modelo de plato Petri.
Introduction
Como un órgano femenino importante, el útero es crucial para la reproducción y esencial para la nutrición del feto1. El útero consta de tres capas: perimetrio, miometrio y endometrio. El miometrio es la principal capa contráctea del útero y desempeña un papel clave en el parto del feto. El endometrio es la capa más interna que recubre la cavidad uterina y es esencial para la implantación de embriones. En las mujeres no embarazadas en edad reproductiva, la capa endometrial se desprende mensualmente al comienzo del ciclo menstrual. El miometrio ayuda en este proceso de desprendimiento manteniendo las contracciones miometriales espontáneas necesarias para eliminar el tejido endometrial necrótico del útero1.
Desafortunadamente, aumento de la contractilidad miometrial puede resultar en efectos secundarios negativos como dismenorrea, o calambres menstruales dolorosos. Esto se ve especialmente en las mujeres jóvenes y las mujeres nulosa22. Sin embargo, la dismenorrea es diferente para cada mujer y depende de la fuerza de sus contracciones miometriales; contracciones más fuertes se asocian a menudo con la sensación de calambres graves3. La contractilidad miometrial se puede visualizar mediante ultrasonido uterino y a menudo se reconoce como ondas endometriales. Se cree que la liberación mejorada de prostaglandinas durante la menstruación4 en un útero sometido a desprendimiento de endometrio contribuye a aumentar la hipercontractilidad miometrial, lo que resulta en isquemia e hipoxia del músculo uterino y, por lo tanto, aumenta dolor3.
La dismenorrea grave puede obstaculizar la actividad diaria de algunas mujeres y entre el 3 y el 33% de las mujeres tienen dolormuy intenso, lo que podría causar que una mujer esté en cama durante 1 a 3 días cada ciclo menstrual 5. La dismenorrea es la principal causa de morbilidad ginecológica en mujeres en edad reproductiva independientemente de su edad, nacionalidad y situación económica5. La prevalencia estimada de dismenorrea es alta y variable, oscilando entre el 45% y el 93% en mujeres en edad reproductiva5. El dolor asociado a la dismenorrea tiene un efecto en la vida diaria de las mujeres y puede resultar en un bajo rendimiento académico en adolescentes, menor calidad del sueño, restricción de las actividades diarias, y cambios de humor5.
Muchas mujeres que experimentan dismenorrea grave recurren a medicamentos de venta libre para aliviar su dolor. Estos medicamentos de venta libre contienen inhibidores de la ciclooxigenasa (COX) que previenen la formación de prostaglandinas6. Sin embargo, los inhibidores de la COX están asociados con eventos cardiovasculares adversos, y alrededor del 18% de las mujeres con dismenorrea no responden a estos inhibidores7. Por lo tanto, hay una necesidad de nuevos medicamentos para reducir los calambres menstruales. Dado que la contraetimididad del útero contribuye a la patogénesis de la dismenorrea, una posible estrategia puede ser el uso de relajantes uterinos.
Es beneficioso cuantificar los efectos de los medicamentos relajantes potenciales en un modelo de contracciones espontáneas de ondas miometriales de origen natural. Sin embargo, hasta ahora, no se ha descrito ningún método ex vivo eficiente para probar fármacos relajantes musculares en el útero intacto. Actualmente, las mediciones de tensión isométrica se utilizan para evaluar los efectos del fármaco relajante. Durante estas mediciones, una tira muscular uterina se mantiene a una longitud constante bajo precarga en un baño de tejido, mientras que la fuerza de las contracciones del músculo uterino se registra antes y después de la estimulación de la oxitocina en presencia o ausencia de un medicamento relajante. Aunque este enfoque es muy útil, requiere equipos costosos. Además, las contracciones isométricas no se asemejan a las contracciones espontáneas similares a las ondas miometriales que se producen naturalmente en el útero intacto. De manera única, las ondas miometriales uterinas en roedores se pueden visualizar como motilidad del cuerno uterino cuando todo el tracto reproductivo (ovarios, oviductos, útero y vagina) se mantiene en una solución tampón. Aquí, presentamos un método ex vivo para monitorear la motilidad espontánea del útero intacto del ratón colocado en una placa Petri que contiene tampón Krebs oxigenado. También describimos un algoritmo de cuantificación de motilidad utilizando el rastreador de movimiento MATLAB. Este enfoque novedoso proporciona una alternativa fácil y menos costosa para probar el potencial relajante de remedios naturales y compuestos sintéticos.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana (Indianapolis, IN). En el estudio se utilizaron ratones hembra sexualmente maduros F2-129S-C57BL/6 de 2-5 meses de edad.
PRECAUCION: Garantice la seguridad usando una capa de laboratorio, una máscara y guantes cuando trabaje con animales y materiales biopeligrosos.
1. Preparación de la solución
- Preparar el tampón Krebs, que contiene: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 0,56 mM MgCl2, 25 mM NaHCO3y 5 mM de glucosa, pH 7,4. Oxigenar continuamente el tampón Krebs con una mezcla de gases comprimidos que contienen 5% de CO2 y 95% De2 mientras mantiene la temperatura de tampón a 37 oC utilizando un baño de agua circulante.
- Preparar la salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS), quecontiene: 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4,136,89 mM NaCl y 8,1 mM Na2HPO4,pH 7,4.
2. Preparación animal
- Anestetizar ratones con inhalación de isoflurano (3%) con barrido de gas residual. Asegurar una anestesia adecuada mediante la evaluación de los reflejos de abstinencia. Pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo trasero para afirmar que no se provocan movimientos, lo que indica la pérdida de respuestas reflejo. Después de que se logra la anestesia profunda, eutanasia al animal por decapitación.
NOTA: El isoflurano puede causar dilatación muscular suave. Por lo tanto, la preparación del tracto reproductivo debe lavarse e incubarse ampliamente en el tampón Krebs durante al menos 15-30 minutos antes de comenzar los experimentos ex vivo. El isoflurano puede causar irritación y malestar cuando está en contacto con la piel, así que proceda con precaución. - Coloque el cuerpo en un bote de pesaje grande forrado con una toalla de papel.
NOTA: El personal de laboratorio femenino embarazada no debe participar en experimentos con isoflurano porque puede disminuir el peso fetal, disminuir la osificación esquelética fetal y aumentar el riesgo de aborto espontáneo8,9. La inhalación de CO2 se puede utilizar como sustituto de los ratones de eutanasia.
3. Determinación de la etapa de ciclo de Estrous
- Con pequeños fórceps, levante el clítoris para acceder al ostium vaginal e inserte lentamente una punta de micropipeta que contenga 10 ml de DPBS en la vagina.
- Asegúrese de que la punta del micropipeta se inserta a través del ostium en un ángulo de 10 - 30o para evitar puntuar la pared vaginal. El líquido todavía debe ser visible en la punta después de la inserción. Si el líquido no es visible, la punta se insertó demasiado lejos en la vagina, y el área paracervical de la vagina podría haber sido perforada.
- Tire ligeramente hacia abajo en los músculos vaginales del ostium con la punta de la micropipette para permitir que el aire salga de la vagina.
- Enjuague lentamente la cavidad vaginal pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces con 10 s de DPBS y coloque la suspensión de la célula dibujada en un portaobjetos de vidrio.
- Utilice un microscopio de contraste de fase invertido para determinar la etapa del ciclo estroso a través del análisis citológico. El procedimiento se realiza como se describe en otros lugares10,11. Asegúrese de que la suspensión celular no se seque antes de que se pueda realizar el análisis citológico. La suspensión puede diluirse con DPBS fresco, si es necesario.
4. Desdisección del tracto reproductivo del ratón
- Organizar el ratón en una posición supina y extender sus extremidades para exponer la región abdominopelvic.
- Rocíe con 70% de etanol para humedecer y desinfectar la zona abdominopelvic.
- Con fórceps, levante cuidadosamente la piel que se encuentra superior al clítoris. Hacer pequeñas incisiones transversales en los aspectos laterales de la zona abdominal inferior, hasta las extremidades superiores para exponer el peritoneo (Figura1A). Durante este proceso, se formará una solapa externa. A medida que las pequeñas incisiones se hacen continuamente, la solapa aumentará de tamaño.
- Cortar cuidadosamente a través del peritoneo para exponer el tracto gastrointestinal (Figura 1B). Es importante tener en cuenta que los cuernos uterinos a menudo se pueden ubicar directamente debajo del peritoneo, así que haga incisiones con precaución y no toque los cuernos, ya que esto puede afectar la motilidad uterina.
- Usando fórceps, retire la fascia y el tejido adiposo que cubre el tracto gastrointestinal. Eliminar los siguientes segmentos del tracto gastrointestinal de la cavidad abdominal: el duodeno, el yeyuno, el íleon, el cecum, el colon ascendente y transversal (Figura1C).
- Para localizar los órganos reproductivos, primero identifique la vejiga urinaria (Figura1C, "4"), que puede tener una apariencia desinflada debido al vaciado después de la eutanasia. La vagina estará justo debajo de la vejiga urinaria.
- Localice la sínfisis púbica en la confluencia de los huesos púbicos (caudalmente a la vejiga).
- Usando tijeras, retire la sínfisis púbica haciendo cuidadosamente incisiones en sus lados laterales a través del tejido fibrocartilaginoso interpúbico para obtener acceso y proporcionar una ruta para la extracción de la vagina (Figura 1D).
- Corte a través del perineo situado entre el ano y la parte inferior de la vulva.
- Con fórceps, levante la vagina e exchorele lentamente el recto.
- Identificar dos cuernos uterinos que se bifurcan en un tenedor, rostrally a la vagina. Localice un oviducto y ovario enrevesado al final de cada cuerno, que puede estar oculto bajo los segmentos restantes del tracto gastrointestinal. Use tijeras disecantes pequeñas para eliminar los ligamentos que se conecten y apoyen los cuernos, oviductos y ovarios dentro de la cavidad abdominal.
- Retire el tracto reproductivo, que incluye la vagina, el útero, los oviductos y los ovarios, de la cavidad abdominal.
- Transfiera el tracto reproductivo aislado (Figura1E)a una placa Petri de 100 mm llena de 10 ml de DPBS. No comprima los cuernos uterinos para evitar dañar el miometrio.
- Utilice fórceps y tijeras quirúrgicas para eliminar cualquier tejido conectivo y adiposo que rodea los cuernos uterinos y la vagina, así como cualquier pelaje en la región púbica que pueda dificultar la calidad de la imagen. Retire el ligamento ancho para permitir la motilidad de los cuernos uterinos.
- Lavar el tracto reproductivo aislado con DPBS fresco dos veces y transferirlo a una placa Petri de 35 mm llena de 3 ml de solución de Krebs oxigenado.
5. Imágenes de tejidos
- Coloque la placa Petri que contiene el tracto reproductivo en un tampón Krebs oxigenado sobre una superficie negra. Mantenga el plato a temperatura ambiente.
NOTA: Es posible utilizar una almohadilla de calentamiento por infrarrojos para mantener el tejido a 37 oC. - Permita que comiencen 15-30 min para que comiencen las contracciones espontáneas. Registre la motilidad uterina espontánea durante 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de vídeo digital.
- Transfiera la preparación a una placa Petri que contenga el tampón Krebs oxigenado complementado con un compuesto de prueba. Registre la motilidad uterina espontánea durante unos 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de vídeo digital.
- Lavar todo el tracto reproductivo en una placa Petri de 100 mm con 10 ml de DPBS para evaluar la reversibilidad del tratamiento.
- Transfiera la preparación a un plato de Petri con el tampón Krebs recién oxigenado. Registre la motilidad uterina espontánea durante unos 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de vídeo digital.
- Transfiera la preparación a otra placa Petri de 35 mm llena de tampones Krebs oxigenados complementado con el vehículo para el compuesto de prueba para asegurarse de que no haya cambios inducidos mecánicamente en la motilidad uterina espontánea. Este es un control importante.
- Transfiera el material de archivo de vídeo a un disco duro de ordenador.
6. Análisis de datos
- Haga clips utilizando cualquier software de edición de vídeo a partir del material de archivo de vídeo original que contenga los episodios de control, tratamiento y lavado.
- Utilice el software MATLAB y el script proporcionado (consulte el material suplementario en línea) para cuantificar la motilidad uterina espontánea.
NOTA: El complemento Computer Vision Toolbox para MATLAB debe estar instalado para que el script sea completamente funcional.- Abra el script de MATLAB, vaya a la pestaña Editor y haga clic en Ejecutar.
- Seleccione el primer archivo de vídeo y haga clic en Abrir.
- Introduzca una etiqueta para el archivo de vídeo en el cuadro de diálogo emergente y haga clic en Aceptar.
- Introduzca el intervalo de tiempo (s) necesario para calcular la velocidad del movimiento de la bocina (distancia euclidiana / s).
- Utilice el cursor del ratón para seleccionar dos puntos en el primer fotograma del vídeo. Una ventana emergente le pedirá que confirme que los puntos seleccionados deben utilizarse para el seguimiento. Haga clic en Iniciar para iniciar el proceso de seguimiento en tiempo real que se mostrará en la ventana emergente. También puede hacer clic en Volver a seleccionar puntos para volver a seleccionar los dos puntos.
- Supervise la precisión del proceso de seguimiento en la ventana emergente.
- Observe una gráfica de dispersión de velocidad frente a dispersión de tiempo y gráfico de dispersión de distancia frente a dispersión de tiempo en una nueva ventana emergente. Guarde las dos figuras seleccionando Archivo ( File) Guardar como en la misma ventana para documentar los datos.
- Busque una carpeta denominada PointTrackerData, creada automáticamente por MATLAB, en el mismo directorio donde se encuentra el script de MATLAB. Identifique un archivo de Excel denominado label_Data que contenga puntos de datos recopilados del vídeo en dos pestañas de hoja de cálculo independientes.
NOTA: Cualquier software de seguimiento de movimiento alternativo se puede utilizar para cuantificar la motilidad espontánea del útero.
- Utilice un software adecuado (por ejemplo, Excel o SigmaPlot 13) para realizar el análisis estadístico.
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Representative Results
La Figura 1 muestra imágenes representativas tomadas durante todo el procedimiento de aislamiento del tracto reproductivo que se describe en este protocolo. Para evitar contaminar el tampón con piel, lo que disminuiría la calidad del vídeo, humedecimos el cuerpo del ratón con 70% de etanol. El punto de referencia principal para la sección de disección del protocolo es encontrar la vejiga urinaria. El útero y la vagina se ubicarán de forma inferior a la vejiga urinaria.
Para probar el protocolo, tratamos todo el tracto reproductivo con epinefrina. Epinefrina es bien conocido para causar relajación muscular lisa uterina. Esta hormona se produce endógenamente en la médula suprarrenal y sirve como una hormona del estrés en los mamíferos. Usamos epinefrina de 1 m en nuestros experimentos. Se trata de una concentración de saturación conocida por causar la respuesta máxima12. Se realizaron una serie de cuatro experimentos. En todos los ensayos, 1 M de epinefrina inhibía de forma reversible la motilidad uterina espontánea (Figura2).
Para cuantificar la motilidad espontánea del tracto reproductivo, diseñamos un algoritmo que nos permite evaluar la tasa media de cambio en la distancia euclidiana entre dos puntos seleccionados en el tracto reproductivo del ratón. Las posiciones de punto se rastrean utilizando el módulo de seguimiento de movimiento del software MATLAB. El script correspondiente para MATLAB, que utilizamos para calcular las distancias euclidianas, se proporciona en el material suplementario en línea. La posición de los puntos es fundamental para un procedimiento de seguimiento de movimiento exitoso. Se debe tener en cuenta cuidadosamente la calidad de los videos porque los reflejos de luz de la pared de la placa Petri pueden distraer el rastreador de movimiento, y puede dejar de rastrear el movimiento de la bocina mientras reasigna el punto a una de las luz Reflexiones. Optamos por colocar uno de los puntos en medio de un cuerno para asegurarnos de que estaba lo suficientemente lejos de los reflejos de la pared de la placa Petri. El segundo punto fue generalmente seleccionado en la vagina ya que no presentaba motilidad espontánea. La Figura 3 proporciona una muestra de análisis de datos, y la figura suplementaria 1 muestra las imágenes representativas adquiridas durante el seguimiento de movimiento.
Figura 1 : Pasos de aislamiento del tracto reproductivo completo. (A) Se hizo una incisión en la piel y la región abdominopelvic se expuso por encima del peritoneo (1). (B) La membrana serosa se abrió lentamente para exponer el tracto gastrointestinal (2). (C) El tracto gastrointestinal se ha movido para exponer los cuernos uterinos (3). La vejiga urinaria (4) se puede visualizar cerca de la conjunción de los cuernos. (D) Los cuernos uterinos se han liberado y se han realizado cortes en los lados laterales de la sínfisis púbica (5) para exponer la vagina (6). (E) Extirpación del tracto reproductivo aislado y colocación en la solución DPBS. Se extirpó el exceso de piel o tejido conectivo. (F) Se puede ver una sangría profunda en la vagina (derecha) después de la extirpación del recto (izquierda, 7). (G) Se extrae el tejido conectivo circundante. Se utilizó una cámara digital y el software Application Suite (versión 3.7.0) para adquirir imágenes en tiempo real durante la disección (ajuste de la cámara: hue 20/saturation 80). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Se muestra un experimento representativo con todo el tracto reproductivo aislado. Las imágenes se tomaron 15 s de separación antes (A), durante (B), y después de (C) la aplicación de 1 m de epinefrina. La preparación del tracto reproductivo mostró una alta motilidad en los paneles A y C en ausencia de epinefrina, pero está en reposo en el panel B con la presencia de 1 m de epinefrina. El material de archivo de vídeo sin editar se proporciona como videos suplementarios 1-3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de datos en el experimento ex vivo descrito en Figura 2. (A) Se muestra un curso de tiempo de la tasa de cambio de distancia euclidiana. Los puntos de referencia entre los que se determinó la distancia durante la motilidad uterina espontánea se muestran como puntos verdes en el recuadro. Los puntos fueron seleccionados en la parte proximal de la vagina y el segmento medio de un cuerno uterino como se representa. Los círculos rellenos de azul muestran los valores de la tasa de motilidad espontánea antes de agregar epinefrina, los círculos rojos muestran las tasas de motilidad espontánea en presencia de 1 epinefrina, y los círculos rellenos verdes muestran las tasas de motilidad espontánea después de un lavado. (B) Una comparación de las tasas medias de cambio de distancia euclidiana (píxeles/s) antes de la adición de epinefrina (barra azul), en presencia de 1 m de epinefrina (barra roja) y después de un lavado (barra verde). El software MATLAB se utilizó para cuantificar la motilidad uterina. El intervalo de t se ha establecido en 5 s. "Distancia" se calcula como la diferencia entre la distancia de fotograma inicial y la distancia de fotograma 5 s más tarde. El análisis estadístico se realizó utilizando Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks seguido de todos los procedimientos de comparación múltiple según el Método de Dunn utilizando SigmaPlot 13. El asterisco indica el conjunto de datos que era significativamente diferente de los otros conjuntos de datos experimentales (P -<0.001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película suplementaria 1: Videoclip de lapso de tiempo que muestra la motilidad uterina espontánea antes de añadir 1 epinefrina. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Película suplementaria 2: Videoclip de lapso de tiempo que muestra la motilidad uterina espontánea cuando el tampón Krebs se complementó con 1 m de epinefrina. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Película suplementaria 3: Videoclip de lapso de tiempo que muestra la motilidad uterina espontánea después del lavado. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Figura suplementaria 1: Imágenes representativas tomadas cada 15 s durante el seguimiento de movimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Material suplementario: El script de algoritmo de seguimiento basado en MATLAB. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí, describimos un método para evaluar la contractilidad espontánea de todo el tracto reproductivo de los roedores, que incluye los ovarios, oviductos, cuernos uterinos y la vagina. Utilizamos un método similar para demostrar el efecto relajante de la fenilefrina en la motilidad uterina espontánea13, sin embargo, en el pasado no pudimos proporcionar análisis cuantitativos de los datos. En este trabajo, desarrollamos un algoritmo para el análisis cuantitativo de datos de motilidad utilizando el módulo de seguimiento de movimiento MATLAB. Esta es una técnica útil para probar nuevos fármacos que regulan la contractilidad uterina independientemente de si los medicamentos se relajan o constriñen los músculos lisos uterinos. Una ventaja importante de este modelo es que el tracto reproductivo está intacto, preservando todas las interacciones celulares intrauterinas intrínsecas. En particular, este protocolo no requiere ningún equipo especial. El aislamiento del útero se puede hacer con una simple lupa y no hay ningún requisito para cualquier equipo de grabación de vídeo sofisticado. Si una cámara digital de alta resolución no está disponible para la creación de imágenes, se puede utilizar una cámara de teléfono móvil personal como alternativa.
El paso más crítico del protocolo para evaluar la motilidad del tracto reproductivo es obtener tejido uterino viable. El miometrio, dentro de los cuernos uterinos, es el elemento móvil del tracto reproductivo. Por lo tanto, durante el aislamiento es importante evitar el estiramiento excesivo o la compresión de los cuernos. También es importante asegurarse de que el tejido uterino está bien oxigenado a lo largo del experimento para mantener la motilidad uterina. La mejor manera de prevenir cualquier daño a los cuernos uterinos es hacer contacto solo con el tejido conectivo adyacente mientras se limpia el útero o se mueve el tracto reproductivo. Dado que la vagina no se contrae espontáneamente durante el experimento, es aceptable comprimirla con los fórceps al mover el tracto reproductivo de un plato a otro. Los experimentos del tracto reproductivo completos se pueden realizar junto con grabaciones de tensión isométrica que evalúan la contractilidad uterina inducida por precarga y/o oxitocina. Sin embargo, un miógrafo de alambre es una pieza costosa de equipo que no siempre está disponible en un entorno de laboratorio común.
El método descrito tiene varias limitaciones. Dado que el miometrio es muy sensible a las compresiones o a los tirón, esto complica el proceso de disección del tracto reproductivo. Si los cuernos están dañados durante la disección, no se observará contractilidad espontánea. Esta es una limitación importante del protocolo porque es incierto si las células musculares lisas contráctil fueron dañadas sin saberlo a pesar del uso de cuidado adecuado y precaución o si carecían de motilidad debido a una causa natural. De hecho, no observamos motilidad en 10-20% de las preparaciones del tracto reproductivo en este estudio. Es importante asegurarse de que el segmento vaginal del tracto reproductivo permanece intacto porque la eliminación de la vagina disminuye notablemente la motilidad espontánea de los cuernos uterinos. Por el contrario, la ausencia de ovarios y/u oviductos no afecta a toda la motilidad del tracto reproductivo. Además, uno debe tener en cuenta que algunos compuestos son sensibles a la oxidación. Por ejemplo, la epinefrina se puede oxidar fácilmente. Probar los efectos de estos compuestos requeriría un tiempo de incubación más corto para prevenir la oxidación excesiva. Sin embargo, tiempos de incubación más cortos pueden obstaculizar la capacidad de un medicamento para penetrar eficientemente el espesor de la pared uterina. Otra limitación del método incluye la evaluación de los movimientos tridimensionales de los cuernos. Los cuernos tienen una naturaleza innata de acurrucarse en un plano tridimensional, lo que complica el análisis. Para superar este problema, se puede disminuir el volumen de tampón Krebs en la placa Petri a 2 ml.
Encontramos que el rango de edad óptimo para ratones hembra es de 2-5 meses. Hemos indicado que la anestesia con isoflurano puede resultar en una reducción de la motilidad y pueden ser necesarios lavados adicionales para prevenir esta complicación inducida por el isoflurano. Alternativamente, se puede utilizar dióxido de carbono para eutanasiar ratones. Si surgen dificultades durante la disección, la concentración en puntos de referencia, como la vejiga urinaria, puede ayudar. Para cuantificar los datos de motilidad obtenidos, utilizamos el software MATLAB. El principal problema con el seguimiento de movimiento en MATLAB fue que el rastreador no pudo localizar correctamente los cuernos cuando se movieron cerca de la pared de la placa Petri. Adobe Premier Element se utilizó para recortar el material de archivo de vídeo y reducir el tamaño de los archivos de vídeo. Aunque es un paquete de software excepcional, es posible que no siempre esté disponible en un entorno de laboratorio típico. Una opción alternativa puede ser utilizar el módulo de seguimiento de movimiento libre del software ImageJ o incluso una simple evaluación manual de imágenes tomadas con intervalos idénticos y comparar la posición de los cuernos uterinos en una cuadrícula de segmentación. La Figura 2 muestra un ejemplo de evaluación simple de la motilidad uterina espontánea e incluye una comparación de los movimientos del tracto reproductivo dentro de un intervalo de 15 s.
Hasta el momento no se ha notificado ningún método sencillo que evalúe la motilidad uterina en un entorno de plato de Petri. Los sensores de ultrasonido y presión intrauterina se pueden utilizar para controlar la contractilidad del útero humano14. Sin embargo, es difícil estudiar los mecanismos subyacentes en el útero humano intacto. Por lo tanto, el uso de modelos animales para investigar la contractilidad uterina espontánea es importante. El tracto reproductivo femenino presenta contracciones miometriales espontáneas que son críticas para el bienestar de la mujer, incluyendo su fertilidad y trabajode parto 15. Estas contracciones se pueden visualizar como ondas endometriales durante un examen por ultrasonido. Sin embargo, durante la menstruación, la contraetimición del útero puede crear molestias y provocar dismenorrea, o calambres menstruales. Para ayudar a aliviar algunos síntomas de la dismenorrea, se necesitan nuevos medicamentos dirigidos a relajar los músculos lisos uterinos. Nuestro método simple proporciona una manera de evaluar los efectos de varios compuestos en la contractilidad uterina.
En este estudio, utilizamos nuestro modelo de plato Petri fácil para confirmar la eficacia de la epinefrina, una hormona relajante uterina12,para prevenir la motilidad uterina espontánea de los tracto reproductivos aislados del ratón. Nuestro método también se puede utilizar para probar tales compuestos que pueden aumentar la contractilidad del útero. Es importante destacar que este método podría tener el potencial de actualizarse para la detección de drogas de rendimiento utilizando un formato de placa de seis pocillos. Por lo tanto, el método que presentamos aquí puede tener la capacidad de optimizarse para los procedimientos de cribado a escala industrial. No intentamos realizar experimentos similares en roedores más grandes, pero esperamos que una motilidad espontánea similar esté presente en el útero aislado de la rata. El tracto reproductivo más grande de las ratas puede exhibir una motilidad uterina más pronunciada. Encontramos que el útero de ratón embarazada también puede ser evaluado usando este modelo de plato de motilidad uterina ex vivo Petri. Como era de esperar, la motilidad espontánea del útero embarazada se redujo porque está en un estado de reposo. Sin embargo, el aumento de peso añadido por el tejido fetal también puede contribuir a la obstrucción de la motilidad. Todavía puede ser beneficioso explorar más a fondo la idoneidad de todo este modelo de tracto reproductivo para evaluar el efecto de los compuestos tocolíticos (relajantes) o uterotónicos (estimulantes) en el contexto del embarazo y el trabajo de parto. Así, aquí presentamos un modelo fácil ex vivo para evaluar la motilidad espontánea del tracto reproductivo intacto. Este enfoque puede ser adoptado para la detección de drogas y ser utilizado para el descubrimiento de nuevos fármacos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos internos de IU. AGO concibió el estudio. XC y AGO participaron en el diseño de los experimentos descritos. FL y AGO analizaron e interpretaron los datos. KLL, JOB, FL realizaron todos los experimentos ex vivo. FL escribió el script MATLAB. KLL, JOB y AGO escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2- 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
- Kuijsters, N. P. M., et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).
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