Summary
הציג כאן הוא פרוטוקול לבצע זמן, שטח הגן מוגבל להוריד במיתרי השדרה על ידי הזרקת CAS9-gRNA מורכבות לתוך התעלה המרכזית חוט השדרה ואחריו electroporation.
Abstract
האקסון יש את היכולת הייחודית להתחדש באופן מלא בחוט השדרה שלה. זה בעיקר בשל התאים הependymal שנותרו כמו תאי גזע עצביים (NSCs) ברחבי החיים, אשר מתרבים לרפורמה הצינור ependymal ולהבדיל לתוך הנוירונים איבד לאחר פגיעה בחוט השדרה. פענוח כיצד NSCs אלה לשמור על העוצמה לאחר הפיתוח ומתרבים על הפגיעה בחוט השדרה לרפורמה מבנה טרום פציעה המדויק יכול לספק תובנה רבת ערך לגבי האופן שבו מיתרי השדרה יכול להתחדש כמו גם אפשרויות טיפול פוטנציאליות. ביצוע המנקוש גנים בקבוצות מערכות מסוימות של NSCs בתוך פרק זמן מוגבל יאפשר לימוד של מנגנונים מולקולריים מאחורי אלה תהליכי רגנרציה, מבלי להיות מבולבל על ידי פיתוח perturbing אפקטים. מתוארים כאן היא שיטה לבצע גנים מעלף בחוט השדרה NSCs באמצעות מערכת CRISPR-Cas9. על ידי הזרקת את קומפלקס CAS9-gRNA לתוך התעלה המרכזית חוט השדרה ואחריו electroporation, היעד גנים הם הפילו בתוך NSCs באזורים ספציפיים של חוט השדרה בנקודת זמן רצויה, המאפשר מחקרים מולקולריים של חוט השדרה NSCs במהלך תחדשות.
Introduction
חוט השדרה של רוב החוליות אינו מסוגל להתחדש בעקבות פציעה, המוביל נכות קבע. מספר מסלמנדרות, כגון האקאוסול, הם חריגים בולטים. האקסון יכול להתחדש באופן מלא בחוט השדרה זהה מבחינה מבנית ותפקוד שחזור לחלוטין חוט השדרה. הרבה יכולת ההתחדשות של חוט השדרה האקאולית היא בשל תאים ependymal. תאים אלה קו התעלה המרכזית, ובניגוד לאלה יונקים, התאים axoependymal l להישאר כתאי גזע עצביים (NSCs) לאחר ההתפתחות העובריים. לאחר פגיעה בחוט השדרה (למשל, מ קטיעה זנב), אלה NSCs מתרבים לגדול מחדש את צינור ependymal ולהבדיל להחליף נוירונים אבודים1,2,3. חשיפת כיצד axoNSCs חוט השדרה להישאר pluripotent ולהיות מופעל לאחר הפציעה יכול לספק מידע חשוב על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות עבור חולים אנושיים.
בשל ההתקדמות ב-crispr-Cas9 gene הטכניקה, ביצוע טוק-אאוט כדי לפענח את הפונקציה גנטית הפכה קלה יותר, הוכח כי יש ישימות רחבה במינים שונים, כולל axo ls4,5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , 8. המהדורה האחרונה של הגנום axoלגמרי למלא וטראנסקריפט כעת מאפשר לכל מקום גנומית להיות ממוקד ולהעריך טוב יותר את ההשפעות מחוץ ליעד9,10,11,12 , מיכל בן 13 , 14. ממוטב הפרוטוקולים פותחו עבור לנקוש-out ו-in ב axoCas9 ls באמצעות CRISPR-מערכת15. משלוח של מכונות CRISPR-Cas9 בצורה של חלבון CAS9-gRNA ribonuאופאנפרוטאין (RNP) הוכח להיות יעיל יותר מאשר באמצעות Cas9 ו-gRNA-קידוד פלמידים4. זה סביר בגלל RNP להיות קטן יותר בגודל של וקטורים פלביניים, היכולת שלה ליצור הפסקות DNA מיד, והגנה על gRNA מ-RNA השפלה. בנוסף, באמצעות שימוש עוקף RNPs ותרגום; כך, הוא מונע בעיות כגון כוח היזם ושימוש אופטימלי השימוש כאשר אלמנטים פלביניים נגזרים ממינים שונים.
מחקרים באובדן התפקוד הם אחת הגישות הכלליות לחקירת פונקציות פוטנציאליות של גנים מעניינים. על מנת ללמוד פונקציה גנטית במהלך התחדשות, נוק אאוט צריך להתבצע באופן אידיאלי רק לפני פגיעה כדי למנוע השפעות על פיתוח. בנוסף, הדפיקה החוצה צריכה להיות מוגבלת הן לNSCs והן לאזור ההתחדשות. להפיל את הגן היעד של כל NSCs (כולל אלה במוח, שהוא המקרה במערכות מערכות לloxp), עשוי לייצר אפקטים לא קשור התחדשות שיכול לבלבל את הפרשנות של תוצאות. למרבה המזל, המבנה של חוט השדרה axol מספק הזדמנות ייחודית לזמן ומקום מוגבל לנקוש ב NSCs. רוב חוט השדרה NSCs במגע עם התעלה המרכזית ומהווים את הרוב המכריע של התאים במגע עם תעלת המרכזית16,17. לכן, זריקה של קומפלקס CAS9-grna לתוך התעלה המרכזית, ואחריו electroporation, מאפשר מסירה NSCs חוט השדרה באזור הרצוי בשעה מסוימת4,18,19. פרוטוקול זה מדגים כיצד זה מבוצע, המוביל לתוך חדירה מאוד החוצה בחוט השדרה NSCs. הניתוח שלאחר מכן מבוצעים כדי ללמוד את ההשפעות על התחדשות ועל התנהגות המועצה לבטחון לאומי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויים בבעלי חיים חייבים להתבצע בהתאם לתקנות מקומיות ולאומיות בנושא ניסויים בבעלי חיים ובאישור לוח הסקירה המוסדי הרלוונטי.
1. הכנת התמהיל CAS9-gRNA RNP
- עיצוב וסינתזה של gRNAs.
הערה: עיין בפרסומים אחרים לעיצוב וסינתזה של grnas, כולל אחד באופן בלעדי על axofor15,20,21,22. - השג CAS9-NLS חלבון על ידי הכנת הבית או לרכוש אותו באופן מסחרי.
- להכין CAS9-gRNA לערבב על ידי ערבוב 5 μg של CAS9-NLS חלבון, 4 μg של gRNA, 0.9 μL של 10x CAS9 מאגר, ולמלא את עוצמת הקול ל 10 μL עם nuclease-H חינם2O. aliquot את התערובת ואת החנות ב-80 ° צ' אם לא נעשה שימוש מיידי.
2. הכנת לוחות מעלה לאלקטרופורציה
- הכינו 200 mL של 2% (wt/vol) פתרון ב 1x DPBS. מתמוסס על ידי חימום הפתרון במיקרוגל ויוצקים אותו על 10 ס מ מנות פטרי לעומק של כ 10 מ"מ (עמוק מספיק כדי לכסות את החיה כולה).
- הניחו ללוחות להחזק בטמפרטורת החדר. חנות צלחות ב -4 ° c אם לא בשימוש מיידי.
- שימוש באזמל כירורגי, לחתוך את הצלחת agarose לעשות סדק להחזקת הזנב ישר, טוב להתאמת הגוף של בעל החיים, ושתי בארות נוספות עבור הצבת אלקטרודות (איור 1E).
- מניחים את הצלחת על הקרח וממלאים אותו עד הסוף עם קרח קר 1x DPBS. השתמש באותו פתרון DPBS להכנת צלחות כדי להבטיח conductibility חשמלי עקבי בהגדרת.
3. קביעת התצורה של האלקטרופורקטור
- קבע את תצורת האלקטרופוראטור. הגדר את הדופק צפיה להכיל פולס דו קוטבית אחד של 70 V, עם משך של 5 אלפיות השנייה, מרווח של 50 ms, ואין ריקבון מתח. להגדיר את הדופק העברה יש ארבעה פולסים דו קוטבית של 40 V, עם משך של 50 ms, מרווח של 999 ms, ו 10% ניוון מתח.
- חבר את האלקטרודות לאלקטרופורטור והתאם את הפינצטה להיות בהפרש של 7 מ"מ. השקיעו את האלקטרודות בגביע של DPBS לפני ובין האלקטרופורציה.
4. הכנת וטעינת נימי זכוכית מיקרוהזרקה
- לבצע מבחן הרמפה על פולר בוער/חום מיקרופיפטה לפי הוראות היצרן כדי לקבוע את ערך החום.
- משוך נימים הזרקה עם קצוות מחודדות באמצעות הפרמטרים הבאים: חום = ערך הבדיקה השיפוע, משוך = 100, מהירות = 100, זמן = 100.
- . הביטו במחט מתחת לstereomicroscope באמצעות מלקחיים עדינים, לשבור את הנימים בזווית כך שיש לו טיפ משופע. לשבור בעמדה שבה הוא רזה מספיק כדי למקד את התעלה המרכזית, תוך היותו חזק מספיק כדי לחדור את העור.
הערה: הנקודה בה הקוטר הוא בערך 20 יקרומטר או כ-50% מקוטר חוט השדרה הוא נקודת התחלה טובה. ייתכן שיהיה צורך בנסיונות מרובים כדי לקבל שבירת אופטימלית. - הוסף פתרון מהיר ירוק FCF לתמהיל RNP ביחס של 1:30 וטען על 5 μL של תערובת הזרקה לתוך נימי עם טיפ מיקרוטוען מיקרו.
- הר הקפילר על המשאבה הפניאומטית, כשקצהו הנטוי פונה כלפי מטה.
5. קביעת התצורה של המשאבה הפניאומטית
- הגדר את המשאבה הפניאומטית. הגדר את החסימה כדי 0.5 פאונד לאינץ ' מרובע (psi), להוציא כדי 2 psi להחזיק, ואת משך מגודרת.
- מבחן קפיטים ופנאומטי הגדרות משאבה ידי לטבול את הנימים לתוך טיפת מים לחיצה על דוושת הרגל כדי להזריק. ודא שערבוב ההזרקה יוצא בזרם איטי אך יציב.
- להתאים את הלחץ להחזיק אם ערבוב ההזרקה להתחיל דולף באופן ספונטני או מים הוא נשאב את הנימים. להגדיל את הלחץ הפליטה או לשבור יותר של נימי אם תערובת ההזרקה יוצאת לאט מדי. הפחת את הלחץ הפליטה אם הזריקה יוצאת מהר מדי.
6. הזרקת RNP לתוך חוט השדרה
- בשנת 0.03% הפתרון בנזוקיין במשך 10 דקות לפחות. בדוק כי בעלי החיים אינם מגיבים על ידי היפוך אותם הפוך במים.
- להרים בעל חיים עם מלקחיים הטבעת ולהניח אותו על מיטה של סיליקון, עם הצד השמאלי של החיה הפונה כלפי מעלה הזנב מצביע לכיוון ימין. הצב את אתר ההזרקה באמצע שדה התצוגה של הstereomicroscope (איור 1א).
- כוונן את המיקרומניפולציה כך שהנימי יגיע ב-60 ° מצדו הימני של שדה התצוגה (איור 1ב).
- זהה את חוט השדרה ואת התעלה המרכזית (איור 1ג).
הערה: חוט השדרה הוא מבנה צינורי מעל notochord. - כיוון לתעלה המרכזית, הזז את הקפילר קדימה כדי לחדור בעדינות את העור ואת השריר לתוך התעלה המרכזית של חוט השדרה. הגבילו את תנועת הקפילר לצעדים קטנים, כאשר חוט השדרה נמצא ממש מתחת לשרירי הזנב.
- לחץ והחזק את דוושת הרגל כדי להזריק את התערובת לתוך התעלה המרכזית. שים לב אם המיקס RNP מתפשט לאורך התעלה המרכזית כשורה כחולה בשני הכיוונים, אשר מראה כי הקפילר ממוקם כראוי (איור 1ד).
- אם זה לא קורה, להשאיר את דוושת הרגל לחוץ תוך הזזת נימי קצת פנימה והחוצה עד המיקס RNP מתחיל ללכת. אם הנימים הופך סתומים על ידי רקמה, לנקות אותו על ידי הוצאת לתוך מים על לחצים גבוהים.
- כוונן את הלחץ הפליטה כך שיהיה מספיק כדי לגרום למיקס ה-RNP להתפשט בתעלה המרכזית, אך לא עד כדי כך שהוא יפוצץ את המבנה.
- המשך להחזיק את הדוושה ברגל כך ערבוב ההזרקה מתפשט לאורך התעלה המרכזית, עד שהוא מגיע הטרמינל שלפוחית בסוף חוט השדרה והחדרים במוח.
הערה: הדבר עשוי להימשך עד 2 דקות בהתאם לגודל החיה. ייתכן שיהיה צורך להגביר את הלחץ לאחר זמן מה כדי לגרום לערבוב RNP להיכנס לחללי המוח. - המשך בהקדם האפשרי לאלקטרופורציה לאחר הזרקה מוצלחת.
7. אלקטרופורציה
- להעביר את בעל החיים עם מלקחיים הטבעת על הצלחת המוכן מראש אלקטרופורציה (איור 1E) על הקרח. מניחים את הזנב בתוך החריץ כך שהוא דחוקה על ידי agarose (איור 1F).
- מניחים את האלקטרודות לתוך הבארות משני צידי הזנב. ודא כי כל החיות והאלקטרודות מכוסות על-ידי PBS קר קרח.
- לחץ על מתג הרגל כדי להתחיל את האלקטרופורציה.
- לאחר השלמת האלקטרופורציה, החזר את החיה למים.
- המשך להזריק בעלי חיים נוספים אם יש צורך בכך.
- בדוק כי בעלי החיים electroporated הם בריאים לאחר ההרדמה מתפוגג וכי אין נזק שנגרם לזנב.
8. הערכת יעילות להוריד
- . תקן את הזנב של החיה האלקטרו-מלאכותית לעשות צולבות סעיפים של הזנב ואחריו מכתים אימונוהיסטוכימיה כדי להעריך את היעילות של הנוק אאוט ברמת החלבון.
הערה: אם יש לבצע כריתת זנב לאחר האלקטרופורציה, ניתן להשתמש בזנב החתוך למטרה זו. בעלי חיים החשמליים עם gRNAs נגד Gfp או Tyrosinase, למשל, יכול לשמש כפקד שלילי4. - לחילופין, חוט השדרה האלקטרו-מגנטי יכול להיות מחולץ ומיועד לבדיקת דנ א. בצע את ה-PCR בעקבות הערכת הרצף של Sanger או רצף הדור הבא כדי להעריך את אחוזי הסדר הגנטי הערוך15.
הערה: יעילות העריכה המתקבלת תפחית את יעילות העריכה בפועל עבור NSCs, בשל הכללה של תאים שאינם אלקטרופורביים ונוירונים שחוסר הקשר האפיפיורי אל המרכז המרכזי ולכן לא יקבל את המיקס RNP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזרקה ואלקטרופורציה של קומפלקס CAS9-gRNA נגד Sox2 לתוך התעלה המרכזית לחוט השדרה המרכזי הוביל לאובדן מסיבי של Sox2 immunoreactivity ברוב של השדרה NSCs חוט, עם Grna נגד Tyrosinase (tyr) כפקד (איור 2 A). B3-טובולין (ויטראז ' עם TUJ1) הוא סמן לנוירונים ולא התבטא ב NSCs, ו SOX2-TUJ1-תאים סביב התעלה המרכזית נחשבו תאים מחסה SOX2 מחיקות. הקוונפיקציה הראה Sox2 החוצה במספר משמעותי של NSCs על-ידי CAS9-Sox2-grna אלקטרופורציה (איור 2B), המציין כי שיטה זו הובילו יעיל וחודר מאוד גנים להוריד בחוט השדרה NSCs.
לאחר הזרקה בו אלקטרופורציה, התערובת של שני מכלולי CAS9-gRNA נגד Sox2 ו -gfp, בהתאמה, לתוך האקסון הטרנסגניים עם ביטוי gfp בכל מקום (הכולל), אחוז גבוה של כפול נוק אאוט NSCs נצפו (איור 2ג, ד), המציין כי הפרוטוקול ניתן להשתמש בגמישות לנקוש החוצה גנים מרובים.
איור 1 : הזרקת חוט השדרה ואלקטרופורציה. (א) סכמטי מראה הזרקה של CAS9-GRNA rnp לתוך התעלה המרכזית לחוט השדרה המרכזי. (ב) הגדרת מיקרומניפולציה עבור הזריקה. (ג) השקפה דרך הstereomicroscope של זנב האקאוסול, עם חוט השדרה המצוין. (ד) השקפה דרך stereomicroscope של זנב האקסון עם חוט השדרה מוזרק. (ה) סכימטי של לוחית האלקטרופורציה. (ו) סכמטי של בעל החיים והאלקטרודות שהונחו בתוך לוחית האלקטרופורציה, מוכן לצורך אלקטרופורציה. קנה מידה של מייצגי פעילויות = 1 מ"מ. הדמות הזאת מותאמת מאלבורס וטאנאקה18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : הנציג להוריד את התוצאות בחוט השדרה NSCs. (א) חוט השדרה הזרקה ואלקטרופורציה של CAS9-Sox2-grna (n = 21) הובילה לאובדן Sox2 ברוב NSCs במהלך 15 ימים לאחר אלקטרופורציה (dpe) על ידי כתמים אימונוהיסטוכימיה. CAS9-Tyr-grna (n = 21) שימש כשליטה שלילית. קנה מידה של סרגלים = 100 μm. (ב) קוונפיקציה הראה ירידה משמעותית ב SOX2 + NSCs (p < 0.001 על ידי מבחן t של הסטודנט), ספירת SOX2-TUJ1 תאים המקיפים את התעלה המרכזית כמו NSCs מחסה מחיקה SOX2 . קווי שגיאה = SD. (ג) בו הזרקה ו אלקטרופורציה של Sox2-grna ו gfp-grna בשילוב כדי CAS9 (n = 6) הובילה לאובדן Sox2 ו-gfp ברוב NSCs על ידי כתמים אימונוהיסטוכימיה. CAS9-Tyr-grna (n = 6) משמש כשליטה שלילית. קנה מידה של סרגלים = 100 μm. (ד) קוונפיקציה הראה כי בין כל NSCs ממוקדת שיש כל מחיקה, רוב (94%) מחיקה כפולה הרשועמם (GFP-SOX2-), בעלת פרופורציה קטנה בלבד (6%) בעל מחיקה בודדת (GFP + סוקס-או GFP-SOX2 +). דמות זו מותאמת מפיי ואח '4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר מאפשר הזמן והשטח הגן מוגבלת לנקוש ב NSCs בחוט השדרה axol. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר פילוח ספציפי של NSCs בזמן מוגדר מיקום עם החדירה גבוה. היא מונעת השפעות בלתי רצויות פוטנציאלי שמקורם הגן לנקוש ב NSCs באזורים אחרים כגון המוח המתרחשים בעת שימוש במערכת היצור-LoxP. זה גם מונע השפעות התפתחותיות שמקורם מתמשך החוצה, המאפשר לימוד של תפקוד הגנים התמקדו התחדשות. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להתבצע בעלי חיים מסוג פראי, הימנעות זמן ההמתנה הארוך הדרוש כדי לייצר axo, המקביל הטרנסגניים, אשר נדרש עבור מערכת היצור-LoxP. הוא גם מציע את רב-תכליתיות להוריד גנים מרובים בו זמנית והוא חודר מאוד, המאפשר ניסויים להתבצע על F0 בעלי חיים. חשוב מכך, ההליך מוצג כי אין השפעה הנצפה על הזנב התחדשות חוט השדרה4.
השימוש CAS9 חלבון-gRNA RNP מתחמי גם מציג יעילות גבוהה יותר מאשר מערכות באמצעות CAS9 ו-grna-הביע פלמידים4. זה עשוי להיות בגלל גודל קטן יותר של מורכבות rnp לעומת פלמידים, כמו גם השימוש הדיפרנציאלי קודון ההשפעה על הביטוי של חלבון CAS9 מפלסטלינה הנובעים ממערכות היונקים. בנוסף, מאז CAS9 חלבון-gRNA RNP מתחמי יכול לגרום לשבור מיד, החוצה מתרחשת במהירות. 60%-70% של גנומית שונה נצפתה על ידי ה-PCR הדפס בתוך 24 שעות של אלקטרופורציה (נתונים לא מוצגים). קיימת גם אפשרות לבצע הטוק-שימוש באסטרטגיה זו על-ידי שיתוף בתבנית תיקון. מספר אסטרטגיות לדפיקה זמינות, הפרטים והשיקולים שאינם נמצאים בטווח עבור פרסום זה, אך הם מתוארים בפירוט בפרסום אחר15.
מצד שני, לפרוטוקול הזה. יש כמה מגבלות כתמים או גנוהקלדה PCR נדרש בדרך כלל כדי להעריך את מידת הדפיקה של כל חיה ניסיונית, אשר יכול להיות מפרך. בעוד ג'ין לנקוש מתוך שיטה זו מוגבלת במידה רבה NSCs סביב התעלה המרכזית, זה לא ניתן לשלול כי סוגי תאים אחרים יכולים גם להיות ממוקד, כי 1) הם גם בקשר עם התעלה המרכזית, או 2) שילוב RNP הדליף מתוך מרכז תעלת הגחון לפני האלקטרופורציה. יש לשקול גורמים אלה בעת פענוח התוצאות.
gRNA עיצוב
עם הגנום axo, שפורסם לאחרונה, וטראנסקריפט, זיהוי גנים axol והרצפים שלהם הפך הרבה יותר קל9,10, 11,12,13. מדריכים מפורטים בעיצוב gRNAs תוארה במקום אחר, כולל אחד העוסק באופן בלעדי עם axoלויום15. מומלץ לעצב ולבדוק לפחות שלושה gRNAs לצורך עריכת יעילות מראש ולבחור את העיצוב האופטימלי עבור הניסוי בפועל. היעילות של gRNA יכול להיבדק על ידי הזרקת CAS9-gRNA לערבב ביצים שהונחו טרי בשלב של תא אחד23. יעילות העריכה יכולה להיות מוערך לאחר מכן על ידי הקליית הזחלים המקווקו.
שיקולי הזרקה
מאז אתר ההזרקה של חוט השדרה סובל מנזק פיזי שנגרם על ידי המחט והפצת שילוב RNP לרקמות מחוץ לתעלה המרכזית, חשוב לבצע את ההזרקה במיקומים הרחק מאזור העניין לניתוח. לדוגמה, אם קטיעה זנב מבוצעת לאחר אלקטרופורציה כדי ללמוד את ההשפעות של הגן ממוקד התחדשות חוט השדרה, יש צורך לבצע את הזריקה שבה האתר יוסר על ידי קטיעה.
כניסה לתעלה המרכזית עם נימי הזרקה היא הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול זה, ומומלץ למשתמשים חדשים לתרגל לפני הניסוי בפועל. הזרקה היא הטובה ביותר להתבצע על בעלי חיים קטנים יותר (פחות מ 2.5 ס מ ארוך) בקצה האחורי של חוט השדרה, איפה זה הכי קל למקם את העצה נימי לתוך התעלה המרכזית. מומלץ לצפות בהתפשטות הראשונית של התמהיל הכחול של RNP באופן מקרוב. יש אפשרות כי שילוב RNP יכול להיות מוזרק לחלל המננגיאל סביב חוט השדרה. התפשטות חדה ומהירה כשורה לאורך אמצע חוט השדרה מצביעה על זריקה מוצלחת בתעלה המרכזית18. אם שום דבר לא יוצא או התפשטות מפסיק בטרם עת, מומלץ לשמור על דוושת כף הרגל לחצה תוך הזזת נימי קצת פנימה והחוצה. אם הדבר נכשל, ייתכן שיהיה צורך למקם מחדש את הנימים או לבדוק פתיחה סתומה. לתמהיל RNP להתפשט לתוך החדרים המוח, זה לעתים קרובות הכרחי כדי להגדיל את הלחץ פליטה לקראת הסוף. לאחר מילוי חללי המוח אינו הכרחי לאלקטרופורציה של חוט השדרה, אך זהו הסימן הטוב ביותר לכך שמיקס RNP הוזרק לתעלה המרכזית.
שיקולי אלקטרופורציה
מומלץ לייעל את הפרמטרים אלקטרופורציה מראש כדי להשיג מסירה מספקת של RNP לרוב NSCs מבלי לגרום נזק נרחב לרקמות אחרות או להרוג את החיה. פרוטוקול זה ממוטב עבור בעלי חיים 2.0-2.5 ס"מ בגודל18. הפחתה העברת מתח הדופק כדי 35 V הוא ככל הנראה הכרחי כאשר עובדים עם בעלי חיים קטנים יותר זה. לעומת זאת, בעלי חיים גדולים יותר ידרשו מתח גבוה יותר ו/או יותר פולסים. בנוסף, המרחק בין האלקטרודות משפיע על היעילות. הפחתה של המרחק ל 6 מ"מ עשויה להיות הכרחית לבעלי חיים גדולים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
אנו מודים לפרופסור אלי מ. טנקה על תמיכתה המתמשכת וארוכת הטווח. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית המדע הטבעי של סין (NSFC) מענק (317716), מחקר החל מענקים מאוניברסיטת דרום סין נורמלי (S82111 ו 8S0109), ו הקרן המדע הפוסט דוקטורט של סין (2018M633067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
- O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
