Summary
Presenteras här är ett protokoll för att utföra tid-och rymdbegränsad Gene knock-out i axolotl ryggmärgen genom att injicera CAS9-gRNA komplex i ryggmärgen Central kanalen följt av elektroporation.
Abstract
Axolotl har den unika förmågan att helt återskapa sin ryggmärg. Detta beror till stor del på ependymceller celler kvar som neurala stamceller (nscs) under hela livet, som sprider sig till reformen av ependymceller röret och differentiera till förlorade nervceller efter ryggmärgsskada. Dechiffrera hur dessa NSCs behålla pluripotensen efter utveckling och försprida sig på ryggmärgsskada för att reformera den exakta pre-skada struktur kan ge värdefull insikt i hur däggdjurs ryggmärgen kan regenerera samt potentiella behandlingsalternativ. Utföra gen knock-outs i specifika undergrupper av NSCs inom en begränsad tidsperiod kommer att möjliggöra studier av de molekylära mekanismerna bakom dessa regenerativa processer, utan att blandas ihop med utvecklingen störande effekter. Beskrivs här är en metod för att utföra Gene knock-out i axolotl ryggmärg NSCs med hjälp av CRISPR-Cas9 systemet. Genom att injicera CAS9-gRNA Complex i ryggmärgs Central kanalen följt av elektroporation, är målgener slås ut i NSCs inom specifika regioner i ryggmärgen vid en önskad tidpunkt, vilket möjliggör molekylära studier av ryggmärg NSCs under Förnyelse.
Introduction
Ryggmärgen av de flesta ryggradsdjur är oförmögen att återhämta sig efter skada, vilket leder till permanent invaliditet. Flera salamandrar, såsom axolotl, är anmärkningsvärda undantag. Den axolotl kan helt regenerera en strukturellt identisk ryggmärgen och helt återställa ryggmärgen funktion. Mycket av regenerativ förmåga axolotl ryggmärgen beror på ependymceller celler. Dessa celler linje den centrala kanalen, och till skillnad från de hos däggdjur, axolotl ependymceller celler kvar som neurala stamceller (nscs) post-embryonal utveckling. Efter ryggmärgsskada (t. ex. från en svans amputation), dessa nscs föröka sig att återföds ependymceller röret och differentiera för att ersätta förlorade neuroner1,2,3. Avslöja hur axolotl ryggmärg NSCs förbli pluripotenta och blir aktiverad efter skada kan ge värdefull information om att utveckla nya terapeutiska strategier för mänskliga patienter.
På grund av framstegen i CRISPR-Cas9 gen knock-out teknik, utföra knock-outs till dechiffrera genfunktion har blivit lättare och har visat sig ha en bred tillämplighet i olika arter, inklusive axolotien4,5, 6 , 7 , 8. den senaste utgåvan av hela axolotl genom och transkriptome tillåter nu alla genomisk Locus att riktas och för bättre bedömning av off-Target effekter9,10,11,12 , 13 , 14. optimerade protokoll har utvecklats för knock-out och Knock-in i axolotien med hjälp av CRISPR-Cas9 system15. Leverans av CRISPR-Cas9 maskiner i form av Cas9 protein-grna ribonukleoprotein (RNP) har visat sig vara mer effektiv än att använda Cas9 och grna-kodning plasmider4. Detta beror sannolikt på att RNP är mindre i storlek än plasmid vektorer, dess förmåga att skapa DNA-avbrott omedelbart, och skydda gRNA från RNA-nedbrytning. Dessutom använder RNPs kringgår transkription och översättning; Sålunda, det undviker frågor som Promotorn styrka och optimal kodon användning när plasmid element härleds från en annan art.
Förlust av funktion studier är en av de allmänna metoder för att undersöka potentiella funktioner av gener av intresse. För att kunna studera genfunktion under regenereringen bör en knock-out helst utföras strax före en skada för att undvika effekter på utvecklingen. Dessutom bör utslagningar begränsas till både de nationella kontaktpunkterna och regionen för förnyelse. En knock-out av målet genen i alla NSCs (inklusive de i hjärnan, vilket är fallet i CRE-LoxP system), kan ge effekter som inte är relaterade till förnyelse som kan blanda ihop tolkningen av resultaten. Lyckligtvis ger strukturen i axolotl ryggmärgen en unik möjlighet för tid-och utrymmesbegränsade knock-out i NSCs. De flesta av ryggmärgen nscs är i kontakt med den centrala kanalen och utgör den stora majoriteten av cellerna i kontakt med den centrala kanalen16,17. Därför, en injektion av CAS9-grna komplex i den centrala kanalen, följt av elektroporation, tillåter leverans till ryggmärgen nscs i en önskad region vid en viss tidpunkt4,18,19. Detta protokoll visar hur detta utförs, vilket leder till mycket genomträngande knock-out i den riktade ryggmärgen NSCs. efterföljande analys utförs sedan för att studera effekterna på förnyelse och NSC beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök måste utföras i enlighet med lokala och nationella bestämmelser om djurförsök och med godkännande från den berörda institutionella prövnings nämnden.
1. förbereda CAS9-gRNA RNP mix
- Design och syntetisera gRNAs.
Anmärkning: hänvisa till andra publikationer för att designa och syntetisera grnas, inklusive en uteslutande om axolotien15,20,21,22. - Skaffa CAS9-NLS protein genom att förbereda internt eller köpa det kommersiellt.
- Bered CAS9-gRNA-blandningen genom att blanda 5 μg CAS9-NLS-protein, 4 μg gRNA, 0,9 μL 10X CAS9-buffert, och fyll upp volymen till 10 μL med nukleasfri H2O. Ali kvot blandningen och förvara vid-80 ° c om den inte används omedelbart.
2. beredning av agaros plattor för elektroporering
- Förbered 200 mL 2% (WT/VOL) aguppstod lösning i 1x DPBS. Lös upp genom att värma upp lösningen i en mikrovågsugn och häll den på 10 cm petriskålar till ett djup av ca 10 mm (tillräckligt djup för att täcka hela djuret).
- Låt plattorna stelna vid rumstemperatur. Förvara plattorna vid 4 ° c om de inte används omedelbart.
- Med hjälp av kirurgiska skalpeller, klippa aguppstod plattan för att göra en slits för att hålla svansen raka, en bra för montering i kroppen av djuret, och två extra brunnar för att placera elektroderna (figur 1E).
- Placera plattan på isen och fyll den upp till brädden med iskalla 1x DPBS. Använd samma dpbs lösning för att göra plattorna för att säkerställa konsekvent elektrisk lednings i set-up.
3. Konfigurera elektroporatorn
- Konfigurera elektroporatorn. Ställ in Poring pulsen att bestå av en bipolär puls på 70 V, med en löptid på 5 MS, intervall på 50 ms, och ingen spänning förfall. Ställ in överföring puls att ha fyra bipolär pulser av 40 V, med en varaktighet på 50 ms, intervall på 999 MS, och 10% spänning förfall.
- Anslut elektroderna till elektroporatorn och justera pincetten så att den är 7 mm isär. Sänk elektroderna i en bägare av DPBS före och mellan elektroporation.
4. förberedelse och lastning görs glas kapillärer
- Utför ett ramptest på en flammande/brun micropipett avdragare enligt tillverkarens anvisningar för att bestämma värmevärdet.
- Dra injektion kapillärer med avsmalnande ändar med hjälp av följande parametrar: värme = ramp test värde, pull = 100, Velocity = 100, tid = 100.
- Observera nålen under ett stereomikroskop. Använda fina pintippar, bryta kapillär i en vinkel så att den har en lutande spets. Bryt på en plats där den är tunn nog att rikta den centrala kanalen, samtidigt som den är stark nog att tränga igenom huden.
Anmärkning: den punkt där diametern är ca 20 μm eller ca 50% av diametern på ryggmärgen är en bra utgångspunkt. Flera försök kan behövas för att få optimal brytning. - Tillsätt snabb, grön FCF-lösning till RNP-blandningen med ett förhållande på 1:30 och fyll på ca 5 μL injektions blandning i kapillärspetsen med en Mikrolastpipett.
- Montera kapillär på pneumatisk pump, med sneda spetsen vänd nedåt.
5. konfigurering av pneumatisk pump
- Konfigurera pneumatisk pump. Ställ in Hold till 0,5 pounds per kvadrattum (PSI), mata ut till 2 PSI Hold, och varaktighet till gated.
- Testa kapillär och pneumatiska pumpens inställningar genom att doppa kapillär i en droppe vatten och trycka på fotpedal att injicera. Se till att injektions blandningen kommer ut i en långsam men stadig ström.
- Justera Håll trycket om injektions blandningen börjar läcka ut spontant eller vatten sugs upp kapillärområdet. Öka ejektionstrycket eller bryta mer av kapillär om injektion blandningen kommer ut för långsamt. Minska ejektionstrycket om injektionen kommer ut för fort.
6. injektion av RNP-blandningen i ryggmärgen
- Anesthetize axolotien i 0,03% bensokain lösning för minst 10 min. Kontrollera att djuren inte är lyhörd genom att vända dem upp och ner i vattnet.
- Plocka upp ett djur med ring tång och lägga den på en bädd av kisel, med den vänstra sidan av djuret uppåt och svansen pekar mot höger. Placera injektionsstället i mitten av synfältet för stereomikroskopet (figur 1A).
- Justera mikromanipulatorn så att kapillärområdet kommer in på 60 ° från höger sida av synfältet (figur 1B).
- Identifiera ryggmärgen och Central kanalen (figur 1C).
Anmärkning: ryggmärgen är den rörformiga strukturen ovanför notochord. - Siktar på den centrala kanalen, flytta kapillär fram för att försiktigt tränga igenom huden och muskler i den centrala kanalen i ryggmärgen. Begränsa förflyttning av kapillär till små steg, som ryggmärgen är rätt under svansmusklerna.
- Tryck och håll ned fotpedalen för att injicera blandningen i den centrala kanalen. Observera om RNP-blandningen sprids längs den centrala kanalen som en blå linje i båda riktningarna, vilket visar att kapillärområdet har placerats korrekt (figur 1D).
- Om detta inte inträffar, håll fotpedalen intryckt medan du flyttar kapillär något in och ut tills RNP blandningen börjar gå in. Om kapillär blir igensatt av vävnad, rensa den genom att mata ut i vatten vid högre tryck.
- Justera ejektionstrycket så att det är precis tillräckligt för att orsaka RNP blandningen att spridas i den centrala kanalen, men inte så mycket att det blåser upp strukturen.
- Fortsätt att hålla ner fotpedalen så att injektions blandningen sprider sig vidare längs den centrala kanalen, tills den når den terminala vesikeln i slutet av ryggmärgen och ventriklarna i hjärnan.
Anmärkning: Detta kan ta upp till 2 minuter beroende på djurets storlek. Det kan vara nödvändigt att öka trycket efter en tid att orsaka RNP blandningen att komma in i hjärn ventriklarna. - Fortsätt så snart som möjligt till elektroporation efter lyckad injektion.
7. elektroporation
- Överför djuret med ringpinps på den preparerade Agam-elektroporeringsplattan (figur 1E) på isen. Placera svansen inuti skåran så att den är inklämd av aguppstod (figur 1F).
- Placera elektroderna i brunnarna på båda sidor av svansen. Se till att hela djuret och elektroderna täcks av iskall PBS.
- Tryck på fotreglaget för att starta elektroporationen.
- Efter elektroporation är klar, returnera djuret till vatten.
- Fortsätt att injicera fler djur om det behövs.
- Kontrollera att de elektroporerade djuren är friska efter anestesi avtar och att det inte finns någon skada på svansen.
8. bedömning av Knock-out-effektivitet
- Fixera svansen på det elektroporerade djuret. Gör tvärsnitt av svansen följt av immunohistokemisk färgning för att bedöma effektiviteten i knock-out på proteinnivå.
Anmärkning: om en svans amputation ska utföras efter elektroporation, kan cut off tail användas för detta ändamål. Djur som elektroporeras med gRNAs mot GFP eller Tyrosinase kan till exempel användas som en negativ kontroll4. - Alternativt kan den elektroporerade ryggmärgen extraheras och lyseras för DNA. Utför genotypning PCR följt av sanger sekvensering eller nästa generations sekvensering för att bedöma andelen redigerade genetiska loci15.
Obs: den resulterande redigering effektivitet kommer underskatta den faktiska redigering effektivitet för NSCs, på grund av införandet av icke-elektroporerade celler och nervceller som saknar apikala kontakt med centrala lumen och därmed kommer inte att få RNP blandningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Injektion och elektroporation av CAS9-gRNA komplex mot Sox2 i axolotl ryggmärgen Central kanalen ledde till en massiv förlust av Sox2 immunoreaktivitet i en majoritet av ryggmärgen nscs, med Grna mot Tyrosinase (Tyr) som kontroll (figur 2 A). B3-tubulin (färgas med TUJ1) är en markör för nervceller och var inte uttryckt i nscs, och SOX2-TUJ1-celler som omger den centrala kanalen ansågs vara celler härbärge SOX2 borttagningar. Kvantifieringen visade Sox2 knock-out i ett betydande antal nscs av CAS9-Sox2-grna elektroporation (figur 2B), vilket tyder på att denna metod ledde till effektiv och mycket genomträngande gen knock-out i ryggmärgen nscs.
Efter samtidig injektion och elektroporation, blandningen av två CAS9-grna komplex mot Sox2 och GFP, respektive, i transgena axolotien med allestädes närvarande GFP uttryck (caggs-GFP), en hög andel dubbel knock-out nscs observerades (figur 2C, D), vilket indikerar att protokollet kan användas för att flexibelt slå ut flera gener.
Figur 1 : Axolotl ryggmärgs insprutning och elektroporation. (A) Schematisk visar injektion av CAS9-GRNA RNP i axolotl ryggmärgen central kanal. B) mikromanipulatorset-up för injektionen. C) Visa genom ett stereomikroskop av axolotlsvansen, med ryggmärgen angiven. Dse genom ett stereomikroskop av axolotlsvansen med en injicerad ryggmärg. E) schematiskt av elektroporeringsplattan. Fschematiskt av djuret och elektroderna placerade inuti elektroporeringsplattan, redo för elektroporering. Skalstreck = 1 mm. Denna siffra är anpassad från Albors och Tanaka18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa knock-out resultat i axolotl ryggmärgen NSCs. (A) ryggmärgs insprutning och ELEKTROPORATION av CAS9-Sox2-grna (n = 21) ledde till förlust av Sox2 i majoriteten av nscs vid 15 dagar efter elektroporation (DPE) av immunohistokemisk färgning. CAS9-Tyr-grna (n = 21) fungerade som en negativ kontroll. Skalstreck = 100 μm. (B) kvantifieringen visade signifikant minskning av SOX2 + nscs (p < 0,001 av Students t-test), räkna SOX2-TUJ1-celler som omger den centrala kanalen som nscs hyser en SOX2 radering. Felstaplar = SD. (C) samtidig injektion och elektroporation av Sox2-grna och GFP-grna kopplad till CAS9 (n = 6) ledde till förlust av Sox2 och GFP i de flesta nscs av immunohistokemisk färgning. CAS9-Tyr-grna (n = 6) fungerar som negationkontroll. Skalstreck = 100 μm. D) kvantifiering visade att en majoritet (94%) av alla riktade nscs som hade tagits bort haruttråkad dubbel radering (GFP − SOX2 −), med endast en liten andel (6%) med enkel radering (GFP + SOX-eller GFP-SOX2 +). Denna siffra är anpassad från Fei et al.4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det beskrivna protokollet tillåter tid och utrymme begränsad gen knock-out i NSCs i axolotl ryggmärgen. Det aktuella protokollet tillåter specifik inriktning av NSCs vid en definierad tid och plats med hög penetrans. Det undviker potentiella oönskade effekter som härrör från Gene knock-out i NSCs i andra regioner som hjärnan som uppstår när du använder CRE-LoxP-systemet. Det undviker också utvecklingseffekter som härrör från en ihållande knock-out, vilket gör att studiet av genfunktion inriktad på förnyelse. Dessutom kan detta protokoll utföras i vildtyp djur, undvika den långa väntetid som krävs för att generera ytterligare transgena axolotls, vilket krävs för CRE-LoxP systemet. Den erbjuder också mångsidigheten att slå ut flera gener samtidigt och är mycket genomträngande, vilket gör att experiment kan utföras på F0 djur. Viktigt är att förfarandet visat sig ha någon observerbar effekt på svans och ryggmärgen förnyelse4.
Användningen av CAS9 protein-gRNA RNP-komplex visar också mycket högre effektivitet än system som använder CAS9 och grna-uttrycker plasmider4. Detta beror sannolikt på mindre storlek av RNP-komplexet jämfört med plasmider, liksom differentiell kodon-användning som påverkar uttrycket av CAS9-proteinet från plasmider som härstammar från däggdjurs system. Dessutom, eftersom CAS9 protein-gRNA RNP komplex kan inducera raster omedelbart, Knock-out sker snabbt. 60%-70% av modifierad genomisk loci har observerats genom genotypning PCR inom 24 h av elektroporation (data som inte visas). Det finns också en möjlighet att utföra knock-ins med hjälp av denna strategi genom Co-elektroporating en reparationsmall. Ett antal Knock-in-strategier finns tillgängliga, detaljerna och övervägandena som ligger utanför tillämpningsområdet för denna publikation, men de beskrivs i detalj i en annan publikation15.
Å andra sidan har detta protokoll några begränsningar. Färgning eller genotypning PCR är i allmänhet behövs för att bedöma omfattningen av Knock-out i varje försöksdjur, som kan vara mödosam. Medan Gene knock-out från denna metod är till stor del begränsad till de NSCs som omger den centrala kanalen, kan det inte uteslutas att andra celltyper också kan riktas, eftersom 1) de är också i kontakt med den centrala kanalen, eller 2) RNP-blandningen har läckt ut ur CEN kanalen före elektroporation. Dessa faktorer bör beaktas vid tolkningen av resultaten.
gRNA design
Med den nyligen publicerade axolotl genomet och transkriptome, identifiera axolotl gener och deras sekvenser har blivit mycket lättare9,10,11,12,13. Detaljerade guider för att designa grnas har beskrivits på annat håll, inklusive en som uteslutande behandlar axolotien15. Det rekommenderas att designa och testa minst tre gRNAs för att redigera effektiviteten i förväg och att välja den optimala designen för själva experimentet. Effektiviteten hos gRNA kan testas genom att injicera CAS9-gRNA-blandningen i nyligen lagda axolotl-ägg vid encellsledet23. Redigering effektivitet kan sedan bedömas genom genotypning de kläckt larver.
Överväganden vid injektion
Eftersom injektionsstället av ryggmärgen lider av fysiska skador orsakade av nålen och spridning av RNP blandningen till vävnader utanför den centrala kanalen, är det viktigt att utföra injektionen på positioner bort från regionen av intresse som ska analyseras. Till exempel, om en svans amputation utförs efter elektroporation att studera effekterna av en riktad gen i ryggmärgen förnyelse, är det nödvändigt att utföra injektionen där platsen kommer att avlägsnas genom amputation.
Att komma in i Central kanalen med en injektion kapillär är det mest kritiska steget i detta protokoll, och nya användare rekommenderas att öva innan själva experimentet. Injektionen utförs bäst på mindre djur (mindre än 2,5 cm lång) vid den bakre änden av ryggmärgen, där det är lättast att placera kapillärspetsen i den centrala kanalen. Det rekommenderas att iaktta den initiala spridningen av den blå-färgade RNP blanda noga. Det finns möjlighet att RNP blandningen kan injiceras i meningeal utrymmet runt ryggmärgen. En skarp och snabb spridning som en linje längs mitten av ryggmärgen indikerar lyckad injektion i den centrala kanalen18. Om inget går ut eller spridningen stannar för tidigt, är det rekommenderat att hålla fotpedal intryckt medan du flyttar kapillär något in och ut. Om detta misslyckas, kan det vara nödvändigt att åter placera kapillär eller kontrollera om en igensatt öppning. För RNP blandningen att spridas in i hjärnans ventriklar, det är ofta nödvändigt att öka ejektionstrycket mot slutet. Att ha hjärn ventriklarna fyllt upp är inte nödvändigt för elektroporation av ryggmärgen, men det är den bästa indikationen att RNP blandningen har injicerats i den centrala kanalen.
Överväganden vid elektroporering
Det rekommenderas att optimera elektroporation parametrarna i förväg för att uppnå tillräcklig leverans av RNP till en majoritet av nscs utan att orsaka omfattande skador på andra vävnader eller döda djuret. Detta protokoll har optimerats för djur 2,0-2,5 cm lång i storlek18. En minskning av överföringpulspänningen till 35 V är troligen nödvändig vid arbete med djur som är mindre än så. Å andra sidan, större djur kommer att kräva högre spänning och/eller mer pulser. Dessutom påverkar avståndet mellan elektroderna verkningsgraden. En minskning av avståndet till 6 mm kan behövas för större djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar prof. Elly M. Tanaka för hennes kontinuerliga och långsiktiga stöd. Detta arbete stöddes av en National Natural Science Foundation i Kina (NSFC) Grant (317716), forskning startbidrag från South China normal University (S82111 och 8S0109), och en China postdoktorala stiftelsen Grant (2018M633067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
- O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
