Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

कैस9 प्रोटीन-GRNA परिसरों के इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से एक्सोटोटल स्पाइनल कॉर्ड न्यूरल स्टेम सेल का डायरेक्ट जीन नॉक-आउट

Published: July 9, 2019 doi: 10.3791/59850
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 3, 3
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2The Research Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna Biocenter (VBC), 3Institute for Brain Research and Rehabilitation (IBRR), South China Normal University
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है समय और अंतरिक्ष प्रतिबंधित जीन दस्तक प्रदर्शन करने के लिए axolotl रीढ़ की हड्डी में CAS9-GRNA परिसर रीढ़ की हड्डी केंद्रीय नहर में इंजेक्शन द्वारा जिसके बाद electroporation.

Abstract

एक्सोटोल में अपनी रीढ़ की हड्डी को पूरी तरह से पुनर्जीवित करने की अद्वितीय क्षमता है। यह काफी हद तक जीवन भर तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के रूप में शेष ependymal कोशिकाओं के कारण है, जो ependymal ट्यूब में सुधार और रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद खो न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए proliferate. Deciphering कैसे इन NSCs pluripotency के बाद विकास को बनाए रखने और रीढ़ की हड्डी की चोट पर proliferate सटीक पूर्व चोट संरचना में सुधार कैसे स्तनधारी रीढ़ की हड्डी के रूप में अच्छी तरह से संभावित उपचार के विकल्प पुनर्जीवित कर सकते हैं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. एक प्रतिबंधित समय अवधि के भीतर एनएससी के विशिष्ट सबसेट में जीन नॉक-आउट प्रदर्शन विकास परेशान प्रभाव से उलझन में होने के बिना, इन पुनर्योजी प्रक्रियाओं के पीछे आणविक तंत्र के अध्ययन की अनुमति देगा। यहाँ वर्णित CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग कर axolotl रीढ़ की हड्डी NSCs में जीन नॉक आउट प्रदर्शन करने के लिए एक विधि है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद रीढ़ की हड्डी केंद्रीय नहर में CAS9-GRNA परिसर इंजेक्शन द्वारा, लक्ष्य जीन एक वांछित समय बिंदु पर रीढ़ की हड्डी के विशिष्ट क्षेत्रों के भीतर एनएससी में बाहर खटखटाया जाता है, रीढ़ की हड्डी NSCs के आणविक अध्ययन के लिए अनुमति के दौरान पुनर्जनन.

Introduction

अधिकांश कशेरुकियों की रीढ़ की हड्डी चोट के बाद पुनर्जीवित करने में असमर्थ है, जिससे स्थायी विकलांगता हो जाती है। इस तरह के एक्सोलोटल के रूप में कई salamanders, उल्लेखनीय अपवाद हैं. axolotl पूरी तरह से एक संरचनात्मक समान रीढ़ की हड्डी को पुनर्जीवित कर सकते हैं और पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी समारोह बहाल. एक्स्ओटॉल रीढ़ की हड्डी की पुनर्योजी क्षमता का अधिकांश हिस्सा एपेंडिमल कोशिकाओं के कारण होता है। इन कोशिकाओं को केंद्रीय नहर लाइन, और स्तनधारियों में उन लोगों के विपरीत, axolotl ependymal कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रूप में रहते हैं (एनएससी) भ्रूणीय विकास के बाद. रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद (जैसे, एक पूंछ विच्छेदन से), इन NSCs ependymal ट्यूब regrow और खो न्यूरॉन्स1,2,3की जगह करने के लिए अंतर करने के लिए proliferate. उजागर कैसे axolotl रीढ़ की हड्डी NSCs pluripotent रहते हैं और चोट के बाद सक्रिय हो मानव रोगियों के लिए नई चिकित्सीय रणनीति विकसित करने के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं.

CRISPR-Cas9 जीन नॉक आउट तकनीक में प्रगति के कारण, जीन समारोह को समझने के लिए नॉक-आउट करना आसान हो गयाहै और एक्सोलोटल्स 4,5सहित विभिन्न प्रजातियों में व्यापक प्रयोज्यता के लिए दिखाया गयाहै, 6 , 7 , 8. पूर्ण एक्सोलोटल जीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम की हाल ही में रिलीज होने से अब किसी भी जीनोमिक टिड्डी को लक्षित किया जा सकता है और बेहतर आकलन करने के लिए ऑफ-लक्ष्य प्रभाव9,10,11,12 , 13 , 14. अनुकूलित प्रोटोकॉल CRISPR-Cas9 प्रणाली15का उपयोग कर axolotls में नॉक आउट और नॉक-इन के लिए विकसित किया गया है। CAS9 प्रोटीन-GRNA ribonucleoप्रोटीन (RNP) के रूप में CRISPR-Cas9 मशीनरी की डिलीवरी Cas9 और gRNA-एन्कोडिंग प्लाज्मिड4का उपयोग करने की तुलना में अधिक कुशल होना दिखाया गया है। यह पीएलज़्मिड वैक्टर की तुलना में आकार में छोटे होने के कारण आरएनपी की संभावना है, डीएनए ब्रेक बनाने की क्षमता तुरंत, और आरएनए गिरावट से डीएनए की रक्षा। इसके अलावा, RNPs का उपयोग प्रतिलेखन और अनुवाद bypasses; इस प्रकार, यह प्रमोटर शक्ति और इष्टतम codon उपयोग के रूप में मुद्दों से बचा जाता है जब प्लाज्मिड तत्वों एक अलग प्रजाति से प्राप्त कर रहे हैं.

हानि के समारोह अध्ययन ब्याज के जीन के संभावित कार्यों की जांच करने के लिए सामान्य दृष्टिकोण में से एक हैं. पुनर्जनन के दौरान जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए, विकास पर प्रभाव से बचने के लिए एक चोट से पहले आदर्श रूप से एक नॉक-आउट किया जाना चाहिए। इसके अलावा, नॉक आउट को एनएससी और पुनर्जनन के क्षेत्र दोनों तक सीमित किया जाना चाहिए। सभी NSCs में लक्ष्य जीन का एक नॉक-आउट (मस्तिष्क में उन सहित, जो क्रे-LoxP सिस्टम में मामला है), प्रभाव पुनर्जनन है कि परिणामों की व्याख्या confound कर सकते हैं से संबंधित नहीं उत्पादन कर सकते हैं. सौभाग्य से, axolotl रीढ़ की हड्डी की संरचना समय के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है- और एनएससी में अंतरिक्ष प्रतिबंधित नॉक आउट. अधिकांश मेरुदण्डीय एन सी सी केन्द्रीय नहर के संपर्क में हैं और अधिकांश कोशिकाओं को केंद्रीय नहर16,17के संपर्क में रखते हैं . इसलिए, केंद्रीय नहर में CAS9-GRNA परिसर का एक इंजेक्शन, इलेक्ट्रोपोट्रेशन के बाद, एक विशिष्ट समय4,18,19में एक वांछित क्षेत्र में रीढ़ की हड्डी एनएससी को प्रसव की अनुमति देता है. यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि यह कैसे किया जाता है, जिससे लक्षित रीढ़ की हड्डी एनएससी में अत्यधिक प्रवेश करने वाला नॉक-आउट होता है। इसके बाद के विश्लेषण को पुनर्जनन और एनएससी व्यवहार पर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों पशु प्रयोग पर स्थानीय और राष्ट्रीय नियमों के अनुसार और प्रासंगिक संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुमोदन के साथ किया जाना चाहिए.

1. CAS9-GRNA RNP मिश्रण की तैयारी

  1. डिजाइन और संश्लेषित gRNAs.
    नोट: डिजाइन और synthesizing के लिए अन्य प्रकाशनों को देखें gRNAs, एक विशेष रूप से axolotls से संबंधित सहित15,20,21,22.
  2. घर में तैयार करके या इसे व्यावसायिक रूप से खरीद कर कैस9-एनएलएस प्रोटीन प्राप्त करें।
  3. CAS9-NLS प्रोटीन के 5 डिग्री ग्राम, gRNA के 4 डिग्री ग्राम, 10x CAS9 बफर के 0.9 डिग्री एल मिश्रण से CAS9-GRNA मिश्रण तैयार करें, और मात्रा को 10 डिग्री सेल्सियस के साथ भरने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस के मिश्रण के साथएच 2ओ अलीकोट मिश्रण और स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर यदि तुरंत इस्तेमाल नहीं किया जाता है।

2. इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए एग्रोस प्लेट्स तैयार करना

  1. 1x DPBS में 2% (wt/vol) agarose समाधान के 200 एमएल तैयार करें। एक माइक्रोवेव में समाधान हीटिंग द्वारा भंग और के बारे में 10 मिमी की गहराई के लिए 10 सेमी पेट्री व्यंजन पर डाल (पूरे जानवर को कवर करने के लिए पर्याप्त गहरी).
  2. प्लेटों को कमरे के तापमान पर जमने दें। यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है तो प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. शल्य स्कैल्पल्स का उपयोग करके, पूंछ को सीधे रखने के लिए एक भट्ठा बनाने के लिए अगारोस प्लेट को काट ें, जानवर के शरीर में फिटिंग के लिए एक कुआँ, और इलेक्ट्रोड रखने के लिए दो अतिरिक्त कुएं (चित्र 1ई)।
  4. बर्फ पर थाली प्लेस और यह बर्फ ठंडा 1x DPBS के साथ सीमा तक भरें. सेट-अप में लगातार विद्युत चालकता सुनिश्चित करने के लिए प्लेटों को बनाने के लिए एक ही DPBS समाधान का उपयोग करें।

3. इलेक्ट्रोपोरेटर को कॉन्फ़िगर करना

  1. इलेक्ट्रोपोरेटर कॉन्फ़िगर करें। 70 V की एक द्विध्रुवी नाड़ी से मिलकर पोरिंग पल्स सेट करें, की अवधि के साथ 5 एमएस, अंतराल के 50 एमएस, और कोई वोल्टेज क्षय. 40 V के चार द्विध्रुवी दालों के लिए स्थानांतरण पल्स सेट, की अवधि के साथ 50 एमएस, 999 एमएस के अंतराल, और 10% वोल्टेज क्षय.
  2. इलेक्ट्रोपोरेटर के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्ट और 7 मिमी अलग होने के लिए छनरीज समायोजित करें। इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले और बीच में डीपीएस के बीकर में इलेक्ट्रोड को जलमग्न कर दिया जाता है।

4. माइक्रोइंजेक्शन ग्लास केशिकाओं की तैयारी और लोड िंग

  1. गर्मी मूल्य निर्धारित करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक ज्वलंत/भूरे रंग के माइक्रोपिपेट पुलर पर एक रैंप परीक्षण करें।
  2. निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग कर पतला समाप्त होता है के साथ इंजेक्शन केशिकाओं खींचो: गर्मी ] रैंप परीक्षण मूल्य, पुल $ 100, वेग ] 100, समय ] 100.
  3. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे सुई का प्रेक्षण कीजिए। ठीक संदंश का उपयोग करना, एक कोण पर केशिका को तोड़ने के लिए इतना है कि यह एक slanted टिप है. एक स्थिति है जहाँ यह काफी पतली है केंद्रीय नहर को लक्षित करने के लिए तोड़, जबकि काफी मजबूत त्वचा छेद करने के लिए किया जा रहा है.
    नोट: बिंदु जिस पर व्यास के बारे में है 20 डिग्री या रीढ़ की हड्डी के व्यास के बारे में 50% एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है. एकाधिक कोशिश करता है इष्टतम तोड़ने प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  4. 1:30 के अनुपात में आरएनपी मिश्रण करने के लिए तेजी से ग्रीन FCF समाधान जोड़ें और एक Microloader pipette टिप के साथ केशिका में इंजेक्शन मिश्रण के बारे में 5 डिग्री सेल्सियस लोड.
  5. वायवीय पंप पर केशिका माउंट, slanted टिप नीचे की ओर का सामना करना पड़ के साथ.

5. वायवीय पंप को कॉन्फ़िगर करना

  1. वायवीय पंप कॉन्फ़िगर करें। 0.5 पाउंड प्रति वर्ग इंच (psi) के लिए पकड़ सेट, 2 साई पकड़ करने के लिए बाहर निकालें, और gated करने के लिए अवधि.
  2. परीक्षण केशिका और वायवीय पंप सेटिंग्स पानी की एक बूंद में केशिका सूई और सुई के लिए पैर पेडल दबाने से। सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन मिश्रण एक धीमी लेकिन स्थिर धारा में बाहर आता है.
  3. इंजेक्शन मिश्रण स्वतः बाहर लीक शुरू अगर पकड़ दबाव समायोजित करें या पानी केशिका ऊपर चूसा है. इंजेक्शन मिश्रण बहुत धीमी गति से बाहर आ रहा है, तो इजेक्शन दबाव बढ़ाने या केशिका के अधिक तोड़ने। इंजेक्शन बहुत तेजी से बाहर आ रहा है, तो निष्कासन दबाव कम करें।

6. रीढ़ की हड्डी में आरएनपी मिश्रण इंजेक्शन

  1. कम से कम 10 मिनट के लिए 0.03% बेंजोकेन समाधान में एनेस्थेटाइज एक्सोलोट्स। यह जांच ें करें कि जानवर उन्हें पानी में उल्टा flipping द्वारा उत्तरदायी नहीं हैं।
  2. अंगूठी संदंश के साथ एक जानवर उठाओ और यह सिलिकॉन के एक बिस्तर पर रखना, ऊपर का सामना करना पड़ जानवर के बाईं ओर और पूंछ सही की ओर इशारा करते हुए के साथ. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र के मध्य में इंजेक्शन साइट को स्थित करें (चित्र 1क)।
  3. माइक्रोमैनिप्युलेटर को समायोजित करें ताकि केशिका दृश्य क्षेत्र के दाईं ओर से 60 डिग्री पर आ रहे हैं (चित्र 1ख)।
  4. रीढ़ की हड्डी और केंद्रीय नहर की पहचान करें (चित्र 1ग)।
    नोट: रीढ़ की हड्डी notochord ऊपर ट्यूबलर संरचना है.
  5. केंद्रीय नहर पर निशाना साधते हुए, धीरे रीढ़ की हड्डी की केंद्रीय नहर में त्वचा और मांसपेशियों को भेदने के लिए केशिका को आगे ले जाएं। छोटे कदम के लिए केशिका के आंदोलन को सीमित करें, क्योंकि रीढ़ की हड्डी पूंछ की मांसपेशियों के नीचे सही है।
  6. मध्य नहर में मिश्रण इंजेक्ट करने के लिए पैर पेडल को दबाकर रखें। निरीक्षण करें कि क्या आरएनपी मिश्रण दोनों दिशाओं में नीली रेखा के रूप में केंद्रीय नहर के साथ फैलता है, जो दर्शाता है कि केशिका को सही ढंग से तैनात किया गया है (चित्र 1ड)।
  7. यदि ऐसा नहीं होता है, तो केशिका को थोड़ा ऊपर ले जाते समय पैर पेडल को दबाया जाए जब तक कि आरएनपी मिश्रण में जाने से न हो जाए। यदि केशिका ऊतक से भरा हो जाता है, यह उच्च दबाव पर पानी में बाहर निकालने से साफ.
  8. निष्कासन दबाव को समायोजित करें ताकि यह आरएनपी मिश्रण को केंद्रीय नहर में फैलाने के लिए पर्याप्त हो, लेकिन इतना नहीं कि यह संरचना को उड़ाता है।
  9. यह मस्तिष्क में रीढ़ की हड्डी और निलय के अंत में टर्मिनल vesicle तक पहुँचता है, तो इंजेक्शन मिश्रण केंद्रीय नहर के साथ आगे फैलता है, तो पैर पेडल नीचे पकड़ करने के लिए जारी रखें।
    नोट: यह जानवर के आकार के आधार पर 2 मिनट तक लग सकते हैं। यह मस्तिष्क निलय में प्रवेश करने के लिए RNP मिश्रण पैदा करने के लिए कुछ समय के बाद दबाव बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता है.
  10. सफल इंजेक्शन के बाद जितनी जल्दी हो सके इलेक्ट्रोपोट्रेशन के लिए आगे बढ़ें।

7. विद्युत

  1. जानवर को बर्फ पर तैयार एगारोस इलेक्ट्रोपोरेशन प्लेट (चित्र 1ई) पर वलय बल के साथ स्थानांतरित करें। दरार के अंदर पूंछ रखें ताकि इसे अगारोस द्वारा sandwiched किया गया है (चित्र 1F)
  2. पुच्छ के दोनों ओर कुएँ में इलेक्ट्रोड रखीं। सुनिश्चित करें कि पूरे जानवर और इलेक्ट्रोड बर्फ ठंडा पीबीएस द्वारा कवर कर रहे हैं।
  3. इलेक्ट्रोपोरेशन शुरू करने के लिए पैर स्विच दबाएँ।
  4. विद्युत-पूजन पूरा होने के बाद, जानवर को पानी में वापस कर दें।
  5. यदि आवश्यक हो तो अधिक जानवरों को इंजेक्ट करने के लिए आगे बढ़ें।
  6. जाँच करें कि इलेक्ट्रोपोरेटेड जानवरों संज्ञाहरण बंद पहनता है और वहाँ पूंछ के लिए कोई नुकसान नहीं है के बाद स्वस्थ हैं।

8. नॉक आउट दक्षता का आकलन

  1. इलेक्ट्रोपोरेटेड जानवर की पूंछ को ठीक करें। प्रोटीन स्तर पर नॉक-आउट की दक्षता का आकलन करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने के बाद पूंछ के क्रॉस-सेक्शन बनाएं।
    नोट: यदि इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद एक पूंछ विच्छेदन किया जाना है, तो कट ऑफ टेल का उपयोग इस उद्देश्य के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, Gfp या Tyrosinase के विरुद्ध gRNAs के साथ विद्युतीकृत पशु, एक नकारात्मक नियंत्रण4के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. वैकल्पिक रूप से, इलेक्ट्रोपोरेटेड रीढ़ की हड्डी निकाली जा सकती है और डीएनए के लिए lysed किया जा सकता है। संपादित आनुवंशिक loci15के प्रतिशत का आकलन करने के लिए Sanger अनुक्रमण या अगली पीढ़ी अनुक्रमण के बाद जीनोटाइपिंग पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: जिसके परिणामस्वरूप संपादन दक्षता NSCs के लिए वास्तविक संपादन दक्षता को कम करके आंका जाएगा, गैर electroporated कोशिकाओं और न्यूरॉन्स कि केंद्रीय लुमेन के लिए शीर्ष संपर्क की कमी के शामिल किए जाने के कारण और इस तरह आरएनपी मिश्रण प्राप्त नहीं होगा.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Axolotl रीढ़ की हड्डी केंद्रीय नहर में Sox2 के खिलाफ CAS9-GRNA परिसर के इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोट्रेशन रीढ़ की हड्डी NSCs के बहुमत में SOX2 इम्यूनोरेक्शन का एक भारी नुकसान के लिए नेतृत्व किया, Tyrosinase के खिलाफ gRNA के साथ (Tyr) एक नियंत्रण के रूप में (चित्र 2 एक) B3-tubulin (TUJ1 के साथ दाग) न्यूरॉन्स के लिए एक मार्कर है और NSCs में व्यक्त नहीं किया गया था, और SOX2- TUJ1- केंद्रीय नहर के आसपास की कोशिकाओं को Sox2 विलोपन शरण कोशिकाओं माना जाता था. परिमाणीकरण CAS9- Sox2 -gRNA इलेक्ट्रोपोर्ेशनद्वारा NSCs की एक महत्वपूर्ण संख्या में Sox2 दस्तक से पता चला (चित्र 2बी), यह दर्शाता है कि इस विधि रीढ़ की हड्डी NSCs में कुशल और उच्च मर्मज्ञ जीन नॉक आउट करने के लिए नेतृत्व किया.

एक साथ इंजेक्शन और electroporation के बाद, Sox2 और Gfp के खिलाफ दो CAS9-GRNA परिसरों का मिश्रण, क्रमशः, सर्वव्यापी GFP अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक axolotls में (CAGGS-GFP), डबल नॉक आउट NSCs के एक उच्च प्रतिशत (चित्र2ब्,डी)का अवलोकन किया गया, जो यह दर्शाता है कि प्रोटोकॉल का उपयोग एकाधिक जीनों को लचीला रूप से नॉक आउट करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1 : Axolotl रीढ़ की हड्डी इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोट्रेशन। (क) कैस9-ग्रेना आरएनपी का एक्सोटोटल स्पाइनल कॉर्ड सेंट्रल कैनाल में इंजेक्शन दिखा रहा है। (बी) इंजेक्शन के लिए माइक्रोमैनिप्युलेटर सेट-अप। (ग) रीढ़ की हड्डी के संकेत के साथ, एक्सोटोलट पूंछ के एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखें। (डी) एक इंजेक्शन रीढ़ की हड्डी के साथ एक्सोटोटल पूंछ के स्टीरियो माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखें। (ई) इलेक्ट्रोपोरेशन प्लेट का स्केमेटिक। (च) इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए तैयार इलेक्ट्रोपोरेशन प्लेट के अंदर रखा जानवर और इलेक्ट्रोड की योजना। स्केल बार्स - 1 मिमी. यह आंकड़ा अल्बोर्स और तनाका18से अनुकूलित है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : axolotl रीढ़ की हड्डी NSCs में प्रतिनिधि नॉक आउट परिणाम. (ए) कैस9-सॉक्स2-ग्रना(एन जेड 21) के स्पाइनल कॉर्ड इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोट्रेशन के कारण इम्यूनोहिस्टोकेमिकल दाग द्वारा 15 दिनों के बाद एनएससी के अधिकांश में SOX2 का नुकसान हुआ। CAS9-Tyr-gRNA (द ] 21) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया. स्केल बार्स $ 100 डिग्री मी. (बी) क्वांटिफिकेशन में SOX2+ NSCs (p-lt; 0.001 by Student's t-test) में महत्वपूर्ण कमी दिखाई दी, SOX2- TUJ1- केंद्रीय नहर के आस-पास की कोशिकाओं को एनएससी के रूप में एक Sox2 विलोपन को आश्रय देने के रूप में गणना। त्रुटि सलाखों - एसडी . (सी) एक साथ इंजेक्शन और Sox2-gRNA और Gfp-gRNA के electroporation CAS9 (n ] 6) के लिए युग्मित इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला द्वारा NSCs के बहुमत में SOX2 और GFP के नुकसान के लिए नेतृत्व किया. CAS9-Tyr-gRNA (n ] 6) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। स्केल बार्स $ 100 डिग्री मी. (डी) क्वांटिफिकेशन से पता चला है कि सभी लक्षित एनएससी में कोई विलोपन, बहुमत (94%) बंदरगाह डबल विलोपन (GFP ] SOX2$), केवल एक छोटे से अनुपात के साथ (6%) एकल विलोपन होने (GFP + SOX- या GFP- SOX2 +). यह आंकड़ा फी एट अल4से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल समय और अंतरिक्ष प्रतिबंधित जीन नॉक आउट axolotl रीढ़ की हड्डी में एनएससी में बाहर की अनुमति देता है. वर्तमान प्रोटोकॉल उच्च penetrance के साथ एक निर्धारित समय और स्थान पर एनएससी के विशिष्ट लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है. यह ऐसे मस्तिष्क के रूप में अन्य क्षेत्रों में एनएससी में जीन नॉक-आउट से उत्पन्न होने वाले संभावित अवांछित प्रभाव से बचा जाता है कि जब Cre-LoxP प्रणाली का उपयोग कर रहे हैं. यह भी एक लगातार दस्तक से शुरू होने वाले विकासात्मक प्रभाव से बचा जाता है, जीन पुनर्जनन पर ध्यान केंद्रित समारोह के अध्ययन की अनुमति. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल जंगली प्रकार जानवरों में किया जा सकता है, लंबे समय से प्रतीक्षा अतिरिक्त ट्रांसजेनिक axolotls, जो Cre-LoxP प्रणाली के लिए आवश्यक है उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय से परहेज. यह भी एक साथ कई जीन दस्तक बाहर करने के लिए बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है और अत्यधिक मर्मज्ञ है, प्रयोगों F0 जानवरों पर प्रदर्शन किया जा करने की अनुमति. महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रक्रिया का पूंछ और रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन4पर कोई प्रेक्षणीय प्रभाव नहीं दिखाई गया है।

CAS9 प्रोटीन-GRNA RNP परिसरों का उपयोग भी Cas9 और gRNA-expressing प्लाज्मिड4का उपयोग कर सिस्टम की तुलना में बहुत अधिक दक्षता प्रदर्शित करता है। यह प्लाज्मिड की तुलना में आरएनपी परिसर के छोटे आकार के कारण होने की संभावना है, साथ ही साथ मैमेरियन सिस्टम से व्युत्पन्न प्लाज्मिड से कैस9 प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करने वाले अंतर कोडोन उपयोग। इसके अलावा, के बाद से CAS9 प्रोटीन-gRNA RNP परिसरों तुरंत टूट प्रेरित कर सकते हैं, नॉक आउट जल्दी होता है. संशोधित जीनोमिक लोसी का 60%-70% विद्युत पोर्शन (डेटा नहीं दिखाया गया) के 24 एच के भीतर जीनोटाइपिंग पीसीआर द्वारा मनाया गया है। मरम्मत टेम्पलेट को सह-इलेक्ट्रोपोरेटिंग द्वारा इस रणनीति का उपयोग करके नॉक-इन करने की भी संभावना है। नॉक-इन रणनीतियों की एक संख्या उपलब्ध हैं, विवरण और विचार जिनमें से इस प्रकाशन के लिए गुंजाइश से बाहर हैं, लेकिन वे एक और प्रकाशन15में विस्तार से वर्णित हैं.

दूसरी ओर, इस प्रोटोकॉल कुछ सीमाएं हैं. दाग या genotyping पीसीआर आम तौर पर प्रत्येक प्रयोगात्मक जानवर है, जो कठिन हो सकता है में नॉक आउट की सीमा का आकलन करने की जरूरत है. जबकि जीन दस्तक इस विधि से बाहर काफी हद तक केंद्रीय नहर के आसपास NSCs तक ही सीमित है, यह इनकार नहीं किया जा सकता है कि अन्य सेल प्रकार भी लक्षित किया जा सकता है, क्योंकि 1) वे भी केंद्रीय नहर के साथ संपर्क में हैं, या 2) RNP मिश्रण cen से बाहर लीक कर दिया है विद्युतपोट्रेशन से पहले त्राल नहर. परिणामों की व्याख्या करते समय इन कारकों पर विचार किया जाना चाहिए।

एनआरएनए अभिकल्प
हाल ही में प्रकाशित एक्सोटोल जीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम के साथ , एक्सोटोटल जीनों की पहचान करना और उनके दृश्यों की पहचान करना बहुत आसान हो गया है9,10,11,12,13. GRNAs डिजाइन करने में विस्तृत गाइड कहीं और वर्णित किया गया है, एक है कि एक्सोलोवेल्स15 केसाथ विशेष रूप से सौदों सहित. यह पहले से संपादन दक्षता के लिए कम से कम तीन gRNAs डिजाइन और परीक्षण करने के लिए और वास्तविक प्रयोग के लिए इष्टतम डिजाइन का चयन करने के लिए सलाह दी जाती है. जी.आर.ए.एन.ए. की दक्षता का परीक्षण एक-सेल चरण23में ताजा रखी हुई एक्सालोटोल अंडे में कैस9-जीआरएनए मिश्रण को इंजेक्ट करके किया जा सकता है। संपादन दक्षता तो hatched लार्वा genotyping द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.

इंजेक्शन विचार
चूंकि रीढ़ की हड्डी के इंजेक्शन साइट सुई की वजह से शारीरिक क्षति से ग्रस्त है और केंद्रीय नहर के बाहर ऊतकों के लिए आरएनपी मिश्रण के प्रसार, यह ब्याज के क्षेत्र से दूर पदों पर इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए विश्लेषण किया जाना महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, यदि रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन में एक लक्षित जीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इलेक्ट्रोपोट्रेशन के बाद एक पूंछ विच्छेदन किया जाता है, तो इंजेक्शन जहां साइट विच्छेदन द्वारा हटा दिया जाएगा प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है।

एक इंजेक्शन केशिका के साथ केंद्रीय नहर में प्रवेश इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम है, और नए उपयोगकर्ताओं को वास्तविक प्रयोग से पहले अभ्यास करने की सलाह दी जाती है. इंजेक्शन सबसे अच्छा रीढ़ की हड्डी के पीछे के अंत में छोटे जानवरों (कम से कम 2.5 सेमी लंबी) पर किया जाता है, जहां यह केंद्रीय नहर में केशिका टिप की स्थिति के लिए आसान है। नीले रंग के आरएनपी मिश्रण के प्रारंभिक प्रसार को बारीकी से देखने की सलाह दी जाती है। संभावना है कि आरएनपी मिश्रण रीढ़ की हड्डी के आसपास मेनिंगल अंतरिक्ष में इंजेक्ट किया जा सकता है। रीढ़ की हड्डी के बीच में एक रेखा के रूप में एक तेज और त्वरित प्रसार मध्य नहर18में सफल इंजेक्शन को इंगित करता है . यदि कुछ भी नहीं बाहर निकलता है या प्रसार समय से पहले बंद हो जाता है, तो केशिका को थोड़ा और बाहर ले जाते समय पैर पेडल को दबाया रखने की सिफारिश की जाती है। यदि यह विफल रहता है, तो केशिका को फिर से स्थित करना या भरा हुआ उद्घाटन की जांच करना आवश्यक हो सकता है। मस्तिष्क निलय में फैल करने के लिए RNP मिश्रण के लिए, यह अक्सर अंत की ओर निष्कासन दबाव को बढ़ाने के लिए आवश्यक है. मस्तिष्क निलय भरा होने रीढ़ की हड्डी के इलेक्ट्रोपोट्रेशन के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन यह सबसे अच्छा संकेत है कि आरएनपी मिश्रण केंद्रीय नहर में इंजेक्ट किया गया है।

इलेक्ट्रोपोरेशन विचार
यह अन्य ऊतकों के लिए व्यापक क्षति के कारण या जानवर की हत्या के बिना एनएससी के बहुमत के लिए आरएनपी की पर्याप्त वितरण प्राप्त करने के लिए पहले से ही इलेक्ट्रोपोर्नेशन मापदंडों का अनुकूलन करने के लिए सलाह दी जाती है। इस प्रोटोकॉल को जानवरों के लिए अनुकूलित किया गया है 2.0-2.5 सेमी लंबा आकार18. इससे छोटे जानवरों के साथ काम करते समय 35 ट तक अंतरण स्पंद वोल्टेज में कमी की संभावना है। दूसरी ओर, बड़े जानवरों को उच्च वोल्टेज और/या अधिक दालों की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी दक्षता को प्रभावित करता है. बड़े जानवरों के लिए 6 मिमी की दूरी में कमी आवश्यक हो सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम उसे निरंतर और दीर्घकालिक समर्थन के लिए प्रो एली एम तनाका धन्यवाद. यह काम चीन के एक राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी) अनुदान (317716), अनुसंधान दक्षिण चीन सामान्य विश्वविद्यालय (S82111 और 8S0109) से अनुदान शुरू, और एक चीन Postdoctoral विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (2018M633067) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Benzocaine Sigma-Aldrich E1501-100G
Benzocaine 0.03 % (wt/vol) Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Benzocaine 10 % (wt/vol) Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.
Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. Stutter Instrument  BF120-94-8
CaCl2·2H2O Merck 102382
CAS9 buffer, 10x Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months
CAS9-NLS protein   PNA Bio CP03
Cell culture dishes, 10cm Falcon 351029
Dumont #5 - Fine Forceps Fine Scientific Instruments 11254-20
Electroporator Nepa Gene  NEPA21
BEX Pulse Generator CUY21EDIT II
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252-5G
Fast Green FCF Solution, 5x Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS.
Flaming/Brown Micropipette Puller  Stutter Instrument  P-97
Holtfreter’s solution 400% (wt/vol)  Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
KCl Merck 104936
MgSO4·7H2O Merck 105886
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956003
Micromanipulator  Narishige MN-153 
NaCl Merck 106404
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments  SYS-PV830
Ring Forceps Fine Scientific Instruments 11103-09
Stereomicroscope Olympus SZX10 
Tris base Sigma-Aldrich T6066
Tris-buffered saline, 10x Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter Nepa Gene  CUY650P10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
  2. Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
  3. Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
  4. Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
  5. Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
  6. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  7. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
  8. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
  9. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
  10. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  11. Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
  12. Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
  13. Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  14. Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
  15. Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
  16. Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
  17. Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
  18. Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
  19. Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
  20. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  21. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  22. Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
  23. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).

Tags

आनुवंशिकी अंक 149 axolotl रीढ़ की हड्डी पुनर्जनन CRISPR-Cas9 तंत्रिका स्टेम सेल जीन नॉक आउट
कैस9 प्रोटीन-GRNA परिसरों के इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से एक्सोटोटल स्पाइनल कॉर्ड न्यूरल स्टेम सेल का डायरेक्ट जीन नॉक-आउट
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lou, W. P. K., Wang, L., Long, C.,… More

Lou, W. P. K., Wang, L., Long, C., Liu, L., Fei, J. F. Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes. J. Vis. Exp. (149), e59850, doi:10.3791/59850 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter