Summary
这里介绍的一个协议,通过将CAS9-gRNA复合物注射到脊髓中央管中,然后进行电穿孔,在axolotl脊髓中执行时间和空间限制基因敲除。
Abstract
轴线具有完全再生脊髓的独特能力。这主要是由于脑细胞作为神经干细胞(NSCs)在一生中残留,这些细胞增殖以改造脑管,并在脊髓损伤后分化成丢失的神经元。解读这些 NSC 如何在脊髓损伤后保持多能性并在脊髓损伤时增殖,以改革确切的损伤前结构,从而对哺乳动物脊髓如何再生以及潜在的治疗方案提供有价值的见解。在限定时间内在NSC的特定子集中执行基因敲除,将使得研究这些再生过程背后的分子机制,而不会被发育扰动效应所迷惑。此处描述的是一种使用 CRISPR-Cas9 系统在 axolotl 脊髓 NSC 中执行基因敲除的方法。通过将 CAS9-gRNA 复合物注入脊髓中央管,然后进行电穿孔,目标基因在脊髓特定区域的 NSC 中按所需时间点被敲掉,从而在脊髓 NSC 期间进行分子研究再生。
Introduction
大多数脊椎动物的脊髓在受伤后无法再生,导致永久性残疾。几个蜥蜴,如异种,是明显的例外。axolotl 可以完全再生结构相同的脊髓,并完全恢复脊髓功能。轴线脊髓的再生能力大部分是由于脑膜细胞。这些细胞排列在中央通道上,与哺乳动物不同,轴球细胞作为神经干细胞(NSC)在胚胎后发育。脊髓损伤(例如,从尾部截肢)后,这些NSC增殖,以重新生长的脑管和分化,以取代丢失的神经元1,2,3。揭示轴线脊髓NSC如何保持多能和在损伤后激活,可以为人类患者开发新的治疗策略提供有价值的信息。
由于CRISPR-Cas9基因敲除技术的进步,执行敲除破译基因功能变得更容易,并已证明在各种物种中具有广泛的适用性,包括axolotls4,5,6,7,8.最近发布的完整 axolotl 基因组和转录组现在允许任何基因组位点被靶向,并更好地评估偏离目标的效果 9,10,11,12,13,14.使用CRISPR-Cas9系统15,为敲除和敲击的轴线开发了优化的协议。以CAS9蛋白-gRNA核糖核蛋白(RNP)的形式交付CRISPR-Cas9机械,已经证明比使用Cas9和gRNA编码质粒4更有效。这可能是由于RNP比质粒载体尺寸小,它能够立即产生DNA断裂,并保护gRNA免受RNA降解。此外,使用 RNP 可绕过转录和翻译;因此,当质粒元素来自不同的物种时,它避免了启动子强度和最佳柯顿使用等问题。
功能丧失研究是研究感兴趣的基因的潜在功能的一般方法之一。为了研究再生过程中的基因功能,最好在受伤前进行敲除,以避免对发育的影响。此外,淘汰应限于 NSC 和再生区域。在所有NSC(包括大脑中的目标基因,即Cre-LoxP系统中)中,目标基因的敲除可能产生与再生无关的效果,从而混淆结果的解释。幸运的是,在NSC中,轴线脊髓的结构为时间和空间受限的淘汰提供了一个独特的机会。大多数脊髓NSC与中央运河接触,构成与中央运河接触的绝大多数细胞16、17。因此,将CAS9-gRNA复合物注射到中央通道,然后进行电穿孔,允许在4、18、19的特定时间将脊髓NSC输送到所需区域。该协议演示了如何执行,导致目标脊髓NSC的高度穿透性敲除。然后进行后续分析,以研究对再生和NSC行为的影响。
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Protocol
所有动物实验必须按照地方和国家动物实验条例进行,并经有关机构审查委员会批准。
1. 准备CAS9-gRNA RNP组合
- 设计和合成gRNA。
注:请参阅其他出版物,用于设计和合成gRNA,包括一份专门涉及axolotls 15、20、21、22的出版物。 - 通过内部制备或商业购买获得CAS9-NLS蛋白质。
- 通过混合5μg的CAS9-NLS蛋白、4μgRNA、0.9μL的10xCAS9缓冲液,将卡西至10μL,用无核酸酶H2O.Aliquot混合混合物,如果不立即使用,将混合物储存在-80°C。
2. 准备用于电穿孔的甘蔗板
- 在 1x DPBS 中制备 200 mL 的 2%(wt/vol)角胶溶液。在微波炉中加热溶液,将其倒入10厘米培养皿,深度约10毫米(深度足以覆盖整个动物)溶解。
- 让板在室温下凝固。如果不立即使用,将盘子存放在 4°C。
- 使用手术手术刀,切割甘蔗板,使一个缝,以举行尾巴直,一个孔适合在动物的身体,和两个额外的孔放置电极(图1E)。
- 将盘子放在冰上,用冰冷的 1x DPBS 填充到边缘。使用相同的 DPBS 溶液制作板,以确保在设置中一致的电导率。
3. 配置电孔
- 配置电孔。设置孔隙脉冲,由一个 70 V 的双极脉冲组成,持续时间为 5 ms,间隔为 50 ms,且无电压衰减。设置传输脉冲,使之具有四个 40 V 的双极脉冲,持续时间为 50 毫秒,间隔为 999 ms,电压衰减为 10%。
- 将电极连接到电波器,并将钳子调整为 7 mm。在电穿孔之前和之间将电极浸入 DPBS 的烧杯中。
4. 准备和装载微注射玻璃毛细血管
- 根据制造商的说明,对燃烧/棕色微移液器拉拔器执行斜坡测试,以确定热值。
- 使用以下参数使用锥形末端的拉注射毛细管:热 + 斜坡测试值,拉力 = 100,速度 = 100,时间 = 100。
- 在立体显微镜下观察针头。使用细钳子,以一定角度折断毛细管,使其有倾斜的尖端。打破一个位置,它足够薄,以瞄准中央运河,同时足够强大,以刺穿皮肤。
注:直径约为20μm或脊髓直径约50%的点是一个很好的起点。可能需要多次尝试才能获得最佳中断。 - 以 1:30 的比例向 RNP 混合物添加快速绿色 FCF 溶液,使用 Microloader 移液器尖端将约 5 μL 的喷射混合物加载到毛细管中。
- 将毛细管安装在气动泵上,倾斜的尖端朝下。
5. 配置气动泵
- 配置气动泵。将保持设置为每平方英寸 (psi) 0.5 磅,弹出至 2 psi 保持,持续时间设置为封闭。
- 通过将毛细管浸入一滴水中并按脚踏板进行喷射,测试毛细管和气动泵设置。确保注射混合物以缓慢但稳定的流流出。
- 如果喷射混合物开始自发泄漏或水吸出毛细管,则调整保持压力。如果注射混合物出来太慢,增加喷射压力或折断更多的毛细管。如果喷射出速过快,则降低喷射压力。
6. 将RNP混合物注射到脊髓中
- 用0.03%苯甲酸溶液麻醉阿索洛特至少10分钟。检查动物在水中翻转它们时没有反应。
- 拿起一只带环钳的动物,放在硅床上,动物的左侧朝上,尾巴朝右。将注射部位置于立体显微镜视野的中间(图1A)。
- 调整微操作器,使毛细管从视野右侧以 60° 的速度进入(图 1B)。
- 识别脊髓和中央管网 (图 1C)。
注:脊髓是诺托乔德上方的管状结构。 - 瞄准中央管道,向前移动毛细管,轻轻地将皮肤和肌肉穿入脊髓的中央管道。将毛细管的运动限制在小步,因为脊髓正好在尾肌下方。
- 按住脚踏板,将混合物注入中央运河。观察 RNP 混合物是否沿中央运河以两个方向的蓝线分布,这表明毛细管的位置已正确(图 1D)。
- 如果没有发生这种情况,请按住脚踏板,同时稍微将毛细管移入和移出,直到 RNP 混合料开始进入。如果毛细管被组织堵塞,在更高的压力下将其喷射入水中以清除。
- 调整喷射压力,使其足以使 RNP 混合物在中央运河中扩散,但与其说是吹起结构,则不致。
- 继续按住脚踏板,使注射混合物沿着中央运河进一步扩散,直到它到达脊髓末端的端囊和脑心室。
注:这可能需要长达2分钟,具体取决于动物的大小。可能需要在一段时间后增加压力,使 RNP 混合物进入脑心室。 - 注射成功后,尽快进行电穿孔。
7. 电穿孔
- 将动物用环钳转移到冰上准备好的角质电穿孔板(图1E)。将尾巴放在缝隙内,使其被甘蔗夹住(图1F)。
- 将电极放入尾部两侧的井中。确保整个动物和电极被冰冷的PBS覆盖。
- 按下脚踏开关以启动电穿孔。
- 电穿孔完成后,将动物送回水中。
- 如有必要,继续注射更多动物。
- 检查电检动物在麻醉后是否健康,尾部没有损伤。
8. 评估淘汰效率
- 固定电镀动物的尾巴。对尾部进行横截面,然后进行免疫性化学成分染色,以评估在蛋白质水平上敲除的效率。
注:如果在电穿孔后进行尾部截肢,则切断的尾部可用于此目的。例如,用gRNA电对Gfp或酪氨酸酶的电化动物,可以用作负对照4。 - 或者,电镀脊髓可以提取和解解DNA。执行基因分型PCR,然后桑格测序或下一代测序,以评估编辑遗传位点15的百分比。
注: 由此产生的编辑效率将低估 NSC 的实际编辑效率,因为包含非电化细胞和神经元,这些细胞和神经元缺乏与中央流明的接触,因此不会接收 RNP 组合。
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Representative Results
CAS9-gRNA复合物对Sox2的注射和电穿孔进入轴球脊髓中央管,导致大多数脊髓NSC中SOX2免疫反应性严重丧失,以gRNA对酪氨酸酶(Tyr)作为对照(图2)A.B3-tubulin(与TUJ1染色)是神经元的标记物,在NSCs中没有表达,而围绕中央管道的SOX2-TUJ1-细胞被认为是含有Sox2缺失的细胞。通过CAS9-Sox2-gRNA电穿孔(图2B),定量显示Sox2在大量NSC中被淘汰,表明该方法在脊髓NSC中有效、高穿透性的基因敲除。
同时注射和电穿孔后,将两种CAS9-gRNA复合物分别与Sox2和Gfp混合成具有无处不在的GFP表达(CAGGS-GFP)的转基因合成体,这是双敲出NSC的高百分比观察到(图2C,D),表明该协议可用于灵活地敲除多个基因。
图 1:轴线脊髓注射和电穿孔。(A) 显示CAS9-gRNA RNP注射到轴线脊髓中央管的原理图。(B) 注射的微操作器设置。(C) 通过轴线尾部的立体显微镜观察,显示脊髓。(D) 通过带有注射脊髓的轴线尾部的立体显微镜观察。(E) 电穿孔板的原理图.(F) 放置在电穿孔板内的动物和电极的示意图,准备进行电穿孔。刻度杆 = 1 mm。这个数字改编自阿尔博斯和田中18。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2: 代表性的淘汰导致弓形脊髓 NSC.(A) CAS9-Sox2-gRNA(n = 21) 的脊髓注射和电穿孔导致大多数 NSC 在电化后 15 天内因免疫组织化学染色而损失 SOX2。CAS9-Tyr-gRNA(n = 21)作为阴性对照。刻度条 = 100 μm。(B) 量化显示 SOX2+ NSCs 显著减少(p < 0.001 通过学生 t 测试),将围绕中央运河的 SOX2-TUJ1- 细胞计算为 NSC,其中藏有Sox2删除。错误条 = SD. (C) 同时注射和电穿孔Sox2-gRNA 和Gfp-gRNA 耦合到 CAS9 (n = 6) 导致大多数 NSC 通过免疫组织化学染色损失 SOX2 和 GFP。CAS9-Tyr-gRNA (n = 6) 作为负控制。刻度条 = 100 μm。(D) 量化显示,在所有有删除内容的目标 NS 中,大多数 (94%)包含双重删除 (GFP+ SOX2+),仅包含很小的比例 (6%)具有单次删除(GFP+ SOX- 或 GFP- SOX2+)。这个数字是改编自费等人4。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
所述协议允许在轴线脊髓的NSC中进行时间和空间限制基因敲除。当前协议允许在定义的时间和位置对 NSC 进行特定定位,且渗透性较高。它避免了在使用 Cre-LoxP 系统时在其他地区(如大脑)中来自 NSC 中基因敲除的潜在不良效应。它还避免了来自持续淘汰的发育影响,允许研究以再生为重点的基因功能。此外,该协议可以在野生型动物中执行,避免产生Cre-LoxP系统所需的额外转基因轴胶所需的长时间等待。它还提供了同时敲除多个基因的多功能性,具有高度的穿透力,允许在F0动物身上进行实验。重要的是,这个程序被证明对尾巴和脊髓再生4没有明显的影响。
CAS9蛋白-gRNARNP复合物的使用也比使用Cas9和gRNA表达质粒4的系统效率高得多。这可能是由于RNP复合物比质粒尺寸更小,以及差异性科顿使用影响从哺乳动物系统衍生的质粒的CAS9蛋白的表达。此外,由于CAS9蛋白-gRNA RNP复合物可以立即诱导断裂,因此迅速发生敲除。在电穿孔24小时以内,通过基因分型PCR观察到60%-70%的修饰基因组位点(数据未显示)。此外,还可以通过共同电化维修模板来使用此策略执行敲击。有许多敲撞策略可用,其细节和注意事项不在本出版物的范围之内,但在另一份出版物15中对此进行了详细说明。
另一方面,此协议确实有一些限制。染色或基因分型PCR通常需要评估每个实验动物的淘汰程度,这可能很辛苦。虽然这种方法的基因敲除在很大程度上仅限于围绕中央运河的NSC,但不能排除其他细胞类型也可能成为目标,因为1)它们也与中央运河接触,或2)RNP组合已经泄漏出中心运河电穿孔前的电渠。在解释结果时,应考虑这些因素。
gRNA 设计
随着最近出版的阿索洛特基因组和转录组,识别轴醇基因及其序列已经变得容易得多9,10,11,12,13。设计gRNA的详细指南已经在其他地方被描述过,包括专门处理axolotls15的指南。建议提前设计和测试至少三个gRNA,提高编辑效率,为实际实验选择最佳设计。gRNA的效率可以通过在单细胞阶段23将CAS9-gRNA混合物注射到新鲜产的axolotl卵子中进行测试。编辑效率可以通过基因分型孵化幼虫来评估。
注射注意事项
由于脊髓的注射部位受到针头和RNP混合物扩散到中央通道外组织造成的物理损伤,因此在远离要分析的区域的位置进行注射非常重要。例如,如果在电穿孔后进行尾部截肢,以研究靶向基因在脊髓再生中的影响,则有必要进行注射,在截肢将切除部位的地方。
使用注射毛细管进入中央通道是该协议最关键的步骤,建议新用户在实际实验前练习。注射最好在脊髓后端的小型动物(小于2.5厘米长)上进行,在那里最容易将毛细管尖端插入中央管道。建议密切观察蓝色 RNP 组合的初始分布。RNP混合物有可能被注射到脊髓周围的脑膜空间。沿着脊髓中间的一条线,一个尖锐和快速的扩散表明成功注射到中央运河18。如果没有东西退出或传播过早停止,建议在将毛细管稍微移入和移出时,保持脚踏板的踩下。如果失败,可能需要重新定位毛细管或检查开口是否堵塞。要使RNP混合物扩散到脑心室,通常需要在末端增加喷射压力。将脑心室填满不是脊髓电穿孔所必需的,但它是RNP混合物被注射到中央管道的最好迹象。
电穿孔注意事项
建议事先优化电穿孔参数,以充分交付RNP到大多数NSC,而不会对其他组织造成广泛损害或杀死动物。该协议已经针对动物优化了2.0-2.5厘米长,大小18。当处理小于此的动物时,可能需要将传输脉冲电压降低到 35 V。另一方面,较大的动物需要更高的电压和/或更多脉冲。此外,电极之间的距离会影响效率。对于较大的动物来说,可能需要将距离减小到 6 mm。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢田中美利教授的持续和长期支持。这项工作得到了国家自然科学基金(国家自然科学基金)资助(317716)、华南师范大学研究启动补助金(S82111和8S0109)和中国博士后科学基金资助(2018M633067)的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
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