Summary
Aquí se presenta un protocolo para realizar el desomo genético con tiempo y espacio restringido en las médulas espinales de axolotl inyectando el complejo CAS9-gRNA en el canal central de la médula espinal seguido de electroporación.
Abstract
El axolotl tiene la capacidad única de regenerar completamente su médula espinal. Esto se debe en gran parte a las células ependimales que permanecen como células madre neurales (NSC) a lo largo de la vida, que proliferan para reformar el tubo ependimal y diferenciarse en neuronas perdidas después de una lesión de la médula espinal. Descifrar cómo estos NSC retienen la pluripotencia después del desarrollo y proliferan sobre la lesión de la médula espinal para reformar la estructura exacta antes de la lesión puede proporcionar información valiosa sobre cómo las médulas espinales de los mamíferos pueden regenerarse, así como posibles opciones de tratamiento. La realización de de knock-outs genéticos en subconjuntos específicos de NSC dentro de un período de tiempo restringido permitirá el estudio de los mecanismos moleculares detrás de estos procesos regenerativos, sin ser confundido por efectos perturbadores de desarrollo. Aquí se describe un método para realizar el knock-out genético en los NSC de la médula espinal axolotl utilizando el sistema CRISPR-Cas9. Al inyectar el complejo CAS9-gRNA en el canal central de la médula espinal seguido de electroporación, los genes diana se eliminan en los NSC dentro de regiones específicas de la médula espinal en el momento deseado, lo que permite estudios moleculares de los SEN de la médula espinal durante Regeneración.
Introduction
La médula espinal de la mayoría de los vertebrados es incapaz de regenerarse después de una lesión, lo que conduce a una discapacidad permanente. Varias salamandras, como el axolotl, son notables excepciones. El axolotl puede regenerar completamente una médula espinal estructuralmente idéntica y restaurar completamente la función de la médula espinal. Gran parte de la capacidad regenerativa de la médula espinal axololol se debe a las células ependímicas. Estas células recubren el canal central, y a diferencia de las de los mamíferos, las células axolomales ependílicos permanecen como células madre neurales (NSC) de desarrollo postembrionario. Después de una lesión de la médula espinal (por ejemplo, a partir de una amputación de cola), estos SCN proliferan para regenerar el tubo ependimal y diferenciarse para reemplazar las neuronas perdidas1,2,3. Descubrir cómo los NSC de la médula espinal axolotl siguen siendo pluripotentes y se activan después de la lesión puede proporcionar información valiosa sobre el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para pacientes humanos.
Debido a los avances en la técnica de eliminación del gen CRISPR-Cas9, la realización de noqueos para descifrar la función génica se ha vuelto más fácil y se ha demostrado que tiene una amplia aplicabilidad en varias especies, incluyendo axolotls4,5, 6 , 7 , 8. La reciente publicación del genoma y transcriptoma completos del axolotl ahora permite atacar cualquier locus genómico y evaluar mejor los efectos fuera del objetivo9,10,11,12 , 13 , 14. Se han desarrollado protocolos optimizados para knock-out y knock-in en axolotls utilizando el sistema CRISPR-Cas915. Se ha demostrado que la entrega de la maquinaria CRISPR-Cas9 en forma de ribonucleoproteína CAS9 proteína-gRNA (RNP) es más eficiente que el uso de Plásmidos con codificación Cas9 y gRNA4. Esto es probablemente debido a que el RNP es más pequeño en tamaño que los vectores plásmidos, su capacidad para crear rupturas de ADN inmediatamente, y la protección del ARNR de la degradación del ARN. Además, el uso de RNPs evita la transcripción y la traducción; por lo tanto, evita cuestiones como la fuerza promotora y el uso óptimo de codón cuando los elementos plásmidos se derivan de una especie diferente.
Los estudios de pérdida de funciones son uno de los enfoques generales para investigar las posibles funciones de los genes de interés. Con el fin de estudiar la función génica durante la regeneración, un knock-out debe realizarse idealmente justo antes de una lesión para evitar efectos en el desarrollo. Además, el knock-out debe limitarse tanto a los NSC como a la región de regeneración. Un nocaut del gen objetivo en todos los SCN (incluidos los del cerebro, que es el caso en los sistemas Cre-LoxP), puede producir efectos no relacionados con la regeneración que pueden confundir la interpretación de los resultados. Afortunadamente, la estructura de la médula espinal axolotl proporciona una oportunidad única para el desaqueo con tiempo y espacio restringido en los NSC. La mayoría de los NSC de la médula espinal están en contacto con el canal central y constituyen la gran mayoría de las células en contacto con el canal central16,17. Por lo tanto, una inyección del complejo CAS9-gRNA en el canal central, seguida de electroporación, permite la administración a los NSC de la médula espinal en una región deseada en un momento específico4,18,19. Este protocolo demuestra cómo se lleva a cabo esto, lo que conduce a un nocaut altamente penetrante en los NSC de la médula espinal objetivo.
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Protocol
Todos los experimentos con animales deben llevarse a cabo de conformidad con las reglamentaciones locales y nacionales sobre experimentación con animales y con la aprobación de la junta de revisión institucional pertinente.
1. Preparación de la mezcla CAS9-gRNA RNP
- Diseñar y sintetizar gRNAs.
NOTA: Consulte otras publicaciones para diseñar y sintetizar ARNm, incluida una exclusivamente relativa a axolotls15,20,21,22. - Obtenga la proteína CAS9-NLS preparándola internamente o comprándola comercialmente.
- Preparar la mezcla CAS9-gRNA mezclando 5 g de proteína CAS9-NLS, 4 g de gRNA, 0,9 l de tampón CAS9 de 10x, y llenar el volumen a 10 ml con H2O sin nucleasa, Aliquot la mezcla y almacenar a -80 oC si no se utiliza inmediatamente.
2. Preparación de placas de agarosa para electroporación
- Preparar 200 ml de solución de agarosa al 2% (wt/vol) en 1x DPBS. Disolver calentando la solución en un microondas y verterla en platos Petri de 10 cm a una profundidad de unos 10 mm (lo suficientemente profundo como para cubrir a todo el animal).
- Deje que las placas se solidifiquen a temperatura ambiente. Almacene las placas a 4 oC si no se utilizan inmediatamente.
- Usando bisturíes quirúrgicos, corte la placa de agarosa para hacer una hendidura para sostener la cola recta, un pozo para el ajuste en el cuerpo del animal, y dos pozos adicionales para la colocación de los electrodos (Figura1E).
- Coloque el plato sobre hielo y llénelo hasta el borde con hielo frío 1x DPBS. Utilice la misma solución DPBS para fabricar las placas a fin de garantizar una conductividad eléctrica constante en la configuración.
3. Configuración del electroporator
- Configure el electroporator. Configure el pulso de porte para que consista en un pulso bipolar de 70 V, con una duración de 5 ms, intervalo de 50 ms y sin descomposición de tensión. Configure el pulso de transferencia para tener cuatro pulsos bipolares de 40 V, con una duración de 50 ms, intervalo de 999 ms y una decaimiento de voltaje del 10%.
- Conecte los electrodos al electroporator y ajuste las pinzas para que estén separadas por 7 mm. Sumerja los electrodos en un vaso de precipitados de DPBS antes y entre electroporación.
4. Preparación y carga de capilares de vidrio de microinyección
- Realice una prueba de rampa en un tirador de micropipeta en llamas/marrón según las instrucciones del fabricante para determinar el valor de calor.
- Tire de los capilares de inyección con extremos cónicos utilizando los siguientes parámetros: valor de prueba de rampa de calor, valor de rampa, tira de 100, velocidad 100, tiempo a 100.
- Observe la aguja bajo un estereomicroscopio. Usando fórceps finos, romper el capilar en un ángulo para que tenga una punta inclinada. Romper en una posición donde es lo suficientemente delgado como para apuntar al canal central, mientras que es lo suficientemente fuerte como para perforar la piel.
NOTA: El punto en el que el diámetro es de aproximadamente 20 m o alrededor del 50% del diámetro de la médula espinal es un buen punto de partida. Es posible que se necesiten varios intentos para obtener una rotura óptima. - Agregue la solución Fast Green FCF a la mezcla RNP a una proporción de 1:30 y cargue aproximadamente 5 sL de mezcla de inyección en el capilar con una punta de pipeta Microloader.
- Monte el capilar en la bomba neumática, con la punta inclinada hacia abajo.
5. Configuración de la bomba neumática
- Configure la bomba neumática. Establezca la retención en 0,5 libras por pulgada cuadrada (psi), expulse a 2 psi y la duración a gated.
- Pruebe los ajustes capilares y neumáticos de la bomba sumergiendo el capilar en una gota de agua y presionando el pedal para inyectar. Asegúrese de que la mezcla de inyección salga en un flujo lento pero constante.
- Ajuste la presión de retención si la mezcla de inyección comienza a salirse espontáneamente o se aspira agua al capilar. Aumente la presión de eyección o rompa más del capilar si la mezcla de inyección está saliendo demasiado lenta. Disminuya la presión de eyección si la inyección está saliendo demasiado rápido.
6. Inyección de la mezcla de RNP en la médula espinal
- Anestetizar axolotls en 0.03% solución de benzocaína durante al menos 10 min. Compruebe que los animales no son sensibles volteándolos boca abajo en el agua.
- Recoger un animal con fórceps anillo y ponerlo en un lecho de silicio, con el lado izquierdo del animal hacia arriba y la cola apuntando hacia la derecha. Coloque el lugar de inyección en el centro del campo de visión del estereomicroscopio (Figura1A).
- Ajuste el micromanipulador de modo que el capilar entre a 60o desde el lado derecho del campo de visión (Figura1B).
- Identificar la médula espinal y el canal central (Figura1C).
NOTA: La médula espinal es la estructura tubular por encima del notochord. - Apuntando al canal central, mueva el capilar hacia adelante para perforar suavemente la piel y el músculo en el canal central de la médula espinal. Limite el movimiento del capilar a pequeños pasos, ya que la médula espinal está justo debajo de los músculos de la cola.
- Mantenga pulsado el pedal para inyectar la mezcla en el canal central. Observe si la mezcla RNP se extiende a lo largo del canal central como una línea azul en ambas direcciones, lo que muestra que el capilar se ha posicionado correctamente (Figura1D).
- Si esto no ocurre, mantenga pulsado el pedal mientras mueve el capilar ligeramente dentro y fuera hasta que la mezcla RNP comience a entrar. Si el capilar se obstruye por el tejido, elimítelo expulsándolo en el agua a presiones más altas.
- Ajuste la presión de eyección de modo que sea suficiente para hacer que la mezcla RNP se propague en el canal central, pero no tanto como para volar la estructura.
- Continúe manteniendo presionado el pedal para que la mezcla de inyección se extienda aún más a lo largo del canal central, hasta que llegue a la vesícula terminal al final de la médula espinal y los ventrículos en el cerebro.
NOTA: Esto puede tardar hasta 2 minutos dependiendo del tamaño del animal. Puede ser necesario aumentar la presión después de algún tiempo para hacer que la mezcla RNP entre en los ventrículos cerebrales. - Proceda tan pronto como sea posible a la electroporación después de la inyección exitosa.
7. Electroporación
- Transfiera al animal con fórceps de anillo a la placa de electroporación de agarosa preparada (Figura1E)sobre hielo. Coloque la cola dentro de la hendidura para que sea emparedado por agarosa (Figura1F).
- Coloque los electrodos en los pozos a ambos lados de la cola. Asegúrese de que todo el animal y los electrodos estén cubiertos por PBS helado.
- Pulse el interruptor del pie para iniciar la electroporación.
- Una vez completada la electroporación, devuelva al animal al agua.
- Proceda a inyectar más animales si es necesario.
- Compruebe que los animales electroportados estén sanos después de que la anestesia desaparezca y que no haya daños en la cola.
8. Evaluación de la eficiencia de la eliminación
- Fije la cola del animal electroportado. Hacer secciones transversales de la cola seguidas de tinción inmunohistoquímica para evaluar la eficiencia del knock-out a nivel proteico.
NOTA: Si se va a realizar una amputación de cola después de la electroporación, la cola cortada podría utilizarse para este propósito. Los animales electroportados con ARNm contra Gfp o tirosinasa, por ejemplo, se pueden utilizar como control negativo4. - Alternativamente, la médula espinal electroporada podría ser extraída y lysed para el ADN. Realizar pcR de genotipado seguido de secuenciación de Sanger o secuenciación de próxima generación para evaluar el porcentaje de loci genético editado15.
NOTA: La eficiencia de edición resultante subestimará la eficiencia de edición real para los SNS, debido a la inclusión de células no electroporadas y neuronas que carecen de contacto apical con el lumen central y por lo tanto no recibirán la mezcla RNP.
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Representative Results
La inyección y electroporación del complejo CAS9-gRNA contra Sox2 en el canal central de la médula espinal axolol condujo a una pérdida masiva de inmunoreactividad SOX2 en la mayoría de los NSC de la médula espinal, con EL RNA contra la tirosinasa (Tyr) como control (Figura 2 A). B3-tubulina (manchado con TUJ1) es un marcador para las neuronas y no se expresó en NSCs, y las células SOX2- TUJ1- que rodeaban el canal central se consideraron células que albergaban eliminaciones de Sox2. La cuantificación mostró a Sox2 noqueado en un número significativo de SSC por electroporación CAS9-Sox2-gRNA (Figura2B),lo que indica que este método condujo a un nocaut genético eficiente y altamente penetrante en los NSC de la médula espinal.
Después de la inyección simultánea y la electroporación, la mezcla de dos complejos CAS9-gRNA contra Sox2 y Gfp, respectivamente, en axolotls transgénicos con expresión GFP ubicua (CAGGS-GFP), un alto porcentaje de NSC de doble knock-out fueron observados (Figura2C,D),lo que indica que el protocolo se puede utilizar para eliminar de forma flexible múltiples genes.
Figura 1 : Inyección de la médula espinal de Axolotl y electroporación. (A) Esquema que muestra la inyección de CAS9-gRNA RNP en el canal central de la médula espinal axolotl. (B) Configuración del micromanipulador para la inyección. (C) Ver a través de un estereomicroscopio de la cola de axolotl, con la médula espinal indicada. (D) Ver a través de un estereomicroscopio de la cola de axolotl con una médula espinal inyectada. (E) Esquema de la placa de electroporación. (F) Esquema del animal y los electrodos colocados dentro de la placa de electroporación, listos para la electroporación. Barras de escala de 1 mm. Esta figura está adaptada de Albors y Tanaka18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Resultados representativos de la médula espinal de axolotl. (A) La inyección de la médula espinal y la electroporación de CAS9-Sox2-gRNA (n.o 21) llevaron a la pérdida de SOX2 en la mayoría de los SCN a los 15 días después de la electroporación (dpE) por tinción inmunohistoquímica. CAS9-Tyr-gRNA (n.o 21) sirvió como control negativo. Barras de escala a 100 m. (B) La cuantificación mostró una reducción significativa en los SCN SOX2+ (p < 0.001 por la prueba t del estudiante), contando las células SOX2- TUJ1- que rodean el canal central como NSCs que albergan una eliminación de Sox2. Barras de error - SD. (C) Inyección simultánea y electroporación de Sox2-gRNA y Gfp-gRNA acoplados a CAS9 (n.o 6) condujeron a la pérdida de SOX2 y GFP en la mayoría de los SSC por tinción inmunohistoquímica. CAS9-Tyr-gRNA (n.o 6) sirve como control negativo. Barras de escala a 100 m. (D) La cuantificación mostró que entre todos los SC específicos que tienen alguna supresión, la mayoría (94%) albergado de doble eliminación (GFP SOX2- ), con sólo una pequeña proporción (6%) eliminación única (GFP+ SOX- o GFP- SOX2+). Esta figura está adaptada de Fei et al.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito permite el desoparamiento de genes restringidos en el tiempo y el espacio en los SCN en la médula espinal del axolotl. El protocolo actual permite la segmentación específica de los SCN en un momento y una ubicación definidos con alta penetrancia. Evita posibles efectos no deseados que se originan en el knock-out de genes en los SCN en otras regiones como el cerebro que se producen cuando se utiliza el sistema Cre-LoxP. También evita los efectos del desarrollo que se originan en un knock-out persistente, permitiendo el estudio de la función génica centrada en la regeneración. Además, este protocolo se puede realizar en animales de tipo salvaje, evitando el largo tiempo de espera necesario para generar axolotls transgénicos adicionales, que es necesario para el sistema Cre-LoxP. También ofrece la versatilidad para eliminar múltiples genes simultáneamente y es altamente penetrante, permitiendo que los experimentos se realicen en animales F0. Es importante destacar que el procedimiento ha demostrado no tener ningún efecto observable en la regeneración de la cola y la médula espinal4.
El uso de complejos CAS9 proteína-gRNA RNP también muestra una eficiencia mucho mayor que los sistemas que utilizan Cas9 y plásmidos expresos de ARNG4. Esto es probablemente debido a un tamaño más pequeño del complejo RNP en comparación con los plásmidos, así como el uso diferencial de codón que afecta a la expresión de la proteína CAS9 de plásmidos derivados de sistemas de mamíferos. Además, dado que los complejos CAS9 proteína-gRNA RNP pueden inducir descansos inmediatamente, el desconexión se produce rápidamente. 60%-70% de los loci genómicos modificados se han observado mediante el genotipado de PCR dentro de 24 h de electroporación (datos no mostrados). También existe la posibilidad de realizar knock-ins usando esta estrategia coelectroporando una plantilla de reparación. Se dispone de una serie de estrategias de nocaut, cuyos detalles y consideraciones están fuera del alcance de esta publicación, pero se describen en detalle en otra publicación15.
Por otro lado, este protocolo tiene algunas limitaciones. Por lo general, se necesita la PCR de tinción o genotipado para evaluar el alcance de la noqueo en cada animal experimental, que puede ser laborioso. Si bien el desprendimiento de genes de este método está restringido en gran medida a los SNS que rodean el canal central, no se puede descartar que otros tipos de células también podrían ser blancos, porque 1) también están en contacto con el canal central, o 2) la mezcla RNP se ha filtrado fuera de la cen canal tral antes de la electroporación. Estos factores deben tenerse en cuenta al interpretar los resultados.
diseño de gRNA
Con el genoma y transcriptoma de axolotl recientemente publicado, la identificación de genes axolotl y sus secuencias se ha vuelto mucho más fácil9,10,11,12,13. Se han descrito guías detalladas en el diseño de gRNAs en otros lugares, incluyendo una que se ocupa exclusivamente de axolotls15. Se recomienda diseñar y probar al menos tres gRNAs para la eficiencia de edición de antemano y elegir el diseño óptimo para el experimento real. La eficiencia del ARNB se puede probar inyectando la mezcla CAS9-gRNA en huevos de axolol recién puestos en la etapa de una célula23. La eficiencia de edición se puede evaluar genotipando las larvas eclosionadas.
Consideraciones de inyección
Dado que el lugar de inyección de la médula espinal sufre de daños físicos causados por la aguja y la propagación de la mezcla RNP a los tejidos fuera del canal central, es importante realizar la inyección en posiciones alejadas de la región de interés a analizar. Por ejemplo, si se realiza una amputación de cola después de la electroporación para estudiar los efectos de un gen específico en la regeneración de la médula espinal, es necesario realizar la inyección donde el sitio será eliminado por amputación.
Entrar en el canal central con un capilar de inyección es el paso más crítico de este protocolo, y se recomienda a los nuevos usuarios practicar antes del experimento real. La inyección se realiza mejor en animales más pequeños (menos de 2,5 cm de largo) en el extremo posterior de la médula espinal, donde es más fácil colocar la punta capilar en el canal central. Se recomienda observar de cerca la propagación inicial de la mezcla RNP de color azul. Existe la posibilidad de que la mezcla de RNP se pueda inyectar en el espacio meningeal alrededor de la médula espinal. Una propagación aguda y rápida como una línea a lo largo de la mitad de la médula espinal indica una inyección exitosa en el canal central18. Si nada sale o la propagación se detiene prematuramente, se recomienda mantener pulsado el pedal mientras mueve el capilar ligeramente dentro y fuera. Si esto falla, puede ser necesario volver a colocar el capilar o comprobar si hay una abertura obstruida. Para que la mezcla de RNP se propague a los ventrículos cerebrales, a menudo es necesario aumentar la presión de eyección hacia el final. Tener los ventrículos cerebrales llenos no es necesario para la electroporación de la médula espinal, pero es la mejor indicación de que la mezcla RNP se ha inyectado en el canal central.
Consideraciones de electroporación
Se aconseja optimizar los parámetros de electroporación de antemano para lograr la entrega suficiente del RNP a la mayoría de los NSC sin causar daños extensos a otros tejidos o matar al animal. Este protocolo ha sido optimizado para animales de 2,0-2,5 cm de largo en tamaño18. Es probable que sea necesaria una reducción en la tensión del pulso de transferencia a 35 V cuando se trabaja con animales más pequeños que este. Por otro lado, los animales más grandes requerirán mayor voltaje y/o más pulsos. Además, la distancia entre los electrodos afecta a la eficiencia. Una reducción de la distancia a 6 mm puede ser necesaria para animales más grandes.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a la Profesora Elly M. Tanaka por su apoyo continuo y a largo plazo. Este trabajo fue apoyado por una Beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) (317716), Becas de Inicio de Investigación de la Universidad Normal del Sur de China (S82111 y 8S0109), y una Beca de la Fundación de Ciencia postdoctoral de China (2018M633067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
- O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
