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Immunology and Infection

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

doi: 10.3791/59853 Published: June 24, 2019

Summary

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

Abstract

I linfociti intraeliali che esprimono il recettore delle cellule T (IEL) svolgono un ruolo chiave nella sorveglianza immunitaria dell'epitelio intestinale. A causa in parte della mancanza di un ligando definitivo per il recettore delle cellule T, la nostra comprensione della regolazione dell'attivazione di IEL e della loro funzione in vivo rimane limitata. Ciò richiede lo sviluppo di strategie alternative per interrogare i percorsi di segnalazione coinvolti nella regolazione della funzione IEL e la reattività di queste cellule al microambiente locale. Anche se gli IEL sono ampiamente compresi per limitare la traslocazione degli agenti patogeni, l'uso dell'imaging intravitale è stato fondamentale per comprendere le dinamiche spatiotemporali delle interazioni IEL/epiteliali a stato costante e in risposta a patogeni invasivi. Qui, presentiamo un protocollo per la visualizzazione del comportamento migratorio IEL nella piccola mucosa intestinale di un topo reporter del cellulare T GFP utilizzando la microscopia laser confocale del disco rotante invertita. Sebbene la profondità massima di imaging di questo approccio sia limitata rispetto all'uso della microscopia a scansione laser a due fotoni, la microscopia laser confocale a disco rotante offre il vantaggio dell'acquisizione di immagini ad alta velocità con fotobleaching ridotto e Photodamage. Utilizzando il software di analisi delle immagini 4D, il comportamento di sorveglianza delle cellule T e le loro interazioni con le cellule vicine possono essere analizzati in seguito alla manipolazione sperimentale per fornire ulteriori informazioni sull'attivazione e il funzionamento dell'IEL all'interno della mucosa intestinale.

Introduction

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I linfociti intraeliali (IEL) si trovano all'interno dell'epitelio intestinale e si trovano sia lungo la membrana del seminterrato che tra celle epiteliali adiacenti nello spazio intercellulare laterale1. C'è circa un IEL per ogni 5-10 cellule epiteliali; questi IEL servono come sentinelle per fornire la sorveglianza immunitaria della grande distesa della barriera epiteliale intestinale2. Gli IEL che esprimono il recettore delle cellule T (TCR) costituiscono fino al 60% della popolazione totale di IEL nell'intestino piccolo murno. Studi condotti su topi carenti di cellule T dimostrano un ruolo in gran parte protettivo di queste cellule in risposta a lesioni intestinali, infiammazione e infezione3,4,5. Nonostante la generazione del topo a eliminazione diretta Tcrd 6, la nostra comprensione della biologia della IEL rimane limitata in parte a causa del fatto che i ligandi riconosciuti da z - il TCR sono ancora da identificare7 . Di conseguenza, la mancanza di strumenti per studiare questa popolazione cellulare ha reso difficile studiare il ruolo dell'attivazione e della funzione della TCR in condizioni fisiologiche e patologiche. Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato tecniche di imaging dal vivo per visualizzare il comportamento migratorio di IEL e le interazioni con gli enterociti vicini come mezzo per fornire ulteriori informazioni sulla funzione IEL e sulla reattività agli stimoli esterni in vivo.

Nell'ultimo decennio, l'imaging intravitale ha ampliato significativamente la nostra comprensione degli eventi molecolari coinvolti in molteplici sfaccettature della biologia intestinale, tra cui lo spargimento delle cellule epiteliali8, regolazione della funzione di barriera epiteliale9 ,10, campionamento di cellule mieloidi del contenuto luminale11,12e interazioni host-microbe11,13,14,15,16 . Nel contesto della biologia IEL, l'uso della microscopia intravitale ha fatto luce sulle dinamiche spatiotemporali della motilità IEL e sui fattori che mediano il loro comportamento di sorveglianza13,14,15, 16. Lo sviluppo del topo reporter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), che etichetta gli IEL con l'espressione nucleare della GFP17, ha rivelato che gli IEL sono altamente motili all'interno dell'epitelio e presentano un comportamento di sorveglianza unico che risponde al microbico infezione17,13,14. Recentemente, è stato sviluppato un altro topo di reporter delle cellule T (Tcrd-GDL) che esprime GFP nel citoplasma per consentire la visualizzazione dell'intera cellula18. Metodologia simile è stata utilizzata per studiare il requisito di recettori chemiochine specifici, come il recettore accoppiato a proteina G (GPCR)-18 e -55, sulla dinamica della motilità IEL19,20. In assenza di un reporter specifico per le cellule, sono stati utilizzati anticorpi coniugati fluorescenti contro CD8, per visualizzare e tracciare la motilità IEL in vivo19,20. Sebbene la microscopia a scansione laser a due fotoni sia comunemente utilizzata per l'imaging intravitale, l'uso della microscopia laser confocale confocale a disco rotante offre vantaggi unici per catturare immagini multicanale ad alta velocità e ad alta risoluzione con un minimo rumore di fondo. Questa tecnologia è ideale per chiarire le dinamiche spatiotemporali delle interazioni immuno/epiteliali all'interno del complesso microambiente della mucosa intestinale. Inoltre, attraverso l'uso di vari modelli murini transgenici e/o ad eliminazione diretta, questi studi possono fornire informazioni sulla regolazione molecolare della funzione immunitaria e/o delle cellule epiteliali intestinali.

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Protocol

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Tutti gli studi sono stati condotti in una struttura accreditata dall'Associazione della valutazione e dell'accreditamento della cura degli animali di laboratorio (AALAC) secondo i protocolli approvati dalla Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources.

1. Preparazione del mouse

NOT: La seguente procedura, compresa la preparazione e l'intervento chirurgico, prenderà 30-40 min. Prima dell'intervento chirurgico, accenderà il microscopio e riscalderà l'incubatrice chiusa al microscopio a 37 gradi centigradi.

  1. Eseguire esperimenti su mouse TcrdEGFP di 8-10 settimane su uno sfondo C57BL/6, ottenuti da Bernard Malissen (INSERM, Parigi, Francia). Secondo la procedura approvata da IACUC, anestesizzare il topo mediante iniezione i.p. di ketamina (120 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) in base al peso dell'animale. Valutare il livello di anestesia per frequenza respiratoria (55-65 respiri al minuto)21, pizzico e riflesso palpebrale.
  2. Una volta raggiunta l'anestesia del piano chirurgico, fissare le zampe posteriori del mouse utilizzando il nastro adesivo su un pad di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea, che può essere monitorata dal termometro rettale. Se ci sono segni che l'anestesia si sta consumando (ad esempio, aumento del tasso di respirazione, lampeggiante e/o risposta contrazioni del muscolo oculare al riflesso palpebrale), re-amministrare 50 -L di ketamina/xylazina alla volta fino a quando il mouse è completamente sedato.
  3. Preparare il tintura nucleare diluindo 50 gradi l di Hoechst 33342 (10 mg/mL) con 315 lun dello 0,9% di salina; la concentrazione finale è di 37,5 mg/kg in base al peso del topo (200 -l volume approssimativo). Una volta che il topo è anestesizzato, iniettare lentamente il Hoechst utilizzando una siringa di tubercolina attraverso il seno venoso retro-orbitale.
    NOT: Attendere 1–2 minuti prima di procedere al passaggio successivo per consentire al topo di acclimatarsi al cambiamento di volume circolante dopo l'iniezione retroorbitale.
  4. Posizionare una piccola quantità di lubrificante sugli occhi per evitare che si asciughino.

2. Chirurgia del topo: Laparotomia per esporre Mucosa intestinale

  1. Fare un'incisione verticale di 2 cm attraverso la pelle e peritoneo lungo la linea mediana dell'addome inferiore per esternalizzare la regione dell'intestino da immaginare.
  2. Utilizzando pinze angolate, estrarre attentamente il cecum dalla cavità peritoneale e identificare l'area dell'intestino tenue da immaginare. Fare attenzione a non strappare i vasi sanguigni mesentici durante questo processo. Per ridurre al minimo i potenziali danni o sanguinamento, evitare di afferrare o pizzicare l'intestino con le pinze.
  3. Individuare una regione adatta di intestino tenue (2-3 cm) per l'imaging che contiene un contenuto fecale minimo. Restituire con attenzione il cecum e l'intestino tenue rimanente nella cavità peritoneale, lasciando il segmento di interesse esternalizzato.
    NOT: Evitare di perforare il cecum o interrompere la vascolatura mesenterica durante questo passaggio.
  4. Posizionare due paia di pinze su entrambi i lati della mesenteria sottostante tra i vasi sanguigni e strofinare delicatamente le punte delle pinze insieme per creare un foro nella membrana (Figura 1)22. Questo permetterà all'ago di passare attraverso la mesenteria quando si chiude la cavità peritoneale sotto l'intestino.
  5. Chiudere l'incisione mantenendo il ciclo dell'intestino esternalizzato. Utilizzando pinze angolate e un ago curvo, punto di cono attaccato a una sutura di 5 cm, penetrare un lato del peritoneo, passare attraverso il foro fatto nella fase precedente, e verso l'alto attraverso l'altro lato del rivestimento peritoneale. Posizionare una sutura nella parte superiore e un'altra vicino alla parte inferiore dell'incisione.
    NOT: Evitare di danneggiare la vascolatura durante questo passaggio.
  6. Ripetere questo processo per chiudere la pelle sotto il ciclo intestinale, posizionando una sutura al centro dell'incisione, tra le suture precedenti nel peritoneo sottostante.
    NOT: È importante esternalizzare solo l'area da immaginare; questo ridurrà il movimento estraneo durante l'imaging. Assicurati di evitare di legare le arterie mesentiche.
  7. Utilizzare un elettrocauterio per fare una linea di perforazione lungo il bordo antimesente. Immediatamente dopo la cauterizzazione, applicare alcune gocce d'acqua sulla superficie dell'intestino per evitare ulteriori danni ai tessuti indotti dal calore. Far fluttuare con un Kimwipe per rimuovere l'acqua residua.
  8. Tagliare una piccola scheggia orizzontale sul bordo distale del tessuto cauterizzato utilizzando le forbici Vannas e procedere a tagliare lungo la lunghezza della linea cauterizzata verso l'estremità prossimale del segmento del tessuto esterno (circa 1,5 cm di lunghezza) per esporre il mucosa superficie.
    NOT: Se necessario, utilizzare pinze per rimuovere delicatamente qualsiasi contenuto fecale in eccesso rimanente sulla superficie mucosa esposta.
  9. Coprire l'addome del topo con un Kimwipe umido per evitare che il tessuto si disidrati. Trasportare il topo al microscopio in una nave coperta.

3. Acquisizione di immagini da microscopia confocale disco rotante

  1. Pipette 150 - L of 1 XM AlexaFluor 633 in HBSS sul fondo in vetro ritagliato di un piatto da 35 mm. Posizionare il mouse in modo che la superficie mucosa aperta contatti direttamente lo scivolo.
  2. Inclinare la testa del microscopio indietro e posizionare il mouse sul piatto ritagliato sullo stadio di imaging in un'incubatrice preriscaldata. In alternativa, coprire il mouse con una coperta riscaldante per mantenere la temperatura corporea.
  3. Avviare il software di imaging. L'intensità di eccitazione e il tempo di esposizione per ogni laser non devono superare rispettivamente 10-15 mW o 120-150 ms, per evitare il fotosbiancamento e ridurre al minimo l'intervallo tra i punti temporali. Regolare la media del fotogramma su "2" e attivare la funzione di guadagno EM per ridurre il rumore di fondo. Selezionare la calibrazione obiettivo 63x per garantire la corretta misurazione delle dimensioni in pixel.
    NOT: Le impostazioni descritte in precedenza hanno lo scopo di fornire un riferimento iniziale, ma variano a seconda delle singole configurazioni del microscopio.
  4. Utilizzando il laser da 405 nm e l'obiettivo dell'aria 20x, visualizzare i nuclei per individuare un campo di villi che non hanno un movimento evidente o una deriva a occhio. Evitare le aree di movimento artifactuala a causa di respirazione, peristalsi o battito cardiaco.
  5. Utilizzando la scansione XY, registrare la coordinata XY del campo di interesse e passare all'obiettivo 63X di immersione glicerolo.
  6. Verificare che i villi nel campo selezionato siano stabili acquisendo un'immagine live sul canale 405 nm per un massimo di 1 min.
  7. Durante l'acquisizione di un'immagine dal vivo sul canale 405 nm, regolare la messa a fuoco per trovare il piano ortogonale appena sotto la punta villosa. Acquisire le pile a partire da appena sotto l'epitelio di punta villous lungo il villus fino a quando non è difficile risolvere i nuclei, circa 15-20 m, utilizzando un passo di 1,5 m.
    NOT: Quando si crea immagini con tre canali (405, 488, 640 nm) utilizzando i tempi di esposizione descritti in precedenza, è possibile acquisire tutti e tre i canali in sequenza a intervalli di circa 20 s.
  8. Aprire il software in modalità di analisi, 3-5 min dopo l'inizio dell'acquisizione, per confermare la stabilità dell'immagine e la motilità IEL. Continuare ad acquisire immagini per 30-60 min per ogni campo di villi. Registrare 2–3 campi per ogni mouse. Durante l'imaging, monitorare il mouse ogni 5 min.
    NOT: Se l'anestesia inizia a svanire, usare pinze per setacciare delicatamente il collo del mouse per somministrare 50 -L di ketamina/xilarina alla volta. Continuare a monitorare i livelli di anestesia e ri-somministrare quando necessario.
  9. Non è consigliabile immaginare un singolo mouse per più di 4 h. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, sacrifica i topi con la lussazione cervicale seguita da pneumotorace bilaterale.

4. Analisi 4D delle immagini

  1. Importa direttamente i file di imaging nel software di rendering 4D.
  2. Creare singole superfici per gli IEL e il lume, quindi tenere traccia delle superfici nel tempo utilizzando i parametri descritti nella Tabella 1 come riferimento iniziale. Per gli IEL, attivate Dividi gli oggetti toccanti utilizzando il diametro del punto di seme indicato.
  3. Utilizzare l'algoritmo di tracciamento autogressivo per determinare la motilità IEL. Anche se l'algoritmo di rilevamento è relativamente accurato, è imperativo controllare visivamente le tracce per ogni singolo linguaggio IEL. Se una traccia non è corretta, correggerla utilizzando le funzioni Disconnetti e Connetti nella scheda Modifica tracce.
  4. Per determinare la distanza da ogni lecca-leale al lume, selezionate la Superficie del lume ed eseguite la funzione Trasformazione distanza (Distance Transformation) nel menu Strumento (Tool). Quando richiesto, selezionare Superficie esterna. Una volta calcolata, la trasformazione della distanza verrà visualizzata come quarto canale.
  5. Filtrare il valore Intensity min del quarto canale per selezionare gli IEL di z che si trovano all'interno dello spazio intercellulare laterale (LIS). Questo valore deve essere vicino a 15 m, in base all'altezza di una cella epiteliale colonnare. La percentuale di iEL z z all'interno di questo intervallo è riportata come la frequenza degli IEL nel LIS.
  6. Per ulteriori analisi, esportare i dati statistici tra cui: velocità della traccia IEL, spostamento della pista, rettilineo e lunghezza della pista. In alternativa, analizzare i dati utilizzando il modulo Vantage. A seconda dell'esperimento, ottenere metriche aggiuntive dai dati acquisiti, incluso il tempo di permanenza all'interno delle interazioni LIS o IEL/epiteliale.

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Representative Results

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Utilizzando l'imaging intravitale dei topi reporter TcrdEGFP, abbiamo già dimostrato che gli iEL s'esibiscono con un comportamento di sorveglianza dinamica, in cui pattugliano l'epitelio migrando lungo la membrana del seminterrato e nello spazio intercellulare laterale (LIS) a stato (Figura 2, Filmato 1).

Questo approccio può essere utilizzato anche per valutare come l'inibizione di specifiche vie di segnalazione cellulare e/o recettori influenza il comportamento migratorio IEL. Ad esempio, l'interleuchina (IL)-15 è una citochina pleiotropica che è essenziale per l'omeostasi iEL23,24. Per determinare se la segnalazione di IL-15 attraverso il recettore IL-2R contribuisce alla cinetica della motilità di IEL a stato costante, i topi reporter TcrdEGFP sono stati immagini 2 h a seguito della somministrazione dell'anticorpo anti-IL-2R -1 o del controllo igG2b dell'isotipo. Le tracce colorate indicano i percorsi migratori dei singoli , s s. , nel corso di 30 min (Figura 3A). Anche se la frequenza degli IEL nel LIS è stata aumentata nei topi trattati con TM-1 (Figura 3A,B), più del 30% di questi i-ule iELs ha mostrato un comportamento di inattività (Figura 3A,C). Gli IEL di identità sono stati definiti imponendo limiti superiori alla rettilineità della pista e alla lunghezza dello spostamento della pista. Questo fenotipo al minimo è stato confermato da una significativa riduzione sia della velocità istantanea che del rapporto di confinamento dei IEL dopo il blocco il- il-2R, relativo al controllo (Figura 3D,E). Inoltre, gli idilli, gli IEL, hanno tempi di dimora più lunghi e sono stati più frequentemente localizzati all'interno del LIS rispetto ai Milte ( Figura3F).

Figure 1
Figura 1: Utilizzo di pinze per creare un foro nel mesenteria. Posizionare le pinze su entrambi i lati della membrana per creare un foro per le suture. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rappresentante immagine 3D degli IEL s nel jejunum. Un singolo punto temporale è stato selezionato da un video time-lapse di ripreso della mucosa jejunal di un topo reporter TcrdEGFP allo stato stabile. Gli IEL sono mostrati in verde, i nuclei in bianco e il lume in rosso. Barra della scala: 30 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: L'inibizione dell'IL-2R, induce il alminimo IEL nello spazio intercellulare laterale. Questa cifra è stata adattata da "Epitelial IL-15 Is a Critical Regulator of :A Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa." di Hu, M. D. et al. 2018, J Immunol, 201 (2), p. 747-756. 15 Copyright 2018 dell'American Association of Immunologists, Inc. (A) Immagini time-lapse che mostrano immagini di GFP che migrano all'interno dell'epitelio diffamatorio jejunal dopo 2 h con 0,45 mg di IgG2b o TM-1. La motilità dei singoli - IEL (verde) nel corso di 30 min sono mostrati con tracce colorate. I nuclei sono mostrati in bianco e il lume è mostrato in rosso. Barre di scala : 20 m. (B) Frequenza di - IELs nel LIS (n : 3 topi per trattamento, n - 6-7 video). (C) Percentuale di topi trattati con IgG2b o TM-1. (D) Velocità istantanea (n : 13.299 e 9.600 punti temporali). (E) Vengono visualizzati i rapporti di confinamento delle tracce (n - 350 e 278 tracce). (F) Distanza di inattività e motile - ELdal lume. Viene visualizzata la media del valore di SEM. #p< Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

IEL Lumen
Dettaglio della superficie (m) 1.2 (in questo modo) 1.5 1.
Sottrazione dello sfondo (m) 1.67 (in inglese) 2 Il nome del sistema
Diametro dei punti di semi (m) 7.5 7 non pertinente
Filtro: numero di voxel 250 anni 6.500
Tracciamento: distanza massima (m) 10 del sistema 10 del sistema
Tracciamento: distanza massima 2 Il nome del sistema 2 Il nome del sistema

Tabella 1: Impostazioni rappresentative per la generazione IEL e "Superfici" luminose in Imaris. Queste impostazioni possono essere utilizzate come punto di partenza per la generazione e il monitoraggio delle superfici del canale 488 nm (IEL) e del canale di 640 nm (lumen). A seconda delle condizioni sperimentali, potrebbe essere necessario modificare queste impostazioni.

Film 1: Immagini intravitali del GFP comportamento migratorio IEL nel jejunum del mouse. La microscopia intravitale time-lapse della motilità di z EL in jejunum da un topo TcrdEGFP trattato con 0,45 mg di IgG2b. Gli IEL sono mostrati in verde, i nuclei in blu e il lume in rosso. Barra della scala, 20 m. I fotogrammi sono stati raccolti ogni 30 s per circa 30 min. Film è adattato da Hu, M. D. et al. 201815. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

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Discussion

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Lo sviluppo di tecniche di microscopia intravitale ha fornito un'opportunità senza precedenti per osservare la riorganizzazione delle strutture subcellulari8,9,22, interazioni cellule-cellule12, 25 e comportamento migratorio cellulare13,14,15,16,26 in tessuti altrimenti inaccessibili. C'è stata una generale mancanza di strumenti per studiare la regolazione e la funzione degli IEL in vivo18,27, e di conseguenza, l'uso di immagini intravitali ha aperto nuove strade di indagine per quanto riguarda la regolazione molecolare e caratteristiche funzionali delle popolazioni DiEL13,14,15,16,20. In precedenza si presumeva che gli IEL fossero stazionari all'interno della mucosa intestinale28. Tuttavia, un'ulteriore analisi ha dimostrato che queste cellule sono altamente dinamiche, ma migrano più lentamente dei linfociti in organi linfoidi secondari a causa dei confini stretti del compartimento epiteliale13. Inoltre, l'uso dell'imaging in vivo ha fornito ulteriori informazioni sulla dinamica spatiotemporale del comportamento di sorveglianza iEL, compreso il crosstalk tra Gli IEL e le cellule epiteliali che guida la motilità e la funzione IEL13, 14 Del sistema , 15 Mi lasa del sistema , 16. L'analisi di questo comportamento migratorio ha definito nuove metriche per le risposte cellulari IEL che non sarebbero state quantificabili con precisione utilizzando esperimenti ex vivo o in vitro.

Durante l'intera procedura, è essenziale monitorare continuamente il livello di sedazione del mouse. La somministrazione continua di anestesia gassosa (isoflurane) può essere utilizzata come alternativa alla chetamina/xilazina. Quando si esegue la laparotomia, è fondamentale mantenere intatta l'alimentazione neurovascolare per fornire una valutazione accurata della biologia. Legare i vasi sanguigni mesenterici può portare a ipossia e necrosi graduale del tessuto. Al contrario, la recidiva dei vasi sanguigni comporterà sanguinamento nella mucosa esposta, che può ridurre l'intensità di fluorescenza di alcuni canali durante l'imaging. Se gli IEL sviluppano una morfologia arrotondata e smettono di muoversi durante l'acquisizione dell'immagine, ciò potrebbe essere dovuto a una leggera diminuzione della temperatura corporea del mouse. Il posizionamento del sensore di temperatura vicino allo stadio del microscopio assicura che la temperatura nel sito della mucosa esposta sia mantenuta a 37 gradi centigradi. A seconda della stabilità della temperatura della camera di incubazione può essere necessario aumentare la temperatura a 38-39 gradi centigradi.

Una volta che il topo è stato posizionato sullo stadio del microscopio, può essere difficile identificare campi di villi che mancano di un movimento eccessivo a causa della peristalsi o della contrazione dei vasi sanguigni adiacenti. In questo caso, riposizionare il mouse all'interno del piatto o manipolare i fianchi del mouse esternamente nel tentativo di imballare strettamente villi contro il coperchio. In alternativa, il campo di imaging può diventare più stabile pochi minuti dopo aver posizionato il mouse sullo stage. Se c'è una deriva XY graduale durante l'acquisizione, questo può essere corretto utilizzando la correzione della deriva nel software di rendering 4D selezionando 4-5 nuclei che sono presenti in diverse posizioni dell'immagine durante il corso di tempo e tracciando un punto per ogni nucleo. Una volta generati i punti, selezionare Correggi deriva nel menu Modifica traccia per correggere la deriva traslazionale. È importante che la correzione della deriva venga eseguita prima di qualsiasi altra analisi, poiché ciò modificherà le coordinate utilizzate per tenere traccia di altri oggetti nell'immagine.

Sebbene la microscopia a scansione laser a due fotoni consenta un'ampia profondità di imaging utile per penetrare in profondità nei tessuti29, la microscopia confocale del laser a disco rotante ha i suoi vantaggi unici per le applicazioni di imaging intravitale. La microscopia a scansione laser a due fotoni si basa su tubi fotomoltiplicatori (PMT) in grado di rilevare un solo pixel alla volta con un'efficienza quantistica del 40-50%. Al contrario, la microscopia laser confocale rotante a disco utilizza una telecamera CCD (Electron multiplication) per rilevare direttamente fino a un milione di pixel contemporaneamente, aumentando così l'efficienza quantistica al 95%. Di conseguenza, il potenziale di fotosbiancamento e danni fotografici è significativamente ridotto, mentre l'aumento della velocità di acquisizione massimizza la risoluzione temporale quando si immagina la migrazione delle cellule in tessuti più superficiali. Indipendentemente dalla modalità di imaging, questa procedura chirurgica è ideale per esporre la mucosa intestinale per l'imaging al microscopio invertito.

Con la crescente disponibilità di ceppi di topi che esprimono reporter fluorescenti, sonde fluorescenti o ceppi fluorescenti di microrganismi generati in una moltitudine di lunghezze d'onda, le combinazioni per valutare l'intestino in vivo le risposte in tempo reale sono infinite. L'imaging intravitale non solo può fornire nuove informazioni sulle interazioni cellula-cellula e ospite-microbo, ma può anche evidenziare processi molecolari e cellulari dinamici in cellule epiteliali e immunitarie in condizioni omeostatiche o patologiche.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato da NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Ringraziamo Madeleine Hu per la sua assistenza nella modifica del manoscritto e nella fornitura dei dati riportati nei risultati rappresentativi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm dish, No. 1.5 Coverslip MatTek P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide Invitrogen A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G Thermo Fisher Scientific 14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Tuberculin Syringe Thermo Fisher Scientific 14-829-9
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 08-940
Electrocautery Thermo Fisher Scientific 50822501
Enclosed incubation chamber OKOLAB Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length Roboz RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich 55037C
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules Bitplane Software
Inverted DMi8 Leica Microscope
IQ3 (v. 3.6.3) Andor Software
Ketamine Putney Anesthesia
Kimwipes VWR 21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp Roboz RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided Fisher Scientific NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip Roboz RS-5228
Puralube Vet Ointment Dechra Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser Andor Confocal system
Xylazine Akorn Anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).More

Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).

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