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Immunology and Infection

Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

doi: 10.3791/59853 Published: June 24, 2019

Summary

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

Abstract

Les lymphocytes intraépithéliales exprimant le récepteur des lymphocytes T (IEL) jouent un rôle clé dans la surveillance immunitaire de l'épithélium intestinal. En partie à cause de l'absence d'un ligand définitif pour le récepteur des lymphocytes T, notre compréhension de la régulation de l'activation de l'IEL et de leur fonction in vivo reste limitée. Cela nécessite l'élaboration de stratégies alternatives pour interroger les voies de signalisation impliquées dans la régulation de la fonction IEL et la réactivité de ces cellules au microenvironnement local. Bien que les EI soient largement compris pour limiter la translocation des agents pathogènes, l'utilisation de l'imagerie intravitale a été essentielle pour comprendre la dynamique spatiotemporelle des interactions IEL/épithélial à l'état stable et en réponse aux agents pathogènes invasifs. Ici, nous présentons un protocole pour visualiser le comportement migratoire d'IEL dans la petite muqueuse intestinale d'une souris de journaliste de cellule T de GFP utilisant la microscopie focale focale de laser confocal de disque inversé. Bien que la profondeur maximale d'imagerie de cette approche soit limitée par rapport à l'utilisation de la microscopie à balayage laser à deux photons, la microscopie laser confocale du disque tournant offre l'avantage de l'acquisition d'images à haute vitesse avec un blanchiment de photoet et photodamage. À l'aide d'un logiciel d'analyse d'images 4D, le comportement de surveillance des lymphocytes T et leurs interactions avec les cellules voisines peuvent être analysés à la suite d'une manipulation expérimentale afin de fournir un aperçu supplémentaire de l'activation et de la fonction de l'IEL au sein de la muqueuse intestinale.

Introduction

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Les lymphocytes intraépithéliales (IEL) sont situés dans l'épithélium intestinal, et se trouvent à la fois le long de la membrane du sous-sol et entre les cellules épithéliales adjacentes dans l'espace intercellulaire latéral1. Il y a approximativement un IEL pour chaque 5-10 cellules épithéliales ; ces IEL servent de sentinelles pour assurer la surveillance immunitaire de la grande étendue de la barrière épithéliale intestinale2. Les IEL exprimant le récepteur des lymphocytes T (TCR) représentent jusqu'à 60 % de la population totale d'IEL dans l'intestin grêle murine. Des études menées sur des souris déficientes en lymphocytes T démontrent un rôle largement protecteur de ces cellules en réponse à des lésions intestinales, à l'inflammation et à l'infection3,4,5. Malgré la génération de lasouris Kok6 Tcrd , notre compréhension de la biologie IEL reste limitée en partie en raison du fait que les ligands reconnus par le TCR n'ont pas encore été identifiés7. En conséquence, le manque d'outils pour étudier cette population cellulaire a rendu difficile d'étudier le rôle de l'activation et de la fonction de TCR dans des conditions physiologiques et pathologiques. Pour combler cette lacune, nous avons mis au point des techniques d'imagerie en direct pour visualiser le comportement migratoire et les interactions avec les entéroocytes voisins comme un moyen de fournir un aperçu supplémentaire de la fonction ETL et de la réactivité aux stimuli externes in vivo.

Au cours de la dernière décennie, l'imagerie intravitale a considérablement élargi notre compréhension des événements moléculaires impliqués dans de multiples facettes de la biologie intestinale, y compris l'excrétion épithéliale des cellules8, régulation de la fonction de barrière épithéliale9 ,10, échantillonnage de cellules myéloïdes du contenu luminal11,12, et les interactions hôte-microbe11,13,14,15,16 . Dans le contexte de la biologie IEL, l'utilisation de la microscopie intravitale a mis en lumière la dynamique spatiotemporale de la motilité IEL et les facteurs de médiation de leur comportement de surveillance13,14,15, 16. Le développement de souris reporter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), qui étiquettes IELs par l'expression gFP nucléaire17, a révélé que les IEL sont très motiles dans l'épithélium et présentent un comportement de surveillance unique qui est sensible aux microbiens infection17,13,14. Récemment, une autre souris de journaliste de cellule T a été développée (Tcrd-GDL) qui exprime GFP dans le cytoplasme pour permettre la visualisation de la cellule entière18. Une méthodologie similaire a été utilisée pour étudier l'exigence de récepteurs spécifiques de chimiokine, tels que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR)-18 et -55, sur la dynamique de la motilité IEL19,20. En l'absence d'un journaliste spécifique à une cellule, des anticorps conjugués fluorescents contre cD8 ont été utilisés pour visualiser et suivre la motilité IEL in vivo19,20. Bien que la microscopie à balayage laser à deux photons soit couramment utilisée pour l'imagerie intravitale, l'utilisation de la microscopie laser confocale de disque tournant offre des avantages uniques pour capturer des images multicanaux à haute vitesse et à haute résolution avec un bruit de fond minimal. Cette technologie est idéale pour élucider la dynamique spatiotemporelle des interactions immunitaires/épithéliales dans le microenvironnement complexe de la muqueuse intestinale. En outre, grâce à l'utilisation de divers modèles transgéniques et/ou de souris knock-out, ces études peuvent fournir un aperçu de la régulation moléculaire de la fonction immunitaire intestinale et/ou épithéliale.

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Protocol

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Toutes les études ont été menées dans une association de l'évaluation et de l'accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AALAC) accrédité s'installation selon les protocoles approuvés par Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources.

1. Préparation de la souris

REMARQUE: La procédure suivante, y compris la préparation des animaux et la chirurgie, prendra 30 à 40 min. Avant la chirurgie, allumer le microscope et réchauffer l'incubateur fermé sur le microscope à 37 oC.

  1. Effectuer des expériences sur des souris TcrdEGFP de 8 à 10 semaines sur un fond C57BL/6, obtenues auprès de Bernard Malissen (INSERM, Paris, France). Selon la procédure approuvée par l'IACUC, anesthésier la souris par injection de kétamine (120 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) en fonction du poids de l'animal. Évaluer le niveau d'anesthésie par le taux de respiration (55-65 respirations par minute)21, pincement d'orteil et réflexe palpebral.
  2. Une fois l'anesthésie chirurgicale de plan est atteinte, fixer les pattes postérieures de la souris utilisant le ruban adhésif à un coussin chauffant pour maintenir la température de corps, qui peut être surveillée par le thermomètre rectal. S'il y a des signes que l'anesthésie s'estompe (p. ex., augmentation du taux de respiration, clignotement et/ou réponse de contraction des muscles oculaires au réflexe palpébral), réadministrer 50 l de kétamine/xylazine à la fois jusqu'à ce que la souris soit entièrement sédative.
  3. Préparer le colorant nucléaire en diluant 50 ll de Hoechst 33342 (10 mg/mL) avec 315 l de 0,9 % salin; la concentration finale est de 37,5 mg/kg en fonction du poids de la souris (volume approximatif de 200 lL). Une fois que la souris est anesthésié, injectez lentement le Hoechst à l'aide d'une seringue de tubercumine à travers le sinus veineux rétro-orbital.
    REMARQUE: Attendez 1/2 min avant de passer à l'étape suivante pour permettre à la souris de s'acclimater au changement de volume circulant après l'injection rétro-orbitale.
  4. Placez une petite quantité de lubrifiant sur les yeux pour les empêcher de se dessécher.

2. Chirurgie de la souris: Laparotomie pour exposer muqueuse intestinale

  1. Faire une incision verticale de 2 cm à travers la peau et le péritoine le long de la ligne médiane du bas-ventre pour externaliser la région de l'intestin à être photographié.
  2. À l'aide de forceps inclinés, retirez soigneusement le cecum de la cavité péritonéale et identifiez la zone de l'intestin grêle à imager. Veillez à ne pas déchirer les vaisseaux sanguins mésentériques au cours de ce processus. Pour minimiser les dommages ou les saignements potentiels, évitez de saisir ou de pincer l'intestin avec les forceps.
  3. Localiser une région appropriée de l'intestin grêle (2 à 3 cm) pour l'imagerie qui contient un contenu fécal minimal. Retournez soigneusement le cecum et le reste de l'intestin grêle dans la cavité péritonéale, tout en laissant le segment d'intérêt externalisé.
    REMARQUE: Évitez de perforer le cecum ou de perturber la vascularisation mésentérique pendant cette étape.
  4. Placez deux paires de forceps de chaque côté de la mésenterie sous-jacente entre les vaisseaux sanguins, et frottez doucement les extrémités des forceps ensemble pour créer un trou dans la membrane (Figure 1)22. Cela permettra à l'aiguille de passer à travers la mésenterie lors de la fermeture de la cavité péritonéale sous l'intestin.
  5. Fermer l'incision tout en gardant la boucle de l'intestin externalisé. À l'aide de forceps inclinés et d'une aiguille à pointe s'effilochée fixée à une suture de 5 cm, pénétrer un côté du péritoine, passer par le trou fait dans l'étape précédente, et jusqu'à l'autre côté de la doublure péritonéale. Placez une suture en haut, et une autre près du fond de l'incision.
    REMARQUE: Évitez d'endommager la vascularisation pendant cette étape.
  6. Répétez ce processus pour fermer la peau sous la boucle intestinale, en plaçant une suture au milieu de l'incision, entre les sutures précédentes dans le péritoine sous-jacent.
    REMARQUE: Il est important de ne faire qu'extérioriser la zone qui doit être représentée; ceci réduira le mouvement d'extra-industrie pendant l'imagerie. Assurez-vous d'éviter de lier les artères mésentériques.
  7. Utilisez une électrocautérisation pour faire une ligne de perforation le long de la frontière anti-mésentérique. Immédiatement après la cautérisation, appliquez quelques gouttes d'eau à la surface de l'intestin pour éviter d'autres lésions tissulaires causées par la chaleur. Blot avec un Kimwipe pour enlever l'eau résiduelle.
  8. Couper une petite éliture horizontale au bord distal du tissu cautérisé à l'aide de ciseaux Vannas et procéder à la coupe le long de la ligne cautérisée vers l'extrémité proximale du segment des tissus externalisés (environ 1,5 cm de longueur) pour exposer le muquale surface.
    REMARQUE: Si nécessaire, utilisez des forceps pour enlever délicatement tout excès de matières fécales restant sur la surface muqueuse exposée.
  9. Couvrez l'abdomen de la souris d'un Kimwipe humide pour éviter que le tissu ne se déshydrate. Transportez la souris au microscope dans un récipient couvert.

3. Acquisition d'image par Spinning Disk Confocal Microscopy

  1. Pipette 150 l de 1 M AlexaFluor 633 en HBSS sur le fond en verre glissé du fond d'un plat de 35 mm. Placez la souris de sorte que la surface muqueuse ouverte entre directement en contact avec le bordereau.
  2. Inclinez la tête du microscope vers l'arrière et placez la souris sur le plat couvert sur la scène d'imagerie dans un incubateur pré-chauffé. Sinon, couvrez la souris d'une couverture chauffante pour maintenir la température corporelle.
  3. Lancer un logiciel d'imagerie. L'intensité d'excitation et le temps d'exposition de chaque laser ne doivent pas dépasser 10 à 15 mW ou 120 à 150 m, respectivement, afin d'éviter le photoblanchiment et de minimiser l'intervalle entre les points de temps. Ajustez la moyenne du cadre à « 2 » et activez la fonction de gain EM pour réduire le bruit de fond. Sélectionnez l'étalonnage objectif 63x pour assurer la mesure correcte de la taille des pixels.
    REMARQUE: Les paramètres détaillés ci-dessus sont destinés à fournir une référence initiale, mais varient en fonction des configurations de microscope individuels.
  4. À l'aide du laser 405 nm et de l'objectif d'air 20x, visualisez les noyaux pour localiser un champ de villosités qui n'ont pas de mouvement notable ou de dérive par les yeux. Évitez les zones de mouvement artifactual due à la respiration, péristaltisme ou le rythme cardiaque.
  5. À l'aide de l'analyse XY, enregistrez la coordonnées XY du champ d'intérêt et passez à l'objectif d'immersion de glycérol 63X.
  6. Confirmez que les villosités dans le champ sélectionné sont stables en acquérant une image en direct sur le canal de 405 nm jusqu'à 1 min.
  7. Tout en acquérant une image en direct sur le canal 405 nm, ajuster la mise au point pour trouver le plan orthogonal juste en dessous de la pointe villous. Acquérir des z-piles à partir de l'épithélium pointe villous bas de la villus jusqu'à ce qu'il soit difficile de résoudre les noyaux, environ 15-20 'm, en utilisant une étape de 1,5 m.
    REMARQUE: Lors de l'imagerie avec trois canaux (405, 488, 640 nm) en utilisant les temps d'exposition décrits ci-dessus, il est possible d'acquérir les trois canaux séquentiellement à environ 20 s intervalles.
  8. Ouvrez le logiciel en mode d'analyse, 3 à 5 min après le début de l'acquisition, afin de confirmer la stabilité de l'image et la motilité IEL. Continuer à acquérir des images pour 30 à 60 min pour chaque champ de villosité. Enregistrez 2 à 3 champs pour chaque souris. Pendant l'imagerie, surveillez la souris toutes les 5 min.
    REMARQUE: Si l'anesthésie commence à s'estomper, utilisez des forceps pour frotter doucement le cou de la souris afin d'administrer 50 ll de kétamine/xylazine à la fois. Continuer à surveiller les niveaux d'anesthésie et réadministrer si nécessaire.
  9. Il n'est pas conseillé d'imager une seule souris pendant plus de 4 h. Une fois l'acquisition d'image est complète, sacrifiez les souris par dislocation cervicale suivie du pneumothorax bilatéral.

4. Analyse 4D des images

  1. Importez directement des fichiers d'imagerie vers un logiciel de rendu 4D.
  2. Créez des surfaces individuelles pour les IEL et le lumen, puis suivez les surfaces au fil du temps en utilisant les paramètres décrits dans le tableau 1 comme référence initiale. Pour les IEL, activez le toucher fractionné d'objets à l'aide du diamètre du point de semence indiqué.
  3. Utilisez l'algorithme de suivi autorégressif pour déterminer la motilité IEL. Bien que l'algorithme de suivi soit relativement précis, il est impératif d'inspecter visuellement les pistes pour chaque IEL individuel. Si une piste est incorrecte, corrigez-la en utilisant les fonctions Déconnecter et connecter sous l'onglet Edit Tracks.
  4. Pour déterminer la distance entre chaque IEL et le lumen, sélectionnez la Surface lumen et effectuez la fonction de transformation de distance dans le menu Outil. Lorsque vous êtes invité, sélectionnez Surface extérieure. Une fois calculée, la transformation de distance s'affiche comme le 4ème canal.
  5. Filtrer la min d'intensité du 4ème canal pour sélectionner les IEL qui se trouvent dans l'espace intercellulaire latéral (LIS). Cette valeur doit être proche de 15 m, en fonction de la hauteur d'une cellule épithéliale colonneaire. Le pourcentage total d'EIL dans cette plage est signalé comme la fréquence des IEL dans le LIS.
  6. Pour une analyse plus approfondie, les données statistiques d'exportation, y compris : la vitesse de la voie IEL, le déplacement de la voie, la rectitude de la voie et la longueur de la voie. Vous pouvez également analyser les données à l'aide du module Vantage. Selon l'expérience, obtenir des mesures supplémentaires à partir des données acquises, y compris le temps d'habiter dans les interactions LIS ou IEL/épithélial.

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Representative Results

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À l'aide de l'imagerie intravitale des souris reporter TcrdEGFP, nous avons déjà montré que les IEL présentent un comportement de surveillance dynamique, dans lequel ils patrouillent l'épithélium en migrant le long de la membrane du sous-sol et dans l'espace intercellulaire latéral (LIS) à stable état (Figure 2, Film 1).

Cette approche peut également être utilisée pour évaluer comment l'inhibition de voies de signalisation cellulaire sédentaires spécifiques et/ou de récepteurs influence le comportement migratoire de l'IEL. Par exemple, l'interleukine (IL)-15 est une cytokine pléiotrope qui est essentielle pour l'homéostasie IEL23,24. Afin de déterminer si la signalisation de l'IL-15 par le récepteur IL-2RMD contribue à la cinétique de la motilité de l'IEL à l'état stable, les souris journalistes de TcrdEGFP ont été imaged 2 h après administration de l'anticorps anti-IL-2R (TM-1) ou du contrôle d'isotype IgG2b. Les pistes colorées indiquent les trajectoires migratoires des EI individuels au cours de 30 min (figure 3A). Bien que la fréquence des EI dans le LIS ait été augmentée chez les souris traitées par TM-1 (figure3A,B), plus de 30 % de ces IEL présentaient un comportement de marche au ralenti (Figure 3A,C). Les IL au ralenti ont été définis en imposant des limites supérieures sur la rectitude de la voie et la longueur de déplacement de la voie. Ce phénotype au ralenti a été confirmé par une réduction significative à la fois de la vitesse instantanée et du ratio de confinement des IEL suivant le blocus IL-2RMD par rapport au contrôle (Figure 3D,E). De plus, les IEL oisiles ont des temps d'attente plus longs et ont été plus fréquemment localisés au sein du LIS par rapport aux IEL motiles (figure3F).

Figure 1
Figure 1 : Utiliser des forceps pour créer un trou dans la mésenterie. Placer les forceps de chaque côté de la membrane pour créer un trou pour les sutures. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Image 3D représentative des IEL dans le jejunum. Un seul point de temps a été choisi à partir d'une vidéo en time-lapse de prise de la muqueuse jejunal d'une souris journaliste TcrdEGFP à l'état stable. Les IEL sont représentés en vert, les noyaux en blanc et les lumen en rouge. Barre d'échelle de 30 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : L'inhibition de l'IL-2RMD induit la mise au œuvre de la lit dans l'espace intercellulaire latéral. Ce chiffre a été adapté de « Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa » par Hu, M. D. et al. 2018, J Immunol, 201 (2), p. 747-756. 15 Copyright 2018 par l'American Association of Immunologists, Inc. (A) Images en accéléré montrant des IEL gFP -EL migrateurs dans l'épithélium vilain jejunal suivant un traitement de 2 h avec 0,45 mg d'IgG2b ou tM-1. La motilité des IEL individuels (vert) au cours de 30 min sont représentés avec des pistes colorées. Les noyaux sont représentés en blanc, et le lumen est représenté en rouge. Barres d'échelle de 20 m. (B) Fréquence des IEL dans le LIS (n 3 souris par traitement, n ' 6-7 vidéos). (C) Pourcentage d'IEL qui étaient inactifs chez les souris traitées par IgG2b ou TM-1. (D) Vitesse instantanée (n 13 299 et 9 600 points de temps). (E) Les rapports de confinement de piste (n ' 350 et 278 pistes) sont indiqués. (F) Distance d'ois-oisif et motile IELs du lumen. Moyenne - SEM s'affiche. p 'lt; 0.05, 'p 'lt; 0.01, #p 'lt; 0.0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Iel Lumen
Détail de surface (m) 1,2 1,5
Soustraction de fond (m) 1,67 2 (en)
Diamètre des points de semence (m) 7,5 ne s'applique pas
Filtre : nombre de voxels 250 Annonces 6 500
Suivi : distance maximale (m) 10 Ans et plus 10 Ans et plus
Suivi : écart maximum 2 (en) 2 (en)

Tableau 1 : Paramètres représentatifs pour la génération IEL et "Surfaces" lumineuses à Imaris. Ces paramètres peuvent être utilisés comme point de départ lors de la génération et le suivi des surfaces du canal 488 nm (IEL) et 640 nm canal (lumen). Selon les conditions expérimentales, ces paramètres peuvent devoir être modifiés.

Film 1: Imagerie intravitale de GFP Comportement migratoire IEL dans le jejunum de souris. Microscopie intravitale en time-lapse de la motilité de l'IEL dans le jejunum à partir d'une souris TcrdEGFP traitée avec 0,45 mg d'IgG2b. Les IEL sont représentés en vert, les noyaux en bleu et les lumen en rouge. Barre à l'échelle, 20 m. Les cadres ont été recueillis tous les 30 s pendant environ 30 min. Le film est adapté de Hu, M. D. et al. 201815. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

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Le développement de techniques de microscopie intravitale a fourni une occasion sans précédent d'observer la réorganisation des structures subcellulaires8,9,22, interactions cellule-cellule12, 25 et le comportement migratoire cellulaire13,14,15,16,26 dans des tissus autrement inaccessibles. Il y a eu un manque général d'outils pour étudier la réglementation et la fonction des IEL in vivo18,27, et par conséquent, l'utilisation de l'imagerie intravitale a ouvert de nouvelles voies d'investigation concernant la régulation moléculaire et caractéristiques fonctionnelles des populations IEL13,14,15,16,20. Les IEL étaient auparavant présumés stationnaires dans la muqueuse intestinale28. Cependant, une analyse plus poussée a démontré que ces cellules sont très dynamiques, mais migrent plus lentement que les lymphocytes dans les organes lymphoïdes secondaires en raison des limites serrées du compartiment épithélial13. De plus, l'utilisation de l'imagerie in vivo a fourni un aperçu supplémentaire de la dynamique spatiotemporelle du comportement de surveillance de l'IEL, y compris le traque ment entre les IEL et les cellules épithéliales qui conduit à la motilité et à la fonction de l'IEL13, 14 (en) , 15 Annonces , 16. L'analyse de ce comportement migratoire a défini de nouvelles mesures pour les réponses cellulaires IEL qui n'auraient pas été exactement quantifiables à l'aide d'expériences ex vivo ou in vitro.

Tout au long de la procédure, il est essentiel de surveiller en permanence le niveau de sédation de la souris. L'administration continue de l'anesthésie de gaz (isoflurane) peut être employée comme alternative à la kétamine/xylazine. Lors de l'exécution de la laparotomie, il est essentiel de garder l'approvisionnement neurovasculaire intact pour fournir une évaluation précise de la biologie. Lier les vaisseaux sanguins mésentériques peut conduire à l'hypoxie et à la nécrose progressive du tissu. En revanche, la section des vaisseaux sanguins entraînera des saignements dans la muqueuse exposée, ce qui peut réduire l'intensité de fluorescence de certains canaux pendant la formation image. Si les IEL développent une morphologie arrondie et cessent de bouger lors de l'acquisition de l'image, cela peut être dû à une légère diminution de la température corporelle de la souris. Le fait de placer le capteur de température près de l'étape du microscope garantit que la température à l'emplacement de la muqueuse exposée est maintenue à 37 oC. Il peut être nécessaire d'augmenter la température à 38 à 39 oC en fonction de la stabilité de la température de la chambre d'incubation.

Une fois que la souris a été positionnée sur le stade du microscope, il peut être difficile d'identifier les champs de villosités qui manquent de mouvement excessif en raison du péristaltisme ou de la contraction des vaisseaux sanguins adjacents. Si cela se produit, repositionner la souris dans le plat ou manipuler les flancs de la souris à l'extérieur dans un effort pour emballer étroitement villi contre le bordereau. Alternativement, le champ d'imagerie peut devenir plus stable quelques minutes après avoir placé la souris sur la scène. S'il y a dérive progressive de XY pendant l'acquisition, ceci peut être corrigé en utilisant la correction de dérive dans le logiciel de rendu 4D en sélectionnant les noyaux 4-5 qui sont présents dans différents endroits de l'image tout au long du cours de temps et en suivant un spot pour chaque noyau. Une fois les Spots générés, sélectionnez Corriger la dérive dans le menu Edit Track pour corriger la dérive translationnelle. Il est important que la correction de la dérive soit effectuée avant toute autre analyse, car cela modifiera les coordonnées utilisées pour suivre d'autres objets dans l'image.

Bien que la microscopie à balayage laser à deux photons permet une large profondeur d'imagerie qui est utile pour pénétrer profondément dans les tissus29, la microscopie focale au laser à disque filature a ses propres avantages uniques pour les applications d'imagerie intravitale. La microscopie à balayage laser à deux photons repose sur des tubes photomultiplicateurs (PMT) qui ne peuvent détecter qu'un pixel à la fois avec une efficacité quantique de 40 à 50 %. En revanche, la microscopie laser focale de disque tournant utilise une caméra de multiplication d'électrons (EM) ccD pour détecter directement jusqu'à un million de pixels simultanément, augmentant ainsi l'efficacité quantique à 95%. En conséquence, le potentiel de photoblanchiment et de photodamage est considérablement réduit, tandis que la vitesse d'acquisition accrue maximise la résolution temporelle lors de la migration des cellules d'imagerie dans des tissus plus superficiels. Indépendamment de la modalité de formation image, cette procédure chirurgicale est idéale pour exposer la muqueuse intestinale pour la formation image sur un microscope inversé.

Avec la disponibilité croissante de souches de souris exprimant des reporters fluorescents, des sondes fluorescentes ou des souches fluorescentes de micro-organismes qui ont été générés dans une multitude de longueurs d'onde, les combinaisons pour évaluer in vivo intestinale réponses en temps réel sont infinies. Non seulement l'imagerie intravitale peut fournir un nouvel aperçu des interactions cellules-cellules et hôte-microbe, mais elle peut également mettre en évidence des processus moléculaires et cellulaires dynamiques dans les cellules épithéliales et immunitaires dans des conditions homéostatiques ou pathologiques.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail est soutenu par NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Nous remercions Madeleine Hu pour son aide dans l'édition du manuscrit et la fourniture des données présentées dans les résultats représentatifs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm dish, No. 1.5 Coverslip MatTek P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide Invitrogen A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G Thermo Fisher Scientific 14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Tuberculin Syringe Thermo Fisher Scientific 14-829-9
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 08-940
Electrocautery Thermo Fisher Scientific 50822501
Enclosed incubation chamber OKOLAB Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length Roboz RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich 55037C
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules Bitplane Software
Inverted DMi8 Leica Microscope
IQ3 (v. 3.6.3) Andor Software
Ketamine Putney Anesthesia
Kimwipes VWR 21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp Roboz RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided Fisher Scientific NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip Roboz RS-5228
Puralube Vet Ointment Dechra Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser Andor Confocal system
Xylazine Akorn Anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11, (7), 445-456 (2011).
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Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine
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Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).More

Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).

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