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Biochemistry

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड इंटरैक्टिंग प्रोटीन की पहचान पश्चिमी ब्लॉट या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए जोड़ा गया

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रोटीन की पहचान पर केंद्रित है जो इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटिड को बांधता है। यह biotinylated inositol फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड्स कि streptavidin के माध्यम से agarose या चुंबकीय मोती के लिए स्थिर कर रहे हैं के साथ आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करता है. इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड बाइंडिंग प्रोटीन पश्चिमी सोख्ता या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाने जाते हैं।

Abstract

इनोसिटोल फॉस्फेट और फॉस्फोइनोसिटाइड्स यूकैरियोट में कई सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करते हैं, जिनमें जीन अभिव्यक्ति, आशय की तस्करी, सिग्नल ट्रांसडक्शन, चयापचय और विकास शामिल हैं। ये चयापचय प्रोटीन के लिए बाध्यकारी द्वारा इस नियामक गतिविधि प्रदर्शन, जिससे प्रोटीन रचना बदलने, उत्प्रेरक गतिविधि, और / यहाँ वर्णित विधि आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करता है जो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री या पश्चिमी सोख्ता प्रोटीन की पहचान करने के लिए युग्मित है जो इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड्स के साथ बातचीत करते हैं। Inositol फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड्स रासायनिक बायोटिन के साथ टैग किए गए हैं, जो तब स्ट्रेप्टाविडिन के माध्यम से कब्जा कर लिया जाता है agarose या चुंबकीय मोती के लिए संयुग्मी. प्रोटीन मेटाबोलाइट के लिए बाध्यकारी की उनकी आत्मीयता से अलग कर रहे हैं, तो eluted और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री या पश्चिमी सोख्ता द्वारा की पहचान की. विधि संवेदनशील है कि एक सरल कार्यप्रवाह है, गैर रेडियोएक्टिव, liposome मुक्त, और अनुकूलन, प्रोटीन के विश्लेषण का समर्थन और परिशुद्धता के साथ चयापचय बातचीत. इस दृष्टिकोण लेबल मुक्त में या एमिनो एसिड लेबल मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री तरीकों में इस्तेमाल किया जा सकता है जटिल जैविक नमूनों में प्रोटीन मेटाबोलाइट बातचीत की पहचान या शुद्ध प्रोटीन का उपयोग कर. इस प्रोटोकॉल Trypanosoma bruceiसे प्रोटीन के विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, लेकिन यह संबंधित प्रोटोजोअन परजीवी, खमीर या स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

इनोसिटोल फॉस्फेट (आईपी) और फॉस्फोइनोसिटाइड्स (पीआई) सेलुलर प्रक्रियाओं के विनियमन के माध्यम से यूकैरियोट जीव विज्ञान में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं जैसे जीन अभिव्यक्ति1,2,3, vesicle तस्करी का नियंत्रण 4, सिग्नल ट्रांसडक्शन5,6, चयापचय7,8,9, और विकास8,10. इन चयापचयों के नियामक समारोह प्रोटीन के साथ बातचीत करने की क्षमता से परिणाम और इस प्रकार प्रोटीन समारोह को विनियमित. प्रोटीन द्वारा बाध्यकारी पर, आईपी और पी आई प्रोटीन रचना11, उत्प्रेरक गतिविधि12, या बातचीत13 बदल सकते हैं और इसलिए सेलुलर समारोह को प्रभावित. आईपी और पी आई कई उपकोशिक डिब्बों में वितरित किए जाते हैं, जैसे नाभिक2,3,14,15, एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम16,17प्लाज्मा झिल्ली1 और cytosol18, या तो प्रोटीन के साथ जुड़े3,19 या RNAs20के साथ .

स्फुरदोलिपि ज द्वारा झिल्ली से संबद्ध पीआई(4,5)P2 का क्लीवेज इन्स (1,4,5)P3 की रिहाई में होता है, जो क्रमशः IP काइनेस और फॉस्फेटद्वारा फॉस्फोरोइलेट या डेफॉस्फोरिलेट किया जा सकता है। आईपी घुलनशील अणु हैं जो प्रोटीन के लिए बाध्य कर सकते हैं और नियामक कार्यों को लागू कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, मेटाज़ोआन में Ins(1,4,5)P3 IP3 रिसेप्टर्स के लिए बाध्यकारी द्वारा एक दूसरे दूत के रूप में कार्य कर सकते हैं, जो रिसेप्टर conformational परिवर्तन लाती है और इस प्रकार Ca2 + intracellular भंडार से जारी11. Ins(1,3,4,5)P4 histone deacetylase परिसर के लिए बांधता है और प्रोटीन जटिल विधानसभा और गतिविधि13को नियंत्रित करता है. आईपी नियामक समारोह के अन्य उदाहरणों में क्रोमैटिन संगठन21, आरएनए परिवहन22,23, आरएनए संपादन24, और प्रतिलेखन1, 2,3का नियंत्रण शामिल है . इसके विपरीत, PIs अक्सर प्लाज्मा झिल्ली या organelle झिल्ली25के लिए प्रोटीन की भर्ती के साथ जुड़े रहे हैं. तथापि, पी आई एस की उभरती हुई संपत्ति एक गैर झिल्लीदार वातावरण3,15,19,26में प्रोटीन के साथ संबद्ध करने की क्षमता है. यह परमाणु रिसेप्टर steroidogenic कारक का मामला है, जो प्रतिलेखन नियंत्रण समारोह PI द्वारा विनियमित है(3,4,5)P319, और पाली-A polymerase जो एंजाइमी गतिविधि परमाणु PI(4,5)P226द्वारा विनियमित है. आई पी एस और पी आई के लिए एक विनियामक भूमिका खमीर22,27,स्तनधारी कोशिकाओं19,23, ड्रोसोफिला10 और कृमि28सहित कई जीवों में दिखाई गई है . महत्व का trypanosomes में इन चयापचयों की भूमिका है, जो यूकैरियोटिक वंश से जल्दी diverged. ये चयापचयों Trypanosoma brucei प्रतिलेखन नियंत्रण1,3,विकास8, organelle जीवजनन और प्रोटीन यातायात29,30 में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं , 31 , 32, और रोगजनकों में विकास और संक्रमण को नियंत्रित करने में भी शामिल हैं टी क्रुजी33,34,35,टॉक्सोप्लाज्मा36 और प्लाज्मोडियम 5 , 37.अतः ट्राइपानोसोम में आईपी और पी आई की भूमिका को समझने से इन अणुओं के लिए नए जैविक कार्य को स्पष्ट करने और नवीन औषध लक्ष्यों की पहचान करने में मदद मिल सकती है।

प्रोटीन और आईपी या पीआई बाइंडिंग की विशिष्टता प्रोटीन इंटरैक्टिंग डोमेन और इनोसिटॉल13,38की फॉस्फोरिलेशन स्थिति पर निर्भर करती है,हालांकि पी आई के लिपिड भाग के साथ बातचीत भी19होती है . आईपी और पी आई की विविधता और उनके संशोधित kinases और फॉस्फेटप्रोटीन प्रोटीन समारोह है जो चयापचय उपलब्धता और बहुतायत से प्रभावित है को नियंत्रित करने के लिए एक लचीला सेलुलर तंत्र प्रदान करता है, inositol के फॉस्फोरिलेशन राज्य, और प्रोटीन बातचीत की समानता1,3,13,38. हालांकि कुछ प्रोटीन डोमेन अच्छी तरह से विशेषता रहे हैं39,40,41, उदा, pleckstrin homology डोमेन42 और SPX (एसYG1/ ,44,45, कुछ प्रोटीन आईपी या पी आईपी के साथ बातचीत तंत्र है कि अज्ञात रहते हैं. उदाहरण के लिए, टी ब्रूसी के दमनकारी-सक्रियक प्रोटीन 1 (RAP1) में विहित पीआई-बाइंडिंग डोमेन का अभाव है, लेकिन पीआई (3,4,5)P3 के साथ सूचना का आदान-प्रसार और एंटीजेनिक भिन्नता3में शामिल जीनों के नियंत्रण प्रतिलेखन । एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री आईपी या पीआई के आदान-प्राप्त प्रोटीन trypanosome, खमीर, या स्तनधारी कोशिकाओं से बातचीत प्रोटीन ज्ञात आईपी के बिना कई प्रोटीन की पहचान की- या पीआई बाध्यकारी डोमेन8,46, 47. डेटा अतिरिक्त असामान्य प्रोटीन डोमेन का सुझाव देते हैं जो इन चयापचयों से बांधते हैं। इसलिए, आईपी या पीआई के साथ बातचीत करने वाले प्रोटीन की पहचान इन छोटे अणुओं के लिए प्रोटीन-मेटाबोलाइट इंटरैक्शन और नए सेलुलर नियामक कार्यों के उपन्यास तंत्र को प्रकट कर सकती है।

यहाँ वर्णित विधि आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी पश्चिमी ब्लॉटिंग या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए मिलकर प्रोटीन है कि आईपी या पीआई के लिए बाध्य की पहचान करने के लिए कार्यरत हैं. यह biotinylated आईपी या पी आई का उपयोग करता है कि या तो पार से जुड़े हैं streptavidin संयुग्मी करने के लिए agarose मोती या वैकल्पिक रूप से, streptavidin-संयोजित चुंबकीय मोती के माध्यम से कब्जा कर लिया (चित्र 1). विधि एक सरल कार्यप्रवाह है कि संवेदनशील, गैर रेडियोसक्रिय, liposome मुक्त है और सेल lysates या शुद्ध प्रोटीन3 से प्रोटीन की बाध्यकारी का पता लगाने के लिए उपयुक्त है प्रदान करता है (चित्र2). विधि लेबल मुक्त8मेंइस्तेमाल किया जा सकता ,46 या एमिनो एसिड के लिए युग्मित मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री47 जटिल जैविक नमूनों से आईपी या पीआई बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करने के लिए. इसलिए, यह विधि सेलुलर प्रोटीन के साथ आईपी या पी आई की बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध कुछ तरीकों के लिए एक विकल्प है और trypanosomes और शायद अन्य यूकैरियोट में इन चयापचयों के नियामक समारोह को समझने में मदद मिलेगी।

Protocol

1. आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और पश्चिमी सोख्ता द्वारा आईपी- या पीआई बाध्यकारी प्रोटीन का विश्लेषण सेल विकास, lysis और आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी मध्य लॉग चरण के लिए टी brucei कोशिकाओं हो जाओ और से…

Representative Results

आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और पश्चिमी सोख्ता द्वारा RAP1 और PI(3,4,5)P3 बातचीत का विश्लेषणयह उदाहरण T. brucei lysate से या पुनः संयोजक T. brucei RAP1 प्रोटीन द्वारा P1 की बाइंडिंग का विश्लेषण करने के लिए इस विधि का अनु…

Discussion

प्रोटीन की पहचान है कि आईपी या पी आई के लिए बाध्य इन चयापचयों के सेलुलर समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी पश्चिमी दाग या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर आईपी या पीआई बातच…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी, RGPIN-2019-04658) द्वारा समर्थित किया गया था; NSERC डिस्कवरी लॉन्च अनुपूरक प्रारंभिक कैरियर शोधकर्ताओं के लिए (DGECR-2019-00081) और McGill विश्वविद्यालय द्वारा.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
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References

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Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
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