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Cancer Research

इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर रोगियों से अर्द्ध-स्वचालित पीडी-एल 1 विशेषता और परिसंचरण ट्यूमर कोशिकाओं की गणना

Published: August 14, 2019 doi: 10.3791/59873
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2,3, 4, 4, 5, 1, 3, 6,7, 1,2,3
1Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Groupe Hospitalier Sud, Hospices Civils de Lyon, 2Circulating Cancer (CIRCAN) Program, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 3University of Lyon, Claude Bernard University, Cancer Research Center of Lyon, 4Biolidics Limited, 5Institut de Pathologie Multisites des HCL-Site Sud, Hospices Civils de Lyon, 6Acute Respiratory Disease and Thoracic Oncology Department, Lyon Sud Hospital, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 7EMR-3738 Therapeutic Targeting in Oncology, Lyon Sud Medical Faculty, Lyon 1 University

Summary

ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) घूम की विशेषता अनुवाद अनुसंधान में एक लोकप्रिय विषय है. इस प्रोटोकॉल पीडी-L1 विशेषता और गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) रोगी के नमूने में सीटीसी की गणना के लिए एक अर्द्ध स्वचालित इम्यूनोफ्लोरेसी (आईएफ) परख का वर्णन करता है।

Abstract

प्राथमिक ट्यूमर से व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) परिसंचरण खून या लसीका प्रणाली में बहा रहे हैं। इन दुर्लभ कोशिकाओं (1 "10 कोशिकाओं रक्त के प्रति एमएल) एक गरीब रोग का रोग का पूर्वानुमान वारंट और कई कैंसर में कम समग्र अस्तित्व के साथ सहसंबद्ध हैं (उदा., स्तन, प्रोस्टेट और कोलोरेक्टल). वर्तमान में, विरोधी EpCAM लेपित चुंबकीय मनका आधारित सीटीसी कब्जा प्रणाली खून में सीटीसी की गणना के लिए अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित सोने के मानक परीक्षण है. यह परीक्षण एंटी-एपकैम मार्कर के साथ लेपित चुंबकीय मोती के उपयोग पर आधारित है, जो विशेष रूप से उपकला कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करते हैं। कई अध्ययनों से स्पष्ट है कि EpCAM CTC का पता लगाने के लिए इष्टतम मार्कर नहीं है। दरअसल, सीटीसी कैंसर कोशिकाओं की एक विषम उपजनसंख्या हैं और मेटास्टैटिक प्रसार और आक्रमण के साथ जुड़े एक उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरने में सक्षम हैं। इन CTCs सेल सतह उपकला मार्कर EpCAM की अभिव्यक्ति को कम करने में सक्षम हैं, जबकि इस तरह के vimentin के रूप में mesenchymal मार्करों में वृद्धि. इस तकनीकी बाधा को दूर करने के लिए, सीटीसी के भौतिक गुणों पर आधारित अन्य अलगाव विधियां विकसित की गई हैं। Microfluidic प्रौद्योगिकियों पूरे रक्त के नमूनों से सीटीसी संवर्धन के लिए एक लेबल मुक्त दृष्टिकोण सक्षम. सर्पिल microfluidic प्रौद्योगिकी एक सर्पिल microfluidic चिप के भीतर उत्पन्न घुमावदार चैनलों में निरंतर प्रवाह के साथ जड़त्वीय और डीन खींचें बलों का उपयोग करता है. कोशिकाओं को सामान्य रक्त कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच आकार और प्लास्टिक में अंतर के आधार पर अलग कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल का विवरण CTCs के क्रमादेशित मौत-लिगंड 1 (पीडी-L1) अभिव्यक्ति की विशेषता के लिए विभिन्न चरणों, अनुकूलन इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) मार्कर सेट के साथ एक सर्पिल microfluidic डिवाइस के संयोजन.

Introduction

ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट साइटोटॉक्सिक टी-लिम्फोसाइट (सीटीएल) कैंसर "प्रतिरक्षा निगरानी" के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के माध्यम से कैंसर की प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उनके विरोधी ट्यूमर कार्यों ऐसे CTLA-4 inhibitors और पीडी-1/PD-L1 inhibitors के रूप में प्रतिरक्षा जांच चौकी नाकाबंदी एंटीबॉडी द्वारा बढ़ाया जाता है। गैर-छोटी कोशिका फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) में, पीडी-1/पीडी-एल 1 उपचारों के परिणामस्वरूप पीडी-एल 1-नकारात्मक ट्यूमर वाले रोगियों में 0%-17% और पीडी-एल 1 व्यक्त करने वालों में 36%-100% से लेकर प्रतिक्रिया दरों में परिणाम होता है। पीडी-1/पीडी-एल 1 मेलेनोमा और NSCLC में मनाया नाकाबंदी के लिए मजबूत प्रतिक्रियाओं में सुधार समग्र प्रतिक्रिया दर (आरआर), टिकाऊ नैदानिक लाभ, और प्रगति मुक्त अस्तित्व (PFS) के सबूत द्वारा दिखाए जाते हैं. वर्तमान में, विरोधी PD1 उपचार PD-L1 अभिव्यक्ति की परवाह किए बिना और पीडी-L1 $ 1% व्यक्त रोगियों में pembrolizumab के साथ nivolumab के साथ दूसरी लाइन NSCLC उपचार में देखभाल के मानक हैं. पहली लाइन के उपचार में, देखभाल के मानक NSCLC के साथ रोगियों में अकेले pembrolizumab है पीडी-एल 1 $50% व्यक्त और संभावित रसायन चिकित्सा के साथ बढ़ाया जा सकता है (प्लेटिन और द्वि गुणिक दवा हिस्टोलॉजिक उपप्रकार के आधार पर)1,2.

हालांकि, रोगी प्रबंधन के लिए इस तरह के एक दृष्टिकोण विवादास्पद3है, के बाद से इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति शायद सबसे आदर्श साथी biomarker नहीं है. ट्यूमर उत्परिवर्तन बोझ4 (TMB), microsatellite अस्थिरता (एमएसआई), और / या microbiota के रूप में दूसरों को संभवतः अकेले या संयोजन में इस सेटिंग में दिलचस्प हैं. NSCLC विषम ट्यूमर होने के लिए जाना जाता है, या तो स्थानिक (एक ट्यूमर साइट से एक दूसरे के लिए) या लौकिक (निदान से पुनरावृत्ति के लिए). NSCLC के साथ मरीजों को आम तौर पर नाजुक हैं, और आक्रामक इनवेसिव ऊतक बायोप्सी एक मुद्दा हो सकता है. दरअसल, पहली प्रगति पर फिर से बायोप्सी दर श्रृंखला के आधार पर 46%-84% से लेकर, और सफल फिर से बायोप्सी (हिस्टोलॉजिकल और पूर्ण आणविक विश्लेषण के साथ अर्थ) 33%-75% से पर्वतमाला. इसका मतलब यह है कि 25%-67% रोगियों को पहली प्रगति5,6,7,8के दौरान एक व्यापक पुन: बायोप्सी विश्लेषण प्राप्त नहीं कर सकते .

"तरल बायोप्सी" के आगमन इस प्रकार इस विशेष सेटिंग में काफी उत्साह उत्पन्न किया है, के रूप में यह रोग प्रगति के दौरान आणविक परिवर्तन के महत्वपूर्ण पुनर्मूल्यांकन में सक्षम बनाता है घूम मुक्त डीएनए (cfDNA) घूम से व्युत्पन्न की जांच करके ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी)। इन जीवित कोशिकाओं ट्यूमर से खून में जारी कर रहे हैं, जहां वे स्वतंत्र रूप से प्रसारित. हालांकि नियमित रूप से इस्तेमाल नहीं किया, CTCs के विश्लेषण के लिए आणविक और phenotypic लक्षण, पूर्वानुमान, और फेफड़ों के कैंसर में भविष्य कहनेवाला महत्व के मामले में अत्यधिक आशाजनक प्रतीत होता है (DNAseQ केमाध्यम से, RNAseQ, miRNA और प्रोटीन विश्लेषण). दरअसल, सीटीसी की संभावना प्रारंभिक मार्करों के बजाय सक्रिय रोग के phenotypic विशेषताओं बंदरगाह (निदान पर ऊतक बायोप्सी पर पता चला). इसके अलावा, सीटीसी ट्यूमर ऊतक के स्थानिक विषमता की समस्या को बाईपास करते हैं, जो छोटे बायोप्सी में एक महत्वपूर्ण मुद्दा हो सकता है। नतीजतन, सीटीसी पर पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति संभवतः ट्यूमर ऊतक का उपयोग कर एक भविष्य कहनेवाला biomarker के रूप में इसके उपयोग से प्राप्त विसंगतियों पर प्रकाश डाला जा सकता है.

हाल ही में, एनएससीएलसी के सीटीसी में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति का परीक्षण किया गया है। परीक्षणकिए गए लगभग सभी रोगी पीडी-एल 1 सकारात्मक थे, परिणाम की व्याख्या और इसके नैदानिक उपयोग को जटिल बना रहे थे। कुल मिलाकर, पीडी-एल 1 सकारात्मक सीटीसी 4.5 कोशिकाओं के एक औसत सेनमूने के 69.4% में पाया गया / विकिरण चिकित्सा की शुरुआत के बाद, पीडी-एल 1-सकारात्मक सीटीसी का अनुपात काफी बढ़ गया, जो विकिरण11के जवाब में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति के विनियमन का संकेत देता है। इसलिए, पीडी-एल 1 सीटीसी विश्लेषण का उपयोग ट्यूमर और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के गतिशील परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए किया जा सकता है, जो कीमोथेरेपी, विकिरण, और संभावित इम्यूनोथेरेपी (आईटी) उपचार की प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित कर सकता है।

तारीख करने के लिए, सीटीसी अलगाव और पीडी-L1 विशेषता इस तरह के विरोधी EpCAM लेपित चुंबकीय मनका आधारित सीटीसी पर कब्जा, संवर्धन मुक्त आधारित परख, और आकार आधारित12,13 सीटीसी कब्जा assays के रूप में विभिन्न तरीकों पर भरोसा करते हैं। तथापि, सीटीसी का केवल मेटास्टैटिक एनएससीएलसी वाले 45%-65% रोगियों में पाया गया, जिससे मेटास्टैटिक एनएससीएलसी के आधे से अधिक रोगियों के लिए कोई सूचना प्रदान करने की उनकी क्षमता सीमित हो गई। इसके अलावा, सीटीसी गिनती आकार आधारित दृष्टिकोण10का उपयोग कर इन अध्ययनों में से अधिकांश में कम था. इसके अलावा, इस विधि ने स्वस्थ दाताओं के खून में "द्रोह के cytomorphological पैटर्न" के साथ CD45(-)/DAPI(+) कोशिकाओं का पता लगाने जैसी विसंगतियों को बढ़ावा दिया है। इन चिंताओं को अतिरिक्त कैंसर biomarkers का उपयोग कर स्वस्थ पूरे रक्त से अटूट CD45 (-) कोशिकाओं की प्रतिरक्षा-phenotyping के साथ जुड़े सीटीसी संग्रह की एक अत्यधिक संवेदनशील विधि की आवश्यकता पर प्रकाश डाला (यानी, TTF1, Vimentin, EpCAM, और CD44) NSCLC में.

नतीजतन, हम एक सर्पिल microfluidic डिवाइस है कि जड़त्वका का उपयोग करता है और डीन खींचें बलों का मूल्यांकन करने के लिए एक microfluidic चिप के माध्यम से आकार और प्लास्टिक के आधार पर कोशिकाओं को अलग. डीन भंवर के गठन microfluidic चिप में मौजूद आंतरिक दीवार और चिप की बाहरी दीवार के साथ छोटे प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ स्थित बड़ा सीटीसी में मौजूद बहती है. संवर्धन प्रक्रिया समृद्ध सीटीसी अंश के रूप में संग्रह आउटलेट में बड़े कोशिकाओं sphoning द्वारा पूरा किया है. यह विधि विशेष रूप से संवेदनशील और विशिष्ट है (पूरे रक्त के लगभग 1 सीटीसी/एमएल का पता लगाना)14 और अनुकूलित इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) विश्लेषण के साथ संबद्ध किया जा सकता है। इन उपकरणों नैदानिक व्याख्या के लिए एक सकारात्मक सीमा की स्थापना सक्षम हो जाएगा. एक कार्यप्रवाह इस प्रकार वर्णित है कि जीवविज्ञानियों को अलग करने और इम्यूनोफेनोटाइप CTCs वसूली और विशिष्टता की एक उच्च दर के साथ सक्षम बनाता है. प्रोटोकॉल CTCs इकट्ठा करने के लिए सर्पिल microfluidic डिवाइस के इष्टतम उपयोग का वर्णन करता है, अनुकूलित IF परख कि कैंसर के प्रकार के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है, और सेल छवियों को मापने और विश्लेषण के लिए मुक्त खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एक अर्द्ध स्वचालित प्रदर्शन फ्लोरोसेंट धुंधला के अनुसार कोशिकाओं की संख्या. इसके अतिरिक्त, माइक्रोस्कोप बहुसंकेतन उपलब्ध फ्लोरोसेंट फिल्टर/मार्कर की संख्या के आधार पर किया जा सकता है।

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Protocol

नमूने संभावित CIRCAN के ढांचे के भीतर एकत्र किए गए थे ("CIRculating CANcer") रोगी लिखित सहमति के बाद Lyon विश्वविद्यालय अस्पताल में आधारित सहगण. इस अध्ययन CIRCAN-ALL सहगण में एकीकृत किया गया था. अध्ययन CIRCAN$ALL संदर्भ L15-188 के तहत सीपीपी दक्षिण पूर्व चतुर्थ दिनांक 04/ एक संशोधित संस्करण संदर्भ L16-160 के तहत 20/09/2016 को गैर हस्तक्षेप के रूप में मान्यता प्राप्त किया गया था। CIRCAN]ALL अध्ययन के संदर्भ 15-131 के तहत, पर Hospices सिविल्स डे Lyon के आईटी और स्वतंत्रता संवाददाता के लिए घोषित किया गया था। रक्त संग्रह किया गया था जब चिकित्सकों ट्यूमर प्रगति का जल्द से जल्द संकेत मनाया.

नोट: पूर्व विश्लेषणात्मक नमूना तैयारी और इम्यूनोफ्लोरेसींस परख के लिए संबंधित भंडारण शर्तों के साथ सामग्री की तालिका में उल्लिखित सभी अभिकर्मकों और सामग्री का प्रयोग करें। अभिकर्मकों को प्रतिस्थापित करना और/या भंडारण स्थितियों को संशोधित करने के परिणामस्वरूप उपऑप्टिमल परख निष्पादन हो सकता है.

1. सर्पिल Microfluidic डिवाइस के विसंदूषण

नोट: सर्पिल microfluidic डिवाइस के decontamination बैक्टीरिया संदूषण से उत्पन्न सभी इम्यूनोफ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए एक आवश्यकता है, सीटीसी के cytomorphology का पता लगाने, और उन्हें सामान्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं से अंतर करने में सक्षम हो। प्रोटोकॉल रक्त नमूने के बाद 6 एच के भीतर K2EDTA ट्यूबों में एकत्र रक्त के नमूने के लिए अनुकूलित है और स्वच्छ परिस्थितियों में सर्पिल microfluidic डिवाइस का उपयोग समृद्ध. नमूने के अन्य प्रकार के लिए इस परख का उपयोग (अन्य जैविक तरल पदार्थ) अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. इस decontamination प्रोटोकॉल प्रति सप्ताह एक बार किया जाना चाहिए.

  1. अभिकर्मकों की तैयारी
    1. मंद बफर की तैयारी
      1. एक 0.22 डिग्री मीटर सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर diluent योज्य अभिकर्मक के 20 एमएल बाँझ और 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) अल्ट्रा शुद्ध ग्रेड (सामग्री की तालिका)के1 एल करने के लिए सीधे जोड़ें।
    2. अभिकर्मकों और इनपुट पुआल का बंध्याकरण
      1. आरबीसी lysis बफर और resuspension बफ़र (RSB; सामग्री की तालिका) प्रत्येक समाधान के लिए एक नया 50 एमएल पॉलीप्रोपीलीन शंकु ट्यूब में एक 0.22 m सिरिंज फिल्टर और स्टॉक का उपयोग कर.
      2. सभी उद्देश्य सफाई अभिकर्मक (सामग्री की तालिका) में 1 एच के लिएकमरे के तापमान (आरटी) पर incubating द्वारा इनपुट पुआल स्टरलाइज़ करें। ब्लीच आधारित सफाई एजेंट (सामग्री कीतालिका) और 1 एच के लिए आरटी में इनक्यूबेट करने के लिए पुआल स्थानांतरण।
      3. 1 ज प्रत्येक के लिए बाँझ पीबीएस के साथ दो बार इनपुट पुआल कुल्ला और एक शल्य चिकित्सा बाँझ बैग में बाँझ इनपुट पुआल की दुकान (सामग्री की तालिका) .
  2. सर्पिल microfluidic डिवाइस decontaminating
    1. सभी उद्देश्य सफाई अभिकर्मक का उपयोग कर संक्रमण
      1. भूरे रंग के पेंच unscrewing द्वारा सर्पिल microfluidic डिवाइस के diluent बंदरगाह से diluent बोतल टोपी डिस्कनेक्ट करें. एक सूक्ष्मजीवी सुरक्षा कैबिनेट के तहत, सभी उद्देश्य सफाई अभिकर्मक (सामग्री कीतालिका) के 250 एमएल तक एक नई खाली बोतल में स्थानांतरित करें।
      2. एक सूक्ष्मजीवी सुरक्षा कैबिनेट के तहत 250 एमएल सभी उद्देश्य सफाई अभिकर्मक की बोतल के लिए diluent बोतल टोपी और पुआल पेंच। भूरे रंग के पेंच वापस पेंच द्वारा सर्पिल microfluidic डिवाइस के diluent बंदरगाह के लिए इस बोतल संलग्न.
      3. ब्लीच के 100 एमएल तक स्थानांतरण (1% अंतिम एकाग्रता; सामग्री की तालिका) रन किट में आपूर्ति किए गए अपशिष्ट कंटेनर को (चित्र 1ए)।
      4. इनपुट पोर्ट में सर्पिल माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस (सामग्रीकी तालिका) पर एक नया बाँझ इनपुट पुआल लोड करें। इनपुट पोर्ट में एक नया 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब लोड करें। आउटपुट पोर्ट में एक नया 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब लोड करें।
      5. सर्पिल microfluidic डिवाइस (3 मिनट) पर प्रधानमंत्री पर क्लिक करके सर्पिल microfluidic डिवाइस प्रधानमंत्री के लिए आगे बढ़ें. प्रधानमंत्री के पूरा होने के बाद इनपुट ट्यूब निकालें।
      6. सभी उद्देश्य सफाई अभिकर्मक के 15 एमएल तक स्थानांतरण एक माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट के तहत एक serological पिपेट के साथ एक नया 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए और सर्पिल microfluidic डिवाइस के इनपुट बंदरगाह के लिए ट्यूब देते हैं।
      7. रन शुरू करने से पहले, जांच लें कि समाधान अत्यधिक बुलबुले से मुक्त है। बुलबुले मौजूद हैं, तो उन्हें एक पिपेट के साथ धीमी आकांक्षा से हटा दें।
      8. सर्पिल microfluidic डिवाइस में एक decontamination microfluidic चिप लोड. भागो पर क्लिक करके और 3 (31 मिनट) काचयन करके सर्पिल microfluidic डिवाइस पर एक कार्यक्रम 3 चलाएँ.
        नोट: सर्पिल microfluidic डिवाइस के 3 कार्यक्रम 31 मिनट में सीटीसी के एक तेजी से संवर्धन सक्षम बनाता है.
      9. इनपुट ट्यूब में सभी उद्देश्य सफाई अभिकर्मक के शेष मात्रा का उपयोग कर सर्पिल microfluidic डिवाइस की सफाई कदम के साथ जारी रखें।
      10. सफाई कदम पूरा होने के बाद इनपुट ट्यूब को छोड़ दें, इनपुट पुआल के पीछे छोड़ दें।
    2. ब्लीच आधारित सफाई एजेंट का उपयोग कर Decontamination
      1. भूरे रंग के पेंच unscrewing द्वारा सर्पिल microfluidic डिवाइस के diluent बंदरगाह से सभी उद्देश्य सफाई अभिकर्मक बोतल टोपी डिस्कनेक्ट करें। सूक्ष्मजीवी सुरक्षा मंत्रिमंडल के अंतर्गत, ब्लीच आधारित सफाई एजेंट (सामग्री की तालिका) के 250 एमएल तक एक नई खाली बोतल में स्थानांतरित करें ( चित्र1ए)।
      2. एक microbiological सुरक्षा कैबिनेट के तहत ब्लीच आधारित सफाई एजेंट युक्त बोतल के लिए सभी उद्देश्य सफाई अभिकर्मक बोतल टोपी और पुआल पेंच। भूरे रंग के पेंच वापस पेंच द्वारा सर्पिल microfluidic डिवाइस के diluent बंदरगाह के लिए इस बोतल संलग्न.
      3. एक माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट के तहत एक serological पिपेट का उपयोग कर एक नया 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब इनपुट ट्यूब के लिए ब्लीच आधारित सफाई एजेंट के 15 एमएल तक स्थानांतरण। 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब इनपुट स्थिति लोड करें। आउटपुट स्थिति में एक खाली ट्यूब लोड करें।
      4. रन संसाधित करने से पहले, जांच लें कि नमूना अत्यधिक बुलबुले से मुक्त है और यदि कोई मौजूद है, तो उन्हें एक पिपेट के साथ धीरे-धीरे परेशान करके बुलबुले को हटा दें।
      5. चलाएँ पर क्लिक करके और कार्यक्रम 3 (31 मिनट)का चयन करके कार्यक्रम 3 चलाएँ. रन के बाद, इनपुट ट्यूब में ब्लीच आधारित सफाई एजेंट के शेष मात्रा का उपयोग कर सफाई कदम के लिए सीधे आगे बढ़ें।
      6. इनपुट और आउटपुट ट्यूबों को छोड़ ें।
    3. सर्पिल microfluidic डिवाइस कुल्ला.
      1. ब्लीच आधारित सफाई एजेंट बोतल टोपी भूरे रंग के पेंच unscrewing द्वारा सर्पिल microfluidic डिवाइस के diluent बंदरगाह से डिस्कनेक्ट करें। एक microbiological सुरक्षा कैबिनेट के तहत, ब्लीच आधारित सफाई एजेंट युक्त बोतल से पुआल को नई बोतल में स्थानांतरित करें जिसमें डिलूजेंट बफर है। सर्पिल microfluidic डिवाइस के लिए बोतल पेंच.
      2. एक सूक्ष्म जीव सुरक्षा कैबिनेट के तहत एक serological pipette का उपयोग कर एक नया 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब इनपुट ट्यूब के लिए बाँझ पानी (सामग्री कीतालिका) के 15 एमएल तक स्थानांतरण। 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब इनपुट स्थिति लोड करें। आउटपुट स्थिति में एक खाली ट्यूब लोड करें।
      3. रन संसाधित करने से पहले, जांच लें कि नमूना अत्यधिक बुलबुले से मुक्त है और यदि कोई मौजूद है, तो उन्हें एक पिपेट के साथ धीरे-धीरे परेशान करके बुलबुले को हटा दें।
      4. चलाएँ पर क्लिक करके और कार्यक्रम 3 (31 मिनट)का चयन करके कार्यक्रम 3 चलाएँ. चलाने के बाद, इनपुट ट्यूब में बाँझ पानी की शेष मात्रा का उपयोग कर सफाई कदम के लिए सीधे आगे बढ़ें।
      5. इनपुट और आउटपुट ट्यूबों को छोड़ ें।

2. सर्पिल Microfluidic डिवाइस बैक्टीरिया मुक्त रखने के लिए रखरखाव

नोट: नियमित रखरखाव दिन के अंत में पिछले सफाई कदम के दौरान किया जाना चाहिए.

  1. एक माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट के तहत एक सीरम संबंधी पिपेट का उपयोग करके नए 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ब्लीच-आधारित सफाई एजेंट के 7 एमएल तक स्थानांतरण। सर्पिल microfluidic डिवाइस के इनपुट बंदरगाह में ब्लीच आधारित सफाई ट्यूब पेंच.
  2. साफ चलाने के प्रसंस्करण से पहले, इनपुट नमूना अत्यधिक बुलबुले से मुक्त है और यदि कोई मौजूद हैं, उन्हें एक pippette के साथ धीरे धीरे aspirating द्वारा बुलबुले को हटा दें.
  3. सर्पिल microfluidic डिवाइस पर साफ चलाएँ.

3. रोगी रक्त नमूनों से सीटीसी के पूर्व विश्लेषणात्मक संवर्धन

  1. के2EDTA ट्यूब में रक्त की 7.5 एमएल लीजिए और सेल अवसादन और थक्के से बचने के लिए कोमल आंदोलन के तहत रहते हैं। 6 ज के भीतर प्रक्रिया.
    नोट: यदि रक्त एक सेल मुक्त डीएनए रक्त संग्रह परिरक्षक युक्त ट्यूब में एकत्र किया जाता है, प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर. सुनिश्चित करें कि रक्त का नमूना, आरबीसी lysis बफर, और आरबीएस बफर संवर्धन कदम के साथ आगे बढ़ने से पहले आरटी पर हैं.
  2. एक माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट के तहत एक सीरम विज्ञान पाइपेट का उपयोग कर एक नया 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब इनपुट ट्यूब के लिए पूरे रक्त के 7.5 एमएल तक स्थानांतरण।
  3. आरटी में 10 मिनट के लिए 1,600 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, बडी कोट को परेशान किए बिना एक पिपेट के साथ प्लाज्मा अंश एकत्र करें। 7.5 एमएल तक पीबीएस के सीधे बराबर मात्रा जोड़कर प्लाज्मा अंश बदलें।
  4. 30 एमएल (के2EDTA ट्यूब के लिए) या 37.5 एमएल (एक सेल मुक्त डीएनए रक्त संग्रह ट्यूब के लिए) के अंतिम मात्रा में रक्त के नमूने के लिए आरबीसी lysis बफर (सामग्री कीतालिका) जोड़ें. आरटी में 10 मिनट के लिए रक्त संग्रह ट्यूब 10x और इनक्यूबेट को धीरे से उलटा।
    नोट: आरबीसी lysis के दौरान रक्त का नमूना गहरा लाल हो जाता है। यदि कोई परिवर्तन (अंधेरे लाल और अपारदर्शी से) 10 मिनट के बाद मनाया जाता है, धीरे ट्यूब 3x उलटा और एक और 5 मिनट अधिकतम के लिए खड़े करने के लिए छोड़ दें. यह नमूना गुणवत्ता और परख प्रदर्शन समझौता कर सकते हैं, क्योंकि अधिक से अधिक 15 मिनट के लिए आरबीसी lysis बफर में नमूना मत छोड़ो।
  5. आरटी पर 10 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर lysed रक्त का नमूना सेंट्रीफ्यूज, पर सेंट्रीफ्यूज ब्रेक (या उच्चतम मंदी की गति) के साथ। धीरे मात्रा 4-5 एमएल निशान तक पहुँच जाता है जब तक supernatant को दूर करने के लिए एक पाश्चर पिपेट या serological पिपेट का प्रयोग करें। फिर, शेष supernatant को दूर करने के लिए फ़िल्टर किए गए micropipette युक्तियों का उपयोग करें.
  6. एक फ़िल्टर टिप के साथ एक P1000 micropipette का उपयोग करना, 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब इनपुट ट्यूब की दीवार के लिए RSB के 1.0 एमएल जोड़ें. मिश्रण में बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए, नमूना सजातीय है जब तक धीरे ऊपर और नीचे pipeting द्वारा सेल गोली resuspend.
  7. 50 एमएल अपकेंद्रण ट्यूब इनपुट ट्यूब (कुल मात्रा 4 एमएल) की दीवार के लिए आरएसबी का एक अतिरिक्त 3 एमएल जोड़ें। मिश्रण में बुलबुले शुरू करने से बचें। धीरे से ऊपर और नीचे pipeting द्वारा सेल निलंबन मिश्रण.
    नोट: संभावना नहीं घटना में है कि नियमित रूप से pipeting नीचे सेल clumps को तोड़ने में असमर्थ है (दृश्य या पिपेट टिप अवरुद्ध द्वारा परिभाषित), किसी भी clumps को दूर करने के लिए एक 40 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से नमूना फिल्टर. फ़िल्टरिंग से वॉल्यूम हानि के लिए बनाने के लिए नमूना करने के लिए RSB के 150 $L जोड़ें। ध्यान दें कि इस विधि को संयम से इस्तेमाल किया जा सकता है और केवल जब बड़े clumps मनाया जाता है.
  8. संवर्धन कदम पर आगे बढ़ने से पहले, जांच लें कि नमूना अत्यधिक बुलबुले से मुक्त है और यदि कोई मौजूद है, तो बुलबुले को हटा दें और किसी भी नमूने को न छोड़ने का ध्यान रखें। छोटे बुलबुले मौजूद हैं, तो उनके हटाने की आवश्यकता नहीं है।
  9. सर्पिल microfluidic डिवाइस पर नमूना प्रक्रिया.

4. सर्पिल Microfluidic डिवाइस के साथ रोगी पूरे रक्त से सीटीसी के संवर्धन

  1. एक नया सर्पिल microfluidic चिप लोड. इनपुट और आउटपुट पोर्ट में दो खाली 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब लोड करें।
  2. सर्पिल microfluidic डिवाइस (3 मिनट) पर प्रधानमंत्री पर क्लिक करके एक प्रधानमंत्री चलाएँ. इनपुट और आउटपुट ट्यूब निकालें और इनपुट पोर्ट में संसाधित किया जा करने के लिए नमूना लोड।
  3. समृद्ध सीटीसी एकत्र करने के लिए आउटपुट पोर्ट में एक स्पष्ट 15 एमएल शंकु नली लोड करें। चलाएँ Program 3 चलाएँ और प्रोग्राम 3 (31 मि)का चयन करके चलाएँ।
  4. 10 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर आउटपुट ट्यूब और अपकेंद्रण को अनलोड करें (एक्सेल: 9; मंदी: 5) के साथ 5 एमएल सीरमिक पिपेट के साथ, शंकु 15 एमएल ट्यूब पर 2 एमएल निशान पर सुपरनेट रोक को हटा दें। एक माइक्रोपिपेट के साथ, शंकु 15 एमएल ट्यूब पर 100 डिग्री सेल्सियस के निशान पर सुपरनेंट स्टॉप को हटा दें। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए सीधे समृद्ध नमूने को संसाधित करें।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग

  1. हेमासाइटोमीटर-प्रकार ग्रिड प्रति एमएल कोशिकाओं की संख्या के साथ एक कक्षित स्लाइड पर गणना करें। 0.2% एंटी-बाइंडिंग समाधान (सामग्रीकी तालिका) के साथ समृद्ध नमूने को 100,000 कोशिकाओं/100 $एल प्रति साइटस्पिन तक पहुंचने की सांद्रता के साथ पतला करें।
  2. 0ण्2% प्रति-बाध्यकारी विलयन के 50 डिग्री सेल्सियस के साथ कपास (सामग्री तालिका) का उपयोग करके नमूना कक्ष की समोच्च को नम करें। नमूना कक्ष में एक polylysine ग्लास स्लाइड प्लेस और बंद.
  3. ऊपर और नीचे 3x pipeting द्वारा 0.2% विरोधी बाध्यकारी समाधान के साथ एक टिप कोट. समृद्ध नमूना पुन: निलंबित करें और सेल समाधान को नमूना कक्ष में स्थानांतरित करें. 4 मिनट के लिए 400 आरपीएम पर एक समर्पित अपकेंद्रित्र (सामग्री की तालिका) के साथ सेंट्रीफ्यूज (एक्सेलरेशन कम)।
  4. जमाव के क्षेत्र के चारों ओर एक सिलिकॉन आइसोलेटर रखें। 2 मिनट के लिए एक सूक्ष्म जीवसुरक्षा कैबिनेट के तहत कांच की स्लाइड सूखी.
  5. बाँझ पीबीएस के 3 एमएल के साथ 16% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के 1 एमएल को कम करके निर्धारण समाधान तैयार करें। 10 मिनट के लिए आरटी पर प्रति नमूना निर्धारण समाधान (4% पीएफए) जोड़ें और इनक्यूबेट करें। निर्धारण समाधान निकालें और 2 मिनट के लिए आरटी में 200 $L और इनक्यूबेट के साथ तीन washes प्रदर्शन करें।
    चेतावनी: साँस लेना रोकने के लिए एक रासायनिक सुरक्षा कैबिनेट के तहत पीएफए का प्रयोग करें।
  6. भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 5% पर diluting द्वारा संतृप्ति समाधान तैयार, एफसी रिसेप्टर (FcR) 5% पर अभिकर्मक अवरुद्ध, और बाँझ पीबीएस में 1% पर गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) बाँझ पीबीएस में 1% पर (सामग्रीकीतालिका).। प्रति नमूना संतृप्ति समाधान के 100 $L जोड़ें और RT पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें. संतृप्ति समाधान निकालें.
  7. प्रति नमूना एंटीबॉडी समाधान के 100 $L जोड़ें (CD45 एंटीबॉडी 1/ PanCK एंटीबॉडी 1/ पीडी-एल 1 एंटीबॉडी 1/ Qsp संतृप्ति समाधान 100 डिग्री सेल्सियस ) (सामग्री की तालिका)। एक 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में polylysine ग्लास स्लाइड प्लेस. बाँझ पानी के 2 एमएल के साथ एक शोषक कागज नम और ढक्कन के साथ पेट्री पकवान बंद. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें और प्रकाश से रक्षा करें।
  8. एंटीबॉडी मिश्रण निकालें और 2 मिनट के लिए प्रत्येक धोने incubating पीबीएस के 200 $L के साथ 3 washes प्रदर्शन करते हैं। नमूना 5 मिनट के लिए सूखी और यह प्रकाश से बचाने के लिए करते हैं। जमा के क्षेत्र में बढ़ते विलयन (सामग्रीकीसारणी) का 10 डिग्री सेल्सियस रखें और एक बुलबुले के बिना माइक्रोस्कोप कवरस्लिप से ढक दें। नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप सील करें।

6. सीधे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और एसोसिएटेड सॉफ्टवेयर के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियों का अधिग्रहण

  1. X/Y मोटरचालित प्लेटफ़ॉर्म के साथ सीधे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. डीएनए डाई (4', 6-diamidino-2-ph[nylindole [DAPI]) के लिए इसी चार चैनलों में 8 बिट आरजीबी झगड़ा छवियों लेने के लिए एक 20x उद्देश्य का उपयोग करें, PanCK डाई (fluorescein isothiocyanate [FITC]), पीडी-L1 डाई (CY3), और CD45 डाई (CY5)। उपयोग से पहले पारा लैंप 15 मिनट चालू करें, और अर्द्ध स्वचालित शूट करने के लिए माइक्रोस्कोप और संबद्ध सॉफ्टवेयर को अनुकूलित करें।
  2. कांच-स्लाइड को मंच पर रखें।
  3. अधिग्रहण मेनू में, चार चैनलों को परिभाषित करने और जोखिम समय (DAPI: 15 एमएस, FITC [PanCK]: 500 एमएस सेट; CY3 [पीडी-L1]: 800 ms; CY5 [CD45]: 1,000 ms). स्कैन करने के लिए टाइल्स को परिभाषित करें। टाइलेंक्लिक करें | उन्नत प्रयोगमें, स्कैन करने के लिए क्षेत्र निर्धारित करें.
  4. स्क्रीन पर फ़ोकस समायोजित करें. प्रयोग प्रारंभ करेंक्लिक करें.
  5. प्रत्येक चैनल की TIF फ़ाइलें निर्यात करें और विशेष रूप से इस जानकारी के साथ छवि फ़ाइल को नाम दें: Sample$NumberofTilesRegion[dye]NumberOfSubtiles.tif (उदा., Sample1]TR1]c1m01)। नाम डाई निम्नानुसार: DAPI चैनल c1 है, FITC चैनल c2 है, CY3 चैनल c3 है, और CY5 चैनल c4 है।

7. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियों का विश्लेषण

  1. डाउनलोड करें और व्यापक संस्थान की वेबसाइट से मुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्थापित करें. स्थापना के दौरान सभी डिफ़ॉल्ट स्वीकार करें। छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें और फ़ाइल क्लिक करें | फ़ाइल से पाइपलाइन ] विश्लेषण [4channels]CTC.cppipe|
    नोट: पाइप लाइन ग्रेस्केल में आरजीबी रंग छवियों धर्मान्तरित, एक औसत फिल्टर के साथ छवियों smoothing द्वारा कलाकृतियों को हटा, नाभिक और कोशिका द्रव्य की पहचान करता है, प्रत्येक चैनल के फ्लोरोसेंट तीव्रता मात्रा, और उन्हें एक एक्सेल फ़ाइल में निर्यात करता है.
  2. फ़ाइल सूचीमें फ़ाइलें छोड़ दें | टाइलों द्वारा फ़ाइलों को समूहीकृत करने के लिए मेटाडेटा का अद्यतन करें.
    नोट: सभी निर्देश ों को समूहीकृत करने के लिए सॉफ्टवेयर में निर्दिष्ट कर रहे हैं. नाम फ़ाइलें NamesAndTypes मॉड्यूल में दिखाई दिया और फ़ाइलें प्रति नमूने टाइल और चैनल की संख्या के अनुसार समूहीकृत हैं।
  3. आउटपुट सेटिंग्स देखें क्लिक करें और कोई सही डिफ़ॉल्ट आउटपुट निर्दिष्ट करें. छवियों का विश्लेषणकरें क्लिक करें. तीव्रता पैरामीटर को मापने के लिए संगत स्प्रेडशीट फ़ाइल खोलें।

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Representative Results

पहली पूर्व आवश्यकता ऊतक संस्कृति के लिए CTCs के uncontaminated (संक्रामक एजेंट मुक्त) संग्रह प्राप्त करने और यदि पृष्ठभूमि उत्पन्न से बचने के लिए किया गया था। विसंदूषण प्रोटोकॉल सभी पाइपों और पंपों की सफाई सक्षम है, और यह जीवाणु संदूषण के बिना एक अच्छा वसूली दर के साथ सीटीसी के संग्रह में हुई। समृद्ध नमूनों के बिना और सर्पिल microfluidic डिवाइस के decontamination प्रोटोकॉल कार्यप्रवाह के साथ तुलना की गई. decontamination प्रोटोकॉल को मान्य करने के लिए, A549 सेल लाइन पूरे रक्त की अनुपस्थिति में इस्तेमाल किया गया था और सीधे सर्पिल microfluidic डिवाइस का उपयोग कर समृद्ध. अनुकूलित विसंदूषण प्रोटोकॉल के बिना, उच्च जीवाणु संदूषण केवल 24 एच के बाद समृद्ध A549 सेल लाइन के ऊतक संस्कृति में मनाया गया था, जो यूकैरियोटिक कोशिकाओं में मृत्यु और साइटोमॉर्फोटिक परिवर्तन का कारण बना (चित्र 1बी)।

इसके विपरीत, सफाई प्रोटोकॉल के बाद, रहने वाले A549 कोशिकाओं ऊतक संस्कृति और मीडिया हटाने के 10 एच के बाद 2 डी संस्कृति में बढ़ रही द्वारा प्राप्त किए गए थे और 3 डी की स्थिति में (चित्र 1बी), साथ ही रोगी के नमूने (चित्र 1सी)। संभावित सीटीसी की पहचान रेडक्रॉस से की जाती है (चित्र 1ग)

चित्र 2 पूरे रक्त से समृद्ध सीटीसी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस फीनोटाइपिंग के लिए पूर्ण कार्यप्रवाह को पुन: प्राप्त करता है। यह चार प्रमुख चरणों से बना है: पूरे रक्त नमूना, सीटीसी संवर्धन, इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) परख, और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि विश्लेषण। इससे पहले, सर्पिल microfluidic डिवाइस की वसूली दर14संबोधित किया गया है. फ्लोरोसेंट नकल CTCs (mCTC) का उपयोग करते हुए, इस वसूली दर 1.3 CTCs/एमएल पूरे रक्त14पर स्थापित किया गया था.

वर्तमान कार्य समृद्ध सीटीसी के आईएफ विश्लेषण और डाउनस्ट्रीम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए इष्टतम परिस्थितियों को स्थापित करने पर केंद्रित है (चित्र2)। सबसे पहले, पीडी-L1 एंटीबॉडी की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, दो सेल लाइनों का इस्तेमाल किया गया: (1) पीसी 3 उच्च सकारात्मक-पीडी-L1 सेल लाइन और (2) SW620 कम सकारात्मक-पीडी-एल 1 सेल लाइन. कोशिकाओं तो सर्पिल microfluidic डिवाइस के साथ समृद्ध और IF द्वारा विश्लेषण किया गया. सभी कोशिकाओं ट्यूमर विरोधी PanCK मार्कर, सफेद रक्त कोशिका विरोधी CD45 मार्कर, विरोधी पीडी-L1 (फेफड़ों के कैंसर में उपयोगी), और DAPI (परमाणु डाई) के साथ दाग थे. सफेद रक्त कोशिकाओं DAPI और CD45 के लिए सकारात्मक के रूप में पहचान की गई, जबकि कैंसर कोशिकाओं DAPI और PanCK और CD45 के लिए नकारात्मक के लिए सकारात्मक के रूप में पहचान की गई. PC3 उच्च-पीडी-L1-सकारात्मक सेल लाइन पीडी-L1 के लिए सकारात्मक दाग था, जबकि एक कम पीडी-L1 अभिव्यक्ति SW620 कम-PD-L1-नकारात्मक सेल लाइन में पाया गया था.

फिर, निम्नलिखित की तुलना की गई: (i) तरल यदि दाग परख, (ii) सीधे पॉलीज्या-कोट स्लाइड पर जमा सीटीसी के दाग, और (iii) यदि पॉलीसाइन लेपित स्लाइड पर साइटस्पिन के बाद सीटीसी का धुंधला दाग। यह स्पष्ट रूप से देखा गया था कि सीटीसी की वसूली दर प्रयुक्त प्रोटोकॉल के प्रकार पर निर्भर करती है (चित्र 3क) । तरल IF धुंधला परख में, वसूली दर नुकीला mCTC की संख्या के लिए केवल 10% था सबसे कम था. यह कम वसूली दर metastatic NSCLC के साथ सबसे अधिक रोगियों के लिए एक मुद्दा प्रस्तुत करता है, के रूप में यह काफी कुछ CTCs को अलग करने और phenotypic जानकारी प्रदान करने के लिए इन परीक्षणों की क्षमता को सीमित करता है. दूसरे और तीसरे खंड में वर्णित (एमसीटीसी या सीटीसी का पॉलीलिसिन लेपित स्लाइडों पर बिना और cytopsin के साथ) का प्रत्यक्ष जमाव व्यवस्थित रूप से 60% से अधिक वसूली दर था (चित्र3ए)।

चित्र 3 बी इन IF परख के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है एक ही रोगी से पूरे रक्त के नमूने का उपयोग कर, या तो तरल IF धुंधला परख का उपयोग कर या यदि cytospin के साथ polylysine लेपित स्लाइड पर परख धुंधला. नाभिक की गणना दो परखों के बीच स्पष्ट रूप से भिन्न थी (चित्र 3ठ) परमाणु DAPI धुंधला नमूना में कुल कोशिकाओं की गणना प्रदान की है, और biomarker धुंधला हरे रंग की प्रकाश डाला सक्षम PanCK-सकारात्मक कोशिकाओं, पीडी-L1-सकारात्मक कोशिकाओं में नारंगी, और CD45 अवशिष्ट सफेद कोशिकाओं में लाल (चित्र 3) बी)।

इसके बाद, सफेद रक्त कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिकाओं से अलग करने के लिए, नाभिक के आकार को कल्पना की जानी चाहिए, क्योंकि यह सेल प्रकार की विशेषता है। चित्र 3 सी न्यूक्लिय की रूपरेखा को दर्शाता है कि blurry और आकृति विज्ञान है कि cytospin कदम के अभाव में असामान्य है. इस प्रकार अनुकूलित प्रोटोकॉल में पॉलीलिसिन लेपित स्लाइडों पर समृद्ध सीटीसी की साइटोस्पिनिंग शामिल थी, जिसके बाद यदि धुंधला होने से पहले स्लाइडों को संरक्षित किया जा सके, तो 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) निर्धारण किया गया। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल में पॉलीलिसिन-कोट्ड स्लाइड्स पर सीधे एमसीटीसी के जमा होने के समान वसूली दर थी (चित्र 3ए),तब भी जब बहुत कम कोशिकाओं को जोड़ा गया था। चूंकि यह अतिरिक्त कदम परमाणु आकारिकी के संरक्षण को सक्षम करता है (चित्र 3ब्), कणिकाओं की पहचान उनके बहु-लोब्ड नाभिक के साथ-साथ ट्यूमरल कोशिकाओं (केंद्र में एक लाल क्रॉस के साथ लेबल) के साथ उनके नाभिक के साथ की गई थी। असामान्यताओं, द्रोह पैटर्न, और सफेद रक्त कोशिकाओं की तुलना में बड़ा आकार.

आईएफ प्रोटोकॉल के अनुकूलन के बाद, मेटास्टैटिक रोगियों से पूरे रक्त का उपयोग करके एक सबूत-की-धारणा का आयोजन किया गया था। नमूने संभावित रूप से Lyon विश्वविद्यालय अस्पताल में आधारित CIRCAN नियमित सहगण के ढांचे के भीतर एकत्र किए गए थे. रक्त संग्रह आमतौर पर किया गया था जब चिकित्सकों ट्यूमर प्रगति का जल्द से जल्द संकेत मनाया. सभी ट्यूमर मामलों प्रारंभिक निदान के दौरान FFPE बायोप्सी नमूनों पर histologically या साइटोलॉजिकल रूप से पुष्टि की गई. यहाँ, प्रगति पर सीटीसी विश्लेषण जांचकर्ताओं जो करने के लिए या नैदानिक डेटा के पूर्व ज्ञान का उपयोग नहीं किया था द्वारा प्रदर्शन किया गया. विस्तृत पूर्व विश्लेषणात्मक विचार पहले से प्रकाशित किया गया है15.

चित्र 4, सारणी 1, और सारणी 2में रोगी के नमूनों से विभिन्न निष्कर्ष प्रस्तुत किए जाते हैं। CD45(+), PanCK(-), पीडी-L1(-) प्रोफ़ाइल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। सफेद रक्त कोशिकाओं के अवशिष्ट गिनती दृढ़ता से चर और पूरे रक्त के नमूने पर निर्भर होना दिखाया गया था. इस छोटे से पायलट सहगण में रेंज 648-11,000 सफेद CD45(+) कक्ष थे (चित्र 5A) . नतीजतन, सीटीसी संवर्धन के तुरंत बाद, एकत्र कोशिकाओं की गणना 100,000 कोशिकाओं/cytospin के घनत्व पर cytospin क्षेत्र पर सेलुलर घनत्व को समायोजित करने के लिए शामिल किया गया था (अनुभाग 6 देखें). यह रोगी प्रति कई cytospins के प्रदर्शन और मैनुअल गणना और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पाइप लाइन के उपयोग के लिए सूक्ष्म अवलोकन के अनुकूलन सक्षम.

चित्र 4ए-सी, सारणी1, और सारणी 2में विशिष्ट मामलों की सूचना दी गई है जिनमें अवशिष्ट श्वेत रक्त कोशिका गणनाएं अत्यधिक भिन्न थीं:

(i) पहली प्रोफाइल सीडी 45(-), पैनके(+) और पीडी-एल1(+) है जो चित्र 4क में प्रस्तुत की गई है। अक्सर कोशिकाओं का आकार व्यास में 13 डिग्री मीटर से बेहतर है और नाभिक आकृति विज्ञान अनियमित है, जो द्रोह के एक साइटोमॉर्फिक पैटर्न का प्रतिनिधित्व करता है। यह आबादी संभवतः सीटीसी से बना है।
(ii) दूसरी प्रोफाइल सीडी 45(-), पैनके(-), और पीडी-एल1(+) है। जैसा कि पहले ही बताया जा चुका है, सभी सीटीसी पैन्क बायोमार्कर को व्यक्त नहीं करते हैं (चित्र 4ए)।
(iii) तीसरी प्रोफाइल सीडी 45(-), पैनके(+) और पीडी-एल1(-) है। जैसा कि पहले ही बताया गया है, सभी सीटीसी पीडी-एल 1 बायोमार्कर को व्यक्त नहीं करते हैं।
(iv) चौथा प्रोफाइल सीडी45(+), पैनके(+) और पीडी-एल1(+) है जो चित्र 4खमें प्रस्तुत किया गया है। यह रोगी पूरे रक्त में अटूट सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है. इस जनसंख्या का वर्णनकई प्रकाशनों 16 ,17,18 में किया गया है और संवर्धन के बाद कुल कोशिकाओं का लगभग 5% का प्रतिनिधित्व करता है. इस जनसंख्या की उपस्थिति एक नमूने में झूठी सकारात्मक सीटीसी की दर में वृद्धि हो सकती है अगर CD45 संकेत की तीव्रता बहुत कम है और नाभिक की आकृति विज्ञान अच्छी तरह से संरक्षित नहीं है. यह दृढ़ता से इस इम्यूनोफ्लोरेसींस परख में Vimentin और /
(v) अंत में, अंतिम प्रोफ़ाइल में अनलेबल किए गए कक्ष CD45(-), PanCK(-), और PD-L1(-) शामिल हैं, चित्र 4Cमें हाइलाइट किया गया है। इस आबादी में नाभिक अक्सर द्रोह के साइटोमॉर्फोलॉजिकल पैटर्न को दर्शाता है, और आकार व्यास में 13 डिग्री मीटर से अधिक है। नमूनों में इन कोशिकाओं का प्रतिशत रोगी पूरे रक्त के अनुसार अत्यधिक चर रहा है. यह इस सेल उप जनसंख्या के ट्यूमर पैटर्न की पुष्टि करने के लिए पूरक ट्यूमर बायोमार्कर का उपयोग करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया।

तालिका 1 और तालिका 2 में उन्नत मेटास्टैटिक एनएससीएलसी रोगियों से 16 नमूनों की कोशिका संख्या की सूचना दी गई थी। कोशिकाओं biomarkers की अभिव्यक्ति के अनुसार वर्गीकृत किया गया. प्राप्त उप-जनसंख्या में उच्च परिवर्तनशीलता देखी गई. जैसा कि स्वतंत्र अध्ययन में पहले ही बताया गया है, अधिकांश नमूनों में CD45(-), PanCK(+) और पीडी-एल1(+) प्रोफाइल पाए गए। फिर भी, के रूप में सीटीसी आबादी अत्यधिक विषम है, रोगी के नमूने भी CD45(-), PanCK(-), और पीडी-L1(+) उप-जनसंख्या, CD45(-), PanCK(+), और पीडी-L1(-) उप-जनसंख्या और unlabeled कोशिकाओं CD45(-), PanCK(-), और PD-L1()) शामिल उप-जनसंख्या. अवशिष्ट सफेद रक्त कोशिकाओं का स्तर विश्लेषण नमूनों के बीच अत्यधिक चर रहा था.

सेल गणना की सुविधा के लिए, एक पायलट पाइप लाइन इम्यूनोफ्लोरेसीन छवियों का एक स्वचालित विश्लेषण के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर स्थापित किया गया था। कार्यप्रवाह का वर्णन चित्र 5में किया गया है. इस मामले में, इसके विपरीत और फ्लोरोसेंट तीव्रता के मामले में उच्च गुणवत्ता वाले इम्यूनोफ्लोरेसी छवियों को प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। हार्डवेयर के क्लस्टर परिकलन की क्षमता के आधार पर, छवि विश्लेषण पाइपलाइन cytospin की पूर्ण मर्ज की गई छवि या cytospin के प्रतिनिधि क्षेत्र पर लागू किया जा सकता है।

यहाँ, माइक्रोस्कोप के आधार पर, cytospin के एक अर्द्ध स्वचालित स्कैन (X/Y; $ फोकस शामिल नहीं है) क्षेत्र 150-200 विलय छवियों उत्पन्न. इन छवियों को एक साथ विलय किया जा सकता है और सीधे छवि विश्लेषण पाइप लाइन का उपयोग कर विश्लेषण किया. फिर भी, इस प्रक्रिया समय और गणना क्लस्टर संसाधन लेने वाली है, प्रयोगशालाओं में अपने नियमित उपयोग के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा. इसलिए, सेलुलर hematology के क्षेत्र में पूर्व अनुभव के आधार पर, यह एक माइक्रोस्कोप के तहत पुष्टि करने के बाद प्रत्येक नमूने के प्रतिनिधि क्षेत्रों का विश्लेषण करने का फैसला किया गया था कि कोशिकाओं का वितरण cytospin के पूरे क्षेत्र पर समरूप था. फिर, cytospin के कुल क्षेत्र का 25% (लगभग 40 टाइल्स) 40 x 4 स्वतंत्र छवियों उत्पन्न करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ स्कैन किया गया था. मर्ज की गई फ़ाइल चैनलों द्वारा विभाजित की गई थी, और छवि फ़ाइलें स्वचालित रूप से माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर के साथ उत्पन्न हुई थीं (अनुभाग 7 देखें; चित्र 5 A)इन फ़ाइलों को वर्णित पैरामीटर के अनुसार विश्लेषण के लिए छवि विश्लेषण पाइपलाइन में आयात किया गया था (अनुभाग 8 देखें; चित्र 5 एक)

चित्र 5Bमें, हमने मैन्युअल रूप से एक प्रतिनिधि छवि की पहचान की है जिसमें चार CTCs [CD45(-), PanCK(+), और 77 प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच PD-L1(+)] 77 प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच [CD45(+), PanCK(-), और पीडी-L1(-)]। चित्र 5 B दिखाता है कि कैसे छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर की पहचान की और DAPI धुंधला पर आधारित कोशिकाओं की संख्या की गणना. यह भी दिखाता है कि कैसे छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर माध्यमिक वस्तुओं गिना. अंत में, प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए फ्लोरोसेंट तीव्रता छवियों में रिपोर्ट सभी वस्तुओं के लिए सूचित किया गया.

पृष्ठभूमि की गणना की और नमूना में मौजूद नकारात्मक कोशिकाओं द्वारा प्रतिनिधित्व किया गया था। उदाहरण के लिए, गैर सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं कम फ्लोरोसेंट तीव्रता है और PanCK और पीडी-L1 धुंधला की पृष्ठभूमि को मापने सक्षम. फ्लोरोसेंट संकेत सकारात्मक समझा गया था अगर फ्लोरोसेंट तीव्रता दो गुना से पृष्ठभूमि से अधिक है (चार स्वतंत्र रोगी के नमूने के विश्लेषण के आधार पर). CD45 धुंधला के बारे में, CD45 की अभिव्यक्ति स्तर के रूप में सफेद रक्त कोशिकाओं उप आबादी में अत्यधिक चर रहा है, सकारात्मकता की दहलीज के रूप में संभव के रूप में कम सेट किया गया था. यह CD45 एंटीबॉडी के साथ दाग 10 स्वस्थ पूरे रक्त की छवियों के विश्लेषण पर आधारित था. प्रायोगिक विश्लेषण (द र् 4) में मैनुअल गणन तथा छविविश्लेषण सॉफ्टवेयर गणन (सारणी 2) के बीच सामंजस्य दिखाई दिया। cytospin पर प्रत्येक सेल छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा की पहचान की है और जीवविज्ञानियों सेल को ट्रैक करने के लिए सक्षम बनाता है और मैन्युअल रूप से परिणाम की पुष्टि, यदि आवश्यक हो.

Figure 1
चित्र 1 : के विसंदूषण के लिए कार्यप्रवाह का अवलोकन सर्पिल माइक्रोफ्लूइड युक् ति साधन. (क) विसंदूषण प्रक्रिया में शामिल तीन प्रमुख कदम ( प्रोटोकॉल देखें), जिसमें उपकरण के इनपुट और आउटपुट के स्थानीयकरण का चित्रण किया गया है। (बी) साधन के विसंदूषण से पहले और बाद में A549 सेल लाइन संवर्धन के प्रतिनिधि चित्र। एकत्र कोशिकाओं की व्यवहार्यता और आकारिकी पर एक संक्रामक एजेंट की उपस्थिति का प्रभाव दिखाया गया है। बैक्टीरिया की उपस्थिति में, कोशिका आकारिकी और व्यवहार्यता को संशोधित किया गया था। स्केल बार - 20 डिग्री मी. (सी) फेफड़ों, प्रोस्टेट और स्तन कैंसर के समृद्ध रोगी नमूनों की 3 डी कोशिका संस्कृति। लाल क्रॉस अटूट कोशिकाओं से मेल खाती है। स्केल बार ] 20 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : पूरे रक्त नमूने से इम्यूनोफ्लोरेस विश्लेषण के कार्यप्रवाह का अवलोकन फ्लोरोसेंट छवियों के विश्लेषण के लिए। प्रमुख कदम निम्नानुसार दिखाए जाते हैं: पूरे रक्त के लिए रक्त संग्रह, सर्पिल microfluidic डिवाइस के साथ सीटीसी संग्रह, इम्यूनोफ्लोरेसी परख, और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर. biomarker का चुनाव cytospin स्लाइड पर नजर रखने योग्य कोशिकाओं की विभिन्न आबादी की बेहतर पहचान द्वारा संचालित किया गया था (प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए CD45, PanCK और फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं के लिए पीडी-L1). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : तीन स्वतंत्र धुंधला प्रोटोकॉल की वसूली दर. (क) तरल धुंधला से एमसीटीसी की वसूली दर की तुलना, पॉलीलिसिन लेपित स्लाइडों पर जमा सेल के प्रत्यक्ष दाग, और पॉलीलिसिन लेपित स्लाइडों पर साइटस्पिन के बाद सेल धुंधला। (बी) तरल आईएफ प्रोटोकॉल द्वारा संसाधित रोगी नमूनों की प्रतिनिधि छवियों और cytospinstep के साथ प्रत्यक्ष इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल। कोशिकाओं CD45 monoclonal एंटीबॉडी (क्लोन HI30) एलेक्सा फ्लोर 647 के साथ दाग रहे थे; PanCK मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (क्लोन AE1/ 4', 6-diamidino-2-ph$nylindole (डीएपीआई). स्केल बार ] 20 डिग्रीमी (सी) के साथ और cytospin कदम के बिना सेल संवर्धन के DAPI धुंधला के प्रतिनिधि छवियों. नाभिक की आकृति विज्ञान और आकार DAPI धुंधला का उपयोग कर दिखाया गया. रेड क्रॉस सही हाथ छवि में नाभिक में असामान्यताओं के साथ कोशिकाओं पर प्रकाश डाला गया. बाएँ हाथ की छवि में, छवि फजी है, क्योंकि कोशिकाओं को एक ही स्तर पर नहीं हैं (x-, y-, और z-axes). स्केल बार ] 10 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : सेल प्रोफाइल की पहचान| (ए) विभिन्न सीटीसी प्रोफाइल के साथ रोगियों के प्रतिनिधि छवियों. फ्लोरोसेंट चैनल अलग से प्रस्तुत कर रहे हैं. मर्ज किए गए छवियाँ बाईं ओर दिखाई जाती हैं. वे CD45 monoclonal एंटीबॉडी (क्लोन HI30) एलेक्सा फ्लोर 647 के साथ दाग रहे हैं; PanCK मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (क्लोन AE1/ PDL-1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (क्लोन 29E2A3) phycoerythrin; 4', 6-diamidino-2-ph$nylindole (डीएपीआई); तीर अटूट कोशिकाओं की ओर इशारा करते हैं। (बी) अटूट सफेद रक्त कोशिकाओं प्रोफाइल के साथ दो रोगी नमूनों के इम्यूनोस्टेनिंग के प्रतिनिधि छवियों। कोशिकाओं CD45 monoclonal एंटीबॉडी (क्लोन HI30) एलेक्सा फ्लोर 647 के साथ दाग रहे थे; PanCK मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (क्लोन AE1/ PDL-1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (क्लोन 29E2A3) phycoerythrin; 4', 6-diamidino-2-ph$nylindole (डीएपीआई). छवि CD45(+), PanCK(+), और पीडी-L1(+) के साथ दाग प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति पर प्रकाश डाला गया. (ग) छवि में लेबल न किए गए कक्षों (सीडी45(-), पैनकेके(-) और पीडी-एल1(-) की उपस्थिति पर प्रकाश डाला गया है। स्केल बार ] 10 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : फ्लोरोसेंट छवियों के विश्लेषण का अवलोकन. (ए) मुख्य चरणों का वर्णन किया गया है: माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग, फ्लोरोसेंट के अनुसार चैनल विभाजित, और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में फ़ाइलों का आयात. (B) छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के कार्यप्रवाह के लिए तीन भिन्न चरणों का विवरण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Table 1
तालिका 1: रोगी सेल संवर्धन की मैनुअल गणना. DAPI धुंधला पर आधारित कोशिकाओं की गणना. FITC, पीई और CY5 धुंधला पर आधारित अन्य वस्तुओं की गणना.

Table 2
तालिका 2: छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर रोगी सेल संवर्धन की गणना . DAPI धुंधला पर आधारित कोशिकाओं की गणना. FITC, पीई और CY5 धुंधला पर आधारित अन्य वस्तुओं की गणना. मैनुअल गिनती और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर गणना की तुलना.

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Discussion

दो प्रमुख अंक वर्तमान अध्ययन में उठाए गए थे, पहले के साथ नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अपने हस्तांतरण के लिए कार्यप्रवाह के प्रदर्शन का संबंध है, और दूसरा प्राप्त फ्लोरोसेंट छवियों के विश्लेषण के लिए विषयपरकता में कमी के विषय में.

सीटीसी गणना के लिए एक performant और अनुकूलित कार्यप्रवाह शुरू में एक सीटीसी लेबल मुक्त microfluidic प्रणाली (सर्पिल microfluidic डिवाइस) के माध्यम से सेल संवर्धन के बाद अनुकूलन IF परख का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. इस कार्यप्रवाह का उपयोग करते हुए, एक पायलट अध्ययन की पुष्टि की है कि metastatic NSCLC रोगियों से सभी नमूनों अटूट कोशिकाओं, जो सभी CD45 थे (-) निहित. वे वैकल्पिक रूप से PanCK और /या पीडी-L1 biomarkers के साथ लेबल किया जा सकता है; हालांकि, वे भी सभी परीक्षण biomarkers के लिए पूरी तरह से नकारात्मक हो सकता है [CD45(-), PanCK(-), और PD-L1(-) के रूप में S19 नमूना में मनाया (तालिका 2)]. यह दृढ़ता से phenotyping सीटीसी उप आबादी के लिए अतिरिक्त biomarkers के लिए की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया. नतीजतन, यह इस तरह के EpCAM, Vimentin, और एन-Cadherin के रूप में उपकला-मेसेनकाइमल biomarkers जोड़ने का प्रस्ताव किया गया है; CD44 और CD133 सहित कैंसर स्टेम कोशिकाओं के मार्करों; और फेफड़ों एडेनोकार्सीनोमा के लिए TTF1 सहित विशिष्ट ट्यूमर मार्करों।

प्रायोगिक अध्ययन में, अटूट कोशिका की श्रेणी 3.5 एमएल पूरे रक्त से 40; 400 थी। रोगी के नमूनों के 80% के लिए, अटूट सेल गिनती 50 से अधिक थी। वास्तव में, साइटोलॉजिकल19,20,एंडो ब्रोन्कियल अल्ट्रा सोनिक गाइड ट्रांस ब्रोन्कियल सुई आकांक्षा या सीटी निर्देशित ट्रांस-थोरेसिक पंचर से21 नमूने, पीडी-एल 1 विश्लेषण नमूनों के अधिकांश में उपयुक्त है, लेकिन एक $ 100 ट्यूमर कोशिकाओं की सीमा आमतौर पर मूल्य के एक सांख्यिकीय और नैदानिक व्याख्या का उत्पादन करने के लिए भर्ती किया जाता है. हालांकि, रक्त सीटीसी के विशेष मामले में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि स्थानिक ट्यूमर विषमता के मुद्दे को छोटे साइट पर ट्यूमर के नमूनों के विपरीत द्वारा नजरअंदाज कर दिया जाता है।

दूसरा मुद्दा इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों के विश्लेषण पर हैंडलर के प्रभाव से बचने के लिए था। फ्लोरोसेंट छवियों की छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर इस प्रकार सेल गणना मानकीकरण और इन नमूनों के लिए सांख्यिकीय डेटा प्रदान करने के लिए स्थापित किया गया था. इस स्वचालित प्रक्रिया ने एक ही नमूने में निहित सभी कक्षों के विश्लेषण के लिए शक्तिशाली परिकलन समूहों की आवश्यकता पर प्रकाश डाला. इसके अलावा, यदि धुंधला की गुणवत्ता के लिए एक ही विमान में होना है (confocal सिस्टम के उपयोग से बचने के लिए), और cytospin पर कोशिकाओं के घनत्व के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर को सक्षम करने के लिए सभी कोशिकाओं को अलग से स्लाइड पर पहचान करने के लिए calibrated किया जाना चाहिए. अंत में, परिणाम रोगियों के एक सहगण में नैदानिक परिणामों के बारे में मान्य नहीं थे, लेकिन इस बिंदु एक और समर्पित अध्ययन में संबोधित किया जाना चाहिए.

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Disclosures

जीन Philippe Aurel और कैथरीन Weiki ली Biolidics कंपनी है कि इस लेख में इस्तेमाल उपकरणों का उत्पादन के कर्मचारी हैं. अन्य लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम Astraeca (लंदन, यूनाइटेड किंगडम), Biolidics (सिंगापुर) और लीग Contre ले कैंसर (सोन एट लॉयर, फ्रांस) से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकअपने वित्तीय समर्थन के लिए एस्ट्राज़ेनेका और Biolidics कंपनियों का शुक्र है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) Ozyme BLE 422801 Storage conditions: +4 °C
BD Facs Clean – 5 L BD Biosciences 340345 Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL Biolidics CBB-F016012 Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% Sigma A8412 Storage conditions: +4 °C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 BioLegend BLE304020 Storage conditions: +4 °C
CellProfiler Software Broad Institute Image Analysis Software
Centrifuge device Hettich 4706 Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL Corning 430-829 Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL Biolidics CBB-F001004-25 Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System Biolidics CBB-F011002 Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L Beckman Coulter 8448222 All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S Biolidics CBB-FR001002 Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4 ThermoFisher A78300003 Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL Biolidics CBB-F016009 Storage conditions: +4 °C
EZ Cytofunnels ThermoFisher A78710003 Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent Miltenyi Biotec 130-059-901 Storage conditions: +4 °C
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10270-106 Storage conditions: +4 °C
Fluoromount Sigma F4680 Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone - 50 mg Bristol-Myers-Squibb 90129TB29 Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C
FX1 Input Straw with lock cap Biolidics CBB-F013005 Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide Dutscher 50126 Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 ThermoFisher 53-9003-80 Storage conditions: +4 °C
Paraformaldehyde 16% ThermoFisher 11490570 Fixation solution. Storage conditions: +4 °C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin BioLegend BLE329706 Storage conditions: +4 °C
Petri Dish Dutscher 632180 Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) Ozyme BE17-512F Storage conditions: +4 °C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L 1st Base Laboratory BUF-2040-1X1L Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10% Gibco 24040-032 Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides ThermoFisher J2800AMNZ Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL Falcon 352098 Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL G Biosciences 786-649 Storage conditions: +4 °C
RBC Lysis Buffer – 250 mL G Biosciences 786-650 Storage conditions: +4 °C
Resuspension Buffer (RSB) Biolidics CBB-F016003 Storage conditions: +4 °C
Shandon Cytopsin4 centrifuge ThermoFisher A78300003 Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator Grace bio-Labs 664270 Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL 1st Base Laboratory CUS-4100-100ml Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 Zeiss Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag SPS Laboratoires 98ULT01240 Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile BD Biosciences 300296 Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile ClearLine 51732 Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software Zeiss Microscope associated software

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 150 फेफड़ों के कैंसर ट्यूमर कोशिकाओं घूम नि: शुल्क डीएनए घूम इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख सीटीसी सर्पिल microfluidic डिवाइस पीडी-L1
इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर रोगियों से अर्द्ध-स्वचालित पीडी-एल 1 विशेषता और परिसंचरण ट्यूमर कोशिकाओं की गणना
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Garcia, J., Barthelemy, D., Geiguer, F., Ballandier, J., Li, K. W., Aurel, J. P., Le Breton, F., Rodriguez-Lafrasse, C., Manship, B., Couraud, S., Payen, L. Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (150), e59873, doi:10.3791/59873 (2019).

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