Summary
Die Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) ist ein beliebtes Thema in der translationalen Forschung. Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Immunfluoreszenztest (IF) zur PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung von CTCs in Nicht-Kleinzell-Lungenkrebsproben (NSCLC).
Abstract
Zirkulierende Tumorzellen (CTCs), die aus dem Primärtumor abgeleitet werden, werden in den Blutkreislauf oder das Lymphsystem vergossen. Diese seltenen Zellen (1,10 Zellen pro ml Blut) garantieren eine schlechte Prognose und korrelieren mit einem kürzeren Gesamtüberleben bei mehreren Krebsarten (z. B. Brust, Prostata und Dickdarmkrebs). Derzeit ist das Anti-EpCAM-beschichtete magnetische Perlen-basierte CTC-Erfassungssystem der Goldstandard-Test, der von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) für die Aufzählung von CTCs im Blutkreislauf zugelassen wurde. Dieser Test basiert auf der Verwendung von magnetischen Perlen, die mit Anti-EpCAM-Markern beschichtet sind, die speziell epitheliale Krebszellen aufvisieren. Viele Studien haben gezeigt, dass EpCAM nicht der optimale Marker für die CTC-Erkennung ist. Tatsächlich sind CTCs eine heterogene Subpopulation von Krebszellen und können sich einem epitheliaal-mesenchymalen Übergang (EMT) unterziehen, der mit metastasierender Proliferation und Invasion verbunden ist. Diese CTCs sind in der Lage, die Expression des Zelloberflächenepithelmarkers EpCAM zu reduzieren und gleichzeitig mesenchymale Marker wie Vimentin zu erhöhen. Um diese technische Hürde zu überwinden, wurden andere Isolationsmethoden entwickelt, die auf physikalischen Eigenschaften von CTCs basieren. Mikrofluidische Technologien ermöglichen einen etikettenfreien Ansatz zur CTC-Anreicherung aus Vollblutproben. Die spiralförmige mikrofluidische Technologie nutzt die Trägheits- und Dean-Drag-Kräfte mit kontinuierlichem Fluss in gekrümmten Kanälen, die in einem spiralförmigen mikrofluidischen Chip erzeugt werden. Die Zellen werden aufgrund der Unterschiede in Größe und Plastizität zwischen normalen Blutzellen und Tumorzellen getrennt. Dieses Protokoll beschreibt die verschiedenen Schritte zur Charakterisierung des programmierten Death-Ligand 1 (PD-L1)-Ausdrucks von CTCs, indem ein spiralförmiges mikrofluidisches Gerät mit anpassbarem Immunfluoreszenz-Marker (IF) kombiniert wird.
Introduction
Tumorantigen-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Reaktion auf Krebs erkrankungen durch einen Prozess, der als Krebs "Immunüberwachung" bekannt ist. Ihre Anti-Tumor-Funktionen werden durch Immun-Checkpoint-Blockade-Antikörper wie CTLA-4-Hemmer und PD-1/PD-L1-Hemmer verstärkt. Bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) führen Anti-PD-1/PD-L1-Therapien zu Ansprechraten zwischen 0%-17% bei Patienten mit PD-L1-negativen Tumoren und 36%-100% bei Patienten, die PD-L1 exemittieren. Die robusten Reaktionen auf die PD-1/PD-L1-Blockade, die bei Melanomen und NSCLC beobachtet wurden, zeigen Hinweise auf eine verbesserte Gesamtansprechrate (RR), dauerhafte klinische Vorteile und progressionsfreies Überleben (PFS). Derzeit sind Anti-PD1-Behandlungen der Standard der Behandlung in der zweiten Linie NSCLC-Behandlung mit Nivolumab unabhängig von der PD-L1-Expression und mit Pembrolizumab bei Patienten, die PD-L1-1% exdrücken. In der Erstlinienbehandlung ist der Standard der Behandlung Pembrolizumab allein bei Patienten mit NSCLC, die PD-L1 exdrücken, 50 % undkann potenziell mit Chemotherapie (Platin und Doublet-Medikament je nach histologischem Subtyp) 1,2verbessert werden.
Ein solcher Ansatz für das Patientenmanagement ist jedoch fraglich3, da die PD-L1-Expression in Tumorzellen durch Immunhistochemie (IHC) wahrscheinlich nicht der ideale Begleitbiomarker ist. Andere wie Tumormutationsbelastung4 (TMB), Mikrosatelliteninstabilität (MSI) und/oder Mikrobiota sind in dieser Umgebung möglicherweise allein oder in Kombination interessant. NSCLC sind als heterogene Tumoren bekannt, entweder räumlich (von einer Tumorstelle zu einer anderen) oder zeitlich (von der Diagnose bis zum Wiederauftreten). Patienten mit NSCLC sind in der Regel zerbrechlich, und iterative invasive Gewebebiopsien können ein Problem sein. Tatsächlich liegt die Rebiopsierate bei der ersten Progression je nach Serie zwischen 46 und 84 %, und die erfolgreiche Rebiopsie (d. h. mit histologischer und vollständigmolekularer Analyse) liegt zwischen 33%-75%. Dies bedeutet, dass 25%-67% der Patienten während der ersten Progression keine umfassende Rebiopsieanalyse erhalten können5,6,7,8.
Das Aufkommen von "flüssigen Biopsien" hat daher in diesem speziellen Umfeld erhebliche Begeisterung ausgelöst, da es eine entscheidende Neubewertung molekularer Veränderungen während der Krankheitsprogression ermöglicht, indem zirkulierende freie DNA (cfDNA) untersucht wird, die aus zirkulierender DNA (cfDNA) gewonnen wird. Tumorzellen (CTCs). Diese lebenden Zellen werden aus dem Tumor in den Blutkreislauf freigesetzt, wo sie frei zirkulieren. Obwohl sie nicht routinemäßig verwendet wird, scheint die Analyse von CTCs bei molekularer und phänotypischer Charakterisierung, Prognose und prädiktiver Bedeutung bei Lungenkrebs (über DNAseq, RNAseq, miRNA und Proteinanalyse) sehr vielversprechend zu sein. Tatsächlich enthalten CTCs wahrscheinlich eher phänotypische Merkmale der aktiven Krankheit als die anfänglichen Marker (die bei der Diagnose auf Gewebebiopsien nachgewiesen wurden). Darüber hinaus umgehen CTCs das Problem der räumlichen Heterogenität des Tumorgewebes, das bei kleinen Biopsien ein entscheidendes Problem sein kann. Folglich kann die PD-L1-Expression auf CTCs möglicherweise Licht auf die Diskrepanzen werfen, die sich aus seiner Verwendung als prädiktiver Biomarker unter Verwendung von Tumorgewebe ergeben.
Kürzlich wurde die PD-L1-Expression in CTCs von NSCLC getestet. Fast alle der getestetenPatienten waren PD-L1-positiv, was die Interpretation des Ergebnisses und seine klinische Anwendung erschwerte. Insgesamt wurden PD-L1-positive CTCs in 69,4% der Proben von durchschnittlich 4,5 Zellen/ml10nachgewiesen. Nach Beginn der Strahlentherapie stieg der Anteil der PD-L1-positiven CTCs signifikant an, was auf eine Upregulation der PD-L1-Expression als Reaktion auf Strahlung11hindeutet. Daher kann die PD-L1-CTCs-Analyse verwendet werden, um dynamische Veränderungen des Tumors und der Immunantwort zu überwachen, die die Reaktion auf Chemotherapie, Bestrahlung und wahrscheinliche Immuntherapie (IT) Behandlungen widerspiegeln können.
Bis heute basieren ctCs Isolation und PD-L1-Charakterisierung auf verschiedene Methoden wie Anti-EpCAM-beschichtete magnetische Perlen-basierte CTC-Erfassung, anreicherungsfreie Assay und größenbasierte12,13 CTC-Capture-Assays. CTCs wurden jedoch nur bei 45%-65% der Patienten mit metastasierendem NSCLC nachgewiesen, wodurch ihre Fähigkeit, Informationen für mehr als die Hälfte der metastasierenden NSCLC-Patienten bereitzustellen, eingeschränkt wurde. Darüber hinaus war die CTC-Zahl in den meisten dieser Studien mit größenbasiertem Ansatz10niedrig. Darüber hinaus hat diese Methode zu Diskrepanzen wie dem Nachweis von CD45(-)/DAPI(+)-Zellen mit "zytomorphologischen Mustern der Malignität" im Blut von gesunden Spendern geführt. Diese Bedenken unterstreichen die Notwendigkeit einer hochsensiblen Methode der CTC-Sammlung im Zusammenhang mit der Immun-Phänotypisierung atypischer CD45(-)-Zellen aus gesundem Vollblut mit zusätzlichen Krebsbiomarkern (z. B. TTF1, Vimentin, EpCAM und CD44) in NSCLC.
Folglich haben wir ein spiralmikrofluidisches Gerät ausgewertet, das Trägheits- und Dean-Drag-Kräfte verwendet, um Zellen basierend auf Größe und Plastizität durch einen mikrofluidischen Chip zu trennen. Die Bildung von Dean Wirbelflüssen, die im mikrofluidischen Chip vorhanden sind, führt zu größeren CTCs entlang der Innenwand und kleineren Immunzellen entlang der Außenwand des Chips. Der Anreicherungsprozess wird durch Absaugen der größeren Zellen in den Entnahmeauslass als angereicherte CTC-Fraktion abgeschlossen. Diese Methode ist besonders empfindlich und spezifisch (Nachweis von ca. 1 CTC/ml Vollblut)14 und kann mit kundenspezifischen Immunfluoreszenzanalysen (IF) in Verbindung gebracht werden. Diese Instrumente werden es ermöglichen, einen positiven Schwellenwert für die klinische Interpretation festzulegen. So wird ein Workflow beschrieben, der es Biologen ermöglicht, CTCs mit hoher Regenerationsrate und Spezifität zu isolieren und immunphenotyp. Das Protokoll beschreibt die optimale Nutzung des spiralförmigen mikrofluidischen Geräts zur Erfassung von CTCs, die optimierten IF-Assays, die je nach Krebsart angepasst werden können, und die Verwendung kostenloser Open-Source-Software zur Messung und Analyse von Zellbildern zur Durchführung einer halbautomatischen Zählung der Zellen nach fluoreszierender Färbung. Darüber hinaus kann das Mikroskopmultiplexing in Abhängigkeit von der Anzahl der verfügbaren Fluoreszenzfilter/Marker durchgeführt werden.
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Protocol
Die Proben wurden prospektiv im Rahmen der CIRCAN-Kohorte ("CIRculating CANcer") am Universitätskrankenhaus Lyon nach schriftlicher Zustimmung des Patienten gesammelt. Diese Studie wurde in die Kohorte CIRCAN_ALL integriert. Die Studie CIRCAN_ALL wurde von der CPP South-East IV vom 04.11.2015 unter der Referenz L15-188 als nicht interventional anerkannt. Eine geänderte Fassung wurde am 20.09.2016 unter der Nummer L16-160 als nicht interventionvoll anerkannt. Die CIRCAN_ALL-Studie wurde dem IT- und Freiheitskorrespondenten der Hospize Civils de Lyon am 01.12.2015 unter der Referenz 15-131 gemeldet. Die Blutentnahme wurde durchgeführt, als Ärzte die früheste Indikation der Tumorprogression beobachteten.
HINWEIS: Verwenden Sie alle in der Tabelle der Materialien beschriebenen Reagenzien und Materialien mit den entsprechenden Lagerbedingungen für die voranalytische Probenvorbereitung und den Immunfluoreszenztest. Die Substitution von Reagenzien und/oder die Änderung der Lagerbedingungen kann zu einer suboptimalen Assay-Leistung führen.
1. Dekontamination von Spiral-Mikrofluid-Gerät
HINWEIS: Die Dekontamination des mikrofluidischen Spiralgeräts ist eine Voraussetzung, um alle Immunfluoreszenzhintergründe zu entfernen, die durch Bakterienkontamination erzeugt werden, die Zytomorphologie von CTCs zu erforschen und sie von normalen Immunzellen zu unterscheiden. Das Protokoll ist für Blutproben optimiert, die in K2EDTA-Röhren innerhalb von 6 h nach der Blutentnahme entnommen und mit dem spiralförmigen mikrofluidischen Gerät unter sauberen Bedingungen angereichert werden. Die Verwendung dieses Assays für andere Arten von Proben (andere biologische Flüssigkeiten) kann eine zusätzliche Optimierung erfordern. Dieses Dekontaminationsprotokoll sollte einmal pro Woche durchgeführt werden.
- Herstellung von Reagenzien
- Vorbereitung des Verdünnungspuffers
- 20 ml verdünnungsmittels additives Reagenz mit einem 0,22 m Spritzenfilter sterilisieren und direkt zu 1 L1x 1x Phosphatpuffer-Saline (PBS) ultrareinen Sorte (Materialtabelle) hinzufügen.
- Sterilisation von Reagenzien und dem Eingangsstroh
- Sterilisieren Sie den RBC-Lysepuffer und Resuspensionspuffer (RSB; Materialtabelle) mit einem 0,22 m Spritzenfilter und Lager in einem neuen 50 ml Polypropylen Konusrohr für jede Lösung.
- Sterilisieren Sie das Eingangsstroh durch Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für 1 h im Allzweck-Reinigungsreagenz (Materialtabelle). Das Stroh auf das Bleichmittel (Materialtabelle) geben und bei RT für 1 h brüten.
- Spülen Sie das Eingangsstroh zweimal mit sterilem PBS für jeweils 1 h und lagern Sie das sterilisierte Eingangsstroh in einem chirurgisch sterilen Beutel (Materialtabelle).
- Vorbereitung des Verdünnungspuffers
- Dekontaminierung des mikrofluidischen Spiralgeräts
- Desinfektion mit dem Allzweck-Reinigungsreagenz
- Trennen Sie den verdünnten Flaschenverschluss vom verdünnten Anschluss der spiralförmigen mikrofluidischen Vorrichtung, indem Sie die braune Schraube abschrauben. Unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank bis zu 250 ml Allzweck-Reinigungsreagenz (Materialtabelle) in eine neue leere Flasche geben.
- Schrauben Sie den verdünnten Flaschenverschluss und das Stroh auf die Flasche mit 250 ml Allzweck-Reinigungsreagenz unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank. Befestigen Sie diese Flasche am verdünnten Anschluss der spiralförmigen mikrofluidischen Vorrichtung, indem Sie die braune Schraube zurückschrauben.
- Transfer bis zu 100 ml Bleichmittel (1% Endkonzentration; Materialtabelle) dem im Laufsatz gelieferten Abfallbehälter (Abbildung 1A).
- Laden Sie ein neues steriles Eingangsstroh auf das spiralförmige mikrofluidische Gerät(Materialtabelle) im Eingangsanschluss. Laden Sie ein neues 50 ml Zentrifugenrohr in den Eingangsanschluss. Laden Sie ein neues 50 ml Zentrifugenrohr in den Ausgangsanschluss.
- Fahren Sie mit der Grundierung des mikrofluidischen Spiralgeräts fort, indem Sie auf Prime auf dem spiralförmigen mikrofluidischen Gerät (3 min) klicken. Entfernen Sie das Eingangsrohr, nachdem die Primzahl abgeschlossen ist.
- Bis zu 15 ml Allzweck-Reinigungsreagenz in ein neues 50 ml Zentrifugenrohr mit einer serologischen Pipette unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank übertragen und das Rohr am Eingangsanschluss der Spiralmikrofluidanlage befestigen.
- Bevor Sie mit dem Lauf beginnen, überprüfen Sie, ob die Lösung frei von übermäßigen Blasen ist. Wenn Blasen vorhanden sind, entfernen Sie sie durch langsames Streben mit einer Pipette.
- Laden Sie einen dekontaminationsmikrofluidischen Chip in die spiralförmige mikrofluidische Vorrichtung. Führen Sie ein Programm 3 auf dem mikrofluidischen Spiralgerät aus, indem Sie auf Ausführen klicken und das Programm 3 (31 min)auswählen.
HINWEIS: Das Programm 3 der spiralförmigen mikrofluidischen Vorrichtung ermöglicht eine schnelle Anreicherung von CTCs in 31 min. - Fahren Sie mit dem Reinigungsschritt des spiralförmigen mikrofluidischen Geräts mit dem restdauernden Volumen des Allzweck-Reinigungsreagenzes im Eingangsrohr fort.
- Entsorgen Sie das Eingangsrohr, nachdem der Reinigungsschritt abgeschlossen ist, und lassen Sie das Eingangsstroh zurück.
- Dekontamination mit dem Bleichmittel
- Trennen Sie den Allzweck-Reinigungs-Reagenz-Flaschenverschluss vom verdünnten Anschluss der spiralförmigen mikrofluidischen Vorrichtung, indem Sie die braune Schraube abschrauben. Unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank bis zu 250 ml Bleichmittel (Materialtabelle) in eine neue leere Flasche geben (Abbildung 1A).
- Schrauben Sie den Allzweck-Reinigungs-Reagenz-Flaschenverschluss und Stroh an die Flasche, die das Bleichmittel enthält, unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank. Befestigen Sie diese Flasche am verdünnten Anschluss der spiralförmigen mikrofluidischen Vorrichtung, indem Sie die braune Schraube zurückschrauben.
- Mit einer serologischen Pipette unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank bis zu 15 ml Bleichmittel auf ein neues 50 ml Zentrifugenrohr-Eingangsrohr übertragen. Laden Sie die Eingangsposition des Zentrifugenrohrs von 50 ml. Laden Sie ein leeres Rohr in Ausgangsposition.
- Bevor Sie den Lauf verarbeiten, überprüfen Sie, ob die Probe frei von übermäßigen Blasen ist, und wenn vorhanden, entfernen Sie die Blasen, indem Sie sie langsam mit einer Pipette anheben.
- Führen Sie Programm 3 aus, indem Sie auf Ausführen klicken und das Programm 3 (31 min)auswählen. Fahren Sie nach dem Durchlauf direkt mit dem Reinigungsschritt im Eingangsrohr zum Reinigungsschritt.
- Entsorgen Sie die Eingangs- und Ausgangsrohre.
- Spülen Sie das spiralförmige mikrofluidische Gerät.
- Trennen Sie den flaschenverdünnten Deckel des Bleichmittels vom verdünnten Anschluss der mikrofluidischen Spiralvorrichtung, indem Sie die braune Schraube abschrauben. Übertragen Sie das Stroh unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank aus der Flasche, die das Bleichmittel enthält, in die neue Flasche, die den Verdünnungspuffer enthält. Schrauben Sie die Flasche an die Spiral-Mikrofluid-Vorrichtung.
- Übertragen Sie bis zu 15 ml sterilisiertes Wasser (Materialtabelle) mit einer serologischen Pipette unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank in ein neues 50 ml Zentrifugenrohr-Eingangsrohr. Laden Sie die Eingangsposition des Zentrifugenrohrs von 50 ml. Laden Sie ein leeres Rohr in Ausgangsposition.
- Bevor Sie den Lauf verarbeiten, überprüfen Sie, ob die Probe frei von übermäßigen Blasen ist, und wenn vorhanden, entfernen Sie die Blasen, indem Sie sie langsam mit einer Pipette anheben.
- Führen Sie Programm 3 aus, indem Sie auf Ausführen klicken und das Programm 3 (31 min)auswählen. Gehen Sie nach dem Lauf direkt mit dem Reinigungsschritt mit dem verbleibenden Volumen sterilisierten Wassers im Eingangsrohr fort.
- Entsorgen Sie die Eingangs- und Ausgangsrohre.
- Desinfektion mit dem Allzweck-Reinigungsreagenz
2. Wartung, um das Spiral-Mikrofluid-Gerät bakterienfrei zu halten
HINWEIS: Die routinemäßige Wartung sollte am Ende des Tages während des letzten Reinigungsschritts durchgeführt werden.
- Mit einer serologischen Pipette unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank bis zu 7 ml Bleichmittel in das neue 50 ml Zentrifugenrohr geben. Schrauben Sie das bleichbasierte Reinigungsrohr im Eingangsanschluss der spiralförmigen mikrofluidischen Vorrichtung.
- Bevor Sie den sauberen Lauf verarbeiten, überprüfen Sie, ob die Eingangsprobe frei von übermäßigen Blasen ist, und wenn vorhanden, entfernen Sie die Blasen, indem Sie sie langsam mit einer Pipette anheben.
- Führen Sie das Saubere auf dem spiralförmigen mikrofluidischen Gerät aus.
3. Präanalytische Anreicherung von CTC aus Patientenblutproben
- Sammeln Sie 7,5 ml Blut in der K2EDTA-Röhre und halten Sie unter sanfter Erregung, um Zellsedimentation und Gerinnung zu vermeiden. Prozess innerhalb von 6 h.
HINWEIS: Wenn das Blut in einem zellfreien DNA-Blutentnahmeröhrchen mit Konservierungsmittel gesammelt wird, bei 4 °C bis zur Verarbeitung lagern. Stellen Sie sicher, dass sich die Blutprobe, der RBC-Lysepuffer und der RBS-Puffer bei RT befinden, bevor Sie mit dem Anreicherungsschritt fortfahren. - Mit einer serologischen Pipette unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank bis zu 7,5 ml Vollblut in ein neues 50 ml Zentrifugenrohr-Eingangsrohr übertragen.
- Zentrifuge bei 1.600 x g für 10 min bei RT. Sammeln Sie die Plasmafraktion mit einer Pipette, ohne das buffy Mantel zu stören. Ersetzen Sie die Plasmafraktion, indem Sie direkt gleichwertiges PBS-Volumen bis zu 7,5 ml hinzufügen.
- Fügen Sie der Blutprobe vorsichtig den RBC-Lysepuffer (Materialtabelle) zu einem Endvolumen von 30 ml (für ein K2EDTA-Rohr) oder 37,5 ml (für ein zellfreies DNA-Blutentnahmeröhrchen) hinzu. Umkehren Sie vorsichtig die Blutentnahmeröhrchen 10x und inkubieren Sie für 10 min bei RT.
HINWEIS: Die Blutprobe wird während der RBC-Lyse dunkler rot. Wenn nach 10 min keine Veränderung (von dunkelrot und undurchsichtig) beobachtet wird, umkehren Sie das Rohr vorsichtig 3x und lassen Sie sie für weitere 5 min maximal stehen. Lassen Sie die Probe nicht mehr als 15 min im RBC-Lysepuffer, da sie die Probenqualität und die Assayleistung beeinträchtigen kann. - Zentrifuge die lysierte Blutprobe bei 500 x g für 10 min bei RT, mit Zentrifugenbremsen (oder höchster Verzögerungsgeschwindigkeit). Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette oder eine serologische Pipette, um den Überstand vorsichtig zu entfernen, bis das Volumen die 4-5 ml-Marke erreicht. Verwenden Sie dann gefilterte Mikropipette-Spitzen, um den verbleibenden Überstand zu entfernen.
- Mit einer P1000-Mikropipette mit gefilterter Spitze 1,0 ml RSB an die Wand des 50 ml Zentrifugenrohr-Eingangsrohrs geben. Um blasen zu vermeiden, setzen Sie das Zellpellet wieder auf, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen, bis die Probe homogen ist.
- Fügen Sie der Wand des 50 ml Zentrifugenrohr-Eingangsrohrs weitere 3 ml RSB hinzu (Gesamtvolumen 4 ml). Vermeiden Sie Blasen in die Mischung. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen.
HINWEIS: In dem unwahrscheinlichen Fall, dass regelmäßiges Pipettieren nicht in der Lage ist, Zellklumpen abzubauen (definiert durch sichtbar oder blockieren der Pipettenspitze), filtern Sie die Probe durch ein 40 m großes Zellsieb, um Klumpen zu entfernen. Fügen Sie der Probe 150 L RSB hinzu, um den Volumenverlust durch Filterung zu kompensieren. Beachten Sie, dass diese Methode sparsam und nur verwendet werden soll, wenn große Klumpen beobachtet werden. - Bevor Sie mit dem Anreicherungsschritt fortfahren, überprüfen Sie, ob die Probe frei von übermäßigen Blasen ist, und wenn vorhanden sind, entfernen Sie die Blasen und achten Sie darauf, keine Probe zu verwerfen. Wenn winzige Blasen vorhanden sind, ist ihre Entfernung nicht erforderlich.
- Verarbeiten Sie die Probe auf dem spiralförmigen mikrofluidischen Gerät.
4. Anreicherung von CTCs aus Geduldigem Vollblut mit dem Spiral-Mikrofluid-Gerät
- Laden Sie einen neuen mikrofluidischen Spiralchip. Laden Sie zwei leere 50 ml Zentrifugenrohre in Ein- und Ausgangsanschlüsse.
- Führen Sie eine Primzahl aus, indem Sie auf Prime auf dem spiralförmigen mikrofluidischen Gerät (3 min) klicken. Entfernen Sie die Eingangs- und Ausgangsrohre, und laden Sie die Probe, die im Eingangsanschluss verarbeitet werden soll.
- Laden Sie ein klares 15 ml konisches Rohr in den Ausgangsanschluss, um angereicherte CTCs zu sammeln. Führen Sie Programm 3 aus, indem Sie auf Ausführen klicken und das Programm 3 auswählen (31 min).
- Entladen Sie das Ausgangsrohr und die Zentrifuge bei 500 x g für 10 min (Beschleunigung: 9; Verzögerung: 5). Mit einer 5 ml serologischen Pipette, entfernen Sie überstandes Anhalten an der 2 ml-Markierung auf dem konischen 15 ml Rohr. Entfernen Sie mit einer Mikropipette überstandes Anhalten bei einer Markierung von 100 l am konischen 15 ml-Rohr. Verarbeiten Sie die angereicherte Probe direkt zur Immunfluoreszenzfärbung.
5. Immunfluoreszenz Färbung
- Auf einer kammerförmigen Folie mit einem Hämozytometer-Raster die Anzahl der Zellen pro ml aufzählen. Verdünnen Sie die angereicherte Probe mit 0,2% Anti-Bindungslösung (Materialtabelle) bis zu einer Konzentration von 100.000 Zellen/100 l pro Cytospin.
- Befeuchten Sie die Kontur der Probenkammer mit Baumwolle (Materialtabelle) mit 50 l 0,2% Anti-Bindungslösung. Legen Sie eine Polylysin-Glasrutsche in die Probenkammer und schließen Sie sie.
- Beschichten Sie eine Spitze mit 0,2% Anti-Bindungslösung, indem Sie 3x nach oben und unten pfeifen. Setzen Sie die angereicherte Probe wieder auf und übertragen Sie die Zelllösung in die Probenkammer. Zentrifuge mit einer speziellen Zentrifuge (Materialtabelle) bei 400 U/min für 4 min (Beschleunigung niedrig).
- Legen Sie einen Silizium-Isolator um den Abscheidungsbereich. Den Glasschlitten 2 min unter einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank trocknen lassen.
- Bereiten Sie die Fixierlösung vor, indem Sie 1 ml 16% Paraformaldehyd (PFA) mit 3 ml sterilem PBS verdünnen. Fügen Sie 100 l Fixationslösung (4% PFA) pro Probe hinzu und brüten Sie bei RT für 10 min. Fixationslösung entfernen und drei Waschungen mit 200 l PBS durchführen und bei RT jeweils 2 min inkubieren.
ACHTUNG: Verwenden Sie PFA unter einem chemischen Sicherheitsschrank, um das Einatmen zu verhindern. - Bereiten Sie die Sättigungslösung vor, indem Sie das fetale Rinderserum (FBS) bei 5%, den Fc-Rezeptor (FcR) mit 5% und das Rinderserumalbumin (BSA) bei 1% in sterilem PBS (Tableof Materials )verdünnen. Fügen Sie 100 L Sättigungslösung pro Probe hinzu und brüten Sie 30 min bei RT. Sättigungslösung entfernen.
- Fügen Sie 100 l Antikörperlösung pro Probe hinzu (CD45-Antikörper 1/20; PanCK Antikörper 1/500; PD-L1 Antikörper 1/200; Qsp Sättigungslösung 100 l) (Materialtabelle). Legen Sie den Polylysin-Glasschlitten in eine 100 mm x 15 mm Petrischale. Befeuchten Sie ein saugfähiges Papier mit 2 ml sterilem Wasser und schließen Sie die Petrischale mit dem Deckel. Bei 4 °C über Nacht aufstellen und vor dem Licht schützen.
- Entfernen Sie den Antikörper-Mix und führen Sie 3 Waschungen mit 200 l PBS inkubieren jede Wäsche für 2 min. Lassen Sie die Probe 5 min trocknen und schützen Sie sie vor dem Licht. Platzieren Sie 10 l Montagelösung(Materialtabelle) im Bereich der Abscheidung und Abdeckung mit einem Mikroskop-Abdeckungsrutsch, ohne eine Blase zu machen. Versiegeln Sie den Coverslip mit Nagellack.
6. Erfassung von Immunfluoreszenzbildern mit geradem Fluoreszenzmikroskop und zugehöriger Software
- Verwenden Sie ein gerades Fluoreszenzmikroskop mit einer motorisierten X/Y-Plattform. Verwenden Sie ein 20-faches Objektiv, um 8-Bit-RGB-Tiff-Bilder in vier Kanälen aufzunehmen, die DNA-Farbstoff (4',6-Diamidino-2-phénylindol [DAPI]), PanCK-Farbstoff (Fluorescein isothiocyanat [FITC]), PD-L1-Farbstoff (CY3) und CD45-Farbstoff (CY5) entsprechen. Schalten Sie die Quecksilberlampe 15 min vor Gebrauch ein und passen Sie das Mikroskop und die zugehörige Software an den halbautomatischen Dreh an.
- Legen Sie die Glasrutsche auf die Plattform.
- Definieren Sie im Erfassungsmenü die vier Kanäle und richten Sie die Belichtungszeit ein (DAPI: 15 ms, FITC [PanCK]: 500 ms; CY3 [PD-L1]: 800 ms; CY5 [CD45]: 1.000 ms). Definieren Sie die zu scannenden Kacheln. Klicken Sie auf Kacheln. Definieren Sie im erweiterten Experimentden zu scannenden Bereich.
- Passen Sie den Fokus auf dem Bildschirm an. Klicken Sie auf Experiment starten.
- Exportieren Sie TIF-Dateien jedes Kanals und benennen Sie die Bilddatei mit diesen Informationen: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles.tif (z. B. Sample1_TR1_c1m01). Namensfarbstoff wie folgt: Der DAPI-Kanal ist c1, der FITC-Kanal c2, der CY3-Kanal c3 und der CY5-Kanal c4.
7. Analyse von immunfluoreszierenden Bildern mit Bildanalysesoftware
- Laden Sie die kostenlose Bildanalyse-Software von der Broad Institute-Website herunter und installieren Sie sie. Akzeptieren Sie alle Standardeinstellungen während der Installation. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware, und klicken Sie auf Datei | Pipeline aus Datei | Analysis_4channels_CTC.cppipe.
HINWEIS: Die Pipeline konvertiert RGB-Farbbilder in Graustufen, entfernt Artefakte durch Glätten von Bildern mit einem Medianfilter, identifiziert Kerne und Zytoplasma, quantifiziert Fluoreszenzintensitäten jedes Kanals und exportiert sie in eine Excel-Datei. - Dateien in der Dateilisteablegen . Aktualisieren Sie die Metadaten, um die Dateien nach Kacheln zu gruppieren.
HINWEIS: Alle Anweisungen zum Gruppieren von Bildern sind in der Software angegeben. Namensdateien, die im NamesAndTypes-Modul angezeigt wurden, und Dateien werden nach der Anzahl der Kacheln und Kanäle pro Samples gruppiert. - Klicken Sie auf Ausgabeeinstellungen anzeigen, und geben Sie eine korrekte Standardausgabe an. Klicken Sie auf Bilder analysieren. Öffnen Sie die Tabellenkalkulationsdatei, die den Parametern measure_intensity entspricht.
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Representative Results
Die erste Voraussetzung war, unkontaminierte (infektiöse erregfreie) Sammlungen von CTCs für die Gewebekultur zu erhalten und IF-Hintergrund zu vermeiden. Das Dekontaminationsprotokoll ermöglichte die Reinigung aller Rohre und Pumpen und führte zur Sammlung von CTCs mit einer guten Rückgewinnungsrate ohne bakterielle Kontamination. Die angereicherten Proben wurden ohne und mit dem Dekontaminationsprotokoll-Workflow des spiralförmigen mikrofluidischen Geräts verglichen. Zur Validierung des Dekontaminationsprotokolls wurde die A549-Zelllinie in Abwesenheit von Vollblut verwendet und direkt mit dem spiralförmigen mikrofluidischen Gerät angereichert. Ohne das optimierte Dekontaminationsprotokoll wurde eine hohe bakterielle Kontamination in der Gewebekultur der angereicherten A549-Zelllinie nach nur 24 h beobachtet, was zu Todesfällen und zytomorphologischen Veränderungen in eukaryotischen Zellen führte (Abbildung 1B).
Im Gegensatz dazu wurden nach dem Reinigungsprotokoll lebende A549-Zellen durch Wachstum in 2D-Kultur nach 10 h Gewebekultur und Medienentfernung und in 3D-Bedingungen (Abbildung1B) sowie Patientenproben (Abbildung1C) gewonnen. Die potentiellen CTC werden mit einem roten Kreuz identifiziert (Abbildung 1C).
Abbildung 2 rekapituliert den kompletten Arbeitsablauf für die Immunfluoreszenz-Phänotypisierung angereicherter CTCs aus Vollblut. Es besteht aus vier Hauptschritten: Vollblutprobenahme, CTC-Anreicherung, Immunfluoreszenz (IF) Assay und Bildanalyse mit Software. Bisher wurde die Rückgewinnungsrate des spiralförmigen mikrofluidischen Geräts14adressiert. Mit Fluoreszenz-Imitieren CTCs (mCTC) wurde diese Rückgewinnungsrate bei 1,3 CTCs/ml Vollblut14festgestellt.
Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich auf die Schaffung der optimalen Bedingungen für die IF-Analyse von angereicherten CTCs und die nachgelagerte Visualisierung (Abbildung 2). Zunächst wurden zur Prüfung der Spezifität des PD-L1-Antikörpers zwei Zelllinien verwendet: (1) PC3-Hoch-Positiv-PD-L1-Zelllinie und (2) SW620 Low-Positive-PD-L1-Zelllinie. Die Zellen wurden dann mit dem spiralförmigen mikrofluidischen Gerät angereichert und von IF analysiert. Alle Zellen wurden mit dem Tumor Anti-PanCK-Marker, weißen Blutkörperchen Anti-CD45-Marker, Anti-PD-L1 (nützlich bei Lungenkrebs) und DAPI (Kernfarbstoff) gefärbt. Weiße Blutkörperchen wurden als positiv für DAPI und CD45 identifiziert, während Krebszellen als positiv für DAPI und PanCK und negativ für CD45 identifiziert wurden. Die PC3-Hoch-PD-L1-positive Zelllinie wurde für PD-L1 positiv gefärbt, während eine niedrigere PD-L1-Expression in der SW620-Low-PD-L1-negativen Zelllinie nachgewiesen wurde.
Anschließend wurden folgende verglichen: der (i) flüssige IF-Färbungstest, (ii) die Färbung von CTCs, die direkt auf polylysinbeschichteten Dias abgelagert werden, und (iii) IF-Färbung von CTCs nach Cytospin auf polylysinbeschichteten Dias. Es wurde deutlich festgestellt, dass die Wiederherstellungsrate der CTCs von der Art des verwendeten Protokolls abhing (Abbildung 3A). Im flüssigen IF-Färbetest betrug die Rückgewinnungsrate nur 10 % für die Anzahl der spitzen mCTC. Diese niedrige Wiederherstellungsrate stellt für die meisten Patienten mit metastasierendem NSCLC ein Problem dar, da sie die Fähigkeit dieser Tests, die wenigen CTCs zu isolieren und phänotypische Informationen bereitzustellen, erheblich einschränkt. Der zweite und dritte beschriebene Abschnitt (direkte Ablagerung von mCTC oder CTC auf polylysinbeschichtete Dias ohne und mit Cytopsin) wiesen systematisch Rückgewinnungsraten von mehr als 60 % auf (Abbildung 3A).
Abbildung 3 B zeigt repräsentative Bilder dieser IF-Assays mit Vollblutproben desselben Patienten, entweder mit dem flüssigen IF-Färbetest oder IF-Färbungstest auf polylysinbeschichteten Dias mit Cytospin. Die Aufzählung der Kerne war zwischen den beiden Assays deutlich unterschiedlich (Abbildung 3B). Die kernnukleare DAPI-Färbung lieferte die Aufzählung der Gesamtzellen in der Probe, und die Biomarker-Färbung ermöglichte die Hervorhebung des Grüns der PanCK-positiven Zellen, Orange in den PD-L1-positiven Zellen und Rot in den cd45-Restweißen Zellen (Abbildung3 B).
Um die weißen Blutkörperchen zytologisch von Tumorzellen zu unterscheiden, muss die Form des Zellkerns visualisiert werden, da er für den Zelltyp charakteristisch ist. Abbildung 3 C zeigt die Umrisse der Kerne, die verschwommen sind und Morphologie, die in Abwesenheit des Cytospin-Schritt ungewöhnlich ist. Das optimierte Protokoll umfasste somit das Zytospinnen angereicherter CTCs auf polylysinbeschichteten Dias, gefolgt von einer 4%igen Paraformaldehyd (PFA) Fixierung, um die Dias vor der IF-Färbung zu erhalten. Dieses optimierte Protokoll hatte ähnliche Rückgewinnungsraten wie die Abscheidung von mCTC direkt auf polylysinbeschichtete Dias (Abbildung 3A), selbst wenn nur sehr wenige Zellen hinzugefügt wurden. Da dieser zusätzliche Schritt die Erhaltung der kerntechnischen Morphologie ermöglicht (Abbildung 3C), wurden Granulozyten mit ihren mehrlappigen Kernen sowie Tumorzellen (mit einem roten Kreuz im Kern gekennzeichnet) mit ihren kernförmigen Anomalien, Malignitätsmuster und größere Größe im Vergleich zu weißen Blutkörperchen.
Nach der Optimierung des IF-Protokolls wurde ein Proof-of-Concept mit Vollblut von metastasierenden Patienten durchgeführt. Die Proben wurden prospektiv im Rahmen der CIRCAN-Routinekohorte am Universitätsklinikum Lyon gesammelt. Die Blutentnahme wurde in der Regel durchgeführt, wenn Ärzte die früheste Indikation der Tumorprogression beobachteten. Alle Tumorfälle wurden während der Erstdiagnose histologisch oder zytologisch an FFPE-Biopsieproben bestätigt. Hier wurden CTCs-Analysen bei der Progression von Forschern durchgeführt, die keinen Zugang zu klinischen Daten oder vorkenntnissen. Detaillierte voranalytische Überlegungen wurden bereits veröffentlicht15.
In Abbildung 4, Tabelle 1und Tabelle 2werden verschiedene Befunde aus Patientenproben dargestellt. Das Profil CD45(+), PanCK(-), PD-L1(-) stellt die Immunzellen dar. Die Restzahl der weißen Blutkörperchen war nachweislich stark variabel und abhängig von der Blutprobe. Der Bereich in dieser kleinen Pilotkohorte betrug 648-11.000 weiße CD45(+)-Zellen (Abbildung 5A). Daher wurde unmittelbar nach der CTC-Anreicherung eine Aufzählung der gesammelten Zellen aufgenommen, um die Zelldichte auf dem Zytospinbereich mit einer Dichte von 100.000 Zellen/Zytospin anzupassen (siehe Abschnitt 6). Dies ermöglichte die Leistung mehrerer Cytospins pro Patient und die Optimierung der mikroskopischen Beobachtung für die manuelle Aufzählung und Denuse der Bildanalyse-Softwarepipeline.
In Abbildung 4A-C, Tabelle 1und Tabelle 2werden typische Fälle berichtet, in denen die Anzahl der verbleibenden weißen Blutkörperchen sehr unterschiedlich war:
(i) Das erste Profil ist die in Abbildung 4A dargestellten CD45(-), PanCK(+) und PD-L1(+). Oft ist die Größe der Zellen einem Durchmesser von 13 m überlegen und die Zellmorphologie ist unregelmäßig, was ein zytomorphologisches Muster der Malignität darstellt. Diese Population besteht wahrscheinlich aus CTC.
(ii) Das zweite Profil ist CD45(-), PanCK(-) und PD-L1(+). Wie bereits berichtet, drücken nicht alle CTCs den PanCK-Biomarker aus (Abbildung 4A).
(iii) Das dritte Profil ist CD45(-), PanCK(+) und PD-L1(-). Wie bereits berichtet, drücken nicht alle CTCs den PD-L1-Biomarker aus.
(iv) Das vierte Profil ist die in Abbildung 4Bdargestellten CD45(+), PanCK(+) und PD-L1(+). Es stellt die atypischen aktivierten Immunzellen im Vollblut des Patienten dar. Diese Population wurde in mehreren Publikationen16,17,18 beschrieben und macht etwa 5% der gesamten Zellen nach der Anreicherung aus. Das Vorhandensein dieser Population kann die Rate falsch positiver CTCs in einer Probe erhöhen, wenn die Intensität des CD45-Signals zu niedrig ist und die Morphologie des Kerns nicht gut konserviert ist. Dies unterstreicht nachdrücklich die Notwendigkeit, in diesem Immunfluoreszenz-Test komplementäre Tumorbiomarker-Färbungen wie Vimentin und/oder Epcam durchzuführen.
v) Schließlich enthält das letzte Profil die nicht beschrifteten Zellen CD45(-), PanCK(-) und PD-L1(-), die in Abbildung 4Chervorgehoben sind. Der Kern in dieser Population zeigt oft zytomorphologische Muster der Malignität, und die Größe ist über 13 m im Durchmesser. Der Prozentsatz dieser Zellen in den Proben ist je nach Blutdesatole des Patienten sehr variabel. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, komplementäre tumorale Biomarker zu verwenden, um das Tumormuster dieser Zellsubpopulation zu bestätigen.
In Tabelle 1 und Tabelle 2 wurde die Zellzahl von 16 Proben von fortgeschrittenen metastasierenden NSCLC-Patienten gemeldet. Die Zellen wurden nach der Expression der Biomarker klassifiziert. In den erhaltenen Teilpopulationen wurde eine hohe Variabilität beobachtet. Wie bereits in unabhängigen Studien berichtet, wurden in den meisten Proben CD45(-), PanCK(+) und PD-L1(+)-Profile gefunden. Da die CTC-Population jedoch sehr heterogen ist, enthielten Patientenproben auch CD45(-), PanCK(-) und PD-L1(+) Subpopulationen, die CD45(-), PanCK(+) und PD-L1(-) Subpopulationen und nicht beschrifteten Zellen CD45(-), PanCK(-) und PD-L1(-) Teilpopulationen. Der Gehalt an weißen Blutkörperchen war unter den analysierten Proben sehr variabel.
Um die Zellaufzählung zu erleichtern, wurde mit der Bildanalysesoftware eine Pilotpipeline für eine automatisierte Analyse der Immunfluoreszenzbilder eingerichtet. Der Workflow wird in Abbildung 5beschrieben. In diesem Fall ist es wichtig, qualitativ hochwertige Immunfluoreszenzbilder in Bezug auf Kontrast und Fluoreszenzintensität zu erfassen. Abhängig von der Kapazität der Clusterberechnung der Hardware kann die Bildanalysepipeline auf das vollständige zusammengeführte Bild des Cytospins oder auf einen repräsentativen Bereich des Cytospins angewendet werden.
Hier erzeugte ein halbautomatischer Scan des Cytospins (X/Y; der Z-Fokus ist nicht enthalten) 150-200 zusammengeführte Bilder. Diese Bilder können zusammengeführt und direkt mit der Bildanalysepipeline analysiert werden. Dennoch ist dieses Verfahren zeitaufwändig und berechnender Cluster-Ressourcenverbrauch, eine wichtige Einschränkung für seinen routinemäßigen Einsatz in Laboratorien. Daher wurde auf der Grundlage früherer Erfahrungen auf dem Gebiet der zellulären Hämatologie beschlossen, repräsentative Bereiche jeder Probe zu analysieren, nachdem unter dem Mikroskop überprüft wurde, ob die Zellverteilung auf der gesamten Fläche des Cytospins homogen ist. Dann wurden 25% der Gesamtfläche des Cytospins (ca. 40 Fliesen) mit dem Blütenmikroskop gescannt, um 40 x 4 unabhängige Bilder zu erzeugen. Die zusammengeführte Datei wurde nach Kanälen aufgeteilt, und Bilddateien wurden automatisch mit der Mikroskopsoftware generiert (siehe Abschnitt 7; Abbildung 5 A). Diese Dateien wurden zur Analyse gemäß den beschriebenen Parametern in eine Bildanalysepipeline importiert (siehe Abschnitt 8; Abbildung 5 A).
In Abbildung 5Bhaben wir manuell ein repräsentatives Bild identifiziert, das vier CTCs [CD45(-), PanCK(+) und PD-L1(+)] unter 77 Immunzellen [CD45(+), PanCK(-) und PD-L1(-)] zeigt. Abbildung 5 B veranschaulicht, wie die Bildanalysesoftware die Anzahl der Zellen basierend auf der DAPI-Färbung identifiziert und aufzählt. Es zeigt auch, wie die Bildanalyse-Software die sekundären Objekte gezählt hat. Schließlich wurden Fluoreszenzintensitäten für jeden Fluoreszenzkanal für alle in den Bildern gemeldeten Objekte gemeldet.
Der Hintergrund wurde berechnet und durch die negativen Zellen in der Stichprobe dargestellt. Beispielsweise haben die nicht aktivierten Immunzellen eine niedrige Fluoreszenzintensität und ermöglichen die Messung des Hintergrunds der PanCK- und PD-L1-Färbung. Das fluoreszierende Signal wurde als positiv eingestuft, wenn die Fluoreszenzintensität die des Hintergrunds um das Zweifache überstieg (basierend auf der Analyse von vier unabhängigen Patientenproben). In Bezug auf CD45 Färbung, da der Expressionsgrad von CD45 ist sehr variabel in den weißen Blutkörperchen Subpopulationen, wurde die Schwelle der Positivität so niedrig wie möglich gesetzt. Es basiert auf der Analyse von Bildern von 10 gesunden Vollblut mit dem CD45 Antikörper gefärbt. Die Pilotanalyse (n = 4) zeigte die Übereinstimmung zwischen manueller Enumeration und Bildanalysesoftware-Enumeration (Tabelle 2). Jede Zelle auf dem Cytospin wird durch Bildanalyse-Software identifiziert und ermöglicht es Biologen, die Zelle zu verfolgen und die Ergebnisse bei Bedarf manuell zu bestätigen.
Abbildung 1 : Überblick über den Arbeitsablauf zur Dekontamination von Spiralmikrofluidische Vorrichtung Instrument. (A) Drei Hauptschritte des Dekontaminationsprozesses (siehe Protokoll), die die Lokalisierung der Ein- und Ausgänge des Instruments veranschaulichen. (B) Repräsentative Bilder der A549-Zelllinienanreicherung vor und nach der Dekontamination des Instruments. Die Auswirkungen des Vorhandenseins eines infektiösen Erregers auf die Lebensfähigkeit und Morphologie der gesammelten Zellen werden gezeigt. In Gegenwart von Bakterien wurde die Zellmorphologie und Lebensfähigkeit verändert. Scale bar = 20 m (C) 3D-Zellkultur von angereicherten Patientenproben von Lungen-, Prostata- und Brustkrebs. Das rote Kreuz entspricht atypischen Zellen. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Überblick über den Ablauf der Immunfluoreszenzanalyse von der Vollblutentnahme bis zur Analyse der Fluoreszenzbilder. Die wichtigsten Schritte werden wie folgt dargestellt: Blutentnahme für Vollblut, CTC-Sammlung mit spiralförmigem mikrofluidischem Gerät, Immunfluoreszenz-Assay und Bildanalyse-Software. Die Wahl des Biomarkers wurde durch eine bessere Identifizierung der verschiedenen Populationen von Zellen angetrieben, die auf dem Cytospin-Dia beobachtet werden können (CD45 für Immunzellen, PanCK und PD-L1 für Lungenkrebszellen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Wiederherstellungsrate von drei unabhängigen Färbeprotokollen. (A) Vergleich der Rückgewinnungsrate von mCTCs aus flüssiger Färbung, direkter Färbung der auf polylysinbeschichteten Dias abgelagerten Zelle und Zellfärbung nach Cytospin auf polylysinbeschichteten Dias. (B) Repräsentative Bilder von Patientenproben, die mit dem flüssigen IF-Protokoll und dem direkten Immunstainierungsprotokoll mit dem Cytospinstep verarbeitet wurden. Die Zellen wurden mit cd45 monoklonalen Antikörpern (Klon HI30) Alexa Fluor 647 gefärbt; PanCK monoklonaler Antikörper (Klon AE1/AE3) Alexa Fluor 488; 4',6-Diamidino-2-phénylindol (DAPI). Skala bar = 20 m. (C) Repräsentative Bilder der DAPI-Färbung der Zellanreicherung mit und ohne den Cytospinschritt. Die Morphologie und Größe der Kerne wurden mit DAPI-Färbung gezeigt. Rotes Kreuz hebt Zellen mit Anomalien im Kern im rechten Bild hervor. Im linken Bild ist das Bild unscharf, da sich Zellen nicht auf der gleichen Ebene befinden (x-, y- und z-Achsen). Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Identifikation von Zellprofilen. (A) Repräsentative Bilder von Patienten mit unterschiedlichen CTC-Profilen. Die Fluoreszenzkanäle werden separat dargestellt. Die zusammengeführten Bilder werden auf der linken Seite angezeigt. Sie sind mit CD45 monoklonalen Antikörper (Klon HI30) Alexa Fluor 647; PanCK monoklonaler Antikörper (Klon AE1/AE3) Alexa Fluor 488; PDL-1 monoklonaler Antikörper (Klon 29E2A3) Phycoerythrin; 4',6-Diamidino-2-phénylindol (DAPI); Pfeile zeigen auf atypische Zellen. (B) Repräsentative Bilder der Immunfärbung von zwei Patientenproben mit atypischen Weißen Blutkörperchen. Die Zellen wurden mit cd45 monoklonalen Antikörpern (Klon HI30) Alexa Fluor 647 gefärbt; PanCK monoklonaler Antikörper (Klon AE1/AE3) Alexa Fluor 488; PDL-1 monoklonaler Antikörper (Klon 29E2A3) Phycoerythrin; 4',6-Diamidino-2-phénylindol (DAPI). Das Bild zeigt das Vorhandensein von Immunzellen, die mit CD45(+), PanCK(+) und PD-L1(+) gefärbt sind. (C) Das Bild hebt das Vorhandensein von nicht beschrifteten Zellen (CD45(-), PanCK(-) und PD-L1(-) hervor. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Überblick über die Analyse der fluoreszierenden Bilder. (A) Die wichtigsten Schritte werden beschrieben: Mikroskopische Scan, der Kanal split nach der Fluoreszenz, und der Import von Dateien in Bildanalyse-Software. (B) Beschreibung der drei verschiedenen Schritte für den Workflow der Bildanalysesoftware. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Manuelle Aufzählung der Patientenzellanreicherung. Aufzählung von Zellen auf Basis der DAPI-Färbung. Aufzählung anderer Objekte auf Basis der FITC-, PE- und CY5-Färbung.
Tabelle 2: Bildanalyse-Software Aufzählung der Patientenzellanreicherung . Aufzählung von Zellen auf Basis der DAPI-Färbung. Aufzählung anderer Objekte auf Basis der FITC-, PE- und CY5-Färbung. Vergleich der manuellen Anzahl und Bildanalyse-Software-Enumeration.
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Discussion
In der vorliegenden Studie wurden zwei wichtige Punkte angesprochen, der erste in Bezug auf die Leistung des Workflows für seine Übertragung auf klinische Anwendungen und der zweite in Bezug auf die Abnahme der Subjektivität für die Analyse der erhaltenen Fluoreszenzbilder.
Ein performanter und optimierter Workflow für die CTC-Enumeration wurde zunächst mit anpassbarem IF-Assay nach Zellanreicherung über ein CTC-etikettenfreies mikrofluidisches System (spiralmikrofluidisches Gerät) ermittelt. Anhand dieses Workflows bestätigte eine Pilotstudie, dass alle Proben von metastasierenden NSCLC-Patienten atypische Zellen enthielten, die alle CD45(-) waren. Sie können alternativ mit PanCK- und/oder PD-L1-Biomarkern gekennzeichnet werden; Sie können jedoch auch für alle getesteten Biomarker [CD45(-), PanCK(-) und PD-L1(-) vollständig negativ sein, wie in der S19-Probe (Tabelle 2)] beobachtet. Dies unterstreicht nachdrücklich die Notwendigkeit zusätzlicher Biomarker für die Phänotypisierung von CTC-Subpopulationen. Daher wurde vorgeschlagen, epitheliale-mesenchymale Biomarker wie EpCAM, Vimentin und N-Cadherin hinzuzufügen; Marker von Krebsstammzellen wie CD44 und CD133; und spezifischen Tumormarkern, einschließlich TTF1 für Lungenadenokarzinom.
In der Pilotstudie betrug der Bereich der atypischen Zelle [40; >400] von 3,5 ml Vollblut. Bei 80% der Patientenproben betrug die atypische Zellzahl über 50. In zytologischer19,20,21 Proben von Endo Bronchial Ultra Sonic Guide Trans Bronchial Needle Aspiration oder CT-geführten transthorakalen Punktionen ist die PD-L1-Analyse in den meisten Proben Schwelle von 100 Tumorzellen wird allgemein zugelassen, um eine statistische und klinische Interpretation des Wertes zu produzieren. Im speziellen Fall von Blut-CTCs ist jedoch zu beachten, dass das Problem der räumlichen Tumorheterogenität im Gegensatz zu kleinen Tumorproben vor Ort umgangen wird.
Der zweite Punkt war, den Einfluss des Handlers auf die Analyse von Immunfluoreszenzbildern zu vermeiden. Die Bildanalysesoftware für fluoreszierende Bilder wurde so eingerichtet, um die Zellaufzählung zu standardisieren und statistische Daten für diese Proben bereitzustellen. Dieser automatisierte Prozess verdeutlichte die Notwendigkeit leistungsstarker Berechnungscluster für die Analyse aller Zellen, die in derselben Stichprobe enthalten sind. Darüber hinaus muss die Qualität der IF-Färbung in der gleichen Ebene sein (um den Einsatz von konfokalen Systemen zu vermeiden), und die Dichte der Zellen auf dem Cytospin muss kalibriert werden, damit die Bildanalysesoftware alle Zellen separat auf dem Dia erkennen kann. Schließlich wurden die Ergebnisse in Bezug auf die klinischen Ergebnisse in einer Kohorte von Patienten nicht validiert, aber dieser Punkt sollte in einer anderen speziellen Studie behandelt werden.
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Disclosures
Jean-Philippe Aurel und Kathryn Weiqi Li sind Mitarbeiter der Firma Biolidics, die in diesem Artikel verwendete Instrumente herstellt. Die anderen Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien von AstraZeneca (London, Vereinigtes Königreich), Biolidics (Singapur) und der Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, Frankreich) unterstützt. Die Autoren danken den Unternehmen AstraZeneca und Biolidics für ihre finanzielle Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4 °C |
| BD Facs Clean – 5 L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4 °C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4 °C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4 °C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4 °C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4 °C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone - 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4 °C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4 °C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4 °C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4 °C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4 °C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4 °C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
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