Summary
Характеристика циркулирующих опухолевых клеток (КТК) является популярной темой в трансляционных исследованиях. Этот протокол описывает полуавтоматический иммунофлуоресценции (IF) анализ для PD-L1 характеристики и перечисления CTCs в немелкоклеточного рака легких (NSCLC) образцов пациентов.
Abstract
Циркулирующие опухолевые клетки (КТК), полученные из первичной опухоли, проливаются в кровоток или лимфатическую систему. Эти редкие клетки (1–10 клеток на мл крови) требуют плохого прогноза и коррелируют с более коротким общим выживаемостью при нескольких видах рака (например, груди, простаты и колоректальной). В настоящее время, анти-EpCAM покрытием магнитного биса основе CTC захвата системы является золотой стандарт тест, утвержденный США пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для перечисления CTCs в крови. Этот тест основан на использовании магнитных бусин, покрытых анти-EpCAM маркеров, которые специально нацелены на эпителиальные раковые клетки. Многие исследования показали, что EpCAM не является оптимальным маркером для обнаружения КТК. Действительно, КТК являются неоднородной субпопуляцией раковых клеток и способны пройти эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (ЭМТ), связанный с метастатическим распространением и вторжением. Эти CTCs способны уменьшить выражение эпителиального маркера поверхности клетки EpCAM, в то время как увеличение мезенхимальных маркеров, таких как виментин. Для устранения этого технического препятствия были разработаны другие методы изоляции, основанные на физических свойствах КТК. Микрофлюидические технологии позволяют без маркировки подходить к обогащению КТК из цельных образцов крови. Спиральная микрофлюидная технология использует инерционные и динские силы сопротивления с непрерывным потоком в изогнутых каналах, генерируемых внутри спирального микрофлюидного чипа. Клетки разделены на основе различий в размерах и пластичности между нормальными клетками крови и опухолевыми клетками. Этот протокол детализирует различные шаги, чтобы охарактеризовать запрограммированное выражение КТК, запрограммированное смертельным лигандом 1 (PD-L1), сочетающее спиральное микрофлюидическое устройство с настраиваемым набором маркеров иммунофлюоресценции (ИФ).
Introduction
Опухолевые антиген-специфические цитотоксические Т-лимфоциты (КТЛ) играют решающую роль в ответ на рак через процесс, известный как рак "иммунного эпиднадзора". Их противоопухолевые функции усиливаются антителами блокады иммунных контрольно-пропускных пунктов, такими как ингибиторы CTLA-4 и ингибиторы PD-1/PD-L1. При немелкоклеточном раке легких (NSCLC) анти-PD-1/PD-L1 терапии приводят к реакции ставки от 0%-17% у пациентов с PD-L1-отрицательных опухолей и 36%-100% в тех, кто выражает PD-L1. Надежные реакции на pd-1/PD-L1 блокады наблюдается в меланомы и NSCLC показаны доказательства улучшения общего уровня ответов (RR), прочные клинические преимущества, и прогрессии свободной выживания (PFS). В настоящее время, анти-PD1 лечения являются стандартом ухода в второй линии NSCLC лечение ниволумаб независимо от экспрессии PD-L1 и с pembrolizumab у пациентов, выражающих PD-L1 1%. В первой линии лечения, стандарт ухода pembrolizumab только у пациентов с NSCLC выражения PD-L1 50% и может быть потенциально повышена с помощью химиотерапии (платиновый и дублет препарат в зависимости от гистологического подтипа)1,2.
Тем не менее, такой подход к управлению пациентом является спорным3, так как PD-L1 выражение в опухолевых клетках иммуногистохимии (IHC), вероятно, не самый идеальный спутник биомаркера. Другие, такие как бремя мутации опухоли4 (TMB), микроспутниковой нестабильности (MSI), и / или микробиоты, возможно, интересны в этой обстановке либо в одиночку или в сочетании. NSCLC, как известно, неоднородные опухоли, либо пространственно (от опухоли к другому) или временно (от диагноза до рецидива). Пациенты с NSCLC, как правило, хрупкие, и итеративные инвазивные биопсии тканей может быть проблемой. Действительно, скорость повторной биопсии при первом прогрессии колеблется от 46%-84% в зависимости от серии, а успешная повторная биопсия (имеется в виду гистологический и полный молекулярный анализ) колеблется от 33%-75%. Это означает, что 25%-67% пациентов не могут получить комплексный анализ повторной биопсии во время первой прогрессии5,6,7,8.
Появление "жидкой биопсии", таким образом, вызвало значительный энтузиазм в этой конкретной обстановке, так как это позволяет решающую переоценку молекулярных изменений во время прогрессирования заболевания путем изучения циркулирующих свободной ДНК (cfDNA), полученных из циркулирующих опухолевых клеток (СтК). Эти живые клетки высвобождаются из опухоли в кровоток, где они свободно циркулируют. Хотя анализ кТК обычно не используется, он представляется весьма перспективным в случае молекулярной и фенотипической характеристики, прогноза и прогностического значения при раке легких (через DNAseq, RNAseq, miRNA и анализ белка). Действительно, КТК, вероятно, гавани фенотипические характеристики активного заболевания, а не первоначальные маркеры (обнаруженные на биопсии тканей при постановке диагноза). Кроме того, КТК обходят проблему пространственной неоднородности опухолевой ткани, которая может быть ключевой проблемой при мелкой биопсии. Следовательно, выражение PD-L1 на КТК потенциально может пролить свет на расхождения, полученные от его использования в качестве прогностического биомаркера с использованием опухолевой ткани.
Недавно выражение PD-L1 было протестировано в КТК NSCLC. Почти все пациенты, протестированные9 были PD-L1 положительными, усложняя интерпретацию результата и его клинического использования. В целом, PD-L1-положительные CtCs были обнаружены в 69,4% образцов из в среднем 4,5 клеток / мл10. После начала лучевой терапии, доля PD-L1-положительных КТК значительно увеличилась, что свидетельствует об усилении экспрессии PD-L1 в ответ на излучение11. Таким образом, анализ PD-L1 CTCs может быть использован для мониторинга динамических изменений опухоли и иммунного ответа, которые могут отражать реакцию на химиотерапию, облучение и, вероятно, иммунотерапии (ИТ) лечения.
На сегодняшний день изоляция CTCs и pd-L1 характеристики опираются на различные методы, такие как анти-EpCAM покрытием магнитного биса основе CTC захвата, обогащения основе анализ, и размер на основе12,13 CTC захвата анализов. Тем не менее, КТК были обнаружены только у 45%-65% пациентов с метастатическим NSCLC, тем самым ограничивая их способность предоставлять любую информацию для более чем половины метастатических пациентов NSCLC. Кроме того, количество КТК было низким в большинстве из этих исследований с использованием размера на основе подхода10. Кроме того, этот метод привел к расхождениям, таким как обнаружение клеток CD45(-)/DAPI с "цитоморфологическими моделями злокачественных новообразований" в крови здоровых доноров. Эти опасения подчеркивают необходимость высокочувствительного метода сбора КТК, связанного с иммунной фенотипированием нетипичных клеток CD45(-) из здоровой цельной крови с использованием дополнительных биомаркеров рака (т.е. TTF1, Vimentin, EpCAM и CD44) в NSCLC.
Следовательно, мы оценили спиральный микрофлюидное устройство, которое использует инерционные и Дин перетащить силы для разделения клеток на основе размера и пластичности через микрофлюидный чип. Формирование вихря Дена, присутствующих в микрофлюидных чипов приводит к большей CTCs, расположенных вдоль внутренней стены и меньших иммунных клеток вдоль внешней стены чипа. Процесс обогащения завершается севодок больших клеток в коллекционную розетку в качестве обогащенной фракции CtC. Этот метод является особенно чувствительным и специфическим (обнаружение около 1 КТК/мл цельной крови)14 и может быть связан с индивидуальными иммунофлюоресценции (ИФ) анализами. Эти инструменты позволят установить положительный порог для клинического толкования. Таким образом, описывается рабочий процесс, который позволяет биологам изолировать и иммунофенотип CtCs с высоким уровнем восстановления и специфичности. Протокол описывает оптимальное использование спирального микрофлюидного устройства для сбора КТК, оптимизированные анализы IF, которые могут быть настроены в соответствии с типом рака, и использование свободного программного обеспечения с открытым исходным кодом для измерения и анализа клеточных изображений для выполнения полуавтоматического нумерация клеток в соответствии с флуоресцентным окрашиванием. Кроме того, мультиплексирование микроскопа может осуществляться в зависимости от количества доступных флуоресцентных фильтров/маркеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы были в перспективе собраны в рамках когорты CIRCAN ("CIRculating CANcer"), базирующейся в университетской больнице Лиона после письменного согласия пациента. Это исследование было интегрировано в когорту CIRCAN-ALL. Исследование CIRCAN-ALL было признано неинтервенционным CPP South-East IV от 04/11/2015 под справкой L15-188. Измененный вариант был признан неинтервенционным 20.09.2016 по ссылке L16-160. Исследование CIRCAN-ALL было объявлено корреспонденту по вопросам ИТ и свободы ВИО в Лионе 01/12/2015, под справкой 15-131. Сбор крови был выполнен, когда врачи наблюдали самые ранние признаки прогрессирования опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте все реагенты и материалы, изложенные в таблице материалов с соответствующими условиями хранения для предварительноаналитической подготовки образца и иммунофлуоресценции. Замена реагентов и/или изменение условий хранения могут привести к неоптимальной производительности ассеа.
1. Обеззараживание спирального микрожидкости устройства
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеззараживание спирального микрофлюидного устройства является требованием для удаления всех иммунофлуоресценции фон, порожденных загрязнения бактерий, изучить цитоморфологию КТК, и быть в состоянии дифференцировать их от нормальных иммунных клеток. Протокол оптимизирован для образцов крови, собранных в трубках K2EDTA в течение 6 ч после взятия крови и обогащенный с помощью спирального микрофлюидного устройства в чистых условиях. Использование этого анализа для других типов образцов (других биологических жидкостей) может потребовать дополнительной оптимизации. Этот протокол обеззараживания должен проводиться один раз в неделю.
- Подготовка реагентов
- Подготовка буфера разбавив
- Стерилизовать 20 мл разбавителя добавочных реагентов с помощью фильтра шприца 0,22 мкм и добавить непосредственно к 1 l 1x фосфат буфера солей (PBS) ультра-чистый сорт(Таблица материалов).
- Стерилизация реагентов и входиной соломы
- Стерилизовать буфер лизиса РБК и буфер повторного действия (RSB; Таблица материалов) с помощью фильтра шприца 0,22 мкм и запаса в новой полипропиленовой конической трубке мощностью 50 мл для каждого раствора.
- Стерилизовать входной соломы путем инкубации при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч в универсальный реагент очистки (Таблица материалов). Перенесите солому на основе отбеливателя моющего средства(Таблицаматериалов) и инкубировать на RT в течение 1 ч.
- Промыть входну солому дважды стерильным PBS на 1 ч каждый и хранить стерилизованную входну солому в хирургически стерильной сумке(Таблицаматериалов).
- Подготовка буфера разбавив
- Обеззараживание спирального микрофлюидного устройства
- Дезинфекция с использованием уницелярного реагента для очистки
- Отключите разбавительную крышку бутылки от разбавительного порта спирального микрофлюидного устройства, отвинчивая коричневый винт. Под шкафом микробиологической безопасности, передача до 250 мл универсальный реагент очистки(Таблица материалов) в новую пустую бутылку.
- Винт разбавитель крышка бутылки и соломы в бутылку 250 мл универсальный реагент очистки под микробиологической безопасности шкафа. Прикрепите эту бутылку к разбавительному порту спирального микрофлюидного устройства, завинчивая назад коричневый винт.
- Передача до 100 мл отбеливателя (1% конечной концентрации; Таблица материалов) в контейнер для отходов, поставляемый в комплекте для запуска(рисунок 1А).
- Загрузите новую стерильную вхожную солому на спиральное микрофлюидное устройство(Таблицаматериалов) в вхотливном порту. Загрузите новую центрифугу мощностью 50 мл в вхотливой порт. Загрузите новую центрифугу мощностью 50 мл в выходном порту.
- Приступить к премьер спираль микрофлюидного устройства, нажав на прайм на спираль микрофлюидного устройства (3 мин). Удалите вхожаемую трубку после завершения основного грунта.
- Передача до 15 мл универсальная моющее реагент на новую центрифужную трубку мощностью 50 мл с серологической пипеткой под шкаф микробиологической безопасности и прикрепите трубку к вхотворному порту спирального микрофлюидного устройства.
- Перед запуском убедитесь, что раствор свободен от чрезмерных пузырьков. Если пузырьки присутствуют, удалите их медленным устремлением с помощью пипетки.
- Загрузите микрофлюидный чип для обеззараживания в спиральное микрофлюидное устройство. Выполнить программу 3 на спиральный микрофлюидного устройства, нажав на Run и выбрав Программу 3 (31 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Программа 3 спирального микрофлюидного устройства позволяет быстро обогащать КТК за 31 мин. - Продолжить с спиральной микрофлюидной части устройства очистки шаг, используя оставшийся объем универсальный реагент очистки в входной трубки.
- Отбросьте входной трубку после завершения шага очистки, оставив после себя входной соломинку.
- Обеззараживание с использованием чистящего средства на основе отбеливателя
- Отключите универсальную крышку бутылки для очистки от разбавительного порта спирального микрофлюидного устройства, отвинчивая коричневый винт. Под шкафом микробиологической безопасности, передача до 250 мл отбеливателя основе моющего средства(Таблица материалов) в новой пустой бутылке (рисунок1A).
- Винт универсальный очистки реагента крышка бутылки и соломы в бутылку, содержащую Bleach основе моющего средства под микробиологический шкаф безопасности. Прикрепите эту бутылку к разбавительному порту спирального микрофлюидного устройства, завинчивая назад коричневый винт.
- Передача до 15 мл отбеливателя на основе моющего средства на новый 50 мл центрифуги трубки входну юнитная трубка с помощью серологического пипетки под микробиологической безопасности кабинета. Загрузите положение ввода центрифуги 50 мл. Загрузите пустую трубку в выходное положение.
- Перед обработкой запуска, убедитесь, что образец свободен от чрезмерных пузырьков, и если таковые имеются, удалить пузырьки, медленно успокоив их с пипеткой.
- Выполнить программу 3, нажав на Run и выбрав программу 3 (31 мин). После запуска, перейдите непосредственно к очистке шаг, используя оставшийся объем отбеливателя на основе чистящего средства в входной трубки.
- Отбросьте входные и выходные трубки.
- Промыть спиральный микрофлюидное устройство.
- Отключите крышку бутылки на основе отбеливателя из разбавительного порта спирального микрофлюидного устройства, отвинчивая коричневый винт. Под шкафом микробиологической безопасности, перенесите солому из бутылки, содержащей моющее средство на основе отбеливателя, в новую бутылку, содержащую разбавитель буфера. Винт бутылку спираль microfluidic устройства.
- Передача до 15 мл стерилизованной воды(Таблицаматериалов) в новую центрифугу 50 мл входной трубки с помощью серологического пипетки под шкафом микробиологической безопасности. Загрузите положение ввода центрифуги 50 мл. Загрузите пустую трубку в выходное положение.
- Перед обработкой запуска, убедитесь, что образец свободен от чрезмерных пузырьков, и если таковые имеются, удалить пузырьки, медленно успокоив их с пипеткой.
- Выполнить программу 3, нажав на Run и выбрав программу 3 (31 мин). После запуска, перейдите непосредственно к очистке шаг, используя оставшийся объем стерилизованной воды в входной трубке.
- Отбросьте входные и выходные трубки.
- Дезинфекция с использованием уницелярного реагента для очистки
2. Обслуживание для того чтобы держать Спиральmicrofluidic бактерии-свободно
ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярное техническое обслуживание должно быть сделано в конце дня во время последнего шага очистки.
- Передача до 7 мл моющего средства на основе отбеливателя в новую центрифугу мощностью 50 мл с помощью серологического пипетки под шкафом микробиологической безопасности. Винт отбеливатель основе очистки трубки в входному порту спираль microfluidic устройства.
- Перед обработкой чистого запуска, убедитесь, что входный образец свободен от чрезмерных пузырьков, и если таковые имеются, удалить пузырьки, медленно успокоив их с пипеткой.
- Запустите чистую на спиральном микрофлюидном устройстве.
3. Предварительное аналитическое обогащение КТК из образцов крови пациента
- Соберите 7,5 мл крови в трубке K2EDTA и держите под нежным возбуждением, чтобы избежать отложений клеток и свертывания крови. Процесс в пределах 6 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если кровь собирается в бесклеточной трубке сбора крови ДНК, содержащей консервант, хранить при 4 градусах Цельсия до обработки. Убедитесь, что образец крови, буфер лисиса РБК и буфер RBS находятся на RT, прежде чем приступить к этапу обогащения. - Передача до 7,5 мл цельной крови в новую центрифугу 50 мл входиной трубки с помощью серологического пипетки под шкафом микробиологической безопасности.
- Центрифуга при 1600 х г в течение 10 мин на RT. Соберите плазменную фракцию с пипеткой, не нарушая буйный пальто. Замените плазменную фракцию, добавив непосредственно эквивалентный объем PBS до 7,5 мл.
- Аккуратно добавьте буфер лисиса РБК(Таблицаматериалов) к образцу крови до конечного объема 30 мл (для трубки K2EDTA) или 37,5 мл (для трубки для сбора крови без клеток ДНК). Аккуратно инвертировать трубку для сбора крови 10x и инкубировать в течение 10 минут на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец крови становится более красным во время лиза РБК. Если никаких изменений (от темно-красного и непрозрачного) наблюдается после 10 мин, аккуратно инвертировать трубку 3x и оставить стоять еще 5 мин максимум. Не оставляйте образец в буфере лисиса РБК более 15 мин, поскольку он может поставить под угрозу качество образца и производительность анализов. - Центрифуга лизинированный образец крови на 500 х г в течение 10 мин на RT, с центрифугами тормозов на (или высокая скорость замедления). Используйте пипетку Pasteur или серологическую пипетку, чтобы аккуратно удалить супернатант до тех пор, пока объем не достигнет отметки 4-5 мл. Затем используйте отфильтрованные советы микропайпет, чтобы удалить оставшийся супернатант.
- Используя микропайпет P1000 с отфильтрованным наконечником, добавьте 1,0 мл RSB к стене входиной трубки центрифуги 50 мл. Чтобы избежать введения пузырьков в смесь, resuspend клетки гранулы осторожно pipetting вверх и вниз, пока образец является однородным.
- Добавьте еще 3 мл РСБ к стене входной трубки центрифуги 50 мл (общий объем 4 мл). Избегайте введения пузырьков в смесь. Аккуратно перемешайте клеточную подвеску, аккуратно потянив вверх и вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: В маловероятном случае, что регулярные pipetting не в состоянии сломать ячейки сгустки (определяется, будучи видимым или блокирование кончика пипетки), фильтр образец через 40 мкм ячейки ситечко, чтобы удалить любые сгустки. Добавьте в образец 150 Л Л RSB, чтобы компенсировать потерю объема от фильтрации. Обратите внимание, что этот метод должен использоваться экономно и только при наблюдении больших скоплений. - Прежде чем перейти к этапу обогащения, убедитесь, что образец свободен от чрезмерных пузырьков и если таковые имеются, удалить пузырьки и заботиться, чтобы не отбросить любой образец. Если крошечные пузырьки присутствуют, их удаление не требуется.
- Обработайте образец на спиральном микрофлюидном устройстве.
4. Обогащение КТК от пациента целой крови с помощью спирального микрожидкости
- Загрузите новый спиральный микрофлюидный чип. Загрузите две пустые центрифуги 50 мл в входные и выходные порты.
- Выполнить премьер, нажав на прайм на спираль микрофлюидного устройства (3 мин). Удалите входные и выходные трубки и загрузите образец для обработки в входином порту.
- Загрузите четкую коническую трубку 15 мл в выходном порту для сбора обогащенных CTCs. Выполнить программу 3, нажав на Run и выбрав Программу 3 (31 мин).
- Разгрузите выходную трубку и центрифугу при 500 х г на 10 мин (ускорение: 9; замедление: 5). С помощью серологического пипетки 5 мл, удалите супернатантную остановку на отметке 2 мл на конической трубке 15 мл. С помощью микропипетта удалите супернатант, останавливаясь на отметке 100 л на конической трубке 15 мл. Обработайте обогащенный образец непосредственно для окрашивания иммунофлюоресценции.
5. Иммунофлуоресценция окрашивание
- Перечислите на камерной горке с сеткой гемоситометра количество ячеек на мл. Разбавить обогащенный образец антисвязным раствором 0,2%(Таблицаматериалов) до концентрации, достигающей 100 000 клеток/100 л на цитоспин.
- Смочите контур камеры образца хлопком(Таблицаматериалов) с 50 зл 0,2% антисвязывающего раствора. Поместите полилизин стеклянной слайд в камере образца и закрыть.
- Пальто наконечник с 0,2% анти-связывающего решения пайпеттинг вверх и вниз 3x. Отреприжите обогащенный образец и перенесите клеточный раствор в камеру образца. Центрифуга со выделенной центрифугой(Таблица материалов) при 400 об/мин в течение 4 мин (ускорение низкое).
- Поместите кремниевый изолятор вокруг области осаждения. Дайте высушить стекло-слайд под шкафом микробиологической безопасности в течение 2 мин.
- Подготовьте раствор фиксации, разбавив 1 мл 16% параформальдегида (PFA) 3 мл стерильного PBS. Добавьте 100 кЛ раствора фиксации (4% PFA) на образец и инкубировать на РТ в течение 10 мин. Удалите раствор фиксации и выполните три стирок с 200 Зл PBS и инкубировать на RT каждый в течение 2 мин.
ПРЕДЕКТО: Используйте PFA под шкафом химической безопасности для предотвращения вдыхания. - Подготовка раствора насыщения путем разбавления сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) на 5%, Fc рецептор (FcR) блокирующий реагент на 5%, и бычьей сыворотки альбумина (BSA) на 1% в стерильной PBS (Таблица материалов). Добавьте 100 кл. раствора насыщения на образец и инкубировать в течение 30 мин на RT. Удалить раствор насыщения.
- Добавьте 100 л раствора антител на образец (антитела CD45 1/20; Антитела ПанкК 1/500; Антитела PD-L1 1/200; Сыпучий раствор насыщения 100 л)(Таблицаматериалов). Поместите полилизин стеклянной слайд в 100 мм х 15 мм Петри блюдо. Смочите абсорбцивательную бумагу 2 мл стерильной воды и закройте чашку Петри крышкой. Поместите при 4 градусах на ночь и защитите от света.
- Удалите смесь антител и выполнить 3 моет с 200 Зл ТБС инкубации каждой стирки в течение 2 минут. Дайте образцу высохнуть в течение 5 мин и защитите его от света. Поместите 10 зл монтажного раствора(Таблицаматериалов) в область осаждения и накройте микроскопом крышкой, не сделав пузырь. Печать крышки с лаком для ногтей.
6. Приобретение иммунофлуоресцентных изображений с помощью прямого флуоресцентного микроскопа и связанного с ним программного обеспечения
- Используйте прямой флуоресцентный микроскоп с моторизованной платформой X/Y. Используйте 20-кратную цель, чтобы взять 8-битные RGB tiff изображения в четырех каналах, соответствующих красителя ДНК (4',6-диамидино-2-фанилиндоль »DAPI), PanCK краситель (флуоресцен изотиоцианат (FITC), PD-L1 краситель (CY3), и CD45 краситель (CY5). Включите ртутную лампу за 15 минут до использования и адаптируйте микроскоп и связанное с ним программное обеспечение к полуавтоматизированной съемке.
- Поместите стеклянную горку на платформу.
- В меню приобретения определите четыре канала и навяжете время экспозиции (DAPI: 15 мс, FITC (PanCK) : 500 мс; CY3 (PD-L1): 800 мс; CY5 (CD45): 1000 мс). Определите плитки для сканирования. Нажмите плитки. В Эксперименте Advancedопределите область для сканирования.
- Отрегулируйте фокус на экране. Нажмите Запуск эксперимента.
- Экспортировать файлы TIF каждого канала и конкретно называть файл изображения с помощью этой информации: Sample-NumberofTilesRegion-dye-NumberOfSubtiles.tif (например, Sample1'TR1'c1m01). Название красителя следующим образом: канал DAPI является c1, канал FITC c2, cy3 канал c3, и CY5 канал c4.
7. Анализ иммунофлуоресцентных изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений
- Скачать и установить бесплатное программное обеспечение для анализа изображений с веб-сайта Института Широкой. Примите все по умолчанию во время установки. Откройте программное обеспечение для анализа изображений и нажмите файл (ru) Трубопровод из файла Анализ: 4каналы-CTC.cppipe.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конвейер преобразует цветные изображения RGB в серую шкалу, удаляет артефакты, сглаживая изображения средним фильтром, идентифицирует ядра и цитоплазму, количественно увеличивает интенсивность флуоресценции каждого канала и экспортирует их в файл Excel. - Удаление файлов в списке файлов. Обновление метаданных для группы файлов по плиточок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструкции по групповому изображению указаны в программном обеспечении. Файлы имен, появившиеся в модуле NamesAndTypes, и файлы группируются в зависимости от количества плитки и канала на образцы. - Нажмите параметры вывода просмотра и укажите правильный выход по умолчанию. Нажмите Анализ изображений. Откройте файл электронной таблицы, соответствующий параметрам измерения интенсивности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первым предпосылкой было получение незагрязненных (безинфекционных) коллекций КТК для культуры тканей и предотвращение фона IF. Протокол обеззараживания позволил очистить все трубы и насосы, и это привело к сбору КТК с хорошей скоростью восстановления без бактериального загрязнения. Обогащенные образцы сравнивались без и с рабочим процессом протокола обеззараживания спирального микрофлюидного устройства. Для проверки протокола обеззараживания линия клеток A549 использовалась при отсутствии цельной крови и обогащалась непосредственно с помощью спирального микрофлюидного устройства. Без оптимизированного протокола обеззараживания, высокое бактериальное загрязнение наблюдалось в культуре ткани обогащенной линии клетки A549 после всего 24 ч, что вызвало смерть и цитоморфологические изменения в эукариотических клетках(рисунок 1B).
В отличие от этого, после очистки протокола, живые клетки A549 были получены путем роста в 2D культуре после 10 ч культуры тканей и удаления средств массовой информации и в 3D условиях(рисунок 1B), а также образцы пациентов (Рисунок 1C). Потенциальный КТК идентифицируется красным крестом(рисунок 1C).
Рисунок 2 резюмирует полный рабочий процесс для иммунофлуоресцентного фенотипирования обогащенных КТК из всей крови. Он состоит из четырех основных этапов: выборка всей крови, обогащение КТК, иммунофлуоресценция (ИФ) анализ и анализ изображений с помощью программного обеспечения. Ранее, скорость восстановления спирального микрофлюидного устройства была решена14. Используя флуоресцентные имитирующие CTCs (mCTC), этот показатель восстановления был установлен на уровне 1.3 CTCs/mL цельной крови14.
Нынешняя работа сосредоточена на создании оптимальных условий для анализа IF обогащенных КТК и визуализации вниз по течению(рисунок 2). Во-первых, для проверки специфики антитела PD-L1 были использованы две клеточные линии: (1) PC3 высоко-позитивной линии клеток PD-L1 и (2) SW620 с низким положительным PD-L1 клеточной линии. Клетки были затем обогащены спиральным микрофлюидным устройством и проанализированы IF. Все клетки были окрашены маркером опухоли анти-PanCK, маркером противокорательных клеток, анти-PD-L1 (полезен при раке легких) и DAPI (ядерный краситель). Белые кровяные тельца были определены как положительные для DAPI и CD45, в то время как раковые клетки были определены как положительные для DAPI и PanCK и отрицательные для CD45. PC3 высоко-PD-L1-положительная клеточная линия была положительно окрашена для PD-L1, в то время как более низкое выражение PD-L1 было обнаружено в SW620 с низким содержанием PD-L1-негативной клеточной линии.
Затем были сравнены следующие: (i) жидкий, если они окрашивают, (ii) окрашивание КТК, непосредственно откладываемых на полилизиновые слайды, и (iii) если окрашивание КТК после цитоспина на полилизиновых слайдах. Было четко отмечено, что коэффициент восстановления КТК зависит от типа используемого протокола(рисунок 3А). В жидком, если окрашивая ассс, скорость восстановления составила всего 10% для числа шипами mCTC был самым низким. Этот низкий уровень восстановления представляет собой проблему для большинства пациентов с метастатическим NSCLC, так как это значительно ограничивает способность этих тестов изолировать несколько КТК и предоставить фенотипическую информацию. Второй и третий описанные разделы (прямое осаждение mCTC или CTC на полилицыны покрытием слайды без цитопсина и с цитопсином) систематически имели темпы восстановления, превышающие 60%(рисунок 3A).
Рисунок 3 B показывает репрезентативные изображения этих if анализов с использованием целых образцов крови от того же пациента, либо с помощью жидкости, если окрашивая анализ или ЕСЛИ окрашивая анализ на полилизина покрытием слайды с цитоспином. Перечисление ядер явно отличалось между двумя анализами(рисунок 3B). Ядерное окрашивание DAPI обеспечило перечисление общих клеток в образце, а окрашивание биомаркеров позволило выделить зеленые панкК-положительные клетки, оранжевый в PD-L1-положительных клеток, и красный цвет в CD45 остаточных белых клеток (Рисунок 3 B).
Далее, чтобы цитологически дифференцировать белые кровяные клетки из опухолевых клеток, форма ядра должна быть визуализирована, так как это характерно для типа клетки. Рисунок 3 C демонстрирует очертания ядер, которые размыты и морфологии, что является необычным в отсутствие шага цитоспина. Оптимизированный протокол, таким образом, включал цитоспиннинг обогащенных КТК на полилизновых слайдах с последующим 4% фиксацией параформэдида (PFA) для сохранения слайдов перед окрашиванием IF. Этот оптимизированный протокол имел те же темпы восстановления, как осаждение mCTC непосредственно на полилинизевых скольжения (Рисунок 3A), даже когда очень мало клеток были добавлены. Так как этот дополнительный шаг позволяет сохранить ядерную морфологию(рисунок 3С),гранулоциты были отождествлены с их многолопастными ядрами, а также опухолевые клетки (помеченные красным крестом в ядре) с их ядерными аномалии, злокачественные новообразования и больший размер по сравнению с белыми кровяными клетками.
После оптимизации протокола IF, доказательство концепции было проведено с использованием цельной крови от метастатических пациентов. Образцы были в перспективе собраны в рамках обычной когорты CIRCAN, базирующейся в университетской больнице Лиона. Сбор крови обычно осуществлялся, когда врачи наблюдали самые ранние признаки прогрессирования опухоли. Все случаи опухоли были гистологически или цитологически подтверждены на образцах биопсии FFPE во время первоначального диагноза. Здесь анализ КТК при прогрессировании проводился следователями, которые не имели доступа к клиническим данным или не имели предварительных знаний. Подробные доаналитические соображения были ранее опубликованы15.
На рисунке 4, таблица 1, и таблица 2, различные выводы представлены из образцов пациентов. Профиль CD45 (кв), PanCK(-), PD-L1(-) представляет иммунные клетки. Было показано, что остаточный кол белых кровяных телец сильно изменчив и зависит от всего образца крови. Диапазон в этой небольшой лочисле пилота было 648-11,000 белых CD45 (к) клетки(Рисунок 5A). Следовательно, сразу же после обогащения КТК, перечисление собранных клеток было включено для регулировки плотности клеток на площади цитоспина при плотности 100 000 клеток/цитоспин (см. раздел 6). Это позволило производительность нескольких цитоспинов на одного пациента и оптимизацию микроскопического наблюдения для ручного перечисления и использования программного обеспечения для анализа изображений конвейера.
На рисунке 4A-C, Таблица 1, и таблица 2, типичные случаи сообщаются, в которых остаточные белые клетки крови были сильно отличаются:
i) Первым профилем является CD45 (-), PanCK (яп. ) и PD-L1 (яп. Часто размер клеток превосходит 13 мкм в диаметре, а морфология ядра нерегулярна, что представляет собой цитоморфологический образ злокачественности. Эта популяция, вероятно, состоит из КТК.
ii) Второй профиль CD45 (-), PanCK (-), и PD-L1 (я). Как уже сообщалось, не все CTCs выражают биомаркер PanCK(рисунок 4A).
iii) Третьим профилем является CD45 (-), PanCK (яп. ) и PD-L1 (-). Как уже сообщалось, не все CTCs выражают биомаркер PD-L1.
iv) Четвертый профиль CD45 (яп. ) и PD-L1 (яп.) представлен на рисунке 4B. Представляет собой нетипичные активированные иммунные клетки в цельной крови пациента. Эта популяция была описана в нескольких публикациях16,17,18 и составляет примерно 5% от общего числа клеток после обогащения. Присутствие этой популяции может привести к увеличению частоты ложноположительных КТК в выборке, если интенсивность сигнала CD45 слишком низка, а морфология ядра недостаточно законсервирована. Это решительно подчеркивает необходимость проведения дополнительных опухолевых окрашивания биомаркеров, таких как Vimentin и / или Epcam в этом иммунофлуоресцентном анализе.
v) Наконец, последний профиль включает в себя немаркированные ячейки CD45 (-), PanCK (-) и PD-L1 (-), выделенные на рисунке 4C. Ядро в этой популяции часто показывает цитоморфологические закономерности злокачественности, и размер составляет более 13 мкм в диаметре. Процент этих клеток в образцах очень изменчив в зависимости от целой крови пациента. Это подчеркивает необходимость использования дополнительных опухолевых биомаркеров для подтверждения опухолевого паттерна этой клеточной подпопуляции.
В таблице 1 и таблице 2, количество клеток 16 образцов было сообщено от передовых метастатических пациентов NSCLC. Клетки были классифицированы в соответствии с выражением биомаркеров. Высокая изменчивость наблюдалась в полученных субпопуляциях. Как уже сообщалось в независимых исследованиях, в большинстве образцов были обнаружены профили CD45 (--), PanCK (я) и PD-L1(я). Тем не менее, поскольку популяция КТК весьма неоднородна, образцы пациентов также содержали CD45(--), PanCK (-) и PD-L1 (к) субпопуляции, CD45 (-), PanCK (-) субпопуляций. Уровень остаточных белых кровяных телец был весьма изменчивым среди проанализированных образцов.
Для облегчения регистрации клеток был создан экспериментальный конвейер с использованием программного обеспечения для анализа изображений для автоматизированного анализа изображений иммунофлуоресценции. Рабочий процесс описан на рисунке 5. В этом случае важно приобрести высококачественные иммунофлуоресценции с точки зрения контрастности и интенсивности флуоресценции. В зависимости от емкости кластерного расчета оборудования конвейер анализа изображений может быть применен к полному объединенному изображению цитоспина или по репрезентативной области цитоспина.
Здесь, на основе микроскопа, полуавтоматическое сканирование цитоспина (X/Y; фокус не включен) области, генерируемой 150-200 слитых изображений. Эти изображения могут быть объединены вместе и непосредственно проанализированы с помощью конвейера анализа изображений. Тем не менее, эта процедура является ресурсоемким изема времени и расчетов, что является важным ограничением для ее регулярного использования в лабораториях. Поэтому, основываясь на предыдущем опыте в области клеточной гематологии, было решено проанализировать репрезентативные области каждого образца после проверки под микроскопом, что распределение клеток было однородным по всей области цитоспина. Затем 25% от общей площади цитоспина (около 40 плиток) было отсканировано с помощью флоресцированного микроскопа для создания 40 х 4 независимых изображений. Объединенный файл был разделен по каналам, а файлы изображений автоматически генерировались с помощью программного обеспечения микроскопа (см. раздел 7; Рисунок 5 A).Эти файлы были импортированы в конвейер анализа изображений для анализа в соответствии с описанными параметрами (см. раздел 8; Рисунок 5 A).
На рисунке 5Bмы вручную определили репрезентативное изображение, отображающее четыре CtCs (--), PanCK (я) и PD-L1 (яп.) среди 77 иммунных клеток (CD45) , PanCK (-) и PD-L1 (-)». Рисунок 5 B иллюстрирует, как программное обеспечение для анализа изображений идентифицировало и перечисляет количество ячеек на основе окрашивания DAPI. Он также иллюстрирует, как программное обеспечение для анализа изображений считало вторичные объекты. Наконец, интенсивность флуоресценции для каждого флуоресцентного канала были зарегистрированы для всех объектов, зарегистрированных на изображениях.
Фон был рассчитан и представлен отрицательными ячейками, присутствующими в образце. Например, неактивированные иммунные клетки имеют низкую интенсивность флуоресценции и позволяют измерять фон окрашивания PanCK и PD-L1. Флуоресцентный сигнал был признан положительным, если интенсивность флуоресценции превышала интенсивность фона в два раза (на основе анализа четырех независимых образцов пациента). Что касается окрашивания CD45, так как уровень экспрессии CD45 сильно изменчив в подпопуляциях белых кровяных телец, порог позитивности был установлен как можно ниже. Он был основан на анализе изображений 10 здоровых цельной крови, окрашенных антителами CD45. Экспериментальный анализ (n No 4) показал соответствие между ручным перечислением и перечислением программного обеспечения для анализа изображений(таблица 2). Каждая клетка на цитоспине идентифицируется программным обеспечением для анализа изображений и позволяет биологам отслеживать клетку и вручную подтверждать результаты, если это необходимо.
Рисунок 1 : Обзор рабочего процесса по обеззараживанию спиральное микрофлюидное устройство инструмент. (A) Три основных шага, включенных в процесс обеззараживания (см. протокол), иллюстрирующие локализацию входных и выходных данных прибора. (B) Репрезентативные изображения обогащения линии ячейки A549 до и после обеззараживания инструмента. Показано влияние присутствия инфекционного агента на жизнеспособность и морфологию собранных клеток. При наличии бактерий была изменена морфология клеток и жизнеспособность. Шкала бар No 20 мкм. (C) 3D-клеточная культура обогащенных образцов пациента легких, простаты и рака молочной железы. Красный крест соответствует нетипичным клеткам. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Обзор рабочего процесса иммунофлуоресценции анализа от цельной выборки крови для анализа флуоресценции изображений. Основные шаги показаны следующим образом: сбор крови для всей крови, сбор КТК с спиральным микрофлюидным устройством, анализ иммунофлюоресценции и программное обеспечение для анализа изображений. Выбор биомаркера был обусловлен лучшей идентификацией различных популяций клеток, наблюдаемых на слайде цитоспина (CD45 для иммунных клеток, PanCK и PD-L1 для раковых клеток легких). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Скорость восстановления трех независимых протоколов окрашивания. ()Сравнение скорости восстановления mCTCs от жидкого окрашивания, прямое окрашивание клеток, отложенных на полилизина покрытием слайдов, и клеточные окрашивания после цитоспин на полилизина покрытием слайдов. (B) Репрезентативные изображения образцов пациента, обработанных жидким протоколом IF и прямым иммунодефицитным протоколом с цитоспинстепом. Клетки были окрашены моноклональным иттелами CD45 (клон HI30) Alexa Fluor 647; Моноклональные антитела PanCK (клон AE1/AE3) Alexa Fluor 488; 4',6-диамидино-2-фанилиндол (DAPI). Шкала бар No 20 мкм. (C) Представитель изображения DAPI окрашивания клеточного обогащения с и без шага цитоспина. Морфология и размер ядер были показаны с помощью DAPI окрашивания. Красный крест выделяет клетки с аномалиями в ядре на правом изображении. На левом изображении изображение нечеткое, так как ячейки не находятся на одном уровне (x-, y-и-и-оси). Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Идентификация профилей клеток. (A) Репрезентативные изображения пациентов с различными профилями CTC. Каналы флуоресценции представлены отдельно. Слитые изображения отображаются слева. Они окрашены моноклональными антителами CD45 (клон HI30) Alexa Fluor 647; Моноклональные антитела PanCK (клон AE1/AE3) Alexa Fluor 488; PDL-1 моноклональные антитела (клон 29E2A3) фикоэритрин; 4',6-диамидино-2-фанилиндол (DAPI); стрелки указывают на нетипичные клетки. (B) Репрезентативные изображения иммуно-сточки двух образцов пациента с нетипичными белыми клетками профилей. Клетки были окрашены моноклональным иттелами CD45 (клон HI30) Alexa Fluor 647; Моноклональные антитела PanCK (клон AE1/AE3) Alexa Fluor 488; PDL-1 моноклональные антитела (клон 29E2A3) фикоэритрин; 4',6-диамидино-2-фанилиндол (DAPI). Изображение подчеркивает наличие иммунных клеток, окрашенных CD45 (я), PanCK (я) и PD-L1( ( ). (C) Изображение подчеркивает наличие немаркированных ячеек (CD45(-), PanCK (-), и PD-L1 (-). Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Обзор анализа флуоресцентных изображений. (A) Основные шаги описаны: микроскопия сканирования, канал раскол в соответствии с флуоресценцией, и импорт файлов в программное обеспечение анализа изображений. (B) Описание трех различных шагов для рабочего процесса программного обеспечения анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: Ручное перечисление обогащения клеток пациента. Перечисление клеток на основе dAPI окрашивания. Перечисление других объектов на основе fitC, PE и CY5 окрашивания.
Таблица 2: Программное обеспечение для анализа изображений перечисление обогащения клеток пациента . Перечисление клеток на основе dAPI окрашивания. Перечисление других объектов на основе fitC, PE и CY5 окрашивания. Сравнение ручного подсчета и перечисления программного обеспечения для анализа изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании были подняты два основных вопроса: первый в отношении эффективности рабочего процесса для его передачи в клинические приложения, а второй - снижение субъективности анализа полученных изображений флуоресценции.
Перформатора и оптимизированный рабочий процесс для перечисления CTC был первоначально определен с помощью настраиваемых анализов IF после обогащения клеток с помощью микрофлюидной системы CTC (спиральное микрофлюидное устройство). Используя этот рабочий процесс, экспериментальное исследование подтвердило, что все образцы у метастатических пациентов NSCLC содержали нетипичные клетки, которые были все CD45(-). Они могут быть помечены как panCK и/или биомаркеры PD-L1; однако, они также могут быть полностью отрицательными для всех проверенных биомаркеров (-, PanCK(-) и PD-L1 (-), как это наблюдается в образце S19 (Таблица2) . Это подчеркивает необходимость дополнительных биомаркеров для фенотипирования субпопуляций КТК. Следовательно, было предложено добавить эпителийно-мезенхимальные биомаркеры, такие как EpCAM, Vimentin и N-Cadherin; маркеры раковых стволовых клеток, включая CD44 и CD133; и специфические маркеры опухоли, включая TTF1 для аденокарциномы легких.
В экспериментальном исследовании диапазон нетипичных клеток составлял 40 евро, от 3,5 мл цельной крови. Для 80% образцов пациента, нетипичный отсчет клеток был над 50. Действительно, в цитологическом19,20,21 образцы из Эндо Брончиана Ультра Соник Руководство Транс Бронхиальная игла аспирации или КТ-направленные транс-торакальные проколы, PD-L1 анализ подходит в большинстве образцов, но порог в 100 опухолевых клеток обычно допускается производить статистическую и клиническую интерпретацию значения. Однако, в конкретном случае КТК крови, следует отметить, что вопрос пространственной неоднородности опухоли обошел в отличие от небольших образцов опухоли на месте.
Второй момент заключался в том, чтобы избежать влияния обработчика на анализ изображений иммунофлуоресценции. Таким образом, программное обеспечение для анализа изображений флуоресцентных изображений было создано для стандартизации перечисления клеток и предоставления статистических данных по этим образцам. Этот автоматизированный процесс высветил необходимость в мощных кластерах вычислений для анализа всех ячеек, содержащихся в одном образце. Кроме того, качество окрашивания IF должно находиться в одной плоскости (чтобы избежать использования конфокальных систем), а плотность клеток на цитоспине должна быть откалибрована, чтобы программное обеспечение для анализа изображений распознавало все ячейки отдельно на слайде. Наконец, результаты не были подтверждены в отношении клинических исходов в когорте пациентов, но этот момент должен быть рассмотрен в другом специальном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jean-Philippe Aurel и Kathryn Weiqi Li являются сотрудниками компании Biolidics, которая производит инструменты, используемые в этой статье. Другим авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана научно-исследовательскими грантами от Компании АстраЗенека (Лондон, Соединенное Королевство), Biolidics (Сингапур) и Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, Франция). Авторы благодарят компании «АстраЗенека» и «Биолидика» за финансовую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4 °C |
| BD Facs Clean – 5 L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4 °C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4 °C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4 °C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4 °C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4 °C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone - 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4 °C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4 °C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4 °C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4 °C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4 °C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4 °C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
- Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
- Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
- Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
- Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
- Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
- Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
- Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
- Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
- Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
- Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
- Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
- Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
- Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
- Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
