Summary
A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).
Abstract
As células tumorais circulantes (CTCs) derivadas do tumor primário são derramadas na corrente sanguínea ou no sistema linfático. Estas pilhas raras (1 − 10 pilhas por o mL do sangue) justificam um prognóstico pobre e são correlacionadas com a sobrevivência total mais curta em diversos cancros (por exemplo, peito, próstata e colorectal). Atualmente, o sistema de captura de CTC com base em talão magnético anti-EpCAM é o teste padrão ouro aprovado pela administração de alimentos e drogas dos EUA (FDA) para enumerar CTCs na corrente sanguínea. Este teste é baseado no uso de grânulos magnéticos revestidos com os marcadores anti-EpCAM, que visam especificamente as células cancerosas epiteliais. Muitos estudos têm ilustrado que EpCAM não é o marcador ideal para a detecção de CTC. De fato, os CTCs são uma subpopulação heterogênea de células cancerosas e são capazes de sofrer uma transição epitelial-mesenquimais (EMT) associada à proliferação e invasão metastáticas. Estes CTCs são capazes de reduzir a expressão do marcador epitelial de superfície celular EpCAM, enquanto aumentam os marcadores mesenquimais como vimentina. Para abordar este obstáculo técnico, outros métodos de isolamento baseados em propriedades físicas de CTCs foram desenvolvidos. As tecnologias microfluidic permitem uma aproximação Label-Free ao enriquecimento de CTC das amostras de sangue inteiras. A tecnologia microfluídico espiral usa as forças de arrasto inercial e Dean com fluxo contínuo em canais curvados gerados dentro de um chip microfluídico espiral. As células são separadas com base nas diferenças de tamanho e plasticidade entre as células sanguíneas normais e células tumorais. Este protocolo detalha as etapas diferentes para caracterizar a expressão programada do Death-ligand 1 (PD-L1) dos CTCs, combinando um dispositivo microfluídicos espiral com o conjunto de marcador customizável da imunofluorescência (if).
Introduction
Os linfócitos T citotóxicos antígeno-específicos do tumor (CTLs) jogam um papel crucial na resposta aos cancros através de um processo sabido como o cancer "fiscalização imune". Suas funções antitumorais são reforçadas por anticorpos imunológicos de bloqueio de ponto de verificação, como inibidores da CTLA-4 e inibidores da PD-1/PD-L1. No câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), as terapias anti-PD-1/PD-L1 resultam em taxas de resposta variando de 0%-17% em pacientes com tumores PD-L1-negativos e 36%-100% naqueles que expressam PD-L1. As respostas robustas ao bloqueio PD-1/PD-L1 observadas no melanoma e no NSCLC são mostradas pela evidência da taxa de resposta global melhorada (RR), dos benefícios clínicos duráveis, e da sobrevivência livre de progressão (PFS). Actualmente, os tratamentos PD1 são o padrão de cuidados no tratamento com NSCLC de segunda linha com nivolumab, independentemente da expressão PD-L1 e com pembrolizumab em doentes que expressam PD-L1 ≥ 1%. No tratamento de primeira linha, o padrão de cuidado é pembrolizumab isoladamente em pacientes com NSCLC expressando PD-L1 ≥ 50% e pode ser potencialmente reforçada com quimioterapia (platina e droga de dúvida dependendo do subtipo histológico)1,2.
Entretanto, tal aproximação à gerência paciente é discutível3, desde que a expressão de PD-L1 em pilhas do tumor por immunohistochemistry (IHC) é provavelmente não o Biomarker o mais ideal do companheiro. Outros, como a carga de mutação tumoral4 (TMB), a instabilidade de MICROSSATÉLITES (MSI) e/ou a microbiota são possivelmente interessantes neste ajuste isoladamente ou em combinação. NSCLC é sabido para ser tumores heterogêneos, ou espacialmente (de um local do tumor a um outro) ou temporally (do diagnóstico ao retorno). Os pacientes com NSCLC são geralmente frágeis, e as biópsias invasoras iterativas do tecido podem ser uma edição. Na verdade, a taxa de re-biópsia na primeira progressão varia de 46%-84%, dependendo da série, e a re-biópsia bem-sucedida (significado com análise histológica e completa molecular) varia de 33%-75%. Isso significa que 25%-67% dos pacientes não podem receber uma análise de re-biópsia abrangente durante a primeira progressão5,6,7,8.
O advento das "biópsias líquidas" gerou assim um entusiasmo considerável neste cenário particular, pois possibilita uma reavaliação crucial das alterações moleculares durante a progressão da doença, examinando o DNA livre circulante (cfDNA) derivado da circulação células tumorais (CTCs). Estas células vivem são liberados do tumor para a corrente sanguínea, onde circulam livremente. Embora não seja rotineiramente utilizado, a análise de CTCs parece ser altamente promissora no caso de caracterização molecular e fenotípica, prognóstico e significância preditiva no câncer de pulmão (via Dnaseq, Rnaseq, Mirna e análise proteica). Certamente, os CTCs provavelmente abrigam características fenotípicas da doença ativa um pouco do que os marcadores iniciais (detectados em biópsias do tecido no diagnóstico). Além disso, os CTCs contorneam o problema da heterogeneidade espacial do tecido do tumor, que pode ser uma edição crucial em biópsias pequenas. Consequentemente, a expressão de PD-L1 em CTCs pode potencialmente lançar luz sobre as discrepâncias derivadas de seu uso como um biomarcador preditivo usando tecido tumoral.
Recentemente, a expressão PD-L1 foi testada em CTCs do NSCLC. Quase todos os pacientes testados9 foram positivos para PD-L1, complicando a interpretação do resultado e seu uso clínico. Em geral, os CTCs PD-L1-positivos foram detectados em 69,4% das amostras de uma média de 4,5 células/mL10. Após o início da radioterapia, a proporção de CTCs PD-L1-positivas aumentou significativamente, indicando a upregulação da expressão de PD-L1 em resposta à radiação11. Daqui, a análise do CTCs PD-L1 pode ser usada para monitorar mudanças dinâmicas do tumor e da resposta imune, que podem refletir a resposta à quimioterapia, à radiação, e aos tratamentos prováveis da imunoterapia (TI).
Até o momento, o isolamento CTCs e a caracterização PD-L1 dependem de vários métodos, como captura de CTC com base em talão magnético revestido com anti-epcam, ensaio baseado em enriquecimento e com base em tamanho de12,13 ensaios de captura de CTC. Entretanto, os CTCs foram detectados somente em 45%-65% dos pacientes com NSCLC metastático, limitando assim sua habilidade de fornecer toda a informação para mais do que a metade de pacientes metastáticos de NSCLC. Além, a contagem do CTC era baixa em a maioria destes estudos usando a aproximação tamanho-baseada10. Além disso, este método conduziu às discrepâncias tais como a deteção de pilhas de CD45 (-)/DAPI (+) com "testes padrões citomorfológicos da malignidade" na circulação sanguínea de doadores saudáveis. Estas preocupações destacam a necessidade de um método altamente sensível de coleta de CTC associado à imuno-fenotipagem de células CD45 (-) atípicas de sangue total saudável usando biomarcadores adicionais de câncer (i.e., TTF1, Vimentin, EpCAM e CD44) no NSCLC.
Consequentemente, avaliamos um dispositivo microfluídico espiral que utiliza forças de arrasto inercial e Dean para separar as células com base no tamanho e na plasticidade através de um chip microfluídico. A formação de fluxos de vórtice Dean presente nos resultados de chip microfluídico em CTCs maiores localizados ao longo da parede interna e células imunes menores ao longo da parede externa do chip. O processo de enriquecimento é completado por desviando as células maiores na tomada de coleta como a fração de CTC enriquecida. Este método é particularmente sensível e específico (detecção de cerca de 1 CTC/mL de sangue total)14 e pode ser associado a análises de imunofluorescência (if) personalizadas. Estas ferramentas permitirão a criação de um limiar positivo para a interpretação clínica. Um fluxo de trabalho é descrito assim que permite que os biólogos isolem e immunophenotype CTCs com uma taxa elevada de recuperação e de especificidade. O protocolo descreve o uso ideal do dispositivo microfluídico espiral para coletar CTCs, os ensaios otimizados IF que podem ser personalizados de acordo com o tipo de câncer, e o uso de software livre de código aberto para medir e analisar imagens de células para executar um semiautomático numeração das células de acordo com a coloração fluorescente. Além disso, a multiplexação por microscópio pode ser realizada dependendo do número de filtros/marcadores fluorescentes disponíveis.
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Protocol
As amostras foram coletadas prospectivamente no âmbito da coorte CIRCAN ("câncer circulante") com base no hospital universitário de Lyon, após o consentimento por escrito do paciente. Este estudo foi integrado na coorte CIRCAN_ALL. O estudo CIRCAN_ALL foi reconhecido como não intervencionista pelo CPP sudeste IV datado de 04/11/2015 a referência L15-188. Uma versão alterada foi reconhecida como não intervencionista em 20/09/2016 a referência L16-160. O estudo CIRCAN_ALL foi declarado ao IT e ao correspondente da liberdade dos Hospices civils de Lyon em 01/12/2015, a referência 15-131. A coleta de sangue foi realizada quando os médicos observaram a primeira indicação de progressão tumoral.
Nota: Use todos os reagentes e materiais descritos na tabela de materiais com as respectivas condições de armazenamento para preparação de amostras pré-analíticas e ensaio de imunofluorescência. Substituir os reagentes e/ou modificar as condições de armazenamento pode resultar em um desempenho de ensaio subsuboptimal.
1. descontaminação do dispositivo Microfluídico espiral
Nota: A descontaminação do dispositivo microfluídico espiral é uma exigência para remover todo o fundo da imunofluorescência gerado da contaminação das bactérias, explora a citomorfologia dos CTCs, e pode diferenciá-los das pilhas imunes normais. O protocolo é otimizado para amostras de sangue coletadas em tubos de EDTA K2dentro de 6 h após a amostragem de sangue e enriquecido usando o dispositivo microfluídico em espiral em condições limpas. A utilização deste ensaio para outros tipos de amostras (outros fluidos biológicos) pode requerer uma optimização adicional. Este protocolo de descontaminação deve ser feito uma vez por semana.
- Preparação de reagentes
- Preparação do tampão diluente
- Esterilizar 20 mL de reagente aditivo diluente usando um filtro de seringa de 0,22 μm e adicionar diretamente a 1 L de 1x tampão fosfato salina (PBS) Ultra-Pure grau (tabela de materiais).
- Esterilização de reagentes e a palha de entrada
- Esterilizar o tampão de lise do RBC e o tampão de ressuspensão (RSB; Tabela de materiais) usando um filtro de seringa de 0,22 μm e um estoque em um novo tubo cônico de polipropileno 50 mL para cada solução.
- Esterilize a palha da entrada incubando na temperatura ambiente (RT) para 1 h no reagente de limpeza para todos os fins (tabela de materiais). Transfira a palha para o agente de limpeza à base de lixívia (tabela de materiais) e incubar na RT durante 1 h.
- Lave a palha de entrada duas vezes com PBS estéril por 1 h cada e guarde a palha de entrada esterilizada em um saco cirurgicamente estéril (tabela de materiais).
- Preparação do tampão diluente
- Descontaminando o dispositivo microfluídico espiral
- Desinfecção usando o reagente de limpeza para todos os fins
- Desligue a tampa do frasco diluente da porta diluente do dispositivo microfluídico espiral desparafusando o parafuso castanho. um gabinete de segurança microbiológica, transfira até 250 mL de reagente de limpeza para todos os fins (tabela de materiais) para uma nova garrafa vazia.
- Aparafuse a tampa e a palha do frasco diluente ao frasco de 250 mL de reagente de limpeza para todos os fins, um gabinete de segurança microbiológico. Prenda este frasco à porta diluente do dispositivo microfluídico espiral aparafusando o parafuso castanho.
- Transferência de até 100 mL de lixívia (1% de concentração final; Tabela de materiais) para o recipiente de resíduos fornecido no kit de corrida (Figura 1a).
- Coloque uma nova palha de entrada estéril sobre o dispositivo microfluídico espiral (tabela de materiais) na porta de entrada. Carregue um novo tubo de centrífuga de 50 mL na porta de entrada. Carregue um novo tubo de centrífuga de 50 mL na porta de saída.
- Prossiga para Prime o dispositivo microfluídico espiral clicando em Prime no dispositivo microfluídico espiral (3 min). Retire o tubo de entrada após a conclusão da Prime.
- Transfira até 15 mL de reagente de limpeza para todos os fins para um novo tubo de centrifugação de 50 mL com uma pipeta serológica um armário de segurança microbiológico e prenda o tubo à porta de entrada do dispositivo microfluídico espiral.
- Antes de iniciar a corrida, verifique se a solução está livre de bolhas excessivas. Se as bolhas estiverem presentes, retire-as por aspiração lenta com uma pipeta.
- Carregue um chip microfluídico de descontaminação no dispositivo microfluídico espiral. Execute um programa 3 no dispositivo microfluídico espiral clicando em executar e selecionando o programa 3 (31 min).
Nota: o programa 3 do dispositivo microfluídico espiral permite um rápido enriquecimento de CTCs em 31 min. - Continue com a etapa de limpeza do dispositivo microfluídico espiral usando o volume restante do reagente de limpeza para todos os fins no tubo de entrada.
- Descarte o tubo de entrada após a conclusão da etapa de limpeza, deixando para trás a palha de entrada.
- Descontaminação usando o agente de limpeza à base de lixívia
- Desconecte a tampa de garrafa de reagente de limpeza para todos os fins da porta diluente do dispositivo microfluídico espiral, desapertando o parafuso marrom. um gabinete de segurança microbiológica, transfira até 250 mL de agente de limpeza à base de lixívia (tabela de materiais) num novo frasco vazio (Figura 1a).
- Aparafuse a tampa de garrafa de reagente de limpeza para todos os fins e a palha ao frasco que contém o agente de limpeza à base de lixívia um gabinete de segurança microbiológico. Prenda este frasco à porta diluente do dispositivo microfluídico espiral aparafusando o parafuso castanho.
- Transfira até 15 mL de agente de limpeza à base de lixívia para um novo tubo de entrada de tubo de centrifugação de 50 mL utilizando uma pipeta serológica um gabinete de segurança microbiológico. Coloque a posição de entrada do tubo de centrifugação 50 mL. Coloque um tubo vazio na posição de saída.
- Antes de processar a corrida, verifique se a amostra está livre de bolhas excessivas e se houver algum presente, retire as bolhas, aspirando-as lentamente com uma pipeta.
- Execute o programa 3 clicando em executar e selecionando o programa 3 (31 min). Após a execução, prossiga diretamente para a etapa de limpeza usando o volume restante do agente de limpeza à base de lixívia no tubo de entrada.
- Descarte os tubos de entrada e saída.
- Enxágüe o dispositivo microfluídico espiral.
- Desconecte a tampa do frasco do agente de limpeza à base de lixívia da porta diluente do dispositivo microfluídico espiral desparafusando o parafuso marrom. um gabinete de segurança microbiológica, transfira a palha do frasco contendo o agente de limpeza à base de lixívia para a nova garrafa que contém o tampão diluente. Aparafuse o frasco ao dispositivo microfluídico espiral.
- Transfira até 15 mL de água esterilizada (tabela de materiais) para um novo tubo de entrada de tubo de centrifugação de 50 ml utilizando uma pipeta serológica um armário de segurança microbiológico. Coloque a posição de entrada do tubo de centrifugação 50 mL. Coloque um tubo vazio na posição de saída.
- Antes de processar a corrida, verifique se a amostra está livre de bolhas excessivas e se houver algum presente, retire as bolhas, aspirando-as lentamente com uma pipeta.
- Execute o programa 3 clicando em executar e selecionando o programa 3 (31 min). Após a corrida, prossiga diretamente para a etapa de limpeza usando o volume restante de água esterilizada no tubo de entrada.
- Descarte os tubos de entrada e saída.
- Desinfecção usando o reagente de limpeza para todos os fins
2. manutenção para manter o dispositivo Microfluídico espiral bactérias-livre
Nota: A manutenção de rotina deve ser feita no final do dia durante a última etapa de limpeza.
- Transfira até 7 mL de agente de limpeza à base de lixívia para o novo tubo de centrifugação de 50 mL utilizando uma pipeta serológica um armário de segurança microbiológico. Aparafuse o tubo de limpeza à base de lixívia na porta de entrada do dispositivo microfluídico espiral.
- Antes de processar o funcionamento limpo, verifique se a amostra de entrada está livre de bolhas excessivas e, se houver, retire as bolhas, aspirando-as lentamente com uma pipeta.
- Execute a limpeza no dispositivo microfluídico espiral.
3. enriquecimento pré-analítico do CTC de amostras de sangue do paciente
- Colete 7,5 ml de sangue no tubo do EDTA de K2e mantenha-se a agitação delicada para evitar o sedimentação e a coagulação da pilha. Processo dentro de 6 h.
Nota: Se o sangue é coletado em um tubo de coleta de sangue de DNA sem células contendo conservante, armazene a 4 ° c até o processamento. Assegure-se de que a amostra de sangue, o tampão de lise de RBC, e o amortecedor RBS estejam em RT antes de prosseguir com a etapa do enriquecimento. - Transfira até 7,5 ml do sangue inteiro a um tubo de entrada novo do tubo de centrifugação de 50 ml usando uma pipeta sorológicos um armário de segurança microbiológico.
- Centrifugador em 1.600 x g por 10 min em RT. colete a fração de plasma com uma pipeta sem perturbar o casaco Buffy. Substitua a fração plasmática adicionando volume diretamente equivalente de PBS até 7,5 mL.
- Adicione delicadamente o amortecedor da lise de RBC (tabela dos materiais) à amostra de sangue a um volume final de 30 ml (para um tubo do EDTA de K2) ou a 37,5 ml (para um tubo Cell-Free da coleção do sangue do ADN). Inverta suavemente o tubo de coleta de sangue 10x e incubar por 10 min em RT.
Nota: A amostra de sangue fica vermelha mais escura durante a lise de RBC. Se nenhuma mudança (de vermelho escuro e opaco) é observada após 10 min, inverta suavemente o tubo 3x e deixar de pé para outro 5 min máximo. Não deixe a amostra no tampão de lise de RBC por mais de 15 minutos porque pode comprometer a qualidade da amostra e o desempenho do ensaio. - Centrifugue a amostra de sangue lisado em 500 x g por 10 min em RT, com freios centrífugos em (ou maior velocidade de desaceleração). Use uma pipeta de Pasteur ou uma pipeta sorológicos para remover delicadamente o sobrenadante até que o volume alcangue a marca de 4-5 ml. Em seguida, use as pontas de micropipeta filtradas para remover o sobrenadante restante.
- Usando uma micropipeta P1000 com uma ponta filtrada, adicione 1,0 mL de RSB à parede do tubo de entrada do tubo de centrifugação de 50 mL. Para evitar a introdução de bolhas na mistura, Ressuspender o pellet celular gentilmente pipetando para cima e para baixo até que a amostra é homogênea.
- Adicionar um adicional de 3 mL de RSB à parede do tubo de entrada do tubo de centrifugação de 50 mL (volume total 4 mL). Evite introduzir bolhas na mistura. Misture suavemente a suspensão da célula introduzindo suavemente a pipetagem para cima e para baixo.
Nota: No caso improvável de que a pipetagem regular não é capaz de quebrar os aglomerantes de células (definido por ser visível ou bloqueando a ponta da pipeta), filtre a amostra através de um filtro de célula de 40 μm para remover quaisquer aglomerantes. Adicione 150 μL de RSB à amostra para compensar a perda de volume da filtragem. Observe que este método deve ser usado com moderação e somente quando grandes aglomerados são observados. - Antes de prosseguir para a etapa de enriquecimento, verifique se a amostra está livre de bolhas excessivas e, se houver, retire as bolhas e tome cuidado para não descartar nenhuma amostra. Se as bolhas minúsculas estão atuais, sua remoção não é exigida.
- Processe a amostra no dispositivo microfluídico espiral.
4. enriquecimento de CTCs do sangue inteiro paciente com o dispositivo Microfluídico espiral
- Carregue um novo chip microfluídico espiral. Carregue dois tubos de centrifugação vazios de 50 mL em portas de entrada e saída.
- Execute um Prime clicando em Prime no dispositivo microfluídico espiral (3 min). Remova os tubos de entrada e saída e carregue a amostra a ser processada na porta de entrada.
- Carregue um tubo cônico transparente de 15 mL na porta de saída para coletar CTCs enriquecidas. Execute o programa 3 clicando em executar e selecionando o programa 3 (31 min).
- Descarregar o tubo de saída e centrifugar a 500 x g durante 10 min (aceleração: 9; desaceleração: 5). com uma pipeta serológica de 5 ml, retire o sobrenadante parando na marca de 2 ml no tubo cônico de 15 ml. Com uma micropipeta, retire o sobrenadante parando a 100 μL de marca no tubo cônico de 15 mL. Processe a amostra enriquecida diretamente para a coloração da imunofluorescência.
5. coloração da imunofluorescência
- Enumerar em um slide com câmara com uma grade do tipo Hemocytometer o número de células por mL. Diluir a amostra enriquecida com 0,2% de solução antiligante (tabela de materiais) para uma concentração atingindo 100.000 células/100 μl por citospin.
- Umedecer o contorno da câmara de amostra usando algodão (tabela de materiais) com 50 μL de 0,2% de solução antiligação. Coloc um vidro-corrediça do polilisina na câmara da amostra e feche-o.
- Bata uma ponta com 0,2% anti-solução de ligação por pipetagem para cima e para baixo 3x. Resuspend a amostra enriquecida e transfira a solução da pilha na câmara da amostra. Centrifugador com uma centrífuga dedicada (tabela de materiais) a 400 rpm por 4 min (aceleração baixa).
- Coloc um isolador do silicone em torno da área do depósito. Deixe secar o vidro-deslize um gabinete de segurança microbiológica por 2 min.
- Prepare a solução de fixação diluindo 1 mL de paraformaldeído a 16% (PFA) com 3 mL de PBS estéril. Adicionar 100 μL de solução de fixação (4% PFA) por amostra e incubar em RT durante 10 min. Retire a solução de fixação e realize três lavas com 200 μL de PBS e incubar em RT cada por 2 min.
Atenção: Use PFA um gabinete de segurança química para evitar a inalação. - Prepare a solução de saturação diluindo o soro fetal bovino (FBS) em 5%, o receptor FC (FcR) que bloqueia o reagente em 5%, e a albumina de soro bovina (BSA) em 1% em PBS estéril (tabela de materiais). Adicionar 100 μL de solução de saturação por amostra e incubar por 30 min em RT. remover a solução de saturação.
- Adicionar 100 μL de solução de anticorpos por amostra (CD45 anticorpo 1/20; PanCK anticorpo 1/500; PD-L1 anticorpo 1/200; Solução de saturação QSP 100 μL) (tabela de materiais). Coloc o vidro-corrediça do polilisina em um prato de Petri de 100 milímetros x de 15 milímetros. Umedeça um papel absorvente com 2 mL de água estéril e feche o prato de Petri com a tampa. Coloc em 4 ° c durante a noite e proteja da luz.
- Retire a mistura de anticorpos e realize 3 lavagens com 200 μL de PBS incubando cada lavagem durante 2 min. Deixe a amostra secar por 5 min e proteja-a da luz. Coloque 10 μL de solução de montagem (tabela de materiais) na área de deposição e cubra com uma lamínula de microscópio sem fazer uma bolha. Sele o lamela com lustrador de prego.
6. aquisição de imagens imunofluorescentes com microscópio fluorescente reto e software associado
- Use um microscópio fluorescente reto com uma plataforma motorizada X/Y. Use um objetivo 20x para tirar imagens RGB TIFF de 8 bits em quatro canais correspondentes à tintura de DNA (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), corante PanCK (isotiocianato de fluoresceina [FITC]), corante PD-L1 (CY3) e corante CD45 (CY5). Gire sobre a lâmpada de mercúrio 15 minutos antes de usar, e adapte o microscópio e o software associado à parte aérea semiautomatizada.
- Coloque a corrediça de vidro na plataforma.
- No menu de aquisição, definir os quatro canais e configurar o tempo de exposição (DAPI: 15 ms, FITC [PanCK]: 500 MS; CY3 [PD-L1]: 800 MS; CY5 [CD45]: 1.000 MS). Defina as telhas para digitalizar. Clique em mosaicos. No experimento avançado, defina a área a ser digitalizá-lo.
- Ajuste o foco na tela. Clique em Iniciar experimento.
- Exporte arquivos TIF de cada canal e nomeie especificamente o arquivo de imagem com esta informação: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles. tif (por exemplo, Sample1_TR1_c1m01). Tintura de nome como segue: o canal DAPI é C1, canal FITC é C2, CY3 canal é C3, e CY5 canal é C4.
7. análise de imagens imunofluorescentes com software de análise de imagem
- Transfira e instale o software livre da análise da imagem do Web site do Instituto largo. Aceite todo o padrão durante a instalação. Abra o software de análise de imagem e clique em arquivo | Pipeline do arquivo | Analysis_4channels_CTC. cppipe.
Nota: O pipeline converte imagens de cores RGB em tons de cinza, remove artefatos Suavizando imagens com um filtro mediano, identifica núcleos e citoplasma, quantifica intensidades de fluorescência de cada canal e as exporta para um arquivo Excel. - Solte os arquivos na lista arquivo. Atualize os metadados para agrupar os arquivos por blocos.
Nota: Todas as instruções para agrupar imagens são especificadas no software. Os arquivos de nome apareceram no módulo Namesandtypes e os arquivos são agrupados de acordo com o número do bloco e do canal por amostras. - Clique em exibir configurações de saída e especifique uma saída padrão correta. Clique em analisar imagens. Abra o arquivo de planilha correspondente aos parâmetros measure_intensity .
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Representative Results
O primeiro pré-requisito foi a obtenção de coleções não contaminadas (sem agente infeccioso) de CTCs para cultura tecidual e evitar o fundo IF gerado. O protocolo de descontaminação permitiu a limpeza de todos os tubos e bombas, e resultou na coleta de CTCs com uma boa taxa de recuperação sem contaminação bacteriana. As amostras enriquecidas foram comparadas sem e com o fluxo de trabalho do protocolo de descontaminação do dispositivo microfluídico espiral. Para validar o protocolo de descontaminação, utilizou-se a linha celular A549 na ausência de sangue total e enriquecida diretamente com o dispositivo microfluídico espiral. Sem o protocolo de descontaminação otimizado, observou-se alta contaminação bacteriana na cultura tecidual de linhagem celular A549 enriquecida após apenas 24 h, o que causou morte e alterações citomorfológicas em células eucarióticas (Figura 1B).
Em contraste, após o protocolo de limpeza, as células A549 vivas foram obtidas crescendo em cultura 2D após 10 h de cultura tecidual e remoção de meios e em condições 3D (Figura 1B), bem como amostras de pacientes (Figura 1C). O CTC potencial é identificado com uma cruz vermelha (Figura 1C).
A Figura 2 recapitula o fluxo de trabalho completo para a imunofluorescência fenotipagem de CTCs enriquecidos a partir do sangue total. É compor de quatro etapas principais: amostragem do sangue inteiro, enriquecimento de CTC, ensaio da imunofluorescência (IF), e análise da imagem usando o software. Anteriormente, a taxa de recuperação do dispositivo microfluídico espiral foi abordada14. Usando fluorescentes imitando CTCs (mCTC), esta taxa de recuperação foi estabelecida em 1,3 CTCs/mL de sangue total14.
O presente trabalho teve como foco a configuração das condições ideais para a análise de IF de CTCs enriquecidas e visualização a jusante (Figura 2). Em primeiro lugar, para testar a especificidade do anticorpo PD-L1, foram utilizadas duas linhagens celulares: (1) linha celular PC3 alta-positiva-PD-L1 e (2) SW620 linha celular baixo-positivo-PD-L1. As células foram então enriquecidas com o dispositivo microfluídico espiral e analisadas pelo IF. Todas as pilhas foram manchadas com o marcador do anti-PanCK do tumor, marcador CD45 do glóbulo branco, anti-PD-L1 (útil no cancro de pulmão), e DAPI (tintura nuclear). Os glóbulos brancos foram identificados como positivos para DAPI e CD45, enquanto as células cancerosas foram identificadas como positivas para DAPI e PanCK e negativas para CD45. A linhagem de células PC3 alta-PD-L1-positiva foi positivamente corada para PD-L1, enquanto uma menor expressão de PD-L1 foi detectada na linha celular SW620 Low-PD-L1-negativa.
Em seguida, foram comparados os seguintes: o (i) ensaio de coloração líquido IF, (II) coloração de CTCs depositados diretamente em lâminas revestidas com polylysine, e (III) se a coloração de CTCs após citospin em lâminas revestidas com polylysine. Observou-se claramente que a taxa de recuperação dos CTCs dependia do tipo de protocolo utilizado (Figura 3a). No ensaio de coloração líquido IF, a taxa de recuperação foi de apenas 10% para o número de mCTC cravado foi o mais baixo. Esta baixa taxa da recuperação apresenta uma edição para a maioria de pacientes com NSCLC metastático, porque limita significativamente a habilidade destes testes de isolar os poucos CTCs e de fornecer a informação fenotípica. A segunda e terceira seções descritas (deposição direta de mCTC ou CTC em lâminas revestidas com polylysine sem e com cytopsin) sistematicamente apresentaram taxas de recuperação superiores A 60% (Figura 3A).
Figura 3 B mostra imagens representativas destes ensaios If utilizando amostras de sangue total do mesmo doente, quer utilizando o ensaio de coloração líquido if ou ensaio de coloração If em lâminas revestidas com polylysine com citospin. A enumeração dos núcleos foi claramente diferente entre os dois ensaios (Figura 3B). A coloração nuclear de DAPI proporcionou a enumeração das células totais na amostra, e a coloração do biomarcador permitiu destacar o verde das células PanCK positivas, laranja nas células PD-L1-positivas e vermelho nas células brancas residuais CD45 (Figura 3 B).
Em seguida, para diferenciar citologicamente os glóbulos brancos das células tumorais, a forma do núcleo tem de ser visualizada, uma vez que é característico do tipo de célula. Figura 3 C demonstra os contornos dos núcleos que estão borrados e a morfologia que é incomun na ausência da etapa do Cytospin. O protocolo otimizado incluiu, assim, a citofiação de CTCs enriquecidas em lâminas revestidas de polylysine seguidas de fixação de paraformaldeído a 4% (PFA), para preservar as lâminas antes da coloração de IF. Este protocolo otimizado teve taxas de recuperação semelhantes à deposição de mCTC diretamente em lâminas revestidas com polylysine (Figura 3A), mesmo quando poucas células foram adicionadas. Uma vez que este passo adicional permite a preservação da morfologia nuclear (Figura 3C), os granulócitos foram identificados com seus núcleos multilobulados, bem como células tumorais (rotuladas com uma cruz vermelha no núcleo) com seu nuclear anormalidades, padrões de malignidade e tamanho maior em comparação com os glóbulos brancos.
Após a otimização do protocolo IF, uma prova de conceito foi conduzida usando sangue total de pacientes metastáticos. As amostras foram coletadas prospectivamente no âmbito da coorte de rotina CIRCAN com base no hospital universitário de Lyon. A coleta de sangue foi realizada geralmente quando os médicos observaram a primeira indicação de progressão tumoral. Todos os casos do tumor foram confirmados histològica ou citologicamente em espécimes da biópsia de FFPE durante o diagnóstico inicial. Aqui, as análises de CTCs na progressão foram executadas por investigadores que não tiveram o acesso ou o conhecimento prévio de dados clínicos. As considerações pre-analíticas detalhadas foram publicadas previamente15.
Na Figura 4, tabela 1e tabela 2, diferentes achados são apresentados a partir de amostras do paciente. O perfil CD45 (+), PanCK (-), PD-L1 (-) representa as células imunes. A contagem residual de glóbulos brancos mostrou-se fortemente variável e dependente de toda a amostra de sangue. A escala nesta coorte piloto pequena era 648-11000 pilhas brancas de CD45 (+) (Figura 5A). Conseqüentemente, imediatamente depois do enriquecimento de CTC, uma enumeração das pilhas coletadas foi incluída para ajustar a densidade celular na área do Cytospin em uma densidade de 100.000 pilhas/Cytospin (veja a seção 6). Isto permitiu o desempenho de diversos rotineiros por o paciente e a optimização da observação microscópica para a enumeração manual e o uso do encanamento do software da análise de imagem.
Na Figura 4A-C, tabela 1e tabela 2, casos típicos são relatados em que contagens residuais de glóbulos brancos foram altamente diferentes:
(i) o primeiro perfil é o CD45 (-), PanCK (+) e PD-L1 (+) apresentados na Figura 4a . Muitas vezes, o tamanho das células é superior a 13 μm de diâmetro e a morfologia do núcleo é irregular, representando um padrão citomorfológico de malignidade. Esta população é provavelmente compor do CTC.
(II) o segundo perfil é o CD45 (-), PanCK (-), e PD-L1 (+). Como já relatado, nem todos os CTCs expressam o biomarcador PanCK (Figura 4a).
(III) o terceiro perfil é o CD45 (-), PanCK (+) e PD-L1 (-). Como já relatado, nem todos os CTCs expressam o biomarcador PD-L1.
(IV) o quarto perfil é o CD45 (+), PanCK (+) e PD-L1 (+) apresentados na Figura 4B. Representa as pilhas imunes ativadas atípicas no sangue inteiro paciente. Esta população tem sido descrita em várias publicações16,17,18 e representa aproximadamente 5% das células totais após o enriquecimento. A presença desta população pode aumentar a taxa de CTCs falsos positivos em uma amostra se a intensidade do sinal CD45 for muito baixa e a morfologia do núcleo não for bem conservada. Isto destaca fortemente a necessidade para executar a mancha tumoral complementar do biomarcador, tal como Vimentin e/ou epcam neste ensaio da imunofluorescência.
(v) finalmente, o último perfil inclui as células sem rótulo CD45 (-), PanCK (-) e PD-L1 (-), destacadas na Figura 4C. O núcleo desta população muitas vezes mostra padrões citomorfológicos de malignidade, e o tamanho é de mais de 13 μm de diâmetro. A porcentagem dessas células nas amostras é altamente variável de acordo com o sangue total do paciente. Isso destaca a necessidade de se utilizar biomarcadores tumorais complementares para confirmar o padrão tumoral desta subpopulação celular.
Na tabela 1 e na tabela 2, a contagem de células de 16 amostras foi relatada de pacientes metastáticos avançados do NSCLC. As células foram classificadas de acordo com a expressão dos biomarcadores. Observou-se alta variabilidade nas subpopulações obtidas. Como já relatado em estudos independentes, os perfis de CD45 (-), PanCK (+) e PD-L1 (+) foram encontrados na maioria das amostras. No entanto, como a população de CTC é altamente heterogênea, as amostras de pacientes também continham CD45 (-), PanCK (-), e PD-L1 (+) subpopulações, as subpopulações CD45 (-), PanCK (+) e PD-L1 (-) e células não rotuladas CD45 (-), PanCK (-) e PD-L1 (-) subpopulações. O nível de glóbulos brancos residuais foi altamente variável entre as amostras analisadas.
Para facilitar a enumeração de células, um pipeline piloto foi configurado usando o software de análise de imagem para uma análise automatizada das imagens de imunofluorescência. O fluxo de trabalho é descrito na Figura 5. Neste caso, é importante adquirir imagens de imunofluorescência de alta qualidade em termos de contraste e intensidade de fluorescência. Dependendo da capacidade de cálculo do cluster do hardware, o pipeline de análise de imagem pode ser aplicado à imagem completa mesclada do citospin ou em uma área representativa do citospin.
Aqui, baseado no microscópio, uma varredura semiautomatizada do Cytospin (X/Y; o foco de Z não é incluído) área gerada 150-200 imagens fundidas. Essas imagens podem ser mescladas juntas e analisadas diretamente usando o pipeline de análise de imagem. No entanto, esse procedimento é o tempo e o cálculo do cluster que consome recursos, uma limitação importante para seu uso rotineiro em laboratórios. Portanto, com base na experiência prévia no campo da hematologia celular, optou-se por analisar áreas representativas de cada amostra após verificação um microscópio que a distribuição das células foi homogênea em toda a área do citospin. Então, 25% da área total do Cytospin (em torno de 40 telhas) foram escaneadas com o microscópio da florescência para gerar 40 x 4 imagens independentes. O arquivo mesclado foi dividido por canais, e os arquivos de imagem foram gerados automaticamente com o software do microscópio (ver seção 7; Figura 5 A). esses arquivos foram importados em um pipeline de análise de imagem para análise de acordo com os parâmetros descritos (ver seção 8; Figura 5 A).
Na Figura 5B, identificamos manualmente uma imagem representativa exibindo quatro CTCs [CD45 (-), panck (+) e PD-L1 (+)] entre 77 células imunes [CD45 (+), panck (-) e PD-L1 (-)]. Figura 5 B ilustra como o software de análise de imagem identificou e enumerou o número de células com base na coloração DAPI. Ele também ilustra como o software de análise de imagem contou os objetos secundários. Finalmente, as intensidades de fluorescência para cada canal fluorescente foram relatadas para todos os objetos relatados nas imagens.
O plano de fundo foi calculado e representado pelas células negativas presentes na amostra. Por exemplo, as células imunes não ativadas têm baixa intensidade de fluorescência e permitiram a medição do fundo da coloração PanCK e PD-L1. O sinal fluorescente foi considerado positivo se a intensidade da fluorescência excedesse a do fundo por duas vezes (com base na análise de quatro amostras independentes do paciente). Em relação à coloração CD45, como o nível de expressão de CD45 é altamente variável nas subpopulações de glóbulos brancos, o limiar de positividade foi definido o mais baixo possível. Baseou-se na análise de imagens de 10 sangue inteiro saudável manchada com o anticorpo CD45. A análise piloto (n = 4) mostrou concordância entre Enumeração manual e enumeração de softwares de análise de imagem (tabela 2). Cada célula do citospin é identificada pelo software de análise de imagem e permite que os biólogos rastreem a célula e confirmem manualmente os resultados, se necessário.
Figura 1 : Visão geral do fluxo de trabalho para a descontaminação dispositivo microfluídico espiral instrumento. (A) três etapas principais incluídas no processo de descontaminação (ver protocolo), ilustrando a localização das entradas e saídas do instrumento. (B) imagens representativas do enriquecimento da linha celular A549 antes e após a descontaminação do instrumento. O impacto da presença de um agente infeccioso na viabilidade e morfologia das células coletadas é mostrado. Na presença de bactérias, a morfologia celular e a viabilidade foram modificadas. Barra de escala = 20 μm. (C) cultura de células 3D de amostras de pacientes enriquecidas de câncer de pulmão, próstata e mama. A cruz vermelha corresponde a células atípicas. Barra de escala = 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Vista geral do fluxo de trabalho da análise da imunofluorescência da amostragem do sangue inteiro à análise das imagens da fluorescência. As etapas principais são mostradas como segue: coleção do sangue para o sangue inteiro, coleção de CTC com dispositivo microfluídicos espiral, ensaio da imunofluorescência, e software da análise da imagem. A escolha do biomarcador foi impulsionada pela melhor identificação das várias populações de células observáveis na lâmina de citospin (CD45 para células imunes, PanCK e PD-L1 para células cancerosas pulmonares). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Taxa de recuperação de três protocolos de coloração independentes. (A) comparação da taxa de recuperação de mctcs da mancha líquida, mancha direta da pilha depositada em corrediças polylysine-revestidas, e mancha da pilha após o Cytospin em corrediças polylysine-revestidas. (B) imagens representativas de amostras de pacientes processadas por protocolo líquido If e protocolo de imunocoloração direto com o citospinstep. As células foram coradas com anticorpo monoclonal CD45 (clone HI30) Alexa fluor 647; Anticorpo monoclonal PanCK (clone AE1/AE3) Alexa fluor 488; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Barra de escala = 20 μm. (C) imagens representativas da coloração DAPI do enriquecimento celular com e sem a etapa de citorotação. A morfologia e o tamanho dos núcleos foram mostrados usando a mancha de DAPI. A Cruz Vermelha destaca as células com anormalidades no núcleo na imagem da mão direita. Na imagem à esquerda, a imagem é difusa, já que as células não estão no mesmo nível (eixos x, y e z). Barra de escala = 10 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Identificação de perfis celulares. (A) imagens representativas de doentes com diferentes perfis de CTC. Os canais de fluorescência são apresentados separadamente. As imagens mescladas são mostradas à esquerda. Eles são corados com CD45 anticorpo monoclonal (clone HI30) Alexa fluor 647; Anticorpo monoclonal PanCK (clone AE1/AE3) Alexa fluor 488; PDL-1 anticorpo monoclonal (clone 29E2A3) phycoerythrin; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI); setas apontam para células atípicas. B) imagens representativas da imunomarcação de duas amostras de doentes com perfis de glóbulos brancos atípicos. As células foram coradas com anticorpo monoclonal CD45 (clone HI30) Alexa fluor 647; Anticorpo monoclonal PanCK (clone AE1/AE3) Alexa fluor 488; PDL-1 anticorpo monoclonal (clone 29E2A3) phycoerythrin; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). A imagem destaca a presença de células imunes coradas com CD45 (+), PanCK (+) e PD-L1 (+). (C) a imagem destaca a presença de células não rotuladas (CD45 (-), panck (-) e PD-L1 (-). Barra de escala = 10 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Visão geral da análise das imagens fluorescentes. (A) as etapas principais são descritas: varredura da microscopia, a separação da canaleta de acordo com a fluorescência, e a importação dos arquivos no software da análise de imagem. (B) Descrição das três etapas diferentes para o fluxo de trabalho do software de análise de imagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Enumeração manual do enriquecimento celular do paciente. Enumeração de células com base na coloração DAPI. Enumeração de outros objetos com base na coloração FITC, PE e CY5.
Tabela 2: Software de análise de imagem enumeração do enriquecimento de células do paciente . Enumeração de células com base na coloração DAPI. Enumeração de outros objetos com base na coloração FITC, PE e CY5. Comparação de contagem manual e enumeração de software de análise de imagem.
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Discussion
Dois pontos principais foram levantados no presente estudo, o primeiro com relação ao desempenho do fluxo de trabalho para sua transferência para aplicações clínicas, e o segundo referente à diminuição da subjetividade para a análise das imagens de fluorescência obtidas.
Um fluxo de trabalho performant e aperfeiçoado para A enumeração CTC foi determinado inicialmente usando o teste customizável do If após o enriquecimento da pilha através de um sistema microfluídicos Label-Free de CTC (dispositivo microfluídicos espiral). Usando este fluxo de trabalho, um estudo piloto confirmou que todas as amostras de pacientes metastáticos de NSCLC continham células atípicas, que eram todas CD45 (-). Podem alternativamente ser etiquetados com os biomarkers de PanCK e/ou de PD-L1; no entanto, eles também podem ser completamente negativos para todos os biomarcadores testados [CD45 (-), PanCK (-) e PD-L1 (-), como observado na amostra S19 (tabela 2)]. Isto destaca fortemente a necessidade de biomarcadores adicionais para as subpopulações de CTC de fenotipagem. Conseqüentemente, propôs-se adicionar biomarcadores epithelial-mesenchymal tais como o epcam, o Vimentin, e o N-cadherin; marcadores de células-tronco cancerosas, incluindo CD44 e CD133; e marcadores específicos do tumor que incluem TTF1 para o adenocarcinoma do pulmão.
No estudo piloto, a escala da pilha atípica era [40; > 400] de 3,5 mL do sangue inteiro. Para 80% das amostras do paciente, a contagem de células atípicas foi mais de 50. Na verdade, na citológica19,20,21 amostras de endo brônquica ultra Sonic Guide trans agulha brônquica aspiração ou punções trans-torácicas guiadas por TC, a análise PD-L1 é adequada na maioria das amostras, mas uma o limiar de ≥ 100 pilhas do tumor é admitido geralmente para produzir uma interpretação estatística e clínica do valor. Entretanto, no caso particular de CTCs do sangue, deve-se notar que a questão da heterogeneidade espacial do tumor é ignorada pelo contraste às amostras de tumor pequenas no local.
O segundo ponto foi o de evitar o impacto do manipulador na análise de imagens de imunofluorescência. O software da análise da imagem de imagens fluorescentes foi ajustado assim para padronizar a enumeração da pilha e fornecer dados estatísticos para estas amostras. Esse processo automatizado destacou a necessidade de clusters de cálculo poderosos para a análise de todas as células contidas na mesma amostra. Além disso, a qualidade da coloração IF tem que estar no mesmo plano (para evitar o uso de sistemas confocais), e a densidade das células no citospin deve ser calibrada para permitir que o software de análise de imagem reconheça todas as células separadamente no slide. Por fim, os resultados não foram validados quanto aos desfechos clínicos em uma coorte de pacientes, mas esse ponto deve ser abordado em outro estudo dedicado.
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Disclosures
Jean-Philippe Aurel e Kathryn Weiqi li são funcionários da empresa de Biolídicos que produz instrumentos utilizados neste artigo. Os outros autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios de pesquisa da AstraZeneca (Londres, Reino Unido), Biolidicos (Singapura) e da Ligue contre le Cancer (Saone et Loire, França). Os autores agradecem à AstraZeneca e às empresas de Biolidicos pelo seu apoio financeiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4 °C |
| BD Facs Clean – 5 L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4 °C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4 °C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4 °C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4 °C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4 °C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone - 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4 °C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4 °C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4 °C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4 °C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4 °C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4 °C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
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