Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Integreret celle manipulation platform kombineret med enkelt-sonde for massespektrometri analyse af narkotika og metabolitter i enkelt suspension celler

Published: June 21, 2019 doi: 10.3791/59875
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma

Summary

En integreret celle manipulerings platform er udviklet til brug sammen med en enkelt-Probe massespektrometri setup til on-line analyse af individuelle affjedrings celler under omgivende forhold.

Abstract

Enkelt celle massespektrometri (SCMS) muliggør følsom detektion og nøjagtig analyse af brede intervaller af cellulære arter på individuelt celleniveau. Enkelt-sonden, en mikroskala prøveudtagning og ioniserings anordning, kan kobles med et massespektrometer til on-line, hurtig SCMS analyse af cellulære bestanddele under omgivende forhold. Tidligere, enkelt-sonde SCMS teknik blev primært brugt til at måle celler immobiliseret på et substrat, der begrænser de typer af celler til undersøgelser. I den aktuelle undersøgelse er single-Probe SCMS-teknologien blevet integreret med et celle manipulerende system, der typisk anvendes til in vitro-befrugtning. Denne integrerede celle manipulerings-og analyseplatform bruger en celle Valgs sonde til at indfange identificerede individuelle flydende celler og overføre cellerne til enkelt probespidsen til mikroskala lysis efterfulgt af umiddelbar massespektrometri analyse. Denne opsamling og overførsel proces fjerner cellerne fra den omgivende løsning før analyse, minimerer indførelsen af matrix molekyler i massespektrometri analyse. Denne integrerede opsætning er i stand til SCMS analyse af målrettede patient-isolerede celler til stede i kropsvæsker prøver (f. eks urin, blod, spyt, osv.), giver mulighed for potentielle anvendelser af SCMS analyse til humanmedicin og sygdoms biologi.

Introduction

Den menneskelige biologi, især sygdoms biologi, bliver i stigende grad opfattet som et resultat af aktiviteter på de enkelte cellers niveau, men de traditionelle analytiske metoder, såsom Liquid kromatografi massespektrometri (LCMS), anvendes generelt til at analysere prøver fremstillet af populationer af celler, hvorimod de erhvervede molekylære oplysninger ikke præcist kan repræsentere de kemiske processer på det individuelle celleniveau. Disse standard, traditionelle metoder er ude af stand til at skelne virkningerne af cellulære heterogenitet på en analytisk måling, og processen med at ødelægge og blande cellerne til at forberede lysatet potentielt fører til ændring eller tab af cellulære komponenter1,2. Disse begrænsninger af de traditionelle metoder er især vigtige i analysen af patient celler, hvor de opnåede prøver kan indeholde en kompleks blanding af mange forskellige celletyper. For at afhjælpe disse mangler udvikles og anvendes der i stigende grad enkelt celle molekylære metoder, herunder enkelt celle massespektrometri (SCMS)-metoder, til bioanalyse, især af cellulære metabolitter og lav molekylvægt biomolekyler3,4.

De første SCMS teknikker udviklet brugt vakuum-baserede teknikker til at udføre analyserne under ikke-omgivende betingelser2,5,6,7,8,9, 10,11. Ikke-omgivende SCMS teknikker er i stand til at analysere cellulære lipider og metabolitter, men kræver prøve forbehandling under kunstige betingelser, og derfor er ikke egnet til real-time analyse. Prøve forberedelsesprocessen for ikke-omgivende analyse omfatter tilsætning af matrixkomponenter, og dette præparat kan ændre cellulære komponenter fra deres naturlige miljø12. Derfor anvendes omgivende massespektrometri (MS) teknikker, som ikke kræver et vakuum til prøvetagnings miljøet, til at analysere celler i et nærmiljø. Ikke at have et vakuum miljø giver mulighed for alsidighed i den eksperimentelle design; kameraer kan tilføjes for at overvåge den cellulære proces og blødere ioniserings teknikker kan kombineres med adskillelse teknikker til at modtage bedre information fra hvert enkelt celle eksperiment4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 af41,42.

Single-Probe SCMS-metoden er en omgivende teknik, der analyserer levende, pattedyrs Cancer cellelinjer i et nær-Native miljø21,43,44,45,46. Desuden har enkelt Probe-anordningen været anvendt til andre massespektrometri-applikationer, herunder analyse af ekstracellulære molekyler i flercellede sfæroider og MS Imaging af væv47,48,49 ,50,51,52. Men da celle immobilisering på substrater er nødvendig for denne metode, kan affjedrings celler ikke analyseres direkte ved hjælp af denne teknik3,53. Derfor kunne SCMS-systemet med enkelt sonde ikke anvendes direkte til at udtage prøver af ikke-klæbende enkeltceller, såsom ikke-vedhæng ende cellelinjer eller ophængs celler isoleret fra patientens blod eller andre kropsvæsker54. I dette arbejde, en integreret celle manipulation platform (ICMP) er kombineret med enkelt-Probe SCMS teknik til at analysere levende, suspension celler on-line med minimal Prøveforberedelse (figur 1)46. ICMP består af en inverteret mikroskop til at overvåge cellevalg, en glas celle-selektions sonde, en mikroinjektor til at indfange individuelle flydende celler, en opvarmet plade til at opretholde cellulære temperatur, to celle manipulation systemer til at styre rumlige bevægelser af både glas celle-selektions sonden og enkelt sonde, og et digitalt mikroskop for at observere celle overførsel fra celle Valgs sonden til enkelt sondespidsen. Fremstillingen af Single-sonden er beskrevet i tidligere publikationer og vil ikke blive behandlet her21,48. ICMP/single-Probe systemet er koblet til et massespektrometer med høj opløsning. Denne integrerede opsætning giver mulighed for prøvetagning af identificerede enkeltceller fra komplekse biologiske prøver med minimal effekt fra matrix molekyler.

Protocol

1. glas celle-selektions sonde fabrikation

  1. Konverter Enkeltløbede glas slanger til en tilspidset sonde med en skarp spids.
    1. Anbring et glasrør med enkelt boring (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) i klemmerne på en lodret pipette holder, centrere glasset med hensyn til varme spiralen og stram for at fastgøre røret på plads. Varme spolen består af en 18-gauge nikkel-chrom modstand wire (~ 60 mm i længden) rullet rundt om en metalstang (diameter = 3,90 mm) 2,5 gange.
    2. Indstil glas slangen med temperatur program 19,5 (producentens enhed). Denne parameter kan ændres for et bestemt instrument.
    3. Sæt magnet stemplet på 4 (producentens enhed). Denne parameter kan ændres for et bestemt instrument.
    4. Udløser magnetventilen for at trække i glas slangen. Dette trin opretter to sonder sammensmeltet ved spidsen.
    5. Brug pincet til at klippe ~ 1 mm væk fra spidsen af hver sonde, hvilket skaber en åbning på ~ 10 μm i diameter ved sondespidsen.
  2. Bøj glas sonden for nem kobling til ICMP/single-Probe SCMS opsætningen.
    1. Sæt en trukket glas sonde ind i microforge, positionering spidsen ~ 3 mm over platin varmeledning.
    2. Drej varmen på platin ledningen til 30% af den maksimale temperatur.
    3. Bøj sonden ~ 45 ° fra den oprindelige position (figur 2).

2. integreret celle manipulation platform samling

  1. Anbring det inverterede mikroskop, mikroinjektor og to celle manipulerings systemer på et motoriseret bord for nem kobling med massespektrometer.
    1. Ændre en af celle manipulation systemer til at rumme en enkelt-sonde ved at udskifte enden med en arm klemme.
    2. Brug en plastik sprøjte med en nål til at fylde mikroinjektoren med mineralolie. Undgå bobler i slangen, da dette vil påvirke sugning.
    3. Udskift det inverterede mikroskop med den opvarmede plade. Indstil den opvarmede plade ved 37 °C før analyse.
  2. Indstil enheden til valg af glas celle.
    1. Sæt glas celle markerings sonden inde i mikroinjektoren i metal holderen ved at placere den lange (ikke-bøjede) side i kapillar holderen og stramme skruen for at fastgøre sonden på plads. Anbring sondens spids vinkel parallelt med den opvarmede plade.
      Forsigtig: glas sonden er meget skarp og skrøbelig, og den bryder let. Beskyt dine øjne, og vær ekstra forsigtig, når du indsætter sonden i mikroinjektoren.
    2. Fastgør metal holderen til mikroinjektoren til celle manipulerings systemet. Anbring probespidsen nær midten af det inverterede mikroskop-lys.

3. Opret et udvidet ionoverførings rør til massespektrometer indløbet

  1. Brug en metal skærer til at klippe et stykke rustfrit stål slange (OD: 0,0625 (1/16) i, ID: 0,021 i) ~ 250 mm i længden.
  2. Foranstaltning 135 mm fra enden og placere en metal vildt, så ~ 135 mm vil blive udsat for atmosfæren og ~ 115 mm vil være inde i massespektrometer. Fastgør vildtlevende med to skruenøgler for at stramme den.

4. par ICMP med en enkelt sonde setup

  1. Fastgør glas sliden, der indeholder enkelt-sonden, i armklemmen i celle manipulerings systemet.
    Bemærk: single-sonder er fremstillet i henhold til en tidligere offentliggjort protokol48 med to mindre ændringer i den aktuelle undersøgelse: Nano-ESI-senderen er lavet længere for nem kobling til massespektrometer, og enkelt-probes er limet til glasset side på højre side for at undgå interferens med den rumlige bevægelse af glas celle markerings anordningen (figur 2).
  2. Tilslut den opløsningsmiddel-giver kapillar til en ledende Union ved at placere kapillar i ærmet (1/16 x .005 in) af plastik ferrule og finger-stramning montering.
    1. Tilslut den anden side af den ledende fagforening til en kapillar (ID: 40 μm, OD: 150 μm), som er forbundet til en sprøjte, der indeholder prøveudtagnings væsken, ved at placere kapillar i ærmet (1/32 x .007 in) og stramme monteringen. Der anvendes acetonitril med 0,1% myresyre som prøve opløsningsmiddel i disse eksperimenter.
      Bemærk: prøve opløsningsmidlet er fleksibelt, men det bør primært indeholde acetonitril (eller acetonitril med myresyre for bedre ionisering) til en hurtig mikroskala-celle lysis.
    2. Fastgør sprøjten i sprøjtepumpen på massespektrometer.
    3. Anbring Ionisation spændings ledningen på en kobberledning, der er fastgjort til den ledende fagforening.
  3. Nano-ESI-emitter ~ 1 mm til åbningen af det forlængede ionoverførings rør.
    1. Brug celle manipulerings systemet til at styre enkelt sondens rumlige bevægelser, og Anbring Nano-ESI-emitter centralt foran den forlængede ionoverførings slange.

5. forberedelse af prøveudtagning med suspenderede celler

  1. Dagen før analyse (~ 18-24 h), frø ud celler til afprøvning i en cellekultur kolbe (T25). K562 humane myeloid leukæmiceller bruges som modeller i dette studie.
    1. Varme 1x fosfat bufferet saltvand (PBS) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium suppleret med 10% syntetisk føtale kvægserum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 °C i 30 min.
    2. Frø ~ 1 x 106 celler i et samlet volumen på 10 ml ved at kombinere celler med varmt medium. Brug normalt en 10 mL pipette til at placere 8 mL RPMI-medium i en celle dyrknings kolbe. Brug derefter en 2 mL pipette til at sætte 2 mL konfluent K562 celler mediet til ~ 1 x 106 celler.
    3. Cellerne inkurueres ved 37 °C og 5% CO2 indtil analyse.
  2. Forbered celler til analyse.
    1. Der afpipetteres celler fra celle dyrknings kolben til et 15 mL centrifugeglas.
    2. Drej cellerne ned ved 400 x g og 37 °c i 5 min. og kassér supernatanten.
    3. Gensuspension af celler i 4 mL RPMI-medium indeholdende lægemiddelstoffet ved den ønskede behandlings koncentration.
      Bemærk: ved analyse af kontrol celler skal cellerne resuspenderes i 4 mL RPMI-medium og springe til trin 6.
    4. Cellerne inkurueres i varigheden af behandlingstiden ved 37 °C og 5% CO2.
    5. Drej cellerne ned ved 400 x g og 37 °c i 5 min. Aspirer supernatanten.
    6. Cellerne resuspenderes i 10 mL PBS og centrifugeres ved 400 x g og 37 °c i 5 min. Efter centrifugering kasseres supernatanten. Gentag dette trin 3 gange for at minimere påvisning af lægemiddel fra ekstracellulære bestanddele.
    7. Resuspender cellerne i 4 mL PBS til analyse.

6. Udfør SCMS-målinger ved hjælp af ICMP/single-sonde setup

  1. Tilpas parametrene for massespektrometer for eksperimentet.
    1. Vælg Definer scanningunder overskriften scanningstilstand i instrument softwaren. Brug en opløsning på 60.000 m/∆ m ved m/z 400, 1 mikroscanning, 100 MS maksimal indsprøjtningstidspunkt og automatisk forstærkning (AGC) på. Et masse område (m/z) af 100-1000 blev udnyttet til forsøgene. Parametrene kan ændres ud fra instrument modellen.
    2. Under sprøjtepumpeskal du vælge en strømningshastighed på 150 NL/min. strømningshastigheden skal optimeres for hvert eksperiment.
    3. Vælg NSI source og anvende en spænding på ~ 4,5 kV. Denne parameter skal også optimeres for hvert eksperiment.
  2. Tænd for det inverterede mikroskop (med 40x forstørrelse valgt for både toppladen og bund linsen) og Tilslut den til USB-porten på en bærbar computer for at optage live-video-feeds. Tænd for den opvarmede plade og sæt den til 37 °C.
  3. Gå til fanen Hent data på computeren, og vælg kontinuerligt under Hent tid.
  4. Forbered prøven til analyse.
    1. Der afpipetteres 2-3 mL prøve i låget på en lille Petri skål (35 mm x 12 mm).
    2. 6.4.2 Anbring prøven i midten af lyset fra det inverterede mikroskop oven på den opvarmede plade.
  5. Forbered glas celle-selektions sonden til analyse. Brug celle manipulerings systemet til at flytte sonden, så spidsen er fokuseret under det inverterede mikroskop i samme plan som cellerne.
  6. Vælg en enkelt celle til analyse.
    1. Brug celle manipulerings systemet til at flytte celle markerings sondespidsen til en målcelle. Denne proces overvåges ved hjælp af det inverterede mikroskop.
      Bemærk: Hvis spidsen af celle Valgs sonden ikke kan koncentreres i samme plan som cellerne, er det muligt, at den bøjede del af sonden ikke er korrekt vinklet. Juster placeringen af celle markerings sonden, indtil begge sonde spidser kan fokuseres sammen med celler under mikroskopet.
    2. Drej forsigtigt håndtaget på mikroinjektoren for at justere positionen af mineralolien inde i slangen. En blid sugning leveres af mikroinjektoren for at sikre den målrettede celle til celle Valgs sondespidsen.
      Bemærk: Hvis cellen ikke kan optages af celle Valgs sonden gennem sugekraften, skal du kontrollere celle Valgs sonden for at sikre, at den er fuldt indsat i kapillar holderen. Desuden inspicere mineralolie niveauer i mikroinjektoren og slanger, og udvise luft, hvis der er nogen.
    3. Brug celle manipulerings systemet til at flytte cellen ved celle markerings probespidsen til enkeltprobe spidsen ved hjælp af et digitalt mikroskop, der er fokuseret på enkelt sondespidsen for at overvåge denne proces. Når der rører sig, inducerer en lille acetonitrildråbe ved single-probespidsen en hurtig Liechten af cellen, og derefter ioniseres celle lysatet straks til on-line MS-analyse.
      Bemærk: da den valgte celle er fastgjort til celle markerings sondespidsen gennem en blid sugning, kan denne celle muligvis løsnes under overførslen til en enkelt sonde spids. Derfor, hvis ionsignaler af typiske cellulære lipider (Se repræsentative resultater nedenfor) ikke observeres inden for 5 s, er det muligt, at cellen blev løsnet, og udvælgelsen af en anden celle er nødvendig.

Representative Results

Første, ubehandlet K562 celler anvendes til at etablere den eksperimentelle metode. I et typisk SCMS-eksperiment kan der observeres tydelige ændringer af massespektra fra overførsel af en celle, under detektering af cellulære indhold, og efter endt måling (figur S1). Tre almindelige cellulære lipid toppe (phosphatidylcholin, PC), herunder PC (34:4) (m/z 754,536), PC (36:4) (m/z 782,567), og pc (38:5) (m/z 808,583), overvåges for at sikre, at cellen er korrekt overført og cellulære indholdet registreres (figur S2)21,43,46,55,56. Hvis der ikke ses lipidtoppe inden for 5 s, ændres mineralolie niveauet i mikroinjektoren for at reducere indsugningen i cellen ved celle markerings sondespidsen; der skal udvises forsigtighed, så der ikke presses mineralolie ud fra celle Valgs sonden. Identiteten af mange pc'er i masse området af m/z 750-850 er bekræftet ved hjælp af MS/MS på ubehandlet celle lyat prøver (figur 3, figur S2, tabel 1)46.

K562 celler er også udsat for behandling med forskellige stof forbindelser for at udvide alsidigheden af metoden. K562 celler inkueres med Gemcitabin (1 μM) og Taxol (1 μM) for 1 t og OSW-1 (100 nM, 1 μM) for henholdsvis 4 h og 2 timer. Cellerne vaskes derefter med PBS for at minimere påvisning af stof forbindelser fra ekstracellulær indhold. Bidraget fra matrix (f. eks. ioner fra cellekulturmedium, PBS og solvens) til massespektra af cellulær indhold kan elimineres gennem data subtraktion på grund af deres signifikant forskellige ionsignaler (figur S3). Alle tre lægemiddelstoffer er detekteret ved hjælp af ICMP/single-sonde MS setup (figur S4)46. Disse resultater tyder på denne metode kan bruges til at studere intracellulære lipider, narkotika, og metabolitter på enkelt celleniveau fra celler i opløsning i en nær-indfødte miljø.

Figure 1
Figur 1. Eksperimentelt setup til MS-eksperimenter med enkelt affjedrings celler. (A) den integrerede celle manipulerings platform (ICMP) kombineret med et massespektrometer. (B) skematisk til analyse af suspenderede celler. (C) eksperimentel visning af K562 celler, der skal vælges ved hjælp af celle Valgs sonden. Genoptrykt med tilladelse fra Standke et al.46. Copyright 2019 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Billeder af en modificeret enkelt-sonde og en celle-selektions sonde anvendes til enkelt suspension celle MS eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Zoomet massespektrum fra en enkelt celle, der viser de repræsentative arter (m/z 750-850). Kemiske strukturer bekræftes ved hjælp af MS/MS-analyse (figur S1). Genoptrykt med tilladelse fra Standke et al46. Copyright 2019 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

Drug molekyle* m/z Masse fejl (ppm)
[Gemcitabin + H] + 264,076 af 11,32 af
[Taxol + na] + 876,318 af 2,74 af
[OSW-1 + na] + 895,445 af 0,89 af
Cellulære lipider
[PC (34:4) + H] + 754,535 af 3,71 af
[PC (34:3) + H] + 756,551 af 3,44 af
[PC (34:2) + H] + 758,569 af 0,66 af
[PC (36:5) + H] + 780,551 af 3,07 af
[PC (36:4) + H] + 782,568 af 2,17 af
[PC (36:3) + H] + 784,585 af 0,64 af
[PC (38:7) + H] + 804,551 af 4,1 af
[PC (38:6) + H] + 806,567 af 2,48 af
[PC (38:5) + H] + 808,583 af 2,72 af
[PC (38:4) + H] + 810,601 af 0
[PC (40:7) + H] + 832,583 af 3,12 af

Tabel 1. Identificerede mobil komponenter ved hjælp af ICMP/single-Probe opsætningen. Påvisning af alle narkotika forbindelser blev bekræftet ved at sammenligne MS/MS resultater med standard sammensatte.

Discussion

Den integrerede celle manipulation og analyseplatform er konstrueret til at udvide alsidigheden af enkelt-sonde MS-metoden, der giver mulighed for on-line, hurtig analyse af ikke-vedhængende celler i et nær-Native miljø. En stor fordel ved teknikken er, at minimal prøveforberedelse er nødvendig, så cellerne analyseres under forhold, der efterligner deres standardtilstand. Især, individuelle celler af interesse kan visuelt identificeres og udvælges, minimere indflydelsen af matrix effekt på MS ionisering effektivitet samtidig bevare celler i deres naturlige miljø, så resultaterne er mere repræsentative celler ' Native status (figur S3). Denne teknik kan potentielt bruges til at studere patient celler suspenderet i biofluider i fremtidige undersøgelser. En anden fordel ved denne teknik er den fleksible udvælgelse af prøve opløsningsmidlet. Det er vigtigt at inkludere acetonitril som det vigtigste prøve opløsningsmiddel, således at der hurtigt kan forekomme mikroskopi. Potentielt kan interne standarder (f. eks. isotopisk mærkede lægemidler) tilsættes til prøvetagnings opløsningsmidlet til kvantificering af interesse molekyler (f. eks. lægemiddel molekyler) fra individuelle celler, herunder dem, der kan spille en central rolle i at revolutionere behandling af lægemidler i fremtiden54.

Selv om dette integrerede system bekvemt kan anvendes til at analysere brede celleområder, er en begrænsning af metoden, at hverken enkelt sonde-eller celle Valgs sonden er kommercielt tilgængelig; dikterer behovet for optimering af mange parametre (f. eks. strømningshastighed, spænding, længde mellem Nano-ESI-emitter og ionoverførings slanger osv.) før hvert eksperiment. På grund af den lille enkelt sonde-og celle Valgs sonde kan miljøforstyrrelser (f. eks. luftstrøm) desuden medføre vanskeligheder med at etablere et kryds mellem de to sonder. En kortsigtet løsning er bøjning af cellen-selektions sonde tæt på enden for at minimere længden af nedtrapning. Fremtidigt arbejde omfatter udvikling af en bolig til at omslutte de kritiske dele af opsætningen for at minimere miljømæssige virkninger. På grund af den begrænsede mængde af cellulære indhold og korte anskaffelses tid (~ 2-3 s) fra en celle, MS/MS analyse kan kun udføres for relativt rigelige arter. Andre faktorer, der påvirker detektionsfølsomhed omfatter den undertrykte ionisering effektivitet på grund af indførelsen af matrix sammen med cellen og potentielle ion tab gennem den udvidede ion Transfer slange.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Naga Rama kothapalli for hendes arbejde med at udvikle prøveforberedelse til både suspension celler og celle lysat eksperimenter. Desuden vil forfatterne takke NIH (R01GM116116 og R21CA204706) for finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetontrile Millipore Co. AX0145-1 Sampling solvent
CellTram Vario Eppendorf 6221 ICMP
Copper wire stores.ebay.com/jewelerheaven Dead soft, round, 20 guage, 25 ft Conductive union setup
Digital stereomicroscope Shenzhen D&F Co. Supereyes T004 Analysis
Disposable micropipette, 1-5 µL Rochester Scientific 5065 Cell-selection probe fabrication
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" Friedrich & Dimmock, Inc. MBT-005-020-2Q Single-probe fabrication
Epoxy resin Devcon Part No. 20945 Single-probe fabrication
Eppendorf cell manipulation system Eppendorf Transferman NK517800397-U.R. ICMP
External nut VALCO*CHEMINERT EN1 Ion transfer tube fabrication
Formic acid Sigma-Aldrich 399388-500ML Sampling solvent
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm Polymicro Technologies TSP040105 Single-probe fabrication, conductive union setup
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm Polymicro Technologies 1068150015 Conductive union setup
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) Fischer Sci SH3006603 Cell culture
Inline MicroFilter IDEX Health & Science LLC M-520 Conductive union setup
Laser puller Sutter Instrument Co. Model P-2000 Single-probe fabrication
LED UV lamp Foshan Liang Ya Dental Equipment LY-C240 Single-probe fabrication
LTQ Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL Analysis
Microforge Narishige, Co. MF-9 Cell-selection probe fabrication
Microunion IDEX Health & Science LLC M-539 Conductive union
PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft IDEX Health & Science LLC 1576 Conductive union setup
PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft IDEX Health & Science LLC 1577 Conductive union setup
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies 15140-122 Cell culture
Petri dish, 35x10 mm VWR 25382-334 Sample preparation
Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 0780-50L Cell culture
Platinum wire Narishige, Co. Model PT-A Microforge
Power supply Nikon PSM-2120 ICMP
RPMI, 1X with Corning glutagro Corning 10-104-CV Cell culture
Single-bore tubes Boralex 5065 Cell-selection probe fabrication
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD IDEX Health & Science LLC VHP-200-01x Ion transfer tube fabrication
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm IDEX Health & Science LLC U-1128 Ion transfer tube fabrication
Syringe, 250 µL Hamilton 1725LTN250UL Sampling syringe
T25 flask CellStar 690160 Cell culture
Thermo LTQ XL ion source interface flange New Objective PB5500 Analysis
ThermoPlate TokaiHit 55R30N ICMP
TrypLE Express Gibco 12605-010 Cell culture
Tube cutter, for 1/16" stainless steel SUPELCO 58692-U Ion transfer tube fabrication
USB digital photography microscope dx.com SO2 25~500X Analysis
UV curing resin Prime Dental Item No. 006.030 Single-probe fabrication
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Cell-selection probe fabrication
Voltage housing PicoChip PCH-A00120 ICMP/MS interface
Wire cutter Craftsman 4 1/2 in end nipper Conductive union setup

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mao, S., et al. In Scatheless Cell Detachment Reveals Correlation between Adhesion Strength and Viability at Single-Cell Resolution. Angewandte Chemie International Edition. 57 (1), 236-240 (2017).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  3. Linwen, Z., Akos, V. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2017).
  4. Chen, X., et al. Single-cell analysis at the threshold. Nature Biotechnology. 34, 1111 (2016).
  5. Fu, Q., Tang, J., Cui, M., Xing, J., Liu, Z., Liu, S. Application of porous metal enrichment probe sampling to single cell analysis using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Journal of Mass Spectrometry. 51, (2016).
  6. Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-Cell Lipidomics: Characterizing and Imaging Lipids on the Surface of Individual Aplysia californica Neurons with Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (4), 2231-2238 (2013).
  7. Passarelli, M. K., et al. Single-Cell Analysis: Visualizing Pharmaceutical and Metabolite Uptake in Cells with Label-Free 3D Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 87 (13), 6696-6702 (2015).
  8. Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary Ion MS Imaging To Relatively Quantify Cholesterol in the Membranes of Individual Cells from Differentially Treated Populations. Analytical Chemistry. 79 (10), 3554-3560 (2007).
  9. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  10. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. Journal of Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  11. Ong, T. -H., Tillmaand, E. G., Makurath, M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry-based characterization of endogenous peptides and metabolites in small volume samples. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 732-740 (2015).
  12. Yang, Y., Huang, Y., Wu, J., Liu, N., Deng, J., Luan, T. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  13. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip. 7 (4), 423-440 (2007).
  14. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  15. Fujii, T., et al. Direct metabolomics for plant cells by live single-cell mass spectrometry. Nature Protocols. 10, 1445 (2015).
  16. Esaki, T., Masujima, T. Fluorescence Probing Live Single-cell Mass Spectrometry for Direct Analysis of Organelle Metabolism. Analytical Sciences. 31 (12), 1211-1213 (2015).
  17. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live Single-Cell Molecular Analysis by Video-Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 24 (5), 559-561 (2008).
  18. Mizuno, N., Harada, T., Masujima, T., T, H. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. , (2008).
  19. Phelps, M., Hamilton, J., Verbeck, G. F. Nanomanipulation-coupled nanospray mass spectrometry as an approach for single cell analysis. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 124101 (2014).
  20. Phelps, M. S., Verbeck, G. F. A lipidomics demonstration of the importance of single cell analysis. Analytical Methods. 7 (9), 3668-3670 (2015).
  21. Pan, N., Rao, W., Kothapalli, N. R., Liu, R., Burgett, A. W. G., Yang, Z. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Gong, X., et al. Single Cell Analysis with Probe ESI-Mass Spectrometry: Detection of Metabolites at Cellular and Subcellular Levels. Analytical Chemistry. 86 (8), 3809-3816 (2014).
  23. Lorenzo Tejedor, M., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. In Situ Molecular Analysis of Plant Tissues by Live Single-Cell Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (12), 5221-5228 (2012).
  24. Shimizu, T., et al. Live Single-Cell Plant Hormone Analysis by Video-Mass Spectrometry. Plant and Cell Physiology. 56 (7), 1287-1296 (2015).
  25. Yamamoto, K., et al. Cell-specific localization of alkaloids in Catharanthus roseus stem tissue measured with Imaging MS and Single-cell MS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (14), 3891 (2016).
  26. Date, S., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Direct Drug Metabolism Monitoring in a Live Single Hepatic Cell by Video Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 28 (3), 201 (2012).
  27. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  28. Masuda, K., Abouleila, Y., Ali, A., Yanagida, T., Masujima, T. Live Single-Cell Mass Spectrometry (LSC-MS) for Plant Metabolomics. BT - Plant Metabolomics: Methods and Protocols. , 269-282 (2018).
  29. Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Single oocyte and single embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 29-33 (2012).
  30. Ferreira, C. R., Pirro, V., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Developmental phases of individual mouse preimplantation embryos characterized by lipid signatures using desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (10), 2915-2926 (2012).
  31. Lee, J. K., Jansson, E. T., Nam, H. G., Zare, R. N. High-Resolution Live-Cell Imaging and Analysis by Laser Desorption/Ionization Droplet Delivery Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (10), 5453-5461 (2016).
  32. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  33. Yin, L., Zhang, Z., Liu, Y., Gao, Y., Gu, J. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry. Analyst. 144 (3), 824-845 (2019).
  34. González-Serrano, A. F., et al. Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Reveals Lipid Metabolism of Individual Oocytes and Embryos. PLoS ONE. 8 (9), e74981 (2013).
  35. Liu, Y., et al. Study on Variation of Lipids during Different Growth Phases of Living Cyanobacteria Using Easy Ambient Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (14), 7096-7102 (2014).
  36. Shrestha, B., et al. Subcellular Metabolite and Lipid Analysis of Xenopus laevis Eggs by LAESI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 9 (12), e115173 (2014).
  37. Stolee, J. A., Shrestha, B., Mengistu, G., Vertes, A. Observation of Subcellular Metabolite Gradients in Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 51 (41), 10386-10389 (2012).
  38. Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  39. Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and analysis of small cell populations and single cells by consecutive laser pulses. Applied Physics A. 101 (1), 121-126 (2010).
  40. Stolee, J. A., Vertes, A. Toward Single-Cell Analysis by Plume Collimation in Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (7), 3592-3598 (2013).
  41. Zhang, L., Vertes, A. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  42. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6545 LP-6550 (2015).
  43. Liu, R., Pan, N., Zhu, Y., Yang, Z. T-Probe: An Integrated Microscale Device for Online In Situ Single Cell Analysis and Metabolic Profiling Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90 (18), 11078-11085 (2018).
  44. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using Dicationic Ion-Pairing Compounds To Enhance the Single Cell Mass Spectrometry Analysis Using the Single-Probe: A Microscale Sampling and Ionization Device. Analytical Chemistry. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  45. Sun, M., Tian, X., Yang, Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Analytical Chemistry. 89 (17), 9069-9076 (2017).
  46. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass Spectrometry Measurement of Single Suspended Cells Using a Combined Cell Manipulation System and a Single-Probe Device. Analytical Chemistry. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  47. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 986-993 (2015).
  48. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), 53911 (2016).
  49. Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 124-134 (2016).
  50. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chemical Communications. 55 (5), 616-619 (2019).
  51. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic Studies of Live Single Cancer Stem Cells Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  52. Tian, X., Zhang, G., Shao, Y., Yang, Z. Towards enhanced metabolomic data analysis of mass spectrometry image: Multivariate Curve Resolution and Machine Learning. Analytica Chimica Acta. 1037, 211-219 (2018).
  53. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single Cell Isolation and Analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
  54. Wu, C., Wu, P., Zhao, H., Liu, W., Li, W. Clinical Applications of and Challenges in Single-Cell Analysis of Circulating Tumor Cells. DNA and Cell Biology. 37 (2), 78-89 (2017).
  55. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single Cell Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  56. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews. 22 (5), 332-364 (2003).

Tags

Kemi enkelt celle massespektrometri affjedrings celler integreret celle manipulation platform enkelt-sonde ambient ionisering mikroskala prøvetagning
Integreret celle manipulation platform kombineret med enkelt-sonde for massespektrometri analyse af narkotika og metabolitter i enkelt suspension celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Standke, S. J., Colby, D. H.,… More

Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells. J. Vis. Exp. (148), e59875, doi:10.3791/59875 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter