Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Integrert Cell manipulasjon Platform sammen med single-probe for Mass massespektrometri analyse av narkotika og metabolitter i single suspensjon celler

Published: June 21, 2019 doi: 10.3791/59875
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma

Summary

En integrert celle manipulasjon plattform er utviklet for bruk i forbindelse med en enkelt-sonde masse massespektrometri oppsett for on-line analyse av individuelle suspensjon celler under ambient forhold.

Abstract

Enkelt cellemasse massespektrometri (SCMS) muliggjør sensitiv deteksjon og nøyaktig analyse av bredt spekter av cellulære arter på den enkelte cellenivå. Den single-sonde, en Mikroskala prøvetaking og ionisering enhet, kan kombineres med en masse spektrometer for on-line, rask SCMS analyse av cellulære bestanddeler under omgivelsesforhold. Tidligere var den single-probe SCMS teknikken primært brukes til å måleceller immobilisert på et substrat, noe som begrenser hvilke typer celler for studier. I den nåværende studien, den single-sonde SCMS-teknologi har blitt integrert med en celle manipulasjon system, vanligvis brukes for in vitro befruktning. Denne integrerte celle manipulasjon og analyse plattformen bruker en celle-valg sonde å fange identifiserte individuelle flytende celler og overføre celler til Single-sonde spissen for Mikroskala lyse, etterfulgt av umiddelbar masse massespektrometri analyse. Denne fangst og overføre prosessen fjerner celler fra den omkringliggende løsning før analyse, minimere innføringen av matrise molekyler i massen massespektrometri analyse. Dette integrerte oppsettet er i stand til SCMS analyse av målrettede pasient-isolerte celler til stede i kroppsvæsker prøver (f. eks, urin, blod, spytt, etc.), noe som åpner for potensielle anvendelser av SCMS analyse til Human medisin og sykdoms biologi.

Introduction

Human biologi, spesielt sykdoms biologi, er i økende grad forstått å være et resultat av aktiviteter på nivået av individuelle celler, men de tradisjonelle analytiske metoder, som for eksempel flytende kromatografi masse massespektrometri (LCMS), er vanligvis brukt til å analysere prøver fremstilt fra populasjoner av celler, mens ervervet molekylær informasjon ikke kan nøyaktig representere de kjemiske prosessene på det enkelte cellenivå. Disse standard, tradisjonelle metoder er ikke i stand til å skjelne effekten av cellulære heterogenitet på en analytisk måling, og prosessen med å ødelegge og blande cellene for å forberede lysat potensielt fører til endring eller tap av mobilnettet komponenter1,2. Disse begrensningene av tradisjonelle metoder er spesielt viktig i analysen av pasient celler, der de oppnådde prøvene kan inneholde en kompleks blanding av mange forskjellige celletyper. For å overkomme disse manglene, enkelt celle molekylær analysemetoder, inkludert single Cell Mass massespektrometri (SCMS) metoder, er i økende grad utvikles og brukes på bioanalysis, spesielt av cellulære metabolitter og lav molekylvekt biomolekyler3,4.

Den første SCMS teknikker utviklet brukt vakuum-baserte teknikker for å utføre analysene under ikke-ambient forhold2,5,6,7,8,9, 10,11. Ikke-ambient SCMS teknikker er i stand til å analysere cellulære lipider og metabolitter, men krever prøve forbehandling under kunstige forhold, og derfor er ikke egnet for sanntids analyse. Prøven forberedelse prosessen for ikke-ambient analyse omfatter tillegg av matrisen komponenter, og dette preparatet kan endre cellulære komponenter fra sitt naturlige miljø12. Derfor benyttes ambient Mass massespektrometri (MS) teknikker, som ikke krever et vakuum for prøvetaking miljøet, for å analysere celler i en nær-native miljø. Ikke å ha et vakuum miljø gir allsidighet i eksperimentell design; kameraer kan legges til å overvåke cellulære prosessen og mykere ionisering teknikker kan kombineres med separasjon teknikker for å få bedre informasjon fra hver enkelt-celle eksperiment4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37, 38, 39,40 ,41,42.

Single-probe SCMS metoden er en ambient teknikk som analyserer Live, pattedyr kreftcelle linjer i en nær-native Environment21,43,44,45,46. I tillegg har single-probe enheten blitt brukt til andre masse massespektrometri applikasjoner, inkludert analyse av ekstracellulære molekyler i flercellede spheroids og MS Imaging av vev47,48,49 ,50,51,52. Men siden celle immobilisering på underlag er nødvendig for denne metoden, kan suspensjon celler ikke analyseres direkte ved hjelp av denne teknikken3,53. Derfor kunne SCMS-systemet med én sonde ikke brukes direkte til å prøve ikke-tilhenger enkeltceller, for eksempel ikke-tilhenger cellelinjer eller opphengs celler isolert fra pasientens blod eller andre kroppsvæsker54. I dette arbeidet, en integrert celle manipulasjon plattform (ICMP) er kombinert med single-sonde SCMS teknikk for å analysere Live, suspensjon celler på linje med minimal prøveforberedelse (figur 1)46. ICMP består av en invertert mikroskop for å overvåke celleutvalg, en glasscelle-utvalg sonde, en microinjector å fange individuelle flytende celler, en oppvarmet plate for å opprettholde celle temperatur, to celle manipulasjon systemer for å kontrollere romlig bevegelser av både glasscelle-utvelgelses sonde og Single-sonde, og et digitalt mikroskop for å observere celle overføring fra celle-valg sonde spissen til Single-sonde spissen. Den fabrikasjon av single-sonde er beskrevet i tidligere publikasjoner og vil ikke bli behandlet her21,48. ICMP/single-probe systemet er koplet til en høy oppløsning masse spektrometer. Dette integrerte oppsettet gjør det mulig å prøve ut identifiserte enkeltceller fra komplekse biologiske prøver med minimale effekter fra matrise molekyler.

Protocol

1. glass celle-valg sonde fabrikasjon

  1. Konverter enkelt-bar glass slange inn i en konisk sonde med et skarpt tips.
    1. Plasser en single-bar glass Tube (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) inn i klemmene på en vertikal pipette holder, sentrering glasset med hensyn til varme spolen og stram for å feste røret på plass. Varme spolen består av en 18-gauge nikkel-krom motstand wire (~ 60 mm i lengde) spiral rundt en metallstang (diameter = 3,90 mm) 2,5 ganger.
    2. Still inn glass slangen med temperatur program 19,5 (produsentens enhet). Denne parameteren kan endres for et bestemt instrument.
    3. Sett magnet stempelet på 4 (produsentens enhet). Denne parameteren kan endres for et bestemt instrument.
    4. Utløs magneten for å trekke glass slangen. Dette trinnet skaper to sonder smeltet på spissen.
    5. Bruk pinsett til å kutte ~ 1 mm bort fra spissen av hver sonde, og skaper et munnstykke på ~ 10 μm i diameter ved sonde spissen.
  2. Bøy glass sonden for enkel kobling til ICMP/single-probe SCMS-oppsettet.
    1. Sett en trukket glass sonde inn i microforge, posisjonering spissen ~ 3 mm over platina varme wire.
    2. Snu varmen på platina wire til 30% av maksimal temperatur.
    3. Bøy proben ~ 45 ° fra den opprinnelige posisjonen (figur 2).

2. integrert celle manipulasjon plattform montering

  1. Plasser invertert mikroskop, microinjector, og to celle manipulasjon systemer på en motorisert bord for enkel kopling med massen spektrometer.
    1. Endre en av celle manipulasjon systemer for å imøtekomme en enkelt-sonde ved å erstatte enden med en arm klemme.
    2. Bruk en plastsprøyte med en nål for å fylle microinjector med mineralolje. Unngå bobler i slangen da dette vil påvirke utsuging.
    3. Sett på etappe innsatsen til det omvendte mikroskopet med den oppvarmede platen. Sett den oppvarmede platen ved 37 ° c før analysen.
  2. Sett opp glasscelle-valg enhet.
    1. Sett inn glasscelle valgs sonden inne i metall holde ren på microinjector ved å plassere den lange (ikke-bøyde) siden inn i kapillær holde ren og stramme skruen for å feste proben på plass. Plasser sonde spissen parallelt med den oppvarmede platen.
      FORSIKTIG: glasset sonden er veldig skarp og skjør, og det bryter lett. Beskytt øynene dine og vær ekstra forsiktige mens du setter sonden inn i microinjector.
    2. Fest metall holde ren til microinjector i celle manipulasjon systemet. Plasser sonde spissen nær midten av lyset til det omvendte mikroskopet.

3. Opprett et utvidet ion overførings rør for masse spektrometer innløp

  1. Bruk en metall kutter til å skjære et stykke rustfritt stål rør (OD: 0,0625 (1/16) i, ID: 0,021 i) ~ 250 mm i lengde.
  2. Mål 135 mm fra slutten og plassere en metall feral så ~ 135 mm vil bli utsatt for atmosfæren og ~ 115 mm vil være inne i massen spektrometer. Sikre det feral benytter to skiftenøkler å stramme den.

4. par ICMP med et oppsett med én sonde

  1. Fest glass skyve ren som inneholder enkelt sonden inn i arm klemmen til celle manipulering systemet.
    Merk: single-sonder er fabrikkert i henhold til en tidligere publisert protokoll48 med to mindre endringer i den aktuelle studien: nano-ESI emitter er gjort lenger for enkel kopling til massen spektrometer, og enkelt-sonder er limt til glasset side på høyre side for å unngå å forstyrre den romlige bevegelsen av glasscelle valgs enheten (figur 2).
  2. Koble løsningsmidlet-gi kapillær til en ledende Union ved å plassere kapillær inn i ermet (1/16 x .005 i) av plast dobbsko og finger-stramme montering.
    1. Koble den andre siden av ledende Union til en kapillær (ID: 40 μm, OD: 150 μm), som er koblet til en sprøyte som inneholder prøvetaking løsemiddel, ved å plassere kapillær inn i ermet (1/32 x .007 i) og stramme beslaget. Bruk acetonitril med 0,1% maursyre syre som sampling løsemiddel i disse eksperimentene.
      Merk: prøve løsningsmiddelet er fleksibelt, men det bør primært inneholde acetonitril (eller acetonitril med maursyre syre for bedre ionisering) for en hurtig Mikroskala cellelyse.
    2. Fest sprøyten i sprøyte pumpen på masse spektrometer.
    3. Plasser den ionisering spennings ledningen på en kobbertråd som er festet til den ledende unionen.
  3. Plasser nano-ESI emitter ~ 1 mm til åpningen av den utvidede ion overføring tube.
    1. Bruk celle manipulasjon system for å kontrollere den romlige bevegelser av single-sonde og plassere nano-ESI emitter sentralt foran den utvidede ion overføre slangen.

5. forberedelse av suspendert celleprøve

  1. Dagen før analyse (~ 18-24 h), frø ut celler for testing i en cellekultur kolbe (T25). K562 humant myelogen leukemi celler brukes som modeller i denne studien.
    1. Heat 1x fosfat bufret saltvann (PBS) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium supplert med 10% syntetisk fosterets storfe serum (FBS) og 1% penicillin-Streptomycin ved 37 ° c i 30 min.
    2. Seed ~ 1 x 106 celler i et total volum på 10 ml ved å kombinere celler med varmt medium. Generelt, bruk en 10-mL pipette å plassere 8 mL RPMI medium inn i en cellekultur kolbe. Deretter bruker en 2 mL pipette å sette 2 mL confluent K562 celler mediet for ~ 1 x 106 celler.
    3. Ruge cellene ved 37 ° c og 5% CO2 til analyse.
  2. Klargjør celler for analyse.
    1. Pipetter celler fra celle kulturen kolbe inn i en 15-mL sentrifugerør.
    2. Snurr celler ned ved 400 x g og 37 ° c i 5 minutter og kast supernatanten.
    3. Resuspend celler i 4 mL RPMI medium inneholder stoffet sammensatte ved ønsket behandling konsentrasjon.
      Merk: for analyse av kontroll celler, resuspend cellene i 4 mL RPMI medium og hoppe til trinn 6.
    4. Ruge cellene så lenge behandlingstiden er på 37 ° c og 5% CO2.
    5. Snurr celler ned ved 400 x g og 37 ° c i 5 min. aspirer supernatanten.
    6. Cellene er resuspendert i 10 mL PBS, og sentrifuger ved 400 x g og 37 ° c i 5 min. Etter spinning, kast supernatanten. Gjenta dette trinnet 3 ganger for å minimere påvisning av stoffet fra ekstracellulære bestanddeler.
    7. Resuspend celler i 4 mL PBS for analyse.

6. Utfør SCMS målinger ved hjelp av oppsettet ICMP/single-probe

  1. Tilpass parametere for masse spektrometer for eksperimentet.
    1. Under skannemodus -overskriften til instrument programvaren velger du Definer Skann. Bruk en oppløsning på 60 000 m/∆ m ved m/z 400, 1 microscan, 100 MS maksimal injeksjons tid og automatisk forsterkningskontroll (AGC) på. En masse rekkevidde (m/z) av 100-1000 ble benyttet for eksperimentene. Parametere kan endres basert på instrument modellen.
    2. Under sprøyte pumpevelger du en strømningshastighet på 150 nl/min. strømningshastighet må optimaliseres for hvert eksperiment.
    3. Velg NSI-kilde og Påfør en spenning på ~ 4,5 kv. Denne parameteren må også optimaliseres for hvert eksperiment.
  2. Skru på det omvendte mikroskop (med 40x forstørrelsen valgt for begge to overdelen plate og bunnen linsen) og forbinde den å det USB-havn av en bærbar PC å fange bo-video forer. Slå på den oppvarmede platen og sett den til 37 ° c.
  3. Gå til Hent data -fanen på datamaskinen, og velg kontinuerlig under innhenting av tid.
  4. Forbered prøve for analyse.
    1. Pipetter 2-3 mL av prøven inn i lokket på en liten Petri-tallerken (35 mm x 12 mm).
    2. 6.4.2 plasser prøven i midten av lyset fra det omvendte mikroskopet på toppen av den oppvarmede platen.
  5. Klargjør glasscelle-valg sonde for analyse. Bruk celle manipulasjon systemet til å flytte sonden slik at spissen er fokusert under invertert mikroskop i samme plan som cellene.
  6. Velg en enkelt celle for analyse.
    1. Bruk celle manipulasjon systemet til å flytte Cellevalg sonde spissen til en målrettet celle. Denne prosessen overvåkes med det omvendte mikroskopet.
      Merk: Hvis spissen av celle valgs proben ikke kan fokusere på samme plan som cellene, er det mulig at den bøyde delen av proben ikke er riktig vinklet. Juster posisjonen til celle valgs sonden til begge sonde kan fokuseres sammen med celler under mikroskopet.
    2. Drei forsiktig håndtaket på microinjector for å justere plasseringen av mineral oljen inne i slangen. En mild sug er gitt av microinjector for å sikre den målrettede cellen til celle-valg sonde spissen.
      Merk: Hvis cellen ikke kan fanges opp av celle valgs proben gjennom sugekraften, må du kontrollere celle valgs proben for å sikre at den er satt helt inn i kapillær holde ren. I tillegg inspisere mineralolje nivåer i microinjector og rør, og utvise luft hvis det er noen.
    3. Bruk celle manipulasjon systemet til å flytte cellen på celle-valg sonde spissen til Single-sonde spissen, ved hjelp av et digitalt mikroskop fokusert på single-sonde spissen for å overvåke denne prosessen. Når du berører, en liten acetonitril dråpe på single-sonde spissen induserer en rask analyser av cellen, og deretter celle lysat er umiddelbart ionisert for on-line MS analyse.
      Merk: fordi den valgte cellen er festet til den celle-valg sonde spissen gjennom en mild sug, kan denne cellen være potensielt løsrevet under overføring til Single-sonde spissen. Derfor, hvis ion signaler av typiske cellulære lipider (se representative resultater nedenfor) ikke er observert innen 5 s, er det mulig at cellen ble fristilt, og valget av en annen celle er nødvendig.

Representative Results

Først, ubehandlet K562 celler brukes til å etablere den eksperimentelle metoden. I et typisk SCMS eksperiment, kan åpenbare endringer av masse Spectra observeres fra å overføre en celle, under påvisning av mobil innhold, og etter å ha fullført målingen (figur S1). Tre vanlige cellulære lipid topper (phosphatidylcholine, PC), inkludert PC (34:4) (m/z 754,536), PC (36:4) (m/z 782,567), og PC (38:5) (m/z 808,583), overvåkes for å sikre at cellen er overført og mobilnettet innholdet oppdages (figur S2)21,43,46,55,56. Hvis lipid topper ikke ses innen 5 s, er mineralolje nivået i microinjector endret for å redusere sug holde cellen på celle-valg sonde spissen; forsiktighet må utvises slik at ingen mineralolje skyves ut fra celle valgs proben. Identiteten til mange PC-er i massen utvalg av m/z 750-850 er bekreftet ved hjelp av MS/MS på ubehandlet celle lysat prøver(figur 3, figur S2, tabell 1)46.

K562 celler er også utsatt for behandling med ulike medikament forbindelser for å utvide allsidigheten til metoden. K562-celler inkubert med gemcitabin (1 μM) og taxol (1 μM) for 1 t og OSW-1 (100 nM, 1 μM) for henholdsvis 4 t og 2 t. Celler blir deretter vasket med PBS å minimere påvisning av narkotika forbindelser fra ekstracellulære innhold. Bidraget av matrise (f. eks, ioner fra cellekultur medium, PBS, og løsemiddel) til massen Spectra av cellulære innholdet kan elimineres gjennom data subtraksjon, på grunn av deres signifikant forskjellige ion-signaler (figur S3). Alle tre legemiddel forbindelsene oppdages ved hjelp av ICMP/single-probe MS Setup (figur S4)46. Disse resultatene tyder på denne metoden kan brukes til å studere intracellulære lipider, narkotika og metabolitter på enkelt cellenivå fra celler i løsningen i en nær-native miljø.

Figure 1
Figur 1. Eksperimentell oppsett for enkelt suspensjon celle MS eksperimenter. (A) integrert celle manipulasjon plattform (ICMP) kombinert med en masse spektrometer. (B) skjematisk for analyse av suspenderte celler. (C) eksperimentell visning av K562 celler skal velges ved hjelp av celle-valg sonde. Gjengitt med tillatelse fra Standke et al.46. Copyright 2019 American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Bilder av en modifisert single-sonde og en celle-utvalg sonde benyttes for enkelt suspensjon celle MS eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Zoomet-i massen spektrum fra en enkelt celle som viser representative arter (m/z 750-850). Kjemiske strukturer bekreftes ved hjelp av MS/MS analyse (figur S1). Gjengitt med tillatelse fra Standke et al46. Copyright 2019 American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Drug molekyl* m/z Masse feil (ppm)
[Gemcitabin + H] + 264,076 for alle 11,32 for alle
[Taxol + na] + 876,318 for alle 2,74 for alle
[OSW-1 + na] + 895,445 for alle 0,89 for alle
Cellulære lipider
[PC (34:4) + H] + 754,535 for alle 3,71 for alle
[PC (34:3) + H] + 756,551 for alle 3,44 for alle
[PC (34:2) + H] + 758,569 for alle 0,66 for alle
[PC (36:5) + H] + 780,551 for alle 3,07 for alle
[PC (36:4) + H] + 782,568 for alle 2,17 for alle
[PC (36:3) + H] + 784,585 for alle 0,64 for alle
[PC (38:7) + H] + 804,551 for alle 4,1 for alle
[PC (38:6) + H] + 806,567 for alle 2,48 for alle
[PC (38:5) + H] + 808,583 for alle 2,72 for alle
[PC (38:4) + H] + 810,601 for alle 0
[PC (40:7) + H] + 832,583 for alle 3,12 for alle

Tabell 1. Identifiserte cellulære komponenter ved hjelp av oppsettet ICMP/single-probe. Påvisning av alle narkotika forbindelser ble bekreftet ved å sammenligne MS/MS resultater med standard sammensatte.

Discussion

Den integrerte celle manipulasjon og analyseplattform er konstruert for å utvide allsidigheten til Single-sonde MS metoden, slik at for on-line, rask analyse av ikke-tilhenger celler i en nær-native miljø. En stor fordel med teknikken er at minimal prøve forberedelser er nødvendig, slik at cellene blir analysert i forhold som etterligner deres standard tilstand. Spesielt kan enkelte celler av interesse være visuelt identifisert og valgt, minimere påvirkning av matrise effekt på MS ionisering effektivitet og samtidig opprettholde celler i deres naturlige miljø, slik at resultatene er mer representative celler innfødte status (figur S3). Denne teknikken kan potensielt brukes til å studere pasient celler suspendert i biofluids i fremtidige studier. En annen fordel med denne teknikken er det fleksible utvalget av prøvetaking løsemiddel. Det er viktig å inkludere acetonitril som den viktigste prøvetaking løsemiddel slik at Mikroskala lyse kan forekomme raskt. Potensielt, interne standarder (f. eks, isotopically-merket legemiddel forbindelser) kan tilsettes i prøvetaking løsemiddel for kvantifisering av molekyler av interesse (f. eks, legemiddel molekyler) fra individuelle celler, inkludert de kan spille en nøkkelrolle i revolusjonerer tilpasse narkotika behandlinger i fremtiden54.

Selv om dette integrerte systemet kan enkelt brukes til å analysere brede celleområder, er en begrensning av metoden at verken enkelt sonde eller celle utvalgs sonde er kommersielt tilgjengelig; dikterer behovet for optimalisering av mange parametre (f. eks, strømningshastighet, spenning, lengde mellom nano-ESI emitter og Ion overføring rør, etc.) før hvert eksperiment. På grunn av smallness av enkelt sonde og celle utvalgs sonde, kan miljø forstyrrelsene (f.eks. luftstrøm) føre til vanskeligheter med å etablere et knutepunkt mellom de to sonder. En kortsiktig løsning er bøying av Cellevalg sonden nær slutten for å minimere lengden av en gang. Fremtidig arbeid omfatter utvikling av en bolig for å sette de kritiske delene av oppsettet for å minimere miljøeffekter. På grunn av den begrensede mengden av mobil innhold og kort oppkjøps tid (~ 2-3 s) fra en celle, MS/MS analyse kan bare gjennomføres for relativt rikelig arter. Andre faktorer som påvirker deteksjons følsomheten inkluderer undertrykt ionisering effektivitet på grunn av innføringen av matrisen sammen med cellen og potensielle ion tap gjennom den utvidede ion overførings slangen.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Naga Rama Kothapalli for sitt arbeid i å utvikle prøve forberedelser for både suspensjon celler og celle lysat eksperimenter. I tillegg forfatterne takker NIH (R01GM116116 og R21CA204706) for finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetontrile Millipore Co. AX0145-1 Sampling solvent
CellTram Vario Eppendorf 6221 ICMP
Copper wire stores.ebay.com/jewelerheaven Dead soft, round, 20 guage, 25 ft Conductive union setup
Digital stereomicroscope Shenzhen D&F Co. Supereyes T004 Analysis
Disposable micropipette, 1-5 µL Rochester Scientific 5065 Cell-selection probe fabrication
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" Friedrich & Dimmock, Inc. MBT-005-020-2Q Single-probe fabrication
Epoxy resin Devcon Part No. 20945 Single-probe fabrication
Eppendorf cell manipulation system Eppendorf Transferman NK517800397-U.R. ICMP
External nut VALCO*CHEMINERT EN1 Ion transfer tube fabrication
Formic acid Sigma-Aldrich 399388-500ML Sampling solvent
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm Polymicro Technologies TSP040105 Single-probe fabrication, conductive union setup
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm Polymicro Technologies 1068150015 Conductive union setup
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) Fischer Sci SH3006603 Cell culture
Inline MicroFilter IDEX Health & Science LLC M-520 Conductive union setup
Laser puller Sutter Instrument Co. Model P-2000 Single-probe fabrication
LED UV lamp Foshan Liang Ya Dental Equipment LY-C240 Single-probe fabrication
LTQ Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL Analysis
Microforge Narishige, Co. MF-9 Cell-selection probe fabrication
Microunion IDEX Health & Science LLC M-539 Conductive union
PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft IDEX Health & Science LLC 1576 Conductive union setup
PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft IDEX Health & Science LLC 1577 Conductive union setup
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies 15140-122 Cell culture
Petri dish, 35x10 mm VWR 25382-334 Sample preparation
Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 0780-50L Cell culture
Platinum wire Narishige, Co. Model PT-A Microforge
Power supply Nikon PSM-2120 ICMP
RPMI, 1X with Corning glutagro Corning 10-104-CV Cell culture
Single-bore tubes Boralex 5065 Cell-selection probe fabrication
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD IDEX Health & Science LLC VHP-200-01x Ion transfer tube fabrication
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm IDEX Health & Science LLC U-1128 Ion transfer tube fabrication
Syringe, 250 µL Hamilton 1725LTN250UL Sampling syringe
T25 flask CellStar 690160 Cell culture
Thermo LTQ XL ion source interface flange New Objective PB5500 Analysis
ThermoPlate TokaiHit 55R30N ICMP
TrypLE Express Gibco 12605-010 Cell culture
Tube cutter, for 1/16" stainless steel SUPELCO 58692-U Ion transfer tube fabrication
USB digital photography microscope dx.com SO2 25~500X Analysis
UV curing resin Prime Dental Item No. 006.030 Single-probe fabrication
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Cell-selection probe fabrication
Voltage housing PicoChip PCH-A00120 ICMP/MS interface
Wire cutter Craftsman 4 1/2 in end nipper Conductive union setup

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mao, S., et al. In Scatheless Cell Detachment Reveals Correlation between Adhesion Strength and Viability at Single-Cell Resolution. Angewandte Chemie International Edition. 57 (1), 236-240 (2017).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  3. Linwen, Z., Akos, V. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2017).
  4. Chen, X., et al. Single-cell analysis at the threshold. Nature Biotechnology. 34, 1111 (2016).
  5. Fu, Q., Tang, J., Cui, M., Xing, J., Liu, Z., Liu, S. Application of porous metal enrichment probe sampling to single cell analysis using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Journal of Mass Spectrometry. 51, (2016).
  6. Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-Cell Lipidomics: Characterizing and Imaging Lipids on the Surface of Individual Aplysia californica Neurons with Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (4), 2231-2238 (2013).
  7. Passarelli, M. K., et al. Single-Cell Analysis: Visualizing Pharmaceutical and Metabolite Uptake in Cells with Label-Free 3D Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 87 (13), 6696-6702 (2015).
  8. Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary Ion MS Imaging To Relatively Quantify Cholesterol in the Membranes of Individual Cells from Differentially Treated Populations. Analytical Chemistry. 79 (10), 3554-3560 (2007).
  9. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  10. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. Journal of Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  11. Ong, T. -H., Tillmaand, E. G., Makurath, M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry-based characterization of endogenous peptides and metabolites in small volume samples. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 732-740 (2015).
  12. Yang, Y., Huang, Y., Wu, J., Liu, N., Deng, J., Luan, T. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  13. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip. 7 (4), 423-440 (2007).
  14. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  15. Fujii, T., et al. Direct metabolomics for plant cells by live single-cell mass spectrometry. Nature Protocols. 10, 1445 (2015).
  16. Esaki, T., Masujima, T. Fluorescence Probing Live Single-cell Mass Spectrometry for Direct Analysis of Organelle Metabolism. Analytical Sciences. 31 (12), 1211-1213 (2015).
  17. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live Single-Cell Molecular Analysis by Video-Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 24 (5), 559-561 (2008).
  18. Mizuno, N., Harada, T., Masujima, T., T, H. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. , (2008).
  19. Phelps, M., Hamilton, J., Verbeck, G. F. Nanomanipulation-coupled nanospray mass spectrometry as an approach for single cell analysis. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 124101 (2014).
  20. Phelps, M. S., Verbeck, G. F. A lipidomics demonstration of the importance of single cell analysis. Analytical Methods. 7 (9), 3668-3670 (2015).
  21. Pan, N., Rao, W., Kothapalli, N. R., Liu, R., Burgett, A. W. G., Yang, Z. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Gong, X., et al. Single Cell Analysis with Probe ESI-Mass Spectrometry: Detection of Metabolites at Cellular and Subcellular Levels. Analytical Chemistry. 86 (8), 3809-3816 (2014).
  23. Lorenzo Tejedor, M., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. In Situ Molecular Analysis of Plant Tissues by Live Single-Cell Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (12), 5221-5228 (2012).
  24. Shimizu, T., et al. Live Single-Cell Plant Hormone Analysis by Video-Mass Spectrometry. Plant and Cell Physiology. 56 (7), 1287-1296 (2015).
  25. Yamamoto, K., et al. Cell-specific localization of alkaloids in Catharanthus roseus stem tissue measured with Imaging MS and Single-cell MS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (14), 3891 (2016).
  26. Date, S., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Direct Drug Metabolism Monitoring in a Live Single Hepatic Cell by Video Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 28 (3), 201 (2012).
  27. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  28. Masuda, K., Abouleila, Y., Ali, A., Yanagida, T., Masujima, T. Live Single-Cell Mass Spectrometry (LSC-MS) for Plant Metabolomics. BT - Plant Metabolomics: Methods and Protocols. , 269-282 (2018).
  29. Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Single oocyte and single embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 29-33 (2012).
  30. Ferreira, C. R., Pirro, V., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Developmental phases of individual mouse preimplantation embryos characterized by lipid signatures using desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (10), 2915-2926 (2012).
  31. Lee, J. K., Jansson, E. T., Nam, H. G., Zare, R. N. High-Resolution Live-Cell Imaging and Analysis by Laser Desorption/Ionization Droplet Delivery Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (10), 5453-5461 (2016).
  32. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  33. Yin, L., Zhang, Z., Liu, Y., Gao, Y., Gu, J. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry. Analyst. 144 (3), 824-845 (2019).
  34. González-Serrano, A. F., et al. Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Reveals Lipid Metabolism of Individual Oocytes and Embryos. PLoS ONE. 8 (9), e74981 (2013).
  35. Liu, Y., et al. Study on Variation of Lipids during Different Growth Phases of Living Cyanobacteria Using Easy Ambient Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (14), 7096-7102 (2014).
  36. Shrestha, B., et al. Subcellular Metabolite and Lipid Analysis of Xenopus laevis Eggs by LAESI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 9 (12), e115173 (2014).
  37. Stolee, J. A., Shrestha, B., Mengistu, G., Vertes, A. Observation of Subcellular Metabolite Gradients in Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 51 (41), 10386-10389 (2012).
  38. Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  39. Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and analysis of small cell populations and single cells by consecutive laser pulses. Applied Physics A. 101 (1), 121-126 (2010).
  40. Stolee, J. A., Vertes, A. Toward Single-Cell Analysis by Plume Collimation in Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (7), 3592-3598 (2013).
  41. Zhang, L., Vertes, A. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  42. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6545 LP-6550 (2015).
  43. Liu, R., Pan, N., Zhu, Y., Yang, Z. T-Probe: An Integrated Microscale Device for Online In Situ Single Cell Analysis and Metabolic Profiling Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90 (18), 11078-11085 (2018).
  44. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using Dicationic Ion-Pairing Compounds To Enhance the Single Cell Mass Spectrometry Analysis Using the Single-Probe: A Microscale Sampling and Ionization Device. Analytical Chemistry. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  45. Sun, M., Tian, X., Yang, Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Analytical Chemistry. 89 (17), 9069-9076 (2017).
  46. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass Spectrometry Measurement of Single Suspended Cells Using a Combined Cell Manipulation System and a Single-Probe Device. Analytical Chemistry. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  47. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 986-993 (2015).
  48. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), 53911 (2016).
  49. Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 124-134 (2016).
  50. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chemical Communications. 55 (5), 616-619 (2019).
  51. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic Studies of Live Single Cancer Stem Cells Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  52. Tian, X., Zhang, G., Shao, Y., Yang, Z. Towards enhanced metabolomic data analysis of mass spectrometry image: Multivariate Curve Resolution and Machine Learning. Analytica Chimica Acta. 1037, 211-219 (2018).
  53. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single Cell Isolation and Analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
  54. Wu, C., Wu, P., Zhao, H., Liu, W., Li, W. Clinical Applications of and Challenges in Single-Cell Analysis of Circulating Tumor Cells. DNA and Cell Biology. 37 (2), 78-89 (2017).
  55. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single Cell Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  56. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews. 22 (5), 332-364 (2003).

Tags

Kjemi enkelt cellemasse massespektrometri suspensjon celler integrert celle manipulasjon plattform Single-probe ambient ionisering Mikroskala prøvetaking
Integrert Cell manipulasjon Platform sammen med single-probe for Mass massespektrometri analyse av narkotika og metabolitter i single suspensjon celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Standke, S. J., Colby, D. H.,… More

Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells. J. Vis. Exp. (148), e59875, doi:10.3791/59875 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter