Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Gransker langsiktig Synaptic plastisitet i Interlamellar hippocampus CA1 av elektrofysiologisk Field Recording

Published: August 11, 2019 doi: 10.3791/59879
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 2
1Department of Biomedical Sciences, City University of Hong Kong, 2Department of Nano-Bioengineering, Incheon National University, 3Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering, Incheon National University
* These authors contributed equally

Summary

Vi brukte opptak og stimulering elektroder i langsgående hippocampus hjerne skiver og lengderetningen posisjonert opptak og stimulering elektroder i rygg hippocampus i vivo for å fremkalle ekstracellulære postsynaptic potensialer og demonstrere lang sikt Synaptic plastisitet langs langsgående interlamellar CA1.

Abstract

Studiet av Synaptic plastisitet i hippocampus har fokusert på bruk av CA3-CA1 lamellær nettverk. Mindre oppmerksomhet er gitt til den langsgående interlamellar CA1-CA1 nettverk. Nylig har imidlertid en associational forbindelse mellom CA1-CA1 pyramideformet neurons blitt vist. Derfor er det behov for å undersøke om den langsgående interlamellar CA1-CA1 nettverk av hippocampus støtter Synaptic plastisitet.

Vi utformet en protokoll for å undersøke tilstedeværelsen eller fraværet av langsiktig Synaptic plastisitet i interlamellar hippocampus CA1 nettverk ved hjelp elektrofysiologisk feltet innspillinger både in vivo og in vitro. For in vivo ekstracellulære felt innspillinger ble opptaks-og stimulering-elektrodene plassert i en septal-akse i rygg-aksen i en langsgående vinkel, for å fremkalle felt eksitatoriske postsynaptic potensialer. For in vitro ekstracellulære feltet innspillinger, hippocampus langsgående skiver ble kuttet parallelt med septal-Temporal flyet. Opptaks-og stimulering elektroder ble plassert i stratum Oriens (S. O) og stratum radiatum (S. R) av hippocampus langs langsgående aksen. Dette gjorde oss i stand til å undersøke retningsbestemt og lag spesifisitet av fremkalt eksitatoriske postsynaptic potensialer. Allerede etablerte protokoller ble brukt til å indusere langsiktige potensiering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD) både in vivo og in vitro. Våre resultater viste at den langsgående interlamellar CA1 nettverket støtter N-metyl-D-aspartate (NMDA) reseptor-avhengige langsiktige potensiering (LTP) uten retningsbestemt eller lag spesifisitet. Det interlamellar nettverket, derimot, i motsetning til det tverrgående lamellær nettverket, fantes ikke med noen betydelig langsiktig depresjon (LTD).

Introduction

Hippocampus har vært mye brukt i kognitiv studier1,2,3. Den hippocampus lamellær nettverk i tverrgående aksen danner Tri-Synaptic kretser som består av dentate gyrus, CA3 og CA1 regioner. Det lamellær nettverket anses å være en parallell og uavhengig enhet4,5. Dette lamellær synspunkt har påvirket bruken av tverrgående orientering og tverrgående skiver for både in vivo og in vitro elektrofysiologisk studier av hippocampus. I lys av nye undersøkelser, er lamellær hypotesen blir reevaluated6 og oppmerksomhet blir også gitt til interlamellar nettverk av hippocampus. Med hensyn til hippocampus interlamellar nettverket, CA3 regionen har lenge vært undersøkt7,8,9,10, men den langsgående CA1 hippocampus regionen har fått relativt liten oppmerksomhet inntil nylig. Med hensyn til CA1 interlamellar nettverket, den kortsiktige Synaptic egenskaper langs dorsoventral langsgående hippocampus CA1 akse av rotter har vist seg å variere11. Også klynger av hippocampus celler svarer til fase og stedet ble funnet å være arrangert systematisk langs langsgående aksen av hippocampus i rotter, gjennomgår en kortvarig minne oppgave12. Også epileptiske anfall aktiviteter ble funnet å bli synkronisert langs hele hippocampus langs langsgående aksen13.

De fleste studier av den langsgående CA1 hippocampus regionen har imidlertid benyttet innspill fra CA3 til de CA1 regionene11,14,15. Ved hjelp av en unik protokoll for å gjøre langsgående hjerne skiver, demonstrerte vårt tidligere arbeid associational tilkobling av CA1 pyramideformet neurons langs langsgående aksen og innblandet dens evne til å behandle neuronal signalering effektivt16. Men det er behov for å avgjøre om CA1 pyramideformet neurons langs langsgående aksen uten tverrgående innspill kan støtte langsiktig Synaptic plastisitet. Dette funnet kan legge til en annen vinkel i undersøkelser av nevrologiske problemer knyttet til hippocampus.

Evnen til neurons å tilpasse effekten av overføring av informasjon er kjent som Synaptic plastisitet. Synaptic plastisitet er innblandet som den underliggende mekanismen for kognitive prosesser som læring og minne17,18,19,20. Langsiktig Synaptic plastisitet er demonstrert som enten langsiktige potensiering (LTP), som representerer styrking av neuronal respons, eller langsiktig depresjon (LTD), som representerer svekkelsen av neuronal respons. Langsiktig Synaptic plastisitet har blitt studert i tverrgående aksen av hippocampus. Men dette er den første studien til å demonstrere langsiktig Synaptic plastisitet i hippocampus langsgående aksen av CA1 pyramideformet neurons.

Building fra en protokoll som brukes av Yang et al.16, designet vi protokollen til å demonstrere LTP og Ltd i hippocampus langsgående AKSEN av CA1 pyramideformet neurons. Vi brukte C57BL6 mannlige mus med aldre varierer mellom 5-9 uker gammel for in vitro eksperimenter og 6-12 uker gammel for in vivo eksperimenter. Denne detaljerte artikkelen viser hvordan langsgående hippocampus hjerne skiver fra mus ble innhentet for in vitro innspillinger og hvordan in vivo innspillinger ble registrert i den langsgående aksen. For in vitro innspillinger, undersøkte vi retningsbestemt spesifisitet av langsgående CA1 Synaptic plastisitet ved å målrette den septal og timelige slutten av hippocampus. Vi har også undersøkt lag spesifisitet av langsgående CA1 Synaptic plastisitet ved opptak fra stratum Oriens og stratum radiatum av hippocampus. For in vivo-innspillinger undersøkte vi vinklene som best tilsvarer den langsgående retningen til hippocampus.

Bruke både in vivo og in vitro ekstracellulære felt innspillinger, observerte vi at lengderetningen koblet CA1 pyramideformet neurons presentert med LTP, ikke LTD. Den tverrgående orientering som involverer både CA3 og CA1 neurons, men støtter både LTP og LTD. Skillet i Synaptic evner mellom tverrgående og langsgående orientering av hippocampus kunne spekulativt betegne forskjeller i deres funksjonelle tilkobling. Ytterligere eksperimenter er nødvendig for å dechiffrere forskjellene i sine Synaptic evner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr ble behandlet i samsvar med retningslinjer og forskrifter fra Animal Care og bruk av laboratorium for National Institute of Health. Alle metoder beskrevet her har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av City University of Hong Kong og Incheon National University.

1. in vivo felt opptak

  1. Forberedelse av dyr
    1. Injiser polyuretan (0,06 g per 25 g vekt) intraperitonealt til bedøve mus. Supplere med intramuskulær injeksjon av atropin (0,05 mg/kg). Hold musen i en mørk rolig flekk til full anestesi trer i kraft.
      FORSIKTIG: polyuretan har kreftfremkallende potensial. Håndter den med forsiktighet og bruk verneklær for å unngå kontakt med eksponert hud.
      Merk: Alternativt kan isoflurane brukes som anestesi.
    2. Sjekk for dybde av anestesi periodisk til en full kirurgisk fly av anestesi trer i kraft. Sjekk for dybde av anestesi ved å utføre tå knipe, øret klype, hale klype og hornhinnen touch tester for å observere responsen av musen til fysiske stimuli.
      Merk: en refleks eller frivillig bevegelse bør ikke observeres når musen er på et fullt kirurgisk fly av anestesi.
    3. For tå klype test, forlenge enten bak eller forben av musen og knip fast med et par Butt tang eller fingre. Musen er ikke bekreftet for full anestesi hvis det trekker benet eller rister kroppen, har en Observer økt respirasjonsfrekvens eller gjør vokallyder.
    4. For øret knipe test, klype endene av høydepunktene med et par Butt tang eller fingre fast. Full anestesi er ikke bekreftet Hvis musen beveger kinnskjegg fremover, rister på hodet, gjør vokallyder eller har en synlig økt respirasjonsfrekvens.
    5. For halen klype test, hold halen av musen forsiktig og fast klype med en stump tang eller finger. Ingen hale bevegelse, vokal lyd eller observert økning i respirasjonsfrekvens bør observeres når fullt anesthetized for kirurgiske prosedyrer.
    6. For hornhinnen touch test, berøre hornhinnen av musen forsiktig, med en bomulls-Wick. Ingen øyelokk bevegelse, whisker bevegelse eller synlig økning i respirasjonsfrekvens bør observeres når fullt anesthetized for kirurgi.
    7. Barbere håret på nakken og skallen på musen.
    8. Plasser den fullt anesthetized musen på en varmepute satt til 37 ° c og sett rektal temperatur sonde i endetarmen. Dette gjør at varmen som produseres av varmeputen å justere som svar på endringer av musen kroppstemperatur.
    9. Påfør øye gel for å fukte øynene til musen.
    10. Trekk tungen ut til siden av leppene forsiktig ved hjelp av pinsett og fest de to fremre tennene inn i andre eller tredje tenner hullet i stereotactic instrumentet. Fest skallen på musen fast ved hjelp av øye-klemme.
      Merk: Alternativt kan en stereotactic øre klemme brukes.
    11. Observerer under et mikroskop, skille subkutan vev og muskler på slutten av interparietal og occipital bein av musen med en skalpell å utsette Cisterna magna. Blot Dura mater tørr med en bomullsdott.
    12. Forsiktig punktering av Cisterna magna ved å lage en grunne kuttet med en skarp spiss skalpell blad å drenere spinalvæsken (CSF). Fest en bomullspinne for å holde drenering av CSF.
  2. Kraniotomi
    1. Holde huden på hodebunnen med pinsett, klippe og fjerne huden med et par kirurgiske saks. Skjær nok hud til å eksponere bregma og lambda merker på hodebunnen. Hold den utsatte regionen tørr.
    2. Juster den klemt skallen på musen for å aktivere bregma og lambda-punktene som skal justeres i et horisontalt nivå av tilsvarende høyde. Unngå å vippe hodet i enten fremre bakre posisjon eller i midtre sidestilling.
    3. Merk punktene som tilsvarer den hippocampus regionen ved hjelp av en Vernier-sko. Bruk musen hjernen i en stereotactic koordinat bok som en referanse for å bestemme de nøyaktige koordinatene.
      Merk: plasseringen for å markere snitt for hippocampus er 1 mm x 3 mm på midtlinjen referert til som fremre-bakre (AP) ved hjelp av bregma som referansepunkt, og 3 mm x 3 mm vinkelrett på midtlinjen (ML) for å koble punktene på midtlinjen. De stereotactic koordinatene gis som (AP: 1, 3 og ML: 3, 3).
    4. Lag et snitt i skallen over rygg området til hippocampus langs de markerte punktene ved hjelp av en skalpell eller høyhastighets Drill mens du observerer under et mikroskop.
      Merk: en rektangulær formet åpning med en størrelse på 2 mm x 3 mm bør fås etter snitt. Hold utsatte området rent for å unngå skade på hjernen.
    5. Nøye ta ut den løse skallen med tang for å avdekke Dura mater og bruke en sprøyte eller dropper å forsiktig bruke fysiologiske saltvann løsning for å holde overflaten fuktig.
    6. Fjern Dura mater nøye med nål eller skarp spiss tupp tang.
      Merk: Pass på at du ikke skader hjernevevet under kraniotomi. Dette vil føre til hevelse i hjernen og vil påvirke resultatene.
    7. Hold eksponert hjernevev fuktig ved å påføre fysiologisk saltvann eller inert olje ved hjelp av en dråpe eller sprøyte.
  3. In vivo-opptak
    1. Fest og plasser stimulering og Innspillings elektroden godt inn i stereotactic holderen. Juster det stereotactic instrumentet i henhold til plasseringen av de korresponderende AP-og ML-koordinatene for stimulering og opptaks elektroder over CA1 rygg hippocampus.
      Merk: Bruk musen hjernen i stereotactic koordinater som en guide for å finne koordinatene for rygg langsgående CA1 hippocampus regionen. For eksempel vil en stereotactic koordinat for CA1 hippocampus-regionen være (AP 1,5, ML 1,0) for opptaks elektroden og (AP 1,7, ML 1,5) for stimulering elektroden.
    2. Finn den stimulerende elektroden sideveis til opptaks elektroden i en langsgående retning.
      Merk: Sørg for at både stimulering og opptaks elektroder er rene før bruk. Dette hindrer innføringen av støy under opptak.
    3. For opptak, bruk flerkanals elektroder. Først må du finne de stereotactic koordinatene for CA1 hippocampus-regionen ved hjelp av den første kanalen. Plasser de resterende elektrodene slik at vinkelen på stimulering og opptaks elektroder er i området 30 ° til 60 ° i forhold til midtlinjen fra bregma punkt.
      Merk: denne vinkelen tilsvarer den langsgående orienteringen til CA1 hippocampus-regionen.
    4. Som en kontroll, finner du Innspillings elektroden over CA1-regionen og stimulering elektroden over CA3-regionen i rygg-hippocampus. For eksempel, ved hjelp av musen hjernen i stereotactic koordinater som en guide, en stereotactic koordinat for CA1-CA3 hippocampus regionen vil være (AP 1,8, ML 1,0) for opptaks elektroden og (AP 1,5, ML 1,5) for stimulering elektroden.
      Merk: dette trinnet er en alternativ kontroll og bør gjøres i et eget eksperiment.
    5. Plasser referanse elektroden på en av de andre delene av den utsatte hjerne regionen eller under huden på musen.
    6. Slå på opptaks systemet.
    7. Åpne programvaren for innspilling og datainnhenting.
      Merk: ulike laboratorier har sin foretrukne programvare for innspilling og datainnhenting.
    8. Observerer under et mikroskop, senke opptaket og stimulering elektroder langsomt ved hjelp av micromanipulator til det bare berører overflaten av hjernen. Merk punktet som nullpunktet for å begynne å beregne nøyaktig dybde til hippocampus regionen.
      Merk: micromanipulator kan brukes til å overvåke dybden der elektroden er satt inn til enhver tid. Observer en økning i impedans akkurat når elektroden berører hjernen overflaten.
    9. Langsomt senke elektrodene til omtrentlig dybde som tilsvarer de valgte stereotactic koordinater for CA1 hippocampus.
      Merk: Bruk musen hjernen i stereotactic koordinater som en guide for å få den omtrentlige dybden som tilsvarer de valgte stereotactic koordinater.
    10. Gi stimulering (100 μs varighet, gjentatt med 30 s intervaller) og Juster elektrode dybden i trinn på 50 μm eller mindre til det observeres et stabilt fremkalt felt eksitatoriske postsynaptic potensiale (fEPSP).
      Merk: en stimulans på 20 μA er vanligvis nok til å fremkalle en synlig respons.
    11. Sørg for at en stabil fEPSP har blitt fremkalt ved å variere stimulans intensiteten. En merkbar økning i skråningen eller amplitude av fEPSP bør observeres med hver økt stimulans intensitet. Dette er betegnet som input-output kurve. Lag en input-output (I-O) kurve for å oppdage maksimal stimulans intensitet som det er ikke mer økning i skråningen av fremkalt fEPSP (figur 6).
      Merk: Forkast data og endre elektrode posisjonen hvis fiber volley forsvinner under forsøket.
    12. Bruk kurven for inn data utdata til å angi den opprinnelige intensiteten til 40-50% av maksimumsverdien. Bruk tilsvarende stimulans intensitet for Baseline innspillingen.
    13. Registrer det lokale felt potensialet som en opprinnelig plan for 20-30 min.
    14. Bruk samme input-output kurve for å angi stimulans intensiteten for fremkaller høy frekvens stimulering (HFS) eller stivkrampe til 75% av maksimal intensitet. Alternativt, ved å indusere langsiktig depresjon, opprettholde den samme stimulans intensiteten som brukes for innspilling av Baseline når fremkaller lav frekvens stimulering (LFS).
    15. Påfør en tetanic stimulering av 100 Hz pulser 4 ganger med et 10 s intervall for å indusere LTP.
      Merk: Bruk denne protokollen bare når du arbeider på et langsiktig potensiering eksperiment.
    16. Påfør lav frekvens stimulering av 5 Hz (900 stimuli i løpet av 3 min), 1 Hz LFS (900 stimuli i løpet av 15 min.), eller 1 Hz par-puls (50 MS par-puls intervall, 900 par stimuli i løpet av 15 min) for å indusere LTD i henhold til allerede etablerte protokoller.
      Merk: Bruk disse protokollene bare når du arbeider med en langsiktig depresjon eksperiment.
    17. Ta opp det lokale felt potensialet for 1 time etter HFS eller AKU, alternativt.
    18. Eksporter data og analyser ved hjelp av programvaren.
    19. Kontroller plasseringen av opptaket og stimulering elektroden ved å gi en stimulering av 10 μA strøm for 30 s til lesjon de registrerte områdene. Transcardially perfuse musen med 4% paraformaldehyde og høste hjernen for kutting og farging med Cresyl Violet henhold.
    20. Euthanize mus ved cervical forvridning eller injeksjon av dødelig anestesi dosering etter eksperimentet.

2. in vitro feltet innspillingen

  1. Forbereder oksygenert kutting og kunstig spinalvæske (ACSF) løsninger
    1. For 2 L av kutting løsning, tilsett ca 1 L av dobbelt destillert vann i et volum kolbe og rør kraftig på en stirrer plate.
    2. Legg til følgende komponenter for kutting løsning (i mM): 87,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 NaH2PO4, 25,0NaHCO 3, 25,0 glukose, 75,0 sukrose, 7,0MgCl 2. 6h2o og 0,5 CaCl2∙ 2h2o (tabell 1).
      Merk: Alternativt kan MgCl2∙ 6h2o og CaCl2∙ 2h2o utelates i dette stadiet og legges til senere i et klar til å bruke volum.
    3. Topp opp til 2 L med dobbelt destillert vann under omrøring.
    4. For 2 L av ACSF, tilsett ca 1 L av dobbel destillert vann i et volum kolbe og rør kraftig på en stirrer plate.
    5. Legg til følgende ACSF løsningskomponenter (i mM): 125,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 NaH2PO4, 25,0 NaHCO3, 25 glukose, 1,0 MgCl2∙ 6h2o og 2,0 CaCl2∙ 2h2o (tabell 1).
      Merk: Alternativt kan MgCl2. 6h2o og CaCl2∙ 2h2o bli ekskludert i dette stadiet og lagt til senere i en klar til å bruke volum.
    6. Topp opp til 2 L med dobbelt destillert vann under omrøring.
  2. Oppsett og hjerne kutting
    1. Hell 400 mL allerede forberedt kutting løsning i en egen kolbe og oxygenate (95% O2/5% co2) i ca 20 min.
    2. Oppbevar resten av 1,6 L-løsningen i et kjøleskap på 4 ° c. Hold løsningen opp til 1 uke etter som det må kastes hvis ikke brukes til å unngå soppvekst.
    3. Hell 200 mL av oksygenert skjære løsningen i flasken, dekk med parafilm og Overfør til en-80 ° c fryser i ca. 20 min for å lage en slaps.
    4. Hell de resterende 200 mL av kutting løsning i en hjerne skive holde kammer og holde i en 32 ° c vannbad med kontinuerlig bobler.
    5. Forbered benken for kutting. Legg papirhåndklær ned og kirurgiske verktøy på toppen av benken. Ordne kirurgiske verktøy i bruk for å lette en rask og effektiv prosess (figur 7).
    6. Ta ut kjølt kutting løsningen fra fryseren og hell ca 50 mL i et beger. Hell ca 10 mL i en Petri parabolen inneholder filter papir for å fukte den. Plasser dem på isen ved disseksjon området.
    7. Hell resten av slushed kutting løsning i kutting kammeret og fikse det på vibratome.
    8. Bedøve musa med isoflurane benytter retningslinjene og reguleringer opp på dyr bekymre og bruk av laboratorium av nasjonal off av sunnhet, og det anerkjent metoder av institusjonell dyr bruk og bekymre komité av by universitet av Hong Kong og Incheon nasjonal University.
    9. Halshugge den anesthetized musen med et par saks og Legg hodet på silkepapir. Skjær huden som dekker skallen på musen og skjære gjennom hud musklene med saks. Skjær skallen platene langs midtlinjen til occipital benet ved hjelp av kirurgisk saks.
    10. Åpne skallen med stump tang for å utsette hjernen. Forsiktig scoop ut hjernen med en slikkepott og plasser i kjølt kutting løsningen i begeret. Vent 30 s.
    11. Ta ut hjernen ved hjelp av skjeen og forsiktig plassere den på tidligere fuktet filter papir i Petri parabolen.
    12. Skill de to hjernen halvkuler langs midtlinjen med en skalpell blad. Isoler hippocampus ved å løsne det forsiktig fra cortex med en slikkepott og legg den forsiktig på fuktet filter papir. Skjær ut septal og den timelige enden av den isolerte hippocampus ved hjelp av skalpell.
    13. Plukk opp isolert hippocampus ved hjelp av en butt slikkepott og pensel. Forsiktig DAB slikkepotten på en silkepapir for å fjerne overflødig vann.
    14. Påfør en liten mengde lim til skjære platen på vibratome.
    15. For en langsgående CA1 hippocampus skive, fest CA3 regionen av hippocampus til skjære platen med limet. Raskt, men forsiktig plassere den i kutting kammer av vibratome som inneholder kjølt oksygen kutting løsning.
    16. For den tverrgående skive som vil tjene som en kontroll, fester den ventrale enden av hippocampus til kutting plate av vibratome. Raskt, men forsiktig plassere den i kutting kammeret inneholder kjølt oksygenert disseksjon løsning.
      Merk: dette trinnet er et alternativ til trinnet ovenfor og bør utføres separat.
    17. Plasser blad vinkelen til 90 °. Sett vibratome parametre til en hastighet på 0,05 mm/s, en amplitude på 1,20 mm og en skive tykkelse på 400 μm.
    18. Skjær den vedlagte hippocampus med vibratome.
      Merk: en god langsgående CA1 hippocampus hjernen skive vil ha ett lag av CA1 og 2 lag med dentate gyrus. Maksimalt 2 gode hippocampus skiver kan fås. Alternativt, en tverrgående hippocampus hjerne skive vil ha dentate gyrus, CA3 og CA1 regioner intakt.
    19. Overfør de langsgående hippocampus hjerne skiver fra vibratome med en pipette og ruge den i hjernen skive holde kammer i vannbad.
    20. Ruge skiver i vannbadet i 20 min ved en temperatur på 32 ° c og bringe ut til romtemperatur i 30 min for utvinning.
      Merk: Alternativt, overføre hjernen skive når ut av vannbad og forsiktig plassere den i innspillingen kammer med rennende oksygen ACSF ved en temperatur på 32 ° c i 30 min for utvinning.
    21. Mens incubating i vannbad, helle 400 mL ACSF løsning i en egen kolbe og oxygenate (95% O2/5% co2) for ca 20-30 min før du overfører hjernen skive inn i opptaket kammeret. Superfuse ACSF kontinuerlig i Innspillings kammeret med en hastighet på 2 mL/min.
    22. Slå på temperatur kontrolleren for å varme opp den strømmende ACSF til 32 ° c.
    23. Oppbevar resten av 1,6 L-løsningen i et kjøleskap på 4 ° c. Hold løsningen opp til en uke etter som det må kastes hvis ikke brukes til å unngå soppvekst.
  3. Opptak in vitro
    1. Sett opp en opptaks rigg ved å slå på all nødvendig maskinvare.
    2. Overfør hjerne stykket fra stykket som holder kammeret inn i Innspillings kammeret. Juster plasseringen av hjernen skive med sløv tang og hold den på plass med en harpe. La ACSF kjøre i minst 20 minutter. Dette gjør det mulig for hjerne sektoren å være stabil før opptak.
    3. Fyll opptaks pipette med ACSF som en intern løsning.
    4. Sjekk opptaket pipette motstand med utpekt programvare. Den innspillingen pipette motstanden bør være innenfor området 3-5 MΩ.
    5. Slå på programvaren for datainnhenting. Denne programvaren skal ha lignende funksjoner som muliggjør innhenting av data på en lignende måte som in vivo-innspillinger vist tidligere.
    6. Fest opptaket og stimulering elektrodene godt inn i stereotactic instrument holde ren. Plasser referanse elektroden i ACSF i opptaks kammeret.
    7. For langsgående skiver, plasser stimulering og opptaks elektroden i stratum Oriens (S.O.). Hold avstanden mellom elektrodene til ca 300 til 500 μm. Plasser stimulering elektroden på enten septal eller den timelige siden av hjernens skive og ta opp fra samme lag (Figur 8).
    8. Du kan også plassere stimulering og opptaks elektroden i stratum radiatum (S.R.). Plasser stimulering elektroden på enten septal eller temporal side av hjerne sektoren.
    9. For tverrgående skiver som en kontroll, plasserer du den stimulerende elektroden på CA3-området (Schaffer-sikkerhet) og Innspillings elektroden i CA1-regionen (figur 9).
      Merk: Dette er et alternativ kontroll trinn og bør utføres i et eget eksperiment.
    10. Slå på den isolerte stimulans generatoren og gi stimulering (100 μs varighet, gjentas med 30 s intervaller). Juster opptaks elektroden dybden og/eller posisjon til en stabil fremkalt eksitatoriske postsynaptic feltet potensialet er observert.
    11. Sørg for at en stabil fEPSP har blitt fremkalt ved å variere stimulans intensiteten. En merkbar endring i skråningen av fEPSP bør observeres med hver endring av stimulans intensitet. Dette er betegnet som input-output kurve. Lag en input-output (I-O) kurve for å oppdage maksimal stimulans intensitet som det ikke er mer økning i skråningen av FEPSP (figur 6).
      Merk: Forkast data og endre elektrode posisjonen hvis fiber volley forsvinner under forsøket.
    12. Bruk den input-output kurve for å angi stimulans intensiteten for Baseline opptak og for fremkaller høy frekvens stimulering (HFS) eller stivkrampe til 30-40% av maksimal fremkalt fEPSP.
    13. For eksperimenter med LTD bruker du eventuelt kurven for inn data utdata til å angi den opprinnelige intensiteten for Baseline-opptak, og for fremkaller med lav frekvens stimulering (LFS) til 70% av maksimal fremkalt fEPSP.
    14. Registrer det lokale felt potensialet som opprinnelig plan for 20-30 min.
    15. Påfør HFS på 100 Hz pulser to ganger med et 30 s intervall for å indusere LTP.
    16. Alternativt, for LTD eksperimenter, gjelder lav frekvens stimulering av 5 Hz (900 stimuli i løpet av 3 min) eller 1 Hz LFS (900 stimuli under 15 min) eller 1 Hz sammenkoblet-puls (50 MS par-puls intervall, 900 par av stimuli i løpet av 15 min) å indusere LTD i henhold til allerede etablerte protokollen.
    17. Ta opp det lokale felt potensialet for 1 time etter HFS eller LFS.
    18. Eksporter data og analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi utforsket langsiktig Synaptic plastisitet av langsgående CA1 pyramideformet neurons av hippocampus bruke ekstracellulære feltet innspillinger både in vivo og in vitro. LTP og LTD er fasetter av langsiktige Synaptic plastisitet som har blitt demonstrert i tverrgående aksen av hippocampus å være enveis.

Vi viste her at ved hjelp av langsgående hippocampus hjerne skiver, er det LTP i CA1 langsgående aksen av hippocampus. Vi forberedte langsgående skiver av hippocampus langs septotemporal aksen, som er vinkelrett på tverrgående skiver (figur 1). Ved hjelp av innspillinger fra CA1 regionen på hippocampus, viste vi tilstedeværelsen av LTP som ikke var retning bestemt. Det var ingen statistisk signifikante forskjeller i opptakene fra septal eller temporal (figur 2) side av den langsgående hippocampus hjernen skive. Vi viste også tilstedeværelsen av LTP som ikke var laget spesifikt; dermed viste innspillinger fra både stratum radiatum og stratum Oriens (figur 2) vellykket indusert LTP i den langsgående hjerne sektoren. Vi brukte D-AP5, en NMDAR motstander til å demonstrere at LTP indusert var avhengig av NMDA reseptorer (Figur 3). Det som skjer in vitro reflekterer ikke nødvendigvis in vivo-forhold, så vi undersøkte LTP in vivo. Figur 4 a viser et skjematisk diagram av stimulering og opptak elektroden plassert i rygg hippocampus langs langsgående AKSEN i CA1 regionen in vivo. Plasseringen av elektrodene som brukes for opptak og stimulering ble verifisert av lesjon merker og krystall fiolett farging (Figur 4a). Vi demonstrerte tilstedeværelsen av LTP in vivo i den langsgående CA1 regionen (Figur 4b).

Ved å bruke allerede etablerte protokoller for å indusere LTD, klarte vi ikke å indusere LTD både in vivo og in vitro (figur 5).

Figure 1
Figur 1 . En skjematisk tegning av tverrgående og langsgående hippocampus hjerne skiver. Dette tallet er tilpasset og modifisert fra Sun et al. 201821. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . LTP i langsgående skiver. Synaptic responser på S.R. (a) eller S.O. (b) i langsgående skiver er forsterket rett etter stivkrampe stimulering med både timelige og septal innganger (S.R./Temporal (n = 12, c), S.R./septal (n = 12, c), S.O./Temporal (n = 10, d), S.O./septal (n = 9, d).
N står for antall skiver. Feilfelt representerer SE. Dette tallet er tilpasset og modifisert fra Sun et al. 201821. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . NMDAR-avhengige LTP i langsgående skiver. (a,b) LTP induksjon i timelig og septal retning blokkeres av 50 μM D-AP5 (Temporal, n = 6, a) (septal, n = 5, b). (c,d) LTP induksjon i timelig og septal retning blokkeres også av D-AP5. N står for skiver. Feilfelt representerer SE. Dette tallet er tilpasset og modifisert fra Sun et al. 201821. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . In vivo LTP i interlamellar nettverket. (a) en skjematisk tegning av opptaks-og stimulering elektroder i anesthetized dyr. Loci av innspillingen (på septal side av CA1) og stimulerende elektroder (på den timelige siden av CA1) ble identifisert ved lesjon merker. (b) LTP er indusert i interlamellar tilkobling av 100 Hz høy frekvens STIMULERING (HFS) (n = 10 mus). Farge spor: før (svart) og etter (rød) HFS. Feilfelt representerer SE. Dette tallet er tilpasset og modifisert fra Sun et al. 201821. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Fravær av in vivo og in vitro LTD i Interlamellar CA1 nettverk. (a) 1 Hz-PP LFS induserer ikke in vivo Ltd. (b) 1 Hz PP-LTP, (c) 5 Hz LFS, og (d) 1 Hz LFS produserer ikke Ltd på enten Temporal eller septal sider av langsgående hjerne skive. mens LTD er indusert av 1 Hz PP-LFS i tverrgående skiver: Temporal (n = 8), septal (n = 11) og tverrgående (n = 6) med 1 Hz PP-LFS; Temporal (n = 3) og septal (n = 3) med 5 Hz LFS; Temporal (n = 3) og septal (n = 3) med 1 Hz LFS. N står for skiver. Feilfelt representerer SE. Dette tallet er tilpasset og modifisert fra Sun et al. 201821. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Input-utgang kurve presentere fEPSP skråningen som svar på økende stimulans innspill i hippocampus hjernen skive. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 . Kirurgiske verktøy som brukes til hippocampus isolering under in vitro hjerne kutting. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 . En langsgående hjerne skive klar for opptak. Stimulering elektrode og opptak pipette er satt inn i stratum radiatum. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9 . En tverrgående hippocampus hjernen skive klar for opptak. Stimulering elektroden er satt inn i Schaffer sikkerhet CA3 regionen og innspillingen pippette er satt inn i CA1 regionen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sammensatte Kutting løsning (mM) ACSF (mM)
CaCl2. 2h2O 0,5 2
Glukose 25 25
KCl 2,5 2,5
MgCl2. 6h2O 7 1
Nacl 87 125
NaH2PO4 1,3 1,3
NaHCO3 25 25
Sukrose 75

Tabell 1: konsentrasjoner av forbindelser i hjerne sektoren og kunstige spinalvæske løsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen demonstrerer metoden for å indusere langsiktig Synaptic plastisitet i vivo så vel som fra hjerne skiver i den langsgående CA1-CA1 aksen av hippocampus in vitro. Trinnene skissert gir nok detaljer for en eksperimentator å undersøke LTP og LTD i en langsgående hippocampus CA1-CA1 tilkobling. Praksis er nødvendig for å finpusse ferdighetene som kreves for å lykkes posten feltet eksitatoriske potensialer.

I tillegg til å trenge praksis, er det flere viktige skritt som er avgjørende for å oppnå gode resultater. Først ble det vist tidligere at vinkelen som hjernen skiver ble gjort kan enten avkorte eller bevare den langsgående projeksjoner av pyramideformet neurons i CA1-CA1 regionen av hippocampus16. Den langsgående pyramideformet neurons prosjektet fra tverrgående neurons i en vinkel som er nesten vinkelrett. Som CA1 neurons spredd i ulike vinkler i hippocampus, den langsgående forbindelse mellom dem legger ut langs dorsoventral aksen av hippocampus. Således, for in vitro innspillingen, må eksperimentator ha dette i tankene å nøyaktig målrette CA1-CA1 hippocampus neurons langs langsgående aksen ved å kutte isolert hippocampus vev langs rygg-ventrale aksen. Også for in vivo innspillinger, vinkelen som stimulering og opptaks elektrodene er posisjonert avgjør om resultatene innhentet er representative for den langsgående aksen eller en blanding av både tverrgående og langsgående aksen. Videre undersøkelser utnytte CRISPR-Cas9 kan gjøres for å bekrefte om den utløste responsen er utelukkende fra CA1 regionen siden det kan være en blanding av svar fra både CA1 og CA3 regioner.

For det andre, for in vitro eksperimenter, må eksperimentator sikre at hjernen kutting løsning, ACSF, arbeidsbenk og alt utstyr eller instrumenter som kommer i kontakt med hjernen skive er fri for forurensninger. Enhver form for forurensning vil føre til forringelse av integriteten eller død av hjernen skive. Å opprettholde en ren elektrode overflate sikrer gode og stabile opptak for både in vitro-og in vivo-eksperimenter.

Vi har vist at den langsgående hippocampus CA1 nettverket utstillinger NMDAR-avhengige LTPs, men ikke LTDs. Den trisynaptic Circuit, men presenterer med både LTP og Ltd22,23. Dette innebærer at den langsgående CA1 nettverket og Tri-Synaptic kretsene har unike funksjoner. Vår protokoll gjør bruk av kun elektrofysiologisk innspillinger og er derfor begrenset til å finne forskjellen mellom disse to nettverkene.

Jakten på en kur for hjernesykdommer som schizofreni fortsetter. Avslå eller misdannelse av CA1 hippocampus regioner har vært knyttet til noen schizofren symptomer24,25. Anvendelsen av vår protokoll, men grunnleggende, har brakt til lys en unik Synaptic evne til CA1 langsgående hippocampus under region. Denne kunnskapen er nyttig i å designe eksperimenter som kan videre undersøke denne ødeleggende hjerne sykdommen langs langsgående CA1 aksen av hippocampus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Incheon National University (International Cooperative) Research Grant. Vi vil gjerne takke MS gona Choi for å bistå med noen datainnsamling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atropine Sulphate salt monohydrate, ≥97% (TLC), crystalline Sigma-Aldrich 5908-99-6 Stored in Dessicator
Axon Digidata 1550B
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10035-04-8
Clampex 10.7
D-(+)-Glucose ≥ 99.5% (GC) Sigma-Aldrich 50-99-7
Eyegel Dechra
Isoflurane RWD Life Sciences R510-22
Magnesium chloride hexahydrate, BioXtra, ≥99.0% Sigma-Aldrich 7791-18-6
Matrix electrodes, Tungsten FHC 18305
Multiclamp 700B Amplifier
Potassium chloride, BioXtra, ≥99.0% Sigma-Aldrich 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic anhydrous ≥99% Sigma-Aldrich 7778-77-0 Stored in Dessicator
Pump Longer precision pump Co., Ltd T-S113&JY10-14
Silicone oil Sigma-Aldrich 63148-62-9
Sodium Bicarbonate, BioXtra, 99.5-100.5% Sigma-Aldrich 144-55-8
Sodium Chloride, BioXtra, ≥99.5% (AT) Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic, powder Sigma-Aldrich 7558-80-7
Sucrose, ≥ 99.5% (GC) Sigma-Aldrich 57-50-1
Temperature controller Warner Instruments TC-324C
Tungsten microelectrodes FHC 20843
Urethane, ≥99% Sigma-Aldrich 51-79-6
Vibratome Leica VT-1200S
Water bath Grant Instruments SAP12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levy, W. B. A sequence predicting CA3 is a flexible associator that learns and uses context to solve hippocampal-like tasks. Hippocampus. 6 (6), 579-590 (1996).
  2. Eldridge, L. L., Knowlton, B. J., Furmanski, C. S., Bookheimer, S. Y., Engel, S. A. Remembering episodes: A selective role for the hippocampus during retrieval. Nature Neuroscience. 3 (11), 1149-1152 (2000).
  3. Sullivan Giovanello, K., Schnyer, D. M., Verfaellie, M. A critical role for the anterior hippocampus in relational memory: evidence from an fMRI study comparing associative and item recognition. Hippocampus. 14 (1), 5-8 (2004).
  4. Andersen, P., Bland, B., Dudar, J. D. Organization of the hippocampal output. Experimental Brain Research. 17 (2), 152-168 (1973).
  5. Andersen, P., Bliss, T. V. P., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Experimental Brain Research. 13 (2), 222-238 (1971).
  6. Sloviter, R., Lømo, T. Updating the Lamellar Hypothesis of Hippocampal Organization. Frontiers in Neural Circuits. 6 (102), (2012).
  7. Ishizuka, N., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. Journal of Comparative Neurology. 295 (4), 580-623 (1990).
  8. Tamamaki, N., Nojyo, Y. Crossing fiber arrays in the rat hippocampus as demonstrated by three-dimensional reconstruction. Journal of Comparative Neurology. 303 (3), 435-442 (1991).
  9. Swanson, L., Wyss, J., Cowan, W. An autoradiographic study of the organization of intrahippocampal association pathways in the rat. Journal of Comparative Neurology. 181 (4), 681-715 (1978).
  10. Rebola, N., Carta, M., Mulle, C. Operation and plasticity of hippocampal CA3 circuits: implications for memory encoding. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 208 (2017).
  11. Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79 (2017).
  12. Hampson, R. E., Simeral, J. D., Deadwyler, S. A. Distribution of spatial and nonspatial information in dorsal hippocampus. Nature. 402, 610 (1999).
  13. Umeoka, S. C., Lüders, H. O., Turnbull, J. P., Koubeissi, M. Z., Maciunas, R. J. Requirement of longitudinal synchrony of epileptiform discharges in the hippocampus for seizure generation: a pilot study. Journal of Neurosurgery. 116 (3), 513-524 (2012).
  14. Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65, (2010).
  15. Milior, G., et al. Electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons along the longitudinal axis of the mouse hippocampus. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Yang, S., et al. Interlamellar CA1 network in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (35), 12919-12924 (2014).
  17. Tsien, J. Z., Huerta, P. T., Tonegawa, S. The Essential Role of Hippocampal CA1 NMDA Receptor–Dependent Synaptic Plasticity in Spatial Memory. Cell. 87 (7), 1327-1338 (1996).
  18. Bliss, T., Collingridge, G. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
  19. Roman, F., Staubli, U., Lynch, G. Evidence for synaptic potentiation in a cortical network during learning. Brain Research. 418 (2), 221-226 (1987).
  20. McNaughton, B., Barnes, C., Rao, G., Baldwin, J., Rasmussen, M. Long-term enhancement of hippocampal synaptic transmission and the acquisition of spatial information. Journal of Neuroscience. 6 (2), 563-571 (1986).
  21. Sun, D. -g, et al. Long term potentiation, but not depression, in interlamellar hippocampus CA1. Scientific Reports. 8 (1), 5187 (2018).
  22. Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
  23. Milner, A. J., Cummings, D. M., Spencer, J. P., Murphy, K. P. Bi-directional plasticity and age-dependent long-term depression at mouse CA3-CA1 hippocampal synapses. Neuroscience Letters. 367 (1), 1-5 (2004).
  24. Bogerts, B., et al. Hippocampal CA1 deformity is related to symptom severity and antipsychotic dosage in schizophrenia. Brain. 136 (3), 804-814 (2013).
  25. Ho, N. F., et al. Progressive Decline in Hippocampal CA1 Volume in Individuals at Ultra-High-Risk for Psychosis Who Do Not Remit: Findings from the Longitudinal Youth at Risk Study. Neuropsychopharmacology. 42, 1361 (2017).

Tags

Nevrovitenskap hippocampus interlamellar CA1 hippocampus langsiktig Synaptic plastisitet in vitro ekstracellulære feltet innspillingen in vivo ekstracellulære feltet opptak CA1 pyramideformet Nevron schizofreni
Gransker langsiktig Synaptic plastisitet i Interlamellar hippocampus CA1 av elektrofysiologisk Field Recording
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tetteh, H., Lee, J., Lee, J., Kim,… More

Tetteh, H., Lee, J., Lee, J., Kim, J. G., Yang, S. Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording. J. Vis. Exp. (150), e59879, doi:10.3791/59879 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter