Summary
Мы использовали записи и стимуляции электродов в продольных гиппокампа ломтики мозга и продольно расположен записи и стимуляции электродов в царском гиппокампе in vivo, чтобы вызвать внеклеточные постсинаптических потенциалов и продемонстрировать долгосрочная синаптическая пластичность вдоль продольного интерламеллярного CA1.
Abstract
Изучение синаптической пластичности в гиппокампе было сосредоточено на использовании ламеллярной сети CA3-CA1. Меньше внимания уделяется продольной интерламеллярной сети CA1-CA1. В последнее время, однако, ассоциативные связи между CA1-CA1 пирамидальных нейронов было показано. Поэтому необходимо исследовать, поддерживает ли продольная интерламеллярная сеть CA1-CA1 гиппокампа синаптической пластичностью.
Мы разработали протокол для исследования наличия или отсутствия долгосрочной синаптической пластичности в интерламелларной сети гиппокампа CA1 с использованием электрофизиологических полевых записей как in vivo, так и in vitro. Для in vivo внеклеточных полевых записей, записи и стимуляции электродов были помещены в перегородке-височной оси дорсального гиппокампа под продольным углом, чтобы вызвать поле возбуждающих постсинаптических потенциалов. Для внеклеточных полевых записей гиппокампа продольные ломтики были вырезаны параллельно с перептертал-височной плоскостью. Электроды записи и стимуляции помещались в прослойку oriens (S.O) и радиат (S.R) гиппокампа вдоль продольной оси. Это позволило нам исследовать направленную и слойную специфику вызываемых возбуждательных постсинаптических потенциалов. Уже установленные протоколы были использованы для индуцирования долгосрочной потенцирования (ЛТП) и длительной депрессии (LTD) как in vivo, так и in vitro. Наши результаты показали, что продольная сеть interlamellar CA1 поддерживает N-метил-D-аспартат (NMDA) рецептор-зависимых долгосрочных потенцирования (LTP) без направления или слоя специфики. Интерламеллярная сеть, однако, в отличие от поперечной ламеллярной сети, не представляла какой-либо значительной длительной депрессии (LTD).
Introduction
Гиппокамп был широко использован вкогнитивных исследованиях 1,2,3. Сеть ламелляров гиппокампа в поперечной оси образует трисинаптические схемы, которые состоят из зубной извилины, CA3 и CA1 регионов. Ламеллярная сеть считается параллельным инезависимым блоком 4,5. Эта ламеллярная точка зрения повлияла на использование поперечной ориентации и поперечных ломтиков как для in vivo, так и для витроэлектрофизиологических исследований гиппокампа. В свете новых исследований, ламеллярная гипотеза переоценивается6 и внимание также уделяется интерламеллярной сети гиппокампа. Что касается гиппокампа интерламеллярной сети, CA3 регионе уже давно исследованы7,8,9,10, однако продольное CA1 гиппокампа регионе получил относительно мало внимания до недавнего времени. Что касается сети CA1 interlamellar, краткосрочные синаптические свойства вдоль дорсовентальной продольной гиппокампа CA1 оси крыс, как было показано, варьируются11. Кроме того, кластеры гиппокампа клеток, реагируя на фазу и место было установлено, систематически расположены вдоль продольной оси гиппокампа у крыс, проходящих краткосрочную задачу памяти12. Кроме того, было установлено, что эпилептический припадок синхронизирован по всему гиппокампу вдоль продольной оси13.
Большинство исследований продольных CA1 гиппокампа регионе однако, использовали вход ные чондуктора ca3 в CA1 регионов11,14,15. Используя уникальный протокол, чтобы сделать продольные ломтики мозга, наша предыдущая работа продемонстрировала ассоциативное подключение пирамидальных нейронов CA1 вдоль продольной оси и вовлекла его способность эффективно обрабатывать нейрональные сигнализации16. Тем не менее, существует необходимость определить, является ли CA1 пирамидальных нейронов вдоль продольной оси без поперечного ввода может поддерживать долгосрочную синаптическую пластичность. Этот вывод может добавить еще один угол в исследованияневрологских проблем, относящихся к гиппокампа.
Способность нейронов адаптировать эффективность передачи информации известна как синаптической пластичности. Синаптической пластичности является основным механизмом для когнитивных процессов, таких как обучение и память17,18,19,20. Долгосрочная синаптическая пластичность проявляется либо как долгосрочная потенцирование (ЛТП), которая представляет собой усиление нейрональной реакции, либо как длительная депрессия (LTD), которая представляет собой ослабление нейрональной реакции. Долгосрочная синаптическая пластичность была изучена в поперечной оси гиппокампа. Тем не менее, это первое исследование, чтобы продемонстрировать долгосрочную синаптическую пластичность в гиппокампе продольной оси CA1 пирамидальных нейронов.
Опираясь на протокол, используемый Yang et al.16, мы разработали протокол для демонстрации LTP и LTD в гиппокампе продольной оси пирамидальных нейронов CA1. Мы использовали C57BL6 мышей мужского возраста от 5-9 недель для экспериментов in vitro и 6-12 недель для экспериментов in vivo. Эта подробная статья показывает, как длинные гиппокампа мозга ломтики от мышей были получены для записи in vitro и как in vivo записи были записаны в продольной оси. Для записей in vitro мы исследовали направленную специфичность продольной синаптической пластичности CA1, ориентируясь на перетектоновый и височной конец гиппокампа. Мы также исследовали специфику слоя продольной синаптической пластичности CA1, записав из слоя oriens и радиат из слоя гиппокампа. Для записей in vivo мы исследовали углы, которые лучше всего соответствуют продольным направлениям гиппокампа.
Используя как in vivo, так и in vitro внеклеточные полевые записи, мы заметили, что продольно связанные пирамидальные нейроны CA1 представлены LTP, а не LTD. Поперечная ориентация с участием как CA3 и CA1 нейронов, однако, поддерживает как LTP и LTD. Различие в синапических возможностях между поперечным и продольной ориентацией гиппокампа может спекулятивно обозначить различия в их функциональной связи. Необходимы дальнейшие эксперименты для расшифровки различий в их синаптических возможностях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные были обработаны в соответствии с руководящими принципами и правилами, состоронней работы по уходу за животными и использованию лаборатории Национального института здравоохранения. Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Городского университета Гонконга и Национального университета Инчхон.
1. Запись поля In vivo
- Подготовка животных
- Вводят уретан (0,06 г на вес 25 г) интраперитонеально обезболивать мышь. Дополнение с внутримышечной инъекцией атропина (0,05 мг/кг). Держите мышь в темном тихом месте до полной анестезии вступает в силу.
ВНИМАНИЕ: Уретана обладает канцерогенным потенциалом. Обвисть с ним с осторожностью и носить защитную одежду, чтобы избежать контакта с открытой кожей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, изофруран может быть использован в качестве анестезии. - Проверяйте глубину анестезии с перерывами до тех пор, пока не вступит в силу полная хирургическая плоскость анестезии. Проверьте глубину анестезии, выполняя щепотку ног, уха щепотку, хвост щепотку и роговицы сенсорный тесты наблюдать реакцию мыши на физические раздражители.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рефлекторилировили или добровольное движение не следует наблюдать, когда мышь находится в полной хирургической плоскости анестезии. - Для теста на носик, расширить либо задние или передние конечности мыши и твердо щепотку с парой тупых щипков или пальцев. Мышь не подтверждается для полной анестезии, если она снимает ногу или трясет тело, имеет наблюдаемый повышенный уровень дыхания или издает вокальные звуки.
- Для теста уха щепотку, щепотку концы пинна с парой тупых щипнул или пальцы твердо. Полная анестезия не подтверждается, если мышь двигает усы вперед, качает головой, издает вокальные звуки или имеет наблюдаемую повышенную частоту дыхания.
- Для теста хвостовой щепотки, держите хвост мыши осторожно и твердо щепотку с тупой силой или пальцем. Нет движения хвоста, вокальный звук или наблюдаемое увеличение частоты дыхания следует наблюдать, когда полностью анестезируется для хирургических процедур.
- Для теста на тройню, прикоснитесь к роговице мыши осторожно, с хлопчатобумажным фитилем. При полной анестезии при операции не следует наблюдать движение век, движение усов или наблюдаемое увеличение частоты дыхания.
- Бритье волос на шее и черепе мыши.
- Поместите полностью обезопаживаемую мышь на грелку, установленную до 37 градусов по Цельсию, и вставьте ректальный температурный зонд в прямую кишку. Это позволяет тепло, вырабатываемое грелки, регулироваться в ответ на изменения температуры тела мыши.
- Нанесите гель для глаз, чтобы увлажнить глаза мыши.
- Вытяните язык в сторону губ осторожно с помощью щипки и исправить два передних зуба во второй или третий зубы отверстие стереотаксического инструмента. Исправьте череп мыши твердо с помощью глаз зажима.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, можно использовать стереотактический зажим для уха. - Наблюдая под микроскопом, отделяют подкожную ткань и мышцы в конце межперьеи и затылочной кости мыши скальпелем, чтобы разоблачить цистерну магну. Побмать dura mater сухим с ватным тампоном.
- Аккуратно проколоть цистерну магна, сделав неглубокий разрез с острым остроконечным лезвием скальпеля, чтобы слить спинномозговой жидкости (CSF). Прикрепите ватный тампон, чтобы продолжать слива CSF.
- Вводят уретан (0,06 г на вес 25 г) интраперитонеально обезболивать мышь. Дополнение с внутримышечной инъекцией атропина (0,05 мг/кг). Держите мышь в темном тихом месте до полной анестезии вступает в силу.
- Краниотомия
- Держа кожу на коже головы щипками, вырезать и удалить кожу с помощью хирургических ножниц. Вырезать достаточно кожи, чтобы разоблачить брегма и лямбда знаки на кожу головы. Держите открытый регион сухим.
- Отрегулируйте зажатый череп мыши, чтобы очки брегмы и лямбды были выровнены на горизонтальном уровне аналогичной высоты. Избегайте наклона головы либо в передне-задней позиции, либо в медиальном боковом положении.
- Отметьте точки, соответствующие области гиппокампа, используя помощь калипера Вернье. Используйте мозг мыши в стереотаксической книге координат в качестве ссылки, чтобы помочь определить точные координаты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Место, чтобы отметить для разреза для гиппокампа 1 мм х 3 мм на средней линии называют передней задней (AP) с использованием bregma в качестве точки отсчета, и 3 мм х 3 мм перпендикулярно средней линии (ML) для подключения точек на средней линии. Стереотактические координаты приведены как (AP: 1,3 и ML: 3,3). - Сделайте разрез в черепе над областью вдовства гиппокампа вдоль отмеченных точек с помощью скальпеля или высокоскоростной дрель при наблюдении под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: После разреза следует получить прямоугольное отверстие размером 2 мм х 3 мм. Держите облучение области чистой, чтобы избежать повреждения мозга. - Тщательно выняйте свободный череп с щипками, чтобы разоблачить dura mater и использовать шприц или капельница, чтобы мягко применять физиологический сосуд, чтобы сохранить поверхность влажной.
- Удалите dura mater тщательно с иглой или острыми остроконечными щипцы мигами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не вызвать каких-либо повреждений тканей мозга во время краниотомии. Это приведет к отеку мозга и повлияет на результаты. - Держите подвергаются ткани мозга влажной, применяя физиологический сосуд или инертное масло с помощью капельницы или шприца.
- Запись In vivo
- Исправить и положение стимуляции и записи электрода твердо в стереотаксическом держатель. Отрегулируйте стереотактический инструмент в соответствии с положением соответствующих координат AP и ML для стимуляции и записи электродов над дорсальным гиппокампом CA1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте мозг мыши в стереотаксических координатах в качестве руководства в поиске координат для псовой продольной области CA1 гиппокампа. Например, стереотаксическая координата для гиппокампа CA1 будет (AP 1.5, ML 1.0) для записывающего электрода и (AP 1.7, ML 1.5) для электрода стимуляции. - Найдите стимулирующий электрод боковой к записи электрода в продольном направлении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что стимуляция и запись электродов являются чистыми перед использованием. Это предотвращает введение шума при записи. - Для записи используйте многоканальные электроды. Во-первых, найти стереотактические координаты для области бегемота CA1 с помощью Первого канала. Расположите оставшиеся электроды таким образом, что угол стимуляции и записи электродов находится в диапазоне от 30 до 60 градусов по отношению к средней линии из точки брегмы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот угол соответствует продольной ориентации области бегемота CA1. - В качестве контроля, найти запись электрода над областью CA1 и стимуляции электрода выше CA3 области пресного гиппокампа. Например, используя мозг мыши в стереотаксических координатах в качестве руководства, стереотаксическая координата для области бегемота CA1-CA3 будет (AP 1.8, ML 1.0) для записи электрода и (AP 1.5, ML 1.5) для электрода стимуляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является альтернативным элементом управления и должен быть сделан в отдельном эксперименте. - Поместите эталонный электрод в дистальную часть открытой области мозга или под кожу мыши.
- Включите систему записи.
- Откройте программное обеспечение для записи и сбора данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные лаборатории имеют свое предпочтительное программное обеспечение для записи и сбора данных. - Наблюдая под микроскопом, опустите электроды записи и стимуляции медленно с помощью микроманипулятора, пока он не коснется поверхности мозга. Отметьте точку как нулевую точку, чтобы начать вычислять точную глубину в область гиппокампа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроманипуликоран может быть использован для мониторинга глубины, на которой электрод вставляется в любой момент времени. Обратите внимание на увеличение импеданса только тогда, когда электрод касается поверхности мозга. - Медленно опустите электроды до приблизительной глубины, соответствующей выбранным стереотактическим координатам гиппокампа CA1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте мозг мыши в стереотаксических координатах в качестве руководства для получения приблизительной глубины, соответствующей выбранным стереотаксических координатам. - Дайте стимуляции (100 й продолжительность, повторяется с интервалом в 30 с) и настроить глубину электрода в шагах 50 мкм или менее, пока не будет наблюдаться стабильный вызываемый полевой возбуждательный постсинаптический потенциал (fEPSP).
ПРИМЕЧАНИЕ: Стимул 20 ЗА, как правило, достаточно, чтобы вызвать наблюдаемый ответ. - Убедитесь, что стабильный fEPSP был вызван путем изменения интенсивности стимула. Заметное увеличение наклона или амплитуды fEPSP следует наблюдать с каждым увеличением интенсивности стимула. Это называется кривой ввода-вывода. Создайте кривую ввода-вывода (I-O) для определения максимальной интенсивности стимулов, при которой больше нет увеличения наклона вызываемого fEPSP(рисунок6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отбросьте данные и измените положение электрода, если волокневый залп исчезает во время эксперимента. - Используйте кривую ввода-вывода, чтобы установить интенсивность базовой линии до 40 - 50% от максимума. Используйте соответствующую интенсивность стимула для базовой записи.
- Запишите локальный потенциал поля в качестве базового уровня на 20 - 30 минут.
- Используйте ту же кривую ввода-вывода, чтобы установить интенсивность стимула для вызывая высокочастотную стимуляцию (HFS) или столбняка до 75% от максимальной интенсивности. Кроме того, при индуцировании долгосрочной депрессии, поддерживать ту же интенсивность стимула, используемых для записи базового уровня при вызывая низкочастотной стимуляции (LFS).
- Нанесите столбняк стимуляции 100 Гц импульсов 4 раза с интервалом 10 с, чтобы вызвать LTP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот протокол только при работе над долгосрочным экспериментом по потенцирования. - Применить низкочастотную стимуляцию 5 Гц (900 стимулов в течение 3 минут), 1 Гц LFS (900 стимулов в течение 15 минут), или 1 Гц парного пульса (50 мс парного импульса интервал, 900 пар стимулов в течение 15 мин), чтобы побудить LTD в соответствии с уже установленными протоколами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эти протоколы только при работе над долгосрочным экспериментом депрессии. - Запишите локальный потенциал поля для 1 h после HFS или LFS, альтернативно.
- Экспортируйте данные и анализируем с помощью программного обеспечения.
- Проверьте положение записи и стимуляции электрода, давая стимуляции 10 КК тока в течение 30 с поражения зарегистрированных областей. Транскардиально наполнить мышь с 4% параформальдегида и урожай мозга для нарезки и окрашивания с Cresyl фиолетовый в соответствии с.
- Эвтаназия мыши путем вывиха шейки матки или инъекции смертельной анестезии дозировка после эксперимента.
- Исправить и положение стимуляции и записи электрода твердо в стереотаксическом держатель. Отрегулируйте стереотактический инструмент в соответствии с положением соответствующих координат AP и ML для стимуляции и записи электродов над дорсальным гиппокампом CA1.
2. Запись поля in vitro
- Подготовка растворов нарезки кислородом и искусственной спинномозговой жидкости (ACSF)
- Для 2 л нарезки раствора добавьте примерно 1 л двойной дистиллированной воды в объемную колбу и энергично перемешайте на пластине мешалки.
- Добавьте следующие компоненты нарезки раствора (в мМ): 87.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.32PO4, 25.0 NaHCO3, 25.0 глюкоза, 75.0 сахароза, 7.0 MgCl2.6H2O и 0.5 CaCl22H2O (Таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, MgCl2No6H2O и CaCl22H2O O могут быть исключены на этом этапе и добавлены позже в готовый к использованию объем. - Топ до 2 л с двойной дистиллированной воды, помешивая энергично.
- Для 2 L ACSF, добавить примерно 1 л двойной дистиллированной воды в объемной колбе и энергично перемешать на пластине мешалки.
- Добавьте следующие компоненты решения ACSF (в мМ): 125,0 NaCl, 2.5 KCl, 1.32PO4, 25.0 NaHCO3, 25 глюкоза, 1.0 MgCl26H2O и 2.0 CaCl2No2H2O (Таблица1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, MgCl2.6H2O и CaCl22H2O могут быть исключены на этом этапе и добавлены позже в готовый к использованию объем. - Топ до 2 л с двойной дистиллированной воды, помешивая энергично.
- Настройка и нарезка мозга
- Налейте 400 мл уже подготовленного нарезки раствора в отдельнуюколбу и оксигенизм (95% O 2/5% CO2) в течение примерно 20 мин.
- Храните остальную часть раствора 1,6 л в холодильнике с 4 градусами по Цельсию. Держите решение до 1 недели, после чего он должен быть отброшен, если не используется, чтобы избежать грибкового роста.
- Налейте 200 мл насыщенного кислородом нарезки в колбу, накройте парапленкой и перенесите в морозильную камеру -80 градусов в течение примерно 20 минут, чтобы сделать слякоть.
- Налейте оставшиеся 200 мл нарезки раствора в мозг ломтик проведения камеры и держать в 32 градусов воды ванну с непрерывным восходящей.
- Подготовьте скамейку для нарезки. Поместите бумажные полотенца вниз и хирургические инструменты на верхней части скамейки. Упорядочить хирургические инструменты в порядке использования для облегчения быстрого и эффективного процесса(рисунок 7).
- Вынуть охлажденный нарезной раствор из морозильной камеры и залить примерно 50 мл в стакан. Налейте около 10 мл в чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу, чтобы смочить его. Поместите их на лед по области вскрытия.
- Налейте остальную часть слякотной нарезки раствор в нарезку камеры и исправить его на вибратом.
- Анестезия мыши с изофлюран с использованием руководящих принципов и правил по уходу за животными и использования лаборатории Национального института здравоохранения, а также утвержденные методы институционального использования животных и ухода комитета городского университета Гонконга и Инчхон Национальный Университет.
- Обезглавить анестезирующую мышь ножницами и поставить голову на салфетку. Вырежьте кожу, покрывающую череп мыши, и прорежьте кожные мышцы ножницами. Разрежьте черепные пластины вдоль средней линии до затылочной кости хирургическими ножницами.
- Откройте череп тупыми щипками, чтобы разоблачить мозг. Аккуратно вычерпывать мозг шпателем и поместить в охлажденный нарезку раствор в стакане. Подождите около 30 с.
- Вынизвините мозг ложкой и аккуратно поместите его на ранее увлажненную фильтровальную бумагу в чашке Петри.
- Разделите два полушария мозга вдоль средней линии с кальпельным лезвием. Изолировать гиппокамп, аккуратно отсоединив его от коры с помощью шпателя и аккуратно поместите на увлажненную фильтровальную бумагу. Вырежьте перегородки и височной конца изолированного гиппокампа с помощью скальпеля.
- Возьмите изолированный гиппокамп с помощью тупой шпатель и кисть. Аккуратно обмазать шпатель на бумаге для удаления лишней воды.
- Нанесите небольшое количество клея на нарезку пластины вибратом.
- Для продольного ca1 гиппокампа ломтик, прикрепить CA3 области гиппокампа к нарезкой пластины с клеем. Быстро, но осторожно поместите его в нарезку камеры вибратом, содержащего охлажденный кислородом нарезки раствора.
- Для поперечного ломтика, который будет служить в качестве контроля, прикрепите брюшной конец гиппокампа к нарезке пластины вибратом. Быстро, но осторожно поместите его в нарезку камеры, содержащей охлажденный кислородом раствор вскрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является альтернативой вышеупомянутому шагу и должен выполняться отдельно. - Расположите угол лезвия до 90 градусов. Установите параметры вибратомра со скоростью 0,05 мм/с, амплитудаю 1,20 мм и толщиной ломтика 400 мкм.
- Нарежьте прикрепленный гиппокамп с вибратом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хороший продольной CA1 гиппокампа мозга ломтик будет иметь один слой CA1 и 2 слоя зубной извилины. Максимум 2 хороших ломтика гиппокампа можно получить. Кроме того, поперечный гиппокампа мозга ломтик будет иметь зубной извилины, CA3 и CA1 регионов нетронутыми. - Перенесите продольные кусочки мозга гиппокампа из вибратом с помощью пипетки и инкубировать его в мозг ломтик проведения камеры в водяной бане.
- Инкубировать ломтики в водяной бане в течение 20 минут при температуре 32 градусов по Цельсию и вывести до комнатной температуры в течение 30 минут восстановления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, передача ломтик мозга, когда из водяной ванны и аккуратно поместите его в камеру записи с течет кислородом ACSF при температуре 32 градусов по Цельсию в течение 30 минут восстановления. - Во время инкубации в водяной бане, залить 400 мл раствора ACSF в отдельную колбу и оксигенат (95% O2/5% CO2) в течение примерно 20 - 30 минут перед передачей ломтик мозга в камеру записи. Непрерывно superfuse ACSF в камеру записи на скорости 2 мл/мин.
- Включите регулятор температуры, чтобы нагреть протекающий ACSF до 32 градусов по Цельсию.
- Храните остальную часть раствора 1,6 л в холодильнике с 4 градусами по Цельсию. Держите раствор до одной недели, после чего он должен быть отброшен, если не используется, чтобы избежать грибкового роста.
- Запись в пробирке
- Настройка установки записи, включив все необходимое оборудование.
- Перенесите ломтик мозга из среза, удерживая камеру, в камеру звукозаписи. Отрегулируйте положение среза мозга тупыми щипками и удерживайте его на месте с помощью арфы. Разрешить ACSF работать, по крайней мере 20 минут. Это позволяет срез мозга, чтобы быть стабильным перед записью.
- Заполните пипетку записи с помощью ACSF в качестве внутреннего решения.
- Проверьте сопротивление записи пипетки с назначенным программным обеспечением. Устойчивость к записи пипетки должна находиться в пределах 3-5 МЗ.
- Включите программное обеспечение для получения данных. Это программное обеспечение должно иметь аналогичные функции, которые позволяют процессуат для получения данных таким же образом, как и ранее показанные записи in vivo.
- Закрепите запись и электроды стимуляции твердо в держателе стереотаксического инструмента. Поместите эталонный электрод в ACSF в камеру записи.
- Для продольных ломтиков, положение стимуляции и записи электрода в слое oriens (S.O.). Держите расстояние между электродами примерно до 300 до 500 мкм. Поместите электрод стимуляции либо на перегородку или височной стороне среза мозга и запись из того же слоя(рисунок 8).
- Кроме того, положение стимуляции и записи электрода в радиат (S.R.). Поместите электрод стимуляции либо на перегородку или височной стороне среза мозга.
- Для поперечных ломтиков в качестве элемента управления, положение стимулирующего электрода на CA3 (Шаффер залоговый путь) области, и запись электрода на ca1 области(рисунок 9).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это альтернативный шаг контроля и должен быть выполнен в отдельном эксперименте. - Включите изолированный генератор стимулов и дайте стимуляции (100 й продолжительность, повторяется с интервалом 30 с). Отрегулируйте глубину записи электрода и/или положение до тех пор, пока не будет наблюдаться стабильный возбуждающий постсинаптический потенциал поля.
- Убедитесь, что стабильный fEPSP был вызван путем изменения интенсивности стимула. Заметное изменение склона fEPSP следует наблюдать с каждым изменением интенсивности стимула. Это называется кривой ввода-вывода. Создайте кривую ввода-вывода (I-O) для определения максимальной интенсивности стимулов, при которой больше нет увеличения наклона FEPSP(рисунок6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отбросьте данные и измените положение электрода, если волокневый залп исчезает во время эксперимента. - Используйте кривую ввода-вывода, чтобы установить интенсивность стимула для базовой записи и для вызова высокочастотной стимуляции (HFS) или столбняка до 30-40% от максимального вызываемого fEPSP.
- Кроме того, для экспериментов в отношении LTD используйте кривую ввода-вывода, чтобы установить базовую интенсивность для базовой записи и для вызова низкочастотной стимуляции (LFS) до 70% от максимального вызываемого fEPSP.
- Запишите локальный потенциал поля в качестве базового уровня на 20 - 30 мин.
- Применить HFS 100 Гц импульсов дважды с интервалом 30 с, чтобы вызвать LTP.
- Кроме того, для экспериментов LTD, применять низкочастотную стимуляцию 5 Гц (900 стимулов в течение 3 мин) или 1 Гц LFS (900 стимулов в течение 15 мин) или 1 Гц парного импульса (50 мс парного импульса интервал, 900 пар стимулов в течение 15 мин), чтобы вызвать в соответствии с уже установленный протокол.
- Запись локального потенциала поля для 1 ч после HFS или LFS.
- Экспортные данные и анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы исследовали долгосрочную синаптической пластичности продольных пирамидальных нейронов CA1 гиппокампа, используя внеклеточные полевые записи как in vivo, так и in vitro. LTP и LTD являются гранями долгосрочной синаптической пластичности, которые были продемонстрированы в поперечной оси гиппокампа, чтобы быть однонаправленным.
Мы показали здесь, что с использованием продольных гиппокампа ломтиками мозга, есть LTP в CA1 продольной оси гиппокампа. Мы подготовили продольные ломтики гиппокампа вдоль септовременной оси, которая перпендикулярна поперечным ломтикам(рисунок 1). Используя записи из области CA1 гиппокампа, мы показали наличие LTP, который не был конкретным направлением. Статистически значимых отличий в записях с перегородки или височной(рисунок2) стороны продольного гиппокампа мозга. Мы также показали наличие LTP, который не был конкретным слоем; таким образом, записи из обоих слоев радиата и слоя oriens(Рисунок 2) показали успешно индуцированной LTP в продольном мозге ломтик. Мы использовали D-AP5, антагонист NMDAR, чтобы продемонстрировать, что LTP индуцированных зависит от NMDA рецепторов(рисунок 3). То, что происходит в пробирке, не обязательно отражает условия vivo, поэтому мы исследовали LTP in vivo. Рисунок 4 показывает схематическую схему стимуляции и записи электрода, расположенного в царском гиппокампе вдоль продольной оси региона CA1 in vivo. Положение электродов, используемых для записи и стимуляции, было проверено по признакам поражения и кристально фиолетового окрашивания(рисунок 4a). Мы продемонстрировали наличие LTP in vivo в продольном регионе CA1(рисунок 4b).
Используя уже установленные протоколы для индуцирования LTD, мы не смогли успешно вызвать LTD как in vivo, так и in vitro(рисунок 5).
Рисунок 1 . Схематический рисунок поперечных и продольных срезов мозга гиппокампа. Эта цифра адаптирована и изменена с Sun et al. 201821. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 . LTP в продольных ломтиках. Синаптические ответы на S.R. (a) или S.O. (b) в продольных ломтиках потенцируются сразу после стимуляции столбняка как с временными, так и с переплетными входами (S.R./temporal (n No 12, c), 9, г).
N означает количество ломтиков. Бары ошибок представляют SE. Эта цифра адаптирована и изменена с Sun et al. 201821. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 . НМДАР-зависимый LTP в продольных ломтиках. (a,b) Индукция ЛТП в височной и перегородке блокируется на 50 мкм D-AP5 (временный, n- 6, а) (септаль, n- 5, b). (c,d) Индукция LTP в височной и перегородке также блокируется D-AP5. N означает ломтики. Бары ошибок представляют SE. Эта цифра адаптирована и изменена с Sun et al. 201821. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 . In vivo LTP в интерламеллярной сети. () Схематический рисунок записи и стимуляции электродов в анестезируемых животных. Локции записи (на перегородке CA1) и стимулирующие электроды (на временной стороне CA1) были определены по признакам поражения. (b) LTP индуцируется в межламеллярной связи высокочастотной стимуляцией 100 Гц (HFS) (n no 10 мышей). Цветовые следы: до (черный) и после (красный) HFS. Бары ошибок представляют SE. Эта цифра адаптирована и изменена с Sun et al. 201821. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 . Отсутствие in vivo и in vitro LTD в сети Interlamellar CA1. (a) 1 Гц-пп LFS не вызывает in vivo LTD. (b) 1 Гц pp-LTP, (c) 5 Гц LFS, и (d) 1 Гц LFS не производят LTD ни на височной, ни на межсетической или септальной стороны продольного ломтика мозга. в то время как LTD индуцируется 1 Гц pp-LFS поперечными ломтиками: височной (n No 8), септальной (n No 11) и поперечной (n no 6) с 1 Гц pp-LFS; височная (n No 3) и перегородка (n No 3) с 5 Гц LFS; височной (n No 3) и перегородки (n No 3) с 1 Гц LFS. N означает ломтики. Бары ошибок представляют SE. Эта цифра адаптирована и изменена с Sun et al. 201821. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 . Вхотогивная кривая вывода, представляющая склон fEPSP в ответ на увеличение ввода стимула в срез мозга гиппокампа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7 . Хирургические инструменты, используемые для гиппокампа изоляции во время нарезки мозга в пробирке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8 . Продольное срез мозга готов к записи. В радиат слоя вставляются стимулирующий электрод и записывающий пипетка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9 . Поперечный гиппокампа мозг ломтик готов к записи. Стимулирующий электрод вставляется в регионе Schaffer collateral CA3, а запись пиппетта вставляется в регионе CA1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Составной | Решение для нарезки (mM) | ACSF (mM) |
| CaCl2.2H2O | 0.5 | 2 |
| Глюкозы | 25 | 25 |
| Kcl | 2.5 | 2.5 |
| MgCl2.6H2O | 7 | 1 |
| Nacl | 87 | 125 |
| 2PO4 | 1.3 | 1.3 |
| NaHCO3 | 25 | 25 |
| Сахароза | 75 |
Таблица 1: Концентрации соединений в ломтике мозга и искусственных решениях спинномозговой жидкости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол демонстрирует метод индуцирования долгосрочной синаптической пластичности in vivo, а также из ломтиков мозга в продольной оси CA1-CA1 гиппокампа in vitro. Изложенные шаги дают достаточно подробной информации для экспериментатора для расследования LTP и LTD в продольном гиппокампе CA1-CA1 связи. Необходима практика для оттачивание навыков, необходимых для успешного записи полевых возбуждательных потенциалов.
В дополнение к необходимости практики, Есть несколько важных шагов, которые имеют важное значение для получения хороших результатов. Во-первых, было показано ранее, что угол, к которому мозг ломтики были сделаны может либо усечения или сохранить продольные проекции пирамидальных нейронов в CA1-CA1 области гиппокампа16. Продольные пирамидальные нейроны проект из поперечных нейронов под углом, который почти перпендикулярно. Как CA1 нейронов размножаться в различных углах в гиппокампе, продольная связь между ними выкладывается вдоль дорсовентальной оси гиппокампа. Таким образом, для записи in vitro, экспериментатор должен иметь это в виду, чтобы точно нацелить гиппокампа CA1-CA1 вдоль продольной оси, разрезая изолированную ткань гиппокампа вдоль оси псовой-вентральной. Кроме того, для записей in vivo угол, под которым расположены стимуляция и электроды записи, определяет, являются ли полученные результаты репрезентативными продольной оси или смесью как поперечной, так и продольной оси. Дальнейшие исследования с использованием CRISPR-Cas9 могут быть проведены для подтверждения того, является ли вызванный ответ исключительно из региона CA1, поскольку это может быть смесь юрисрешений как из регионов CA1, так и из CA3.
Во-вторых, для экспериментов in vitro, экспериментатор должен убедиться, что решение нарезки мозга, ACSF, рабочая скамейка и все оборудование или инструменты, которые вступают в контакт с ломтиком мозга, свободны от загрязняющих веществ. Любая форма загрязнения приведет к ухудшению целостности или смерти мозга ломтик. Поддержание чистой поверхности электрода обеспечит хорошие и стабильные записи как для экспериментов in vitro, так и для in vivo.
Мы показали, что продольные гиппокампа CA1 сети экспонатов NMDAR-зависимых LTPs, но не LTDs. Трисинаптическая схема, однако, представляет как с LTP и LTD22,23. Это означает, что продольная сеть CA1 и трехсинаптическая схема обладают уникальными характеристиками. Наш протокол использует только электрофизиологические записи и поэтому ограничен в поиске разницы между этими двумя сетями.
Поиск исцеление от таких заболеваний мозга, как шизофрения, продолжается. Снижение или деформация CA1 гиппокампа субрегионов были связаны с некоторыми шизофреническими симптомами24,25. Применение нашего протокола, хотя и основной, вывело на свет уникальную синаптические возможности продольной гиппокампа CA1. Эти знания полезны при разработке экспериментов, которые могут дополнительно исследовать эту изнурительную болезнь мозга вдоль продольной оси CA1 гиппокампа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Инчхон Национального университета (Международный кооператив) научно-исследовательский грант. Мы хотели бы поблагодарить г-жу Гона Чой за помощь в сборе некоторых данных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine Sulphate salt monohydrate, ≥97% (TLC), crystalline | Sigma-Aldrich | 5908-99-6 | Stored in Dessicator |
| Axon Digidata 1550B | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Clampex 10.7 | |||
| D-(+)-Glucose ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Eyegel | Dechra | ||
| Isoflurane | RWD Life Sciences | R510-22 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| Matrix electrodes, Tungsten | FHC | 18305 | |
| Multiclamp 700B Amplifier | |||
| Potassium chloride, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous ≥99% | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | Stored in Dessicator |
| Pump | Longer precision pump Co., Ltd | T-S113&JY10-14 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 63148-62-9 | |
| Sodium Bicarbonate, BioXtra, 99.5-100.5% | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| Sodium Chloride, BioXtra, ≥99.5% (AT) | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic, powder | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| Sucrose, ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | |
| Temperature controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Tungsten microelectrodes | FHC | 20843 | |
| Urethane, ≥99% | Sigma-Aldrich | 51-79-6 | |
| Vibratome | Leica | VT-1200S | |
| Water bath | Grant Instruments | SAP12 |
References
- Levy, W. B. A sequence predicting CA3 is a flexible associator that learns and uses context to solve hippocampal-like tasks. Hippocampus. 6 (6), 579-590 (1996).
- Eldridge, L. L., Knowlton, B. J., Furmanski, C. S., Bookheimer, S. Y., Engel, S. A. Remembering episodes: A selective role for the hippocampus during retrieval. Nature Neuroscience. 3 (11), 1149-1152 (2000).
- Sullivan Giovanello, K., Schnyer, D. M., Verfaellie, M. A critical role for the anterior hippocampus in relational memory: evidence from an fMRI study comparing associative and item recognition. Hippocampus. 14 (1), 5-8 (2004).
- Andersen, P., Bland, B., Dudar, J. D. Organization of the hippocampal output. Experimental Brain Research. 17 (2), 152-168 (1973).
- Andersen, P., Bliss, T. V. P., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Experimental Brain Research. 13 (2), 222-238 (1971).
- Sloviter, R., Lømo, T. Updating the Lamellar Hypothesis of Hippocampal Organization. Frontiers in Neural Circuits. 6 (102), (2012).
- Ishizuka, N., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. Journal of Comparative Neurology. 295 (4), 580-623 (1990).
- Tamamaki, N., Nojyo, Y. Crossing fiber arrays in the rat hippocampus as demonstrated by three-dimensional reconstruction. Journal of Comparative Neurology. 303 (3), 435-442 (1991).
- Swanson, L., Wyss, J., Cowan, W. An autoradiographic study of the organization of intrahippocampal association pathways in the rat. Journal of Comparative Neurology. 181 (4), 681-715 (1978).
- Rebola, N., Carta, M., Mulle, C. Operation and plasticity of hippocampal CA3 circuits: implications for memory encoding. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 208 (2017).
- Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79 (2017).
- Hampson, R. E., Simeral, J. D., Deadwyler, S. A. Distribution of spatial and nonspatial information in dorsal hippocampus. Nature. 402, 610 (1999).
- Umeoka, S. C., Lüders, H. O., Turnbull, J. P., Koubeissi, M. Z., Maciunas, R. J. Requirement of longitudinal synchrony of epileptiform discharges in the hippocampus for seizure generation: a pilot study. Journal of Neurosurgery. 116 (3), 513-524 (2012).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65, (2010).
- Milior, G., et al. Electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons along the longitudinal axis of the mouse hippocampus. Scientific Reports. 6, (2016).
- Yang, S., et al. Interlamellar CA1 network in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (35), 12919-12924 (2014).
- Tsien, J. Z., Huerta, P. T., Tonegawa, S. The Essential Role of Hippocampal CA1 NMDA Receptor–Dependent Synaptic Plasticity in Spatial Memory. Cell. 87 (7), 1327-1338 (1996).
- Bliss, T., Collingridge, G. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
- Roman, F., Staubli, U., Lynch, G. Evidence for synaptic potentiation in a cortical network during learning. Brain Research. 418 (2), 221-226 (1987).
- McNaughton, B., Barnes, C., Rao, G., Baldwin, J., Rasmussen, M. Long-term enhancement of hippocampal synaptic transmission and the acquisition of spatial information. Journal of Neuroscience. 6 (2), 563-571 (1986).
- Sun, D. -g, et al. Long term potentiation, but not depression, in interlamellar hippocampus CA1. Scientific Reports. 8 (1), 5187 (2018).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Milner, A. J., Cummings, D. M., Spencer, J. P., Murphy, K. P. Bi-directional plasticity and age-dependent long-term depression at mouse CA3-CA1 hippocampal synapses. Neuroscience Letters. 367 (1), 1-5 (2004).
- Bogerts, B., et al. Hippocampal CA1 deformity is related to symptom severity and antipsychotic dosage in schizophrenia. Brain. 136 (3), 804-814 (2013).
- Ho, N. F., et al. Progressive Decline in Hippocampal CA1 Volume in Individuals at Ultra-High-Risk for Psychosis Who Do Not Remit: Findings from the Longitudinal Youth at Risk Study. Neuropsychopharmacology. 42, 1361 (2017).
