Summary
Vi brugte optagelses-og stimulerings elektroder i langsgående hippocampus-hjerne skiver og i længde placerede indspilnings-og stimulerings elektroder i dorsaler-hippocampen in vivo til at fremkalde ekstracellulære postsynaptiske potentialer og demonstrere langsigtet synaptisk plasticitet langs langsgående interlamellar.
Abstract
Studiet af synaptisk plasticitet i hippocampus har fokuseret på brugen af det carnetet lamel-netværk. Mindre opmærksomhed er blevet givet til det langsgående interlamellar Carnot-carnetnet. For nylig er der dog blevet vist en associationel forbindelse mellem carloon-carnetneuroner. Derfor er der behov for at undersøge, om det langsgående interlamellar--carnetnet, som hippocampus understøtter synaptisk plasticitet.
Vi har designet en protokol til at undersøge tilstedeværelsen eller fraværet af langvarig synaptisk plasticitet i interlamellar hippocampus carnetnettet ved hjælp af elektrofysiologiske felt optagelser både in vivo og in vitro. For in vivo ekstracellulære felt optagelser blev optagelses-og stimulerings elektroderne anbragt i en septalt-temporær akse i rygnings-hippocampus i en langsgående vinkel for at fremmane felt excitatoriske postsynaptiske potentialer. Til in vitro-ekstracellulære felt optagelser blev hippocampus-langsgående skiver skåret parallelt med det septiske-temporale plan. Optagelses-og stimulerings elektroder blev anbragt i Stratum Oriens (S. O) og stratum radiatum (S. R) i hippocampus langs langsgående akse. Dette gjorde det muligt for os at undersøge retningsbestemte og lag specificitet af fremkaldte excitatoriske postsynaptiske potentialer. Allerede etablerede protokoller blev anvendt til at inducere langsigtede potensering (LTP) og langvarig depression (LTD) både in vivo og in vitro. Vores resultater viste, at det langsgående interlamellar CARNETNET understøtter N-methyl-D-aspartat (NMDA) receptor-afhængig langsigtet potensering (LTP) uden retningsbestemt eller lagspecificitet. Interlamellar netværket, dog i modsætning til det tværgående lamel netværk, ikke til stede med nogen signifikant langsigtet depression (Ltd).
Introduction
Hippocampus har været meget udbredt i kognitive undersøgelser1,2,3. Hippocampus lamel-netværket i den tværgående akse danner det Tri-synaptiske kredsløb, der består af de dentate gyrus-, carnet-og La-regioner. Lamel-netværket anses for at være en parallel og uafhængig enhed4,5. Dette lamel synspunkt har påvirket brugen af tværgående orientering og tværgående skiver for både in vivo og in vitro elektrofysiologiske studier af hippocampus. I lyset af den nye forskning, den lamel hypotese er ved at blive revurderet6 og opmærksomhed er også givet til interlamellar netværk af hippocampus. Med hensyn til hippocampus interlamellar-netværket har Carnot-regionen længe været undersøgt7,8,9,10, men den langsgående relativt lidt opmærksomhed indtil for nylig. Med hensyn til CARNET'S interlamellar-netværk har de kortsigtede synaptiske egenskaber langs den dorsoventrale langsgående hippocampus-akse af rotter vist sig at variere11. Også klynger af hippocampus celler reagerer på den fase og stedet blev fundet at være arrangeret systematisk langs den langsgående akse af hippocampen i rotter, undergår en kort sigt hukommelse opgave12. Også, epileptiske beslaglæggelse aktiviteter blev fundet at være synkroniseret langs hele hippocampus langs langsgående akse13.
De fleste undersøgelser af den langsgående Carnot-hippocampus-region har imidlertid udnyttet input fra Carnot-regionen til de11,14,15. Ved hjælp af en unik protokol til at gøre langsgående hjerne skiver, vores tidligere arbejde demonstreret associationelle konnektivitet af CAROS pyramideformede neuroner langs den langsgående akse og impliceret sin evne til at behandle neuronal signalering effektivt16. Men, der er behov for at afgøre, om de CARPPYRAMIDALE neuroner langs den langsgående akse uden tværgående input kan understøtte langsigtet synaptisk plasticitet. Denne konstatering kan tilføje en anden vinkel i undersøgelser af neurologiske problemer vedrørende hippocampus.
Neuronerne evne til at tilpasse effekten af informationsoverførsel er kendt som synaptisk plasticitet. Synaptisk plasticitet er impliceret som den underliggende mekanisme for kognitive processer såsom læring og hukommelse17,18,19,20. Langsigtet synaptisk plasticitet er demonstreret som enten langsigtede potensering (LTP), som repræsenterer en styrkelse af neuronal respons, eller langvarig depression (LTD), som repræsenterer svækkelsen af neuronal respons. Langsigtet synaptisk plasticitet er blevet undersøgt i den tværgående akse af hippocampus. Men, dette er den første undersøgelse for at demonstrere langsigtede synaptisk plasticitet i hippocampus langsgående akse af CARLOPYRAMIDALE neuroner.
Bygge fra en protokol, der anvendes af Yang et al.16, vi designede protokollen til at demonstrere LTP og Ltd i hippocampus langsgående akse af Carnot pyramidale neuroner. Vi brugte C57BL6 mandlige mus med aldre spænder mellem 5-9 uger gamle for in vitro eksperimenter og 6-12 uger gamle for in vivo eksperimenter. Denne detaljerede artikel viser, hvordan langsgående hippocampus hjerne skiver fra mus blev opnået for in vitro-optagelser, og hvordan in vivo optagelser blev registreret i langsgående akse. For in vitro-optagelser, vi undersøgte retningsbestemt specificitet af langsgående i den synaptiske plasticitet ved at målrette septal og temporale ende af hippocampus. Vi undersøgte også lagspecificiteten af den langsgående, den synaptiske plasticitet i længderetningen, ved at optage fra stratum Oriens og stratum radiatum på Hippocampus. For in vivo-optagelser undersøgte vi de vinkler, der bedst svarer til hippocampus ' længderetningen.
Ved hjælp af både in vivo og in vitro ekstracellulære felt optagelser, bemærkede vi, at de langerinalt tilsluttede CARANPYRAMIDÆRE neuroner præsenteret med LTP, ikke LTD. Den tværgående orientering, der involverer både Carnot og a-neuroner, understøtter imidlertid både LTP og LTD. Sondringen i den synaptiske kapaciteter mellem tværgående og langsgående orientering af hippocampus kunne spekulativt tilkendegiver forskelle i deres funktionelle tilslutningsmuligheder. Yderligere eksperimenter er nødvendige for at dechifrere forskellene i deres synaptisk kapaciteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med de retningslinjer og forordninger fra dyrepasning og anvendelse af laboratoriet i National Institute of Health. Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) fra City University of Hong Kong og Incheon National University.
1. in vivo felt optagelse
- Tilberedning af dyr
- Injicer urethan (0,06 g pr. 25 g vægt) intraperitonealt for at anæstetisere musen. Supplement med intramuskulær injektion af atropin (0,05 mg/kg). Hold musen i et mørkt roligt sted, indtil fuld anæstesi træder i kraft.
Forsigtig: urethan har karcinogent potentiale. Håndtér det med omhu, og bær Beskyttelsesbeklædning for at undgå kontakt med eksponeret hud.
Bemærk: Alternativt kan isofluran anvendes som anæstesi. - Check for dybden af anæstesi periodisk indtil en fuld kirurgisk plan af anæstesi træder i kraft. Tjek for dybden af anæstesi ved at udføre tåen knivspids, øre knivspids, hale knivspids og cornea touch tests for at observere reaktionen fra musen til fysiske stimuli.
Bemærk: en refleks eller frivillig bevægelse bør ikke observeres, når musen er på et fuldt kirurgisk plan af anæstesi. - For toe pinch test, udvide enten Hind eller forbeg af musen og Knib fast med et par stumpe pincet eller fingre. Musen er ikke bekræftet for fuld anæstesi, hvis det trækker benet eller ryster kroppen, har en observerbare øget respiratorisk hastighed eller gør vokallyde.
- For øret pinch test, Knib enderne af Pinna med et par stumpe tang eller fingre fast. Fuld anæstesi er ikke bekræftet, hvis musen bevæger whiskers fremad, ryster hovedet, gør vokallyde eller har en observerbare øget respiratorisk hastighed.
- For halen pinch test, hold halen af musen forsigtigt og fast knivspids med en stump forcep eller finger. Ingen hale bevægelse, vokal lyd eller observeret stigning i respiratorisk hastighed bør observeres, når fuldt bedøvet for kirurgiske indgreb.
- For cornea touch test, røre cornea af musen forsigtigt, med en bomuld Wick. Ingen øjenlåg bevægelse, hale-bevægelse eller observerbare stigning i respiratorisk hastighed bør observeres, når fuldt bedøvet til kirurgi.
- Barberer håret på halsen og kraniet af musen.
- Placer den fuldt bedøvet mus på en varmepude indstillet til 37 °C og Indsæt rektal temperatursonde i endetarmen. Dette gør det muligt for varmen produceret af varmepuden til at justere som reaktion på ændringer i musens kropstemperatur.
- Påfør øjen gel til at fugte øjnene af musen.
- Træk tungen ud til siden af læberne forsigtigt ved hjælp af pincet og fastgør de to forreste tænder i det andet eller tredje tænder hul i det stereo middel instrument. Fix kraniet af musen fast ved hjælp af Eye-clamp.
Bemærk: Alternativt kan der anvendes en Stereotaktisk øreklemme. - Observere under et mikroskop, adskille det subkutane væv og muskler i slutningen af interparietalknoglen og occipital knogle af musen med en skalpel at udsætte Cisterna Magna. DUP dura mater tørt med en vatpind.
- Forsigtigt punktere Cisterna Magna ved at lave et lavvandet snit med en skarp spids skalpel klinge til at dræne cerebrospinalvæsken (CSF). Fastgør en vatpind for at fortsætte med at dræne CSF.
- Injicer urethan (0,06 g pr. 25 g vægt) intraperitonealt for at anæstetisere musen. Supplement med intramuskulær injektion af atropin (0,05 mg/kg). Hold musen i et mørkt roligt sted, indtil fuld anæstesi træder i kraft.
- Kraniotomi
- Holde huden på hovedbunden med tang, klippe og fjerne huden med et par kirurgisk saks. Skær nok hud til at udsætte bregma og lambda mærker på hovedbunden. Hold den udsatte region tør.
- Juster det fastklemte kraniet for at gøre det muligt for bregma-og lambda-punkterne at blive justeret i et vandret niveau af tilsvarende højde. Undgå at vippe hovedet i den forreste, bageste position eller den mediale laterale position.
- Marker de punkter, der svarer til hippocampus-regionen ved hjælp af en Vernier caliper. Brug musen hjernen i en Stereotaktisk koordinat bog som en reference til at hjælpe med at bestemme de nøjagtige koordinater.
Bemærk: placeringen til at markere for indsnit for hippocampus er 1 mm x 3 mm på midterlinjen benævnt anterior-posterior (AP) ved hjælp af bregma som referencepunkt, og 3 mm x 3 mm vinkelret på midterlinjen (ML) for at forbinde punkterne på midterlinjen. De stereotaktiske koordinater er angivet som (AP: 1, 3 og ML: 3, 3). - Lav et snit i kraniet over dorsalregionen i hippocampus langs de markerede punkter ved hjælp af en skalpel eller High-Speed boremaskine, mens observere under et mikroskop.
Bemærk: en rektangulær formet åbning med en størrelse på 2 mm x 3 mm skal opnås efter incision. Hold det udsatte område rent for at undgå skader på hjernen. - Tag forsigtigt det løse kranium med pincet for at udsætte dura mater og brug en sprøjte eller pipette til forsigtigt at anvende fysiologisk saltvandsopløsning for at holde overfladen fugtig.
- Fjern dura mater forsigtigt med nål eller skarpe spids spidser.
Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at beskadige hjernevæv under kraniotomi. Dette vil føre til hævelse af hjernen og vil påvirke resultaterne. - Hold det udsatte hjernevæv fugtigt ved at anvende fysiologisk saltvand eller inert olie ved hjælp af en pipette eller sprøjte.
- In vivo-optagelse
- Fastgør og Placer stimulerings-og optagelses elektroden solidt i den stereo- Juster det stereotaktiske instrument i henhold til positionen af de tilsvarende AP-og ML-koordinater for stimulerings-og optagelses elektroderne over CARMENS dorsale hippocampus.
Bemærk: Brug muse hjernen i stereotaktiske koordinater som en guide til lokalisering af koordinaterne for den dorsale longitudale Carnot-hippocampus-region. F. eks. vil en Stereotaktisk koordinat for det hippocampus-område i Carnot være (AP 1,5, ML 1,0) til optagelses elektroden og (AP 1,7, ML 1,5) til stimulations elektroden. - Find den stimulerende elektrode lateral til optagelses elektroden i en langsgående retning.
Bemærk: Sørg for, at både stimulerings-og optagelses elektroderne er rene før brug. Dette forhindrer indførelse af støj ved optagelse. - Brug multikanals elektroderne til optagelser. Find først de stereotaktiske koordinater for det hippocampus-område i Carnot, som bruger den første kanal. Placer de resterende elektroder, således at vinklen på stimulerings-og optagelses elektroderne er i intervallet 30 ° til 60 ° i forhold til midterlinjen fra bregma-punktet.
Bemærk: denne vinkel svarer til den langsgående retning af CAREJAS hippocampus-region. - Som en kontrol, lokalisere optagelsen elektrode over Carnot-regionen og stimulans elektroden over området i dorsale hippocampus. For eksempel, ved hjælp af muse hjernen i stereotaktiske koordinater som en guide, vil en Stereotaktisk koordinat for Carnot-i hippocampus-regionen være (AP 1,8, ML 1,0) til optagelses elektroden og (AP 1,5, ML 1,5) til stimulerings elektroden.
Bemærk: dette trin er en alternativ kontrol og bør udføres i et separat eksperiment. - Placer reference elektroden i en distale del af den eksponerede hjerneregion eller under huden på musen.
- Tænd for optagelses systemet.
- Åbn softwaren til registrering og dataindsamling.
Bemærk: forskellige laboratorier har deres foretrukne software til registrering og dataindsamling. - Observere under et mikroskop, sænke optagelsen og stimulation elektroderne langsomt ved hjælp af micromanipulator, indtil det bare rører overfladen af hjernen. Marker punktet som nulpunkt for at begynde at beregne den nøjagtige dybde til hippocampus-regionen.
Bemærk: micromanipulatoren kan anvendes til at overvåge den dybde, hvormed elektroden indsættes på et givet tidspunkt. Observere en stigning i impedansen lige når elektroden rører hjernen overflade. - Sænk langsomt elektroderne til den omtrentlige dybde svarende til de valgte stereotaktiske koordinater for Carnot hippocampus.
Bemærk: Brug musen hjernen i stereotaktiske koordinater som en guide til at opnå den omtrentlige dybde svarende til de valgte stereotaktiske koordinater. - Giv stimulation (100 μs varighed, gentages med 30 s intervaller) og Juster elektrode dybden i trin på 50 μm eller mindre, indtil et stabilt fremkaldt felt excitatoriske postsynaptiske potentiale (fEPSP) observeres.
Bemærk: en stimulus på 20 μA er normalt nok til at fremkalde et Observer Bart respons. - Sørg for, at en stabil fEPSP er blevet fremkaldt ved at variere stimulus intensitet. En markant stigning i hældningen eller amplituden af fEPSP bør observeres med hver øget stimulus intensitet. Dette betegnes som input-output-kurven. Opret en input-output (I-O) kurve for at detektere maksimal stimulus intensitet, hvor der ikke er mere stigning i hældningen af den fremkaldte fEPSP (figur 6).
Bemærk: kassér data og Skift elektrode position, hvis fiber volley forsvinder under eksperimentet. - Brug input-output kurven til at indstille baseline intensiteten til 40-50% af maksimum. Brug den tilsvarende stimulus intensitet til baseline optagelse.
- Registrer det lokale felt potentiale som en oprindelig plan for 20-30 min.
- Brug den samme input-output-kurve til at indstille stimulerings intensiteten for at fremkalde højfrekvente stimulation (HFS) eller stivkrampe til 75% af den maksimale intensitet. Alternativt, når inducerende langvarig depression, opretholde den samme stimulus intensitet anvendes til registrering af baseline, når fremkalde lavfrekvente stimulation (LFS).
- Påfør en tetaniske stimulation af 100 Hz impulser 4 gange med et 10 s interval for at inducere LTP.
Bemærk: Brug kun denne protokol, når du arbejder på et langsigtet potensering eksperiment. - Anvend lavfrekvent stimulation af 5 Hz (900 stimuli under 3 min), 1 Hz LFS (900 stimuli under 15 min) eller 1 Hz parret-Pulse (50 MS parret-Pulse interval, 900 par stimuli i løbet af 15 min) at inducere LTD i henhold til allerede etablerede protokoller.
Bemærk: Brug kun disse protokoller, når du arbejder på et langtidsforsøg med depression. - Optag det lokale felt potentiale for 1 time efter HFS eller LFS, alternativt.
- Eksporter data, og analysér ved hjælp af softwaren.
- Kontroller placeringen af optagelsen og stimulerings elektroden ved at give en stimulation på 10 μA strøm i 30 s til at læsion de indspillede områder. Transcardially perfuse musen med 4% PARAFORMALDEHYD og høste hjernen til udskæring og farvning med Cresyl violet ifølge.
- Euthanize mus ved livmoderhals dislokation eller injektion af dødelig bedøvelses dosis efter eksperiment.
- Fastgør og Placer stimulerings-og optagelses elektroden solidt i den stereo- Juster det stereotaktiske instrument i henhold til positionen af de tilsvarende AP-og ML-koordinater for stimulerings-og optagelses elektroderne over CARMENS dorsale hippocampus.
2. in vitro-felt optagelse
- Klargøring af oxygenerede udskæring og kunstige cerebrospinalvæske (acsf)-opløsninger
- For 2 liter skæring opløsning tilsættes ca. 1 L dobbeltdestilleret vand i en målekolbe og omrøres kraftigt på en rørplade.
- Tilføj følgende udsnitnings løsningskomponenter (i mM): 87,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 NaH2po4, 25,0 NaHCO3, 25,0 glucose, 75,0 saccharose, 7,0 mgcl2. 6h2o og 0,5 CaCl2∙ 2H2o (tabel 1).
Bemærk: Alternativt kan MgCl2∙ 6h2o og CaCl2∙ 2H2o udelukkes i denne fase og tilføjes senere i en klar til brug volumen. - Top op til 2 L med dobbeltdestilleret vand under omrøring kraftigt.
- For 2 liter ACSF tilsættes ca. 1 L dobbeltdestilleret vand i en målekolbe, og der omrøres kraftigt på en rørplade.
- Tilføj følgende ACSF-løsningskomponenter (i mM): 125,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 NaH2po4, 25,0 NaHCO3, 25 glucose, 1,0 mgcl2∙ 6h2o og 2,0 CaCl2∙ 2H2o (tabel 1).
Bemærk: Alternativt kan MgCl2. 6h2o og CaCl2∙ 2H2o udelukkes i denne fase og tilføjes senere i en klar til brug volumen. - Top op til 2 L med dobbeltdestilleret vand under omrøring kraftigt.
- Opsætning og hjerne skæring
- 400 mL allerede fremstillet skære opløsning hældes i en separat kolbe og oxygenat (95% O2/5% Co2) i ca. 20 minutter.
- Opbevar resten af 1,6 L-opløsningen i et 4 °C-køleskab. Opbevar opløsningen i op til 1 uge, hvorefter den skal kasseres, hvis den ikke anvendes til at undgå svampevækst.
- Hæld 200 mL af den ilterede skære opløsning i kolben, dæk med parafilm og Overfør til a-80 °C fryser i ca. 20 minutter for at gøre en slush.
- Hæld de resterende 200 mL skæring opløsning i en hjerne skive bedrift kammer og holde i en 32 °C vandbad med kontinuerlig boblende.
- Forbered bænken til udskæring. Placer papirhåndklæder ned og kirurgiske værktøjer på toppen af bænken. Arranger de kirurgiske værktøjer i anvendelsesrækkefølge for at lette en hurtig og effektiv proces (figur 7).
- Tag den afkølede skære opløsning ud af fryseren og hæld ca. 50 mL i et bægerglas. Hæld ca. 10 mL i en Petri skål indeholdende filtrerpapir for at fugte det. Placer dem på is ved dissektions området.
- Hæld resten af den slustede udskæring løsning i udskæring kammer og ordne det på vibratome.
- Bedøve musen med isofluran ved hjælp af retningslinjer og bestemmelser om dyrepasning og brug af laboratorium af National Institute of Health, og de godkendte metoder til institutionel dyre brug og pleje udvalg af City University of Hong Kong og Incheon national Universitet.
- Decapitate den bedøvede mus med et par saks og placere hovedet på silkepapir. Skær huden dækker kraniet af musen og skære gennem de kutane muskler med saks. Skær kraniets plader langs midterlinjen til occipital knoglen ved hjælp af kirurgisk saks.
- Åbn kraniet med sløv pincet for at udsætte hjernen. Hæld forsigtigt hjernen ud med en spatel og Placer den i den afkølede skære opløsning i bægerglasset. Vent ca. 30 s.
- Tag hjernen ud ved hjælp af skeen, og Placer den forsigtigt på det tidligere fugtet filtrerpapir i Petri skålen.
- Adskil de to hjerne halvkugler langs midterlinjen med en skalpel klinge. Isoler hippocampus ved forsigtigt at fjerne den fra cortex med en spatel og placere den forsigtigt på det fugtet filtrerpapir. Skær den septiske og tidsmæssige ende af den isolerede hippocampus ved hjælp af scalpel.
- Pick up den isolerede hippocampus ved hjælp af en stump spatel og børste. DUP forsigtigt spatel på et vævs papir for at fjerne overskydende vand.
- Påfør en lille mængde lim til udskæring pladen af vibratome.
- For en langsgående carbid hippocampus skive, vedhæfte den caeginregionen af hippocampus til udskæring pladen med limen. Hurtigt, men forsigtigt placere det i udskæring kammer af vibratome indeholder kølet oxygenerede udskæring løsning.
- For den tværgående skive, der vil fungere som en kontrol, vedhæfte den ventrale ende af hippocampus til udskæring pladen af vibratome. Hurtigt, men forsigtigt placere det i udskæring kammer, der indeholder kølet oxygenerede dissektion opløsning.
Bemærk: dette trin er et alternativ til trinnet ovenfor og bør udføres separat. - Placer kniv vinklen til 90 °. Indstil vibratome parametrene til en hastighed på 0,05 mm/s, en amplitude på 1,20 mm og en skive tykkelse på 400 μm.
- Skær den vedlagte hippocampus med vibratome.
Bemærk: en god longitudinel carbid i længderetningen, vil have et lag af Carnot og 2 lag af dentate gyrus. Der kan maksimalt opnås 2 gode hippocampale skiver. Alternativt vil en tværgående hippocampus-hjerne skive have de dentate gyrus-,-carbid-og CAINREGIONER intakt. - Overfør den langsgående hippocampus hjerne skiver fra vibratome med en pipette og inkubere det i hjernen skive bedrift kammer i vandbad.
- Inkuber skiver i vandbad i 20 minutter ved en temperatur på 32 °C og Bring ud til stuetemperatur i 30 min. af restitution.
Bemærk: Alternativt kan du overføre hjerne skiven, når du er ude af vandbad og forsigtigt placere den i optagelses kammeret med strømmende oxygeneret ACSF ved en temperatur på 32 °C i 30 min. af restitution. - Mens der inkuberet i vandbad, hældes 400 mL ACSF-opløsning i en separat kolbe og oxygenat (95% O2/5% Co2) i ca. 20-30 min før overførsel af hjerne skiven til optagelses kammeret. Med en hastighed på 2 mL/min. overvåger ACSF kontinuerligt i optagelses kammeret.
- Tænd for temperaturregulatoren for at opvarme den strømmende ACSF til 32 °C.
- Opbevar resten af 1,6 L-opløsningen i et 4 °C-køleskab. Opløsningen opbevares i op til en uge, hvorefter den skal kasseres, hvis den ikke anvendes til at undgå svampevækst.
- In vitro-optagelse
- Indstil en optagelse rig ved at tænde al nødvendig hardware.
- Overfør hjerne skiven fra skiveholder kammeret til optage kammeret. Juster placeringen af hjernen skive med stump pincet og holde det på plads med en harpe. Lad ACSF køre i mindst 20 minutter. Dette gør det muligt for hjernen skive at være stabil før optagelse.
- Fyld optagelses pipetten med ACSF som en intern løsning.
- Kontroller, at der er en pipette modstand med den udpegede software. Kontrol af pipette modstanden skal være inden for intervallet 3-5 MΩ.
- Tænd for softwaren til dataindsamling. Denne software bør have lignende funktioner, der muliggør dataindsamling på samme måde som in vivo optagelser vist tidligere.
- Fastgør optagelsen og stimulations elektroderne fast i den stereo middel holderens instrument holder. Placer reference elektroden i ACSF i optagelses kammeret.
- For langsgående skiver, Placer stimulerings-og optagelses elektroden i Stratum Oriens (S.O.). Hold afstanden mellem elektroderne til ca. 300 til 500 μm. Placer stimulerings elektroden på enten den septiske eller tidsmæssige side af hjerne skiven og Optag fra det samme lag (figur 8).
- Alternativt kan du placere stimulerings-og optagelses elektroden i Stratum radiatum (S.R.). Placer stimulations elektroden på enten den septiske eller temporale side af hjerne skiven.
- For tværgående skiver som kontrol, Placer den stimulerende elektrode på Carnot (Schaffer-sikkerheds pathway)-regionen og optage elektroden på i-regionen (figur 9).
Bemærk: Dette er et alternativt kontroltrin og bør udføres i et separat eksperiment. - Tænd den isolerede stimulus generator og give stimulation (100 μs varighed, gentages med 30 s intervaller). Juster optagelsen elektrode dybde og/eller position indtil en stabil fremkaldt excitatoriske postsynaptiske felt potentiale observeres.
- Sørg for, at en stabil fEPSP er blevet fremkaldt ved at variere stimulus intensitet. En bemærkelsesværdig ændring i hældningen af fEPSP bør observeres med hver ændring af stimulus intensitet. Dette betegnes som input-output-kurven. Opret en input-output (I-O) kurve for at detektere maksimal stimulus intensitet, hvor der ikke er mere stigning i hældningen af FEPSP (figur 6).
Bemærk: kassér data og Skift elektrode position, hvis fiber volley forsvinder under eksperimentet. - Brug input-output kurven til at indstille stimulus intensitet for baseline optagelse og for fremkalde højfrekvente stimulation (HFS) eller stivkrampe til 30-40% af den maksimale fremkaldte fepsp.
- Alternativt, for eksperimenter vedrørende Ltd, bruge input-output kurve til at indstille baseline intensitet for baseline optagelse og for at fremkalde lavfrekvent stimulation (LFS) til 70% af den maksimale fremkaldte fepsp.
- Registrer det lokale felt potentiale som udgangspunkt for 20-30 min.
- Anvend HFS på 100 Hz impulser to gange med et interval på 30 s for at inducere LTP.
- Alternativt, for LTD eksperimenter, anvende lavfrekvens stimulation af 5 Hz (900 stimuli under 3 min) eller 1 Hz LFS (900 stimuli i løbet af 15 min) eller 1 Hz parret-Pulse (50 MS parret-Pulse interval, 900 par stimuli i løbet af 15 min) at inducere LTD i henhold til allerede etablerede protokol.
- Registrer det lokale felt potentiale for 1 time efter HFS eller LFS.
- Eksporter data, og analysér.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi udforskede langsigtet synaptisk plasticitet af langsgående CARPPYRAMIDÆRE neuroner i hippocampus ved hjælp af ekstracellulære felt optagelser både in vivo og in vitro. LTP og LTD er facetter af langsigtet synaptisk plasticitet, der er blevet påvist i den tværgående akse hippocampus at være ensrettede.
Vi viste her, at ved hjælp af langsgående hippocampale hjerne skiver, er der LTP i den langsgående akse af hippocampus. Vi forberedte langsgående skiver af hippocampus langs septotemporal aksen, som er vinkelret på de tværgående skiver (figur 1). Ved hjælp af optagelser fra den Carnot-regionen i hippocampus, viste vi tilstedeværelsen af LTP, der ikke var retningsbestemt. Der var ingen statistisk signifikante forskelle i optagelserne fra septal eller temporale (figur 2) side af den langsgående hippocampus hjerne skive. Vi viste også tilstedeværelsen af LTP, der ikke var lagspecifik; således viste optagelser fra både stratum radiatum og stratum Oriens (figur 2) med succes induceret LTP i den langsgående hjerne skive. Vi brugte D-AP5, en NMDAR antagonist til at påvise, at LTP induceret var afhængig af NMDA-receptorer (figur 3). Hvad der sker in vitro afspejler ikke nødvendigvis in vivo betingelser, så vi undersøgte LTP in vivo. Figur 4 a viser et skematisk diagram over stimulerings-og optagelses elektroden placeret i dorsalen hippocampus langs den langsgående akse i Carnot-regionen in vivo. Placeringen af elektroderne, der anvendes til optagelse og stimulation, blev verificeret ved læsions mærker og krystalviolet farvning (figur 4a). Vi påviste tilstedeværelsen af LTP in vivo i langsgående Carnot-regionen (figur 4b).
Ved hjælp af allerede etablerede protokoller for inducerende Ltd, vi undlod at succes inducere Ltd både in vivo og in vitro (figur 5).
Figur 1 . En skematisk tegning af tværgående og longitudale hippocampus hjerne skiver. Dette tal er tilpasset og modificeret fra Sun et al. 201821. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . LTP i langsgående skiver. Synaptiske svar på S.R. (a) eller S.O. (b) i langsgående skiver er potenseret lige efter stivkrampe stimulation med både temporale og septal indgange (S.R./Temporal (n = 12, c), S.R./septal (n = 12, c), S.O./temporale (n = 10, d), S.O./septal (n = 9, d).
N står for antallet af skiver. Fejllinjer repræsenterer SE. Dette tal er tilpasset og modificeret fra Sun et al. 201821. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . NMDAR-afhængige LTP i langsgående skiver. (a,b) LTP-induktion i tidsmæssig og septisk retning blokeres af 50 μM D-AP5 (temporale, n = 6, a) (septal, n = 5, b). (c,d) LTP-induktion i tidsmæssig og septalt retning blokeres også af D-AP5. N står for skiver. Fejllinjer repræsenterer SE. Dette tal er tilpasset og modificeret fra Sun et al. 201821. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . In vivo LTP i interlamellar-netværket. a) et skematisk tegn på optagelse og stimulering af elektroder i bedøvede dyr. Pladens loci (på septalsiden af Carnot) og stimulerende elektroder (på den temporale side af Carnot) blev identificeret ved læsions mærker. b) LTP induceres i interlamellar-tilslutningen med 100 Hz højfrekvent stimulation (HFS) (n = 10 mus). Farve spor: før (sort) og efter (rød) HFS. Fejllinjer repræsenterer SE. Dette tal er tilpasset og modificeret fra Sun et al. 201821. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Fravær af in vivo og in vitro LTD i Interlamellar CARNETNET. a) 1 Hz-PP LFS inducerer ikke in vivo Ltd. (b) 1 Hz PP-LTP, (c) 5 Hz LFS, og (d) 1 Hz LFS producerer ikke Ltd på enten den tidsmæssige eller septal sider af langsgående hjerne skive. mens LTD er induceret af 1 Hz PP-LFS i tværgående skiver: temporale (n = 8), septal (n = 11) og tværgående (n = 6) med 1 Hz PP-LFS; temporale (n = 3) og septal (n = 3) med 5 Hz LFS; temporale (n = 3) og septal (n = 3) med 1 Hz LFS. N står for skiver. Fejllinjer repræsenterer SE. Dette tal er tilpasset og modificeret fra Sun et al. 201821. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Input-output kurve præsenterer fEPSP hældning som reaktion på stigende stimulus input i hippocampus hjerne skive. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 . Kirurgiske værktøjer, der anvendes til hippocampus isolation under in vitro hjerne skæring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 . En longitudinel hjerne skive klar til optagelse. Stimulerings elektrode og optagelses pipetten indsættes i Stratum radiatum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 . En tværgående hippocampus-hjerne skive klar til optagelse. Stimulerings elektroden indsættes i Schaffer-området, og optagelsen af pippette indsættes i Carnot-regionen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Sammensatte | Skæring opløsning (mM) | ACSF (mM) |
| CaCl2. 2H2O | 0,5 | 2 |
| Glukose | 25 | 25 |
| KCl | 2,5 | 2,5 |
| MgCl2. 6h2O | 7 | 1 |
| Nacl | 87 | 125 |
| NaH2po4 | 1,3 | 1,3 |
| NaHCO3 | 25 | 25 |
| Saccharose | 75 |
Tabel 1: koncentrationer af forbindelser i hjerne skive og kunstige cerebrospinalvæske opløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen demonstrerer metoden til at inducere langsigtet synaptisk plasticitet in vivo såvel som fra hjerne skiver i den langsgående a-carpakse i hippocampus in vitro. De beskrevne trin giver nok detaljer til en eksperimententer til at undersøge LTP og LTD i en langsgående hippocampus-carnetforbindelse. Praksis er nødvendig for at skærpe de færdigheder, der kræves for at kunne registrere felt excitatoriske potentialer.
Ud over at behøve praksis, der er flere kritiske trin, der er afgørende for at opnå gode resultater. For det første blev det vist tidligere, at den vinkel, som hjerne skiverne blev lavet til, enten kunne afkorte eller bevare de langsgående projektioner af pyramidale neuroner i Carnot-carloregionen i hippocampus16. De langsgående pyramide neuroner projekt fra tværgående neuroner i en vinkel, der er næsten vinkelret. I takt med at CARNETNEURONERNE spreder sig i forskellige vinkler inden for hippocampus, lægger den langsgående forbindelse mellem dem ud langs hippocampus på den dorsoventrale akse. Således, for in vitro-optagelse, skal eksperimententer holde dette i tankerne til præcist at målrette den Carnot-carinale hippocampus neuroner langs den langsgående akse ved at skære den isolerede hippocampus væv langs dorsal-ventral akse. For in vivo-optagelser afgør den vinkel, hvormed stimulerings-og optagelses elektroderne er placeret, om de opnåede resultater er repræsentative for længdeaksen eller en blanding af både tværgående og langsgående akse. Yderligere undersøgelser, der udnytter CRISPR-Cas9, kan gøres for at bekræfte, om det fremkaldte svar udelukkende er fra Carda-regionen, da det kunne være en blanding af svar fra både Carnot-og CAUDAS-regionerne.
For det andet, for in vitro eksperimenter, skal eksperimententer sikre, at hjernen udskæring løsning, acsf, arbejdsbord og alt udstyr eller instrumenter, der kommer i kontakt med hjernen skive er fri for forurenende stoffer. Enhver form for kontaminering vil føre til forringelse af integriteten eller død af hjernen skive. Opretholdelse af en ren elektrode overflade vil sikre gode og stabile optagelser for både in vitro-og in vivo-eksperimenter.
Vi har vist, at den langsgående hippocampus carnetnetwork udstiller nmdar-afhængige ltp'er, men ikke ltds. Den trisynaptiske kredsløb, dog præsenterer med både LTP og Ltd22,23. Dette indebærer, at det langsgående CARNETNET og Tri-Synaptic kredsløb har unikke egenskaber. Vores protokol gør brug af kun elektrofysiologiske optagelser og er derfor begrænset til at finde forskellen mellem disse to netværk.
Søgningen efter en kur mod hjernesygdomme som skizofreni fortsætter. Tilbagegang eller deformitet af Carnot hippocampus subregioner har været forbundet med nogle skizofren symptomer24,25. Anvendelsen af vores protokol, selv om grundlæggende, har bragt til lys en unik synaptisk kapacitet i den carinale hippocampus-subregion i længderetningen. Denne viden er nyttig i udformningen af eksperimenter, der kan yderligere undersøge denne invaliderende hjernesygdom langs den langsgående a-akse i hippocampus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Incheon National University (International Cooperative) forskningstilskud. Vi vil gerne takke MS gona Choi for at hjælpe med nogle dataindsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine Sulphate salt monohydrate, ≥97% (TLC), crystalline | Sigma-Aldrich | 5908-99-6 | Stored in Dessicator |
| Axon Digidata 1550B | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Clampex 10.7 | |||
| D-(+)-Glucose ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Eyegel | Dechra | ||
| Isoflurane | RWD Life Sciences | R510-22 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| Matrix electrodes, Tungsten | FHC | 18305 | |
| Multiclamp 700B Amplifier | |||
| Potassium chloride, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous ≥99% | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | Stored in Dessicator |
| Pump | Longer precision pump Co., Ltd | T-S113&JY10-14 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 63148-62-9 | |
| Sodium Bicarbonate, BioXtra, 99.5-100.5% | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| Sodium Chloride, BioXtra, ≥99.5% (AT) | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic, powder | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| Sucrose, ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | |
| Temperature controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Tungsten microelectrodes | FHC | 20843 | |
| Urethane, ≥99% | Sigma-Aldrich | 51-79-6 | |
| Vibratome | Leica | VT-1200S | |
| Water bath | Grant Instruments | SAP12 |
References
- Levy, W. B. A sequence predicting CA3 is a flexible associator that learns and uses context to solve hippocampal-like tasks. Hippocampus. 6 (6), 579-590 (1996).
- Eldridge, L. L., Knowlton, B. J., Furmanski, C. S., Bookheimer, S. Y., Engel, S. A. Remembering episodes: A selective role for the hippocampus during retrieval. Nature Neuroscience. 3 (11), 1149-1152 (2000).
- Sullivan Giovanello, K., Schnyer, D. M., Verfaellie, M. A critical role for the anterior hippocampus in relational memory: evidence from an fMRI study comparing associative and item recognition. Hippocampus. 14 (1), 5-8 (2004).
- Andersen, P., Bland, B., Dudar, J. D.
- Andersen, P., Bliss, T. V. P., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Experimental Brain Research. 13 (2), 222-238 (1971).
- Sloviter, R., Lømo, T. Updating the Lamellar Hypothesis of Hippocampal Organization. Frontiers in Neural Circuits. 6 (102), (2012).
- Ishizuka, N., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. Journal of Comparative Neurology. 295 (4), 580-623 (1990).
- Tamamaki, N., Nojyo, Y. Crossing fiber arrays in the rat hippocampus as demonstrated by three-dimensional reconstruction. Journal of Comparative Neurology. 303 (3), 435-442 (1991).
- Swanson, L., Wyss, J., Cowan, W. An autoradiographic study of the organization of intrahippocampal association pathways in the rat. Journal of Comparative Neurology. 181 (4), 681-715 (1978).
- Rebola, N., Carta, M., Mulle, C. Operation and plasticity of hippocampal CA3 circuits: implications for memory encoding. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 208 (2017).
- Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79 (2017).
- Hampson, R. E., Simeral, J. D., Deadwyler, S. A. Distribution of spatial and nonspatial information in dorsal hippocampus. Nature. 402, 610 (1999).
- Umeoka, S. C., Lüders, H. O., Turnbull, J. P., Koubeissi, M. Z., Maciunas, R. J. Requirement of longitudinal synchrony of epileptiform discharges in the hippocampus for seizure generation: a pilot study. Journal of Neurosurgery. 116 (3), 513-524 (2012).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65, (2010).
- Milior, G., et al. Electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons along the longitudinal axis of the mouse hippocampus. Scientific Reports. 6, (2016).
- Yang, S., et al.
- Tsien, J. Z., Huerta, P. T., Tonegawa, S. The Essential Role of Hippocampal CA1 NMDA Receptor–Dependent Synaptic Plasticity in Spatial Memory. Cell. 87 (7), 1327-1338 (1996).
- Bliss, T., Collingridge, G. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
- Roman, F., Staubli, U., Lynch, G. Evidence for synaptic potentiation in a cortical network during learning. Brain Research. 418 (2), 221-226 (1987).
- McNaughton, B., Barnes, C., Rao, G., Baldwin, J., Rasmussen, M. Long-term enhancement of hippocampal synaptic transmission and the acquisition of spatial information. Journal of Neuroscience. 6 (2), 563-571 (1986).
- Sun, D. -g, et al. Long term potentiation, but not depression, in interlamellar hippocampus CA1. Scientific Reports. 8 (1), 5187 (2018).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Milner, A. J., Cummings, D. M., Spencer, J. P., Murphy, K. P. Bi-directional plasticity and age-dependent long-term depression at mouse CA3-CA1 hippocampal synapses. Neuroscience Letters. 367 (1), 1-5 (2004).
- Bogerts, B., et al. Hippocampal CA1 deformity is related to symptom severity and antipsychotic dosage in schizophrenia. Brain. 136 (3), 804-814 (2013).
- Ho, N. F., et al. Progressive Decline in Hippocampal CA1 Volume in Individuals at Ultra-High-Risk for Psychosis Who Do Not Remit: Findings from the Longitudinal Youth at Risk Study. Neuropsychopharmacology. 42, 1361 (2017).
