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Biochemistry

एमीलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा मस्तिष्क माइटोकोंड्रिया के साथ और झिल्ली permeabilization के साथ बातचीत

Published: September 28, 2019 doi: 10.3791/59883
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran
* These authors contributed equally

Summary

लेकिन यहाँ देशी फार्म के बीच बातचीत की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल है, prefibrillar, और विभिन्न पेप्टाइड्स और प्रोटीन के परिपक्व एमिलॉयड फाइब्रिल्स के साथ mitochondria विभिन्न ऊतकों और मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों से अलग.

Abstract

सबूत के एक बढ़ते शरीर इंगित करता है कि झिल्ली permeabilization, mitochondria जैसे आंतरिक झिल्ली सहित, एक आम विशेषता है और neurodegenerative रोगों में एमिलॉयड कुल प्रेरित विषाक्तता के प्राथमिक तंत्र है. हालांकि, झिल्ली व्यवधान के तंत्र का वर्णन सबसे रिपोर्ट फॉस्फोलिपिड मॉडल सिस्टम पर आधारित हैं, और अध्ययन सीधे जैविक झिल्ली के स्तर पर होने वाली घटनाओं को लक्षित दुर्लभ हैं. यहाँ वर्णित झिल्ली के स्तर पर एमिलॉयड विषाक्तता के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल है. Mitochondrial अलगाव के लिए, घनत्व ढाल मध्यम न्यूनतम myelin संदूषण के साथ तैयारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. माइटोकोंड्रिल झिल्ली अखंडता की पुष्टि के बाद, एमिलॉयड फाइब्रिल की बातचीत जेड-साइनुक्लिइन, गोजातीय इंसुलिन, और मुर्गी अंडे सफेद lysozyme (HEWL) चूहे मस्तिष्क mitochondria के साथ से उत्पन्न होने वाली, एक इन विट्रो जैविक मॉडल के रूप में, जांच की है। परिणाम प्रदर्शित करता है कि फाइब्रिलर विधानसभाओं के साथ मस्तिष्क mitochondria के उपचार झिल्ली permeabilization और ROS सामग्री वृद्धि के विभिन्न डिग्री पैदा कर सकता है. यह एमिलॉयड फाइब्रिल्स और माइटोकोंड्रिल झिल्ली के बीच संरचना-निर्भर अन्योन्यक्रिया को इंगित करता है। यह सुझाव दिया जाता है कि एमिलॉयड फाइब्रिल्स के जैवभौतिक गुण और माइटोकोंड्रिल झिल्ली के लिए उनकी विशिष्ट बाइंडिंग इन प्रेक्षणों में से कुछ के लिए स्पष्टीकरण प्रदान कर सकती है।

Introduction

एमिलॉयड से संबंधित विकार, जिसे एमिलॉयडोस के रूप में जाना जाता है, विभिन्न ऊतकों और अंगों में अघुलनशील प्रोटीन जमा की उपस्थिति द्वारा परिभाषित रोगों का एक बड़ा समूह का गठन1,2. उनमें से, neurodegenerative विकार सबसे अक्सर रूपों में जो प्रोटीन समुच्चय केंद्रीय या परिधीय तंत्रिका तंत्र2में दिखाई देते हैं. हालांकि एमिलॉयड समुच्चय3की विषाक्तता में शामिल होने के लिए कई तंत्रों का प्रस्ताव किया गया है , एमिलॉयड पैथोलॉजी4के प्राथमिक तंत्र के रूप में कोशिका झिल्ली विघटन और permebilization के लिए सबूत की बढ़ती शरीर, 5. प्लाज्मा झिल्ली के अलावा, आंतरिक organelles (यानी, mitochondria) भी प्रभावित हो सकता है.

दिलचस्प है, उभरते सबूत पता चलता है कि mitochondrial रोग neurodegenerative विकारों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, अल्जाइमर और पार्किंसंस रोगों सहित6,7. इस मुद्दे के अनुसार, कई रिपोर्टों ने एमिलॉयड जेड-पेप्टाइड, जेड-सिनयूक्लिइन, हंटिंगटिन, और एएलएस से जुड़े उत्परिवर्ती SOD1 प्रोटीन के बंधन और संचय को माइटोकोंड्रिया8,9,10, 11.एमिलॉयड समुच्चय द्वारा झिल्ली परमीबिलाइजेशन की क्रियाविधि या तो असतत चैनलों के गठन के माध्यम से माना जाता है (पोर) और/या एक गैर विशिष्ट डिटर्जेंट की तरह तंत्र के माध्यम से5,12, 13. यह उल्लेखनीय है कि इन निष्कर्षों के अधिकांश फॉस्फोलिपिड मॉडल सिस्टम से जुड़े रिपोर्ट पर आधारित किया गया है, और अध्ययन सीधे जैविक झिल्ली में होने वाली घटनाओं को लक्षित दुर्लभ हैं. जाहिर है, इन कृत्रिम लिपिड bilayers जरूरी जैविक झिल्ली के आंतरिक गुणों को प्रतिबिंबित नहीं, mitochondria के उन सहित, जो विषम संरचनाओं रहे हैं और फॉस्फोलिपिड और प्रोटीन की एक विस्तृत विविधता से बना.

वर्तमान अध्ययन में, mitochondria चूहे दिमाग से अलग एक इन विट्रो जैविक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है के लिए amyloid फाइब्रिल्स के विनाशकारी प्रभाव की जांच करने के लिए जेड-synuclein से उत्पन्न होने वाले (एक एमिलॉयडप्रोटीन प्रोटीन के रूप में), गोजातीय इंसुलिन (एक मॉडल पेप्टाइड दिखा के रूप में) इंजेक्शन-स्थानीयकृत एमिलॉयडोसिस में शामिल मानव इंसुलिन के साथ महत्वपूर्ण संरचनात्मक होमोलोजी, और मुर्गी अंडे सफेद लाइसोजाइम (HEWL; एमिलॉयड एकत्रीकरण के अध्ययन के लिए एक आम मॉडल प्रोटीन के रूप में)। एमिलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा प्रेरित माइटोकोंड्रियाल झिल्ली की बातचीत और संभावित क्षति की जांच माइटोकोंड्रियाल मैलेट डिहाइड्रोजेनेज (एमडीएच) (माइटोकोंड्रिल मैट्रिक्स में स्थित) और माइटोकोंड्रिया रिएक्टिव ऑक्सीजन की रिहाई को देखकर की जाती है। प्रजातियों (आरओएस) वृद्धि।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों तेहरान विश्वविद्यालय के चिकित्सा विज्ञान के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुसार प्रदर्शन किया गया. गिलोटिन ब्लेड sharpening और ब्लेड के दृढ़ और तेजी से आंदोलनों को लागू करने से चूहों के लिए दुख और हानिकारक प्रभाव को कम करने के लिए अधिकतम प्रयास किए गए थे.

1. मस्तिष्क एकरूपता और माइटोकोंड्रिल अलगाव

नोट: Mitochondrial अलगाव के लिए सभी अभिकर्मकों Sims और एंडरसन14के अनुसार तैयार किए गए थे .

  1. माइटोकोंड्रियाल अलगाव के लिए बफर्स की तैयारी
    1. 100 एमएम ट्राइस-एचसीएल घोल तैयार करें: ट्राइस-एचसीएल का 0.605 ग्राम वजन और इसे बीकर में लगभग 40 एमएल डीओनीकृत जल (डीडब्ल्यू) में घोल लें। समाधान को 50 एमएल volumetric फ्लास्क पर स्थानांतरित करें और अंतिम वॉल्यूम को DW जोड़कर 50 एमएल तक बढ़ाएँ.
    2. एक 10 एमएम EDTA समाधान तैयार करें: EDTA के 0.202 ग्राम वजन और यह एक बीकर में DW के लगभग 40 एमएल में भंग. समाधान को 50 एमएल volumetric फ्लास्क पर स्थानांतरित करें और अंतिम वॉल्यूम को DW जोड़कर 50 एमएल तक बढ़ाएँ.
      नोट: दोनों समाधान कम से कम 4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. एक Tris-HCl/EDTA/sucrose स्टॉक समाधान तैयार करें: बीकर में 100 एमएल Tris-HCl के 30 एमएल और 10 एमएल 10 एमएम EDTA के 30 एमएल जोड़ें। 32.86 ग्राम सुक्रोज का वजन करें और चुंबकीय विलोडक के साथ हिलाते हुए इसे बीकर में जोड़ें। जब sucrose भंग कर दिया है, एक 100 एमएल volumetric फ्लास्क के लिए समाधान हस्तांतरण और DW जोड़कर 100 एमएल करने के लिए अंतिम मात्रा में वृद्धि.
      नोट: यह समाधान 3 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
    4. एक आइसोलेशन बफर (आईबी) तैयार करें: डीडब्ल्यू के लगभग 150 एमएल में ट्रास-एचसीएल/EDTA/sucrose स्टॉक का 100 एमएल जोड़ें। 0.1 M HCl जोड़कर pH को 7.4 में समायोजित करें. DW जोड़कर अंतिम वॉल्यूम को 300 एमएल तक बढ़ाएँ.
    5. आईबी के साथ 15% (v/v) घनत्व प्रवणता माध्यम को ठंड आईबी के 8.5 एमएल घनत्व प्रवणता माध्यम को जोड़कर तैयार की जा यूँ।
    6. तैयार 10 mg/mL गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) समाधान: वजन 20 फैटी एसिड मुक्त बीएसए की मिलीग्राम और यह लगभग में भंग 1.5 एमएल DW एक 2 एमएल शीशी में. DW जोड़कर 2 एमएल करने के लिए अंतिम मात्रा बढ़ाएँ और उपयोग जब तक बर्फ पर स्टोर.
      Note: हौसले से माइटोकोंड्रियाल अलगाव के दिन चरण 1.1.4-1.6 से समाधान तैयार करें और उपयोग होने तक उन्हें बर्फ पर संग्रहीत करें।
  2. चूहा मस्तिष्क का अलगाव
    नोट: Decapitation और पुरुष चूहों के मस्तिष्क को हटाने (150-200 ग्राम) Sims और एंडरसन14के अनुसार प्रदर्शन किया गया.
    1. एक बर्फ बाल्टी में एक 30 एमएल बीकर रखो और बीकर के लिए ठंड आईबी के 10 एमएल जोड़ें.
    2. एक छोटे से जानवर गिलोटिन के साथ चूहे decapitate और mitochondrial गुणों की गिरावट को सीमित करने के लिए decapitation के 1 मिनट के भीतर खोपड़ी से मस्तिष्क को हटा दें।
    3. तेजी से ठंड आईबी युक्त बीकर के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण.
  3. मस्तिष्क एकरूपता और माइटोकोंड्रिया की तैयारी
    नोट: Mitochondrial भिन्न Sims और एंडरसन14द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार अलग थे , कुछ संशोधनों के साथ के रूप में पहले15वर्णित . यह जल्दी से काम करते हैं और प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर सब कुछ रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
    1. आईबी के 30 एमएल के साथ ऊतक 2x धोएं, ठंडे आईबी युक्त बीकर को स्थानांतरित करें, और कैंची से मस्तिष्क को बारीक कीमा करें।
    2. पूर्व ठंडा आईबी के 10 संस्करणों जोड़ें (के बारे में 10 चूहे मस्तिष्क प्रति आईबी के एमएल).
    3. एक 20 एमएल ठंड Dounce homogenizer करने के लिए ऊतक निलंबन स्थानांतरण.
    4. एक motorized मूसल के साथ नौ ऊपर और नीचे स्ट्रोक का उपयोग कर ऊतक के टुकड़े Homogenize.
      नोट: तीन homogenization स्ट्रोक के प्रत्येक सेट के बाद लगभग 30 s के लिए बर्फ पर मिश्रण छोड़ दो सुनिश्चित करने के लिए कि homogenate ठंडा रहता है.
    5. एक पूर्व ठंडा 10 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र 1,300x ग्राम और 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर homogenate स्थानांतरण।
    6. ध्यान से supernatant decant और यह एक पूर्व ठंडा 10 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र 21,000x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट के लिए स्थानांतरित.
    7. सुपरनेंट को त्यागें और एक ठंडे 15% घनत्व ग्रेडिएंट मध्यम समाधान (5 एमएल प्रत्येक मस्तिष्क के लिए) में गोली को धीरे से एक पिपेट के साथ मिश्रण को हिलाते हुए पुन: निलंबित करें।
    8. धीमी त्वरण (45 s से 0 rpm से 500 rpm के बाद सामान्य त्वरण के बाद) और मंदी (कोई ब्रेक) का उपयोग कर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर में सेंट्रीफ्यूज। यह सामग्री के दो अलग-अलग बैंड का उत्पादन करना चाहिए (चित्र 1A, बाएँ).
    9. एक पास्चर पिपेट का उपयोग करना, ढाल के शीर्ष पर जमा सामग्री के तेज बैंड को हटा दें, जिसमें ज्यादातर माइलिन होता है। फिर, बैंड 2 में समृद्ध mitochondrial अंश के किसी भी खोने के बिना जितना संभव हो सामग्री (बैंड 2) overlying घनत्व ढाल मध्यम समाधान को हटा दें।
      नोट: बैंड 2 दोनों synaptic और गैर synaptic mitochondria शामिल हैं.
    10. मिश्रण को पिपेट के साथ धीरे-धीरे हिलाते हुए माइटोकोंड्रियाल भिन्न में आईबी के 8 एमएल जोड़ें।
    11. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,700x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और ध्यान से supernatant को दूर, नीचे ढीला गोली undisturbed छोड़ने.
    12. एक पिपेट की नोक के साथ मिश्रण को धीरे से हिलाते हुए अपकेंद्रित्र ट्यूब में 10 मिलीग्राम/एमएल फैटी एसिड-मुक्त बीएसए का 1 एमएल जोड़ें। आईबी जोड़कर मस्तिष्क प्रति 5 एमएल के लिए अंतिम मात्रा में वृद्धि.
    13. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 6,900x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, जो एक फर्म गोली का उत्पादन करना चाहिए (चित्र 1A, सही)।
    14. सुपरनेंट को रद्द करें और आईबी में माइटोकोंड्रिल गोली को धीरे से पुन: लागू करें, उन्हें 0.5 एमएल ट्यूब में रखें, और उपयोग होने तक तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें।

2. प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण

नोट: प्रोटीन एकाग्रता Lowry एट अल16की विधि का उपयोग कर मापा जाता है.

  1. लोरी परख के लिए समाधान की तैयारी
    1. समाधान A तैयार करें: 0.4 ह नाह और 2 ह ना2ब्व्3 का वजन और डीडब्ल्यू के 80 एमएल में भंग करें, फिर समाधान को 100 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में स्थानांतरित करें और डीडब्ल्यू जोड़कर 100 एमएल तक वॉल्यूम बढ़ाएं।
    2. समाधान बी तैयार करें: 0.1 ग्राम पोटेशियम सोडियम टार्टरेट और 0.05 ग्राम क्यूएसओ4 का वजन करें और 8 एमएल DW में भंग करें, फिर समाधान को 10 एमएल वॉल्यूमिक फ्लास्क में स्थानांतरित करें और डीडब्ल्यू जोड़कर 10 एमएल तक वॉल्यूम बढ़ाएं।
      नोट: दोनों समाधान A और B 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रह सकते हैं।
    3. समाधान C तैयार करें: डडब्ल्यू के 7.5 एमएल के लिए फॉलिन समाधान का 0.5 एमएल जोड़ें।
      नोट: समाधान सी ताजा तैयार करें और उपयोग होने तक प्रकाश से दूर रहें।
    4. 0, 20, 40, 60, 80, 100, और 120 डिग्री सेल्सियस की अंतिम सांद्रता के साथ बीएसए मानकों को तैयार करें 0, 20, 40, 60, 80, 100, और 1 मिलीग्राम/एमएल बीएसए के 120 डिग्री एल के संयोजन से, पर्याप्त डीडब्ल्यू के साथ 1000 $L समाधान करने के लिए।
  2. प्रोटीन एकाग्रता माप
    नोट: अधिक से अधिक सटीकता के लिए, triplicate में इस चरण को चलाएँ।
    1. एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए मानक समाधान और mitochondrial homogenate के 50 डिग्री एल जोड़ें, समाधान ए के 45 डिग्री सेल्सियस के अलावा द्वारा पीछा किया। फिर, 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट गर्म पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    2. समाधान बी के 5 डिग्री एल जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    3. समाधान ब् के 150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट गर्म पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    4. एक प्लेट रीडर में थाली लोड और मानकों और 650 एनएम पर mitochondrial निलंबन के लिए अवशोषण मूल्यों को रिकॉर्ड. फिर, एक अंशांकन वक्र का उपयोग कर, mitochondria के प्रोटीन सामग्री की गणना.

3. Mitochondrial झिल्ली अखंडता निर्धारण

नोट: Mitochondrial झिल्ली अखंडता से पहले और Triton X-100 द्वारा झिल्ली व्यवधान के बाद अलग mitochondria में malate dehydrogenase (MDH) गतिविधि को मापने के द्वारा पुष्टि की है.

  1. शीतल आईबी के साथ 1 मिलीग्राम/एमएल के लिए डिल्यूट माइटोकोंड्रियाल होमोजेनेट और दो 1.5 एमएल ट्यूबों में रखा गया है (आमतौर पर प्रति ट्यूब माइटोकोंड्रिया के 195 डिग्री सेल्सियस)।
  2. जोड़ें 5 $L के 20% (v/v) Triton X-100 (DW के साथ पतला) एक ट्यूब के लिए (अधिकतम एंजाइम गतिविधि के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में) और DW के 5 डिग्री एल एक और ट्यूब के लिए (नियंत्रण के लिए) एक stirr के साथ मिश्रण के बाद.
  3. 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक गर्म पानी स्नान में 10 मिनट के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
  4. 15 मिनट के लिए 16,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर में ट्यूबों के centrifugation द्वारा गोली mitochondria.
  5. ध्यान से निम्नलिखित अनुभाग में वर्णित एक मानक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख का उपयोग कर mitochondrial MDH की गतिविधि परावती के लिए जिसके परिणामस्वरूप supernatants इकट्ठा.
  6. माइटोकोंड्रियाल झिल्ली की अखंडता की गणना निम्नानुसार करें:
    Equation 1

4. एमडीएच गतिविधि निर्धारण

नोट: MDH गतिविधि spectrophotometricly मापा गया था के रूप में Sottocasa एट अल द्वारा वर्णित17.

  1. MDH गतिविधि परख के लिए समाधान की तैयारी
    1. एक 50 मीटर Tris-HCl समाधान तैयार (पीएच - 7.5): Tris-HCl का उपयोग कर DW में एक 7.9 mg/mL समाधान तैयार है, और पीएच को समायोजित करने के लिए 7.5 पर 25 डिग्री सेल्सियस के साथ 1.0 M NaOH.
    2. 50 एमएम ऑक्सालोऐसीटेट समाधान तैयार करें: ट्राइस-एचसीएल में ऑक्सोएएटेट का उपयोग करके 6.6 मिलीग्राम/एमएल घोल तैयार करें।
      नोट: यह समाधान समाधान में एक बार स्थिर नहीं है और तुरंत उपयोग करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए.
    3. 10 मीटर जेड-नाध विलयन तैयार की जा रही है- त्रिस-एचसीएल में र्-नाध का प्रयोग करके 7ण्81 मिलीग्राम/एमएल घोल तैयार की जा रही है।
  2. एमडीएच गतिविधि निर्धारण
    नोट: 1ण्0 एमएल अभिक्रिया मिश्रण में अंतिम परख सांद्रता 50 लाख त्रिस-एचसीएल, 5 एमएम ऑक्सोएटेट तथा 0ण्1 एम एम जेड-नाध है।
    1. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को 25 डिग्री सेल्सियस और 340 एनएम पर सेट करें। पिपेट 890 जेडएल ट्रास-एचसीएल बफर, 100 जेडएल ऑक्सोएसेट समाधान, और एक खाली कुवेट और 880 जेडएल ट्रास-एचसीएल बफर के लिए नाडीह समाधान का 100 डिग्री एल, और एक नमूना कुवेट में नाडीएच समाधान के 10 डिग्री एल।
    2. 3-4 मिनट के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में इनक्यूबेट cuvettes और रिक्त के खिलाफ संदर्भ.
    3. फिर नमूना cuvette करने के लिए mitochondrial homogenate (1 mg/mL) के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, तुरंत उलटा द्वारा मिश्रण, और रिकॉर्ड में कमी कम हो जाती है के कारण अवशोषण में NADH ऑक्सीकरण के कारण 340 एनएम के लिए 1 मिनट.

5. इन विट्रो-साइनुक्लिइन, गोजातीय इंसुलिन, और HEWL फाइब्रिल गठन

  1. प्रोटीन की तैयारी
    1. जेड-साइनुक्लिइन:
      नोट: रिकॉमबिनेंट की अभिव्यक्ति और शुद्धि --synuclein कुछ संशोधनों केसाथ होयर एट अल द्वारा वर्णित के रूप में किया जाता है, और SDS-PAGE द्वारा $-synuclein की शुद्धता की पुष्टि की है।
      1. डाइलीज शुद्ध जेड-सिनक्लिन रात भर फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के खिलाफ।
      2. 275 दउ19पर 5600 उ-1 बउ-1 के विलुप्त होने गुणांक का उपयोग करके प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करें .
      3. 1.5 एमएल ट्यूबों में एलिकोट प्रोटीन और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    2. बोवाइन इंसुलिन और HEWL:
      1. दोनों गोजातीय इंसुलिन और HEWL प्रदान करें.
      2. प्रत्येक प्रोटीन को 50 उम ग्लाइसिन बफर (चह र् 1ण्6; एचसीएल के साथ चह समायोजित की गई)।
      3. क्रमशः20,21में क्रमश: 1ण्0 मिलीग्राम/एमएल के लिए 1.0 तथा 2.63 के विलुप्त होने गुणांक का उपयोग करके गोजातीय इंसुलिन तथा HEWL सांद्रता का निर्धारण करें।
  2. एमिलॉयड फाइब्रिलेशन प्रेरण
    1. एमिलॉयड फाइब्रिलेशन के लिए समाधान की तैयारी:
      1. thioflavin टी (ThT) बफर तैयार करें: NaH2PO4 के 0.3 ग्राम वजन और DW के 80 एमएल में भंग, 6.5 करने के लिए पीएच समायोजित, और DW जोड़कर 100 एमएल करने के लिए मात्रा में वृद्धि.
      2. ThT स्टॉक समाधान (5 मम) तैयार करें: ThT के 1.6 मिलीग्राम वजन और यह ThT बफर के 1 एमएल में भंग, एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर कागज के माध्यम से पारित, और उपयोग जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से दूर रखना.
        नोट: यह समाधान 4 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
      3. ThT समाधान (1 mM) तैयार करें: ThT स्टॉक समाधान (5 m) के 200 $L को ThT बफर के 800 $L में जोड़ें।
        नोट: यह समाधान 1 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. इन विट्रो -सिनयूक्लिइन एमिलॉयड फाइब्रिल गठन:
      1. प्रोटीन विलयन (200 डिग्री सेल्सियस) और 6 डिग्री सेल्सियस थट विलयन (1 उ.मी.) को 1.5 एमएल ट्यूबों में मिलाइए जिसके बाद हिलाते हुए।
      2. 4 दिनों के लिए 800 आरपीएम पर लगातार हलचल के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मोमिक्सर में ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
      3. नियमित समय अंतराल के बाद इनक्यूबेट किए गए नमूनों के एलिकोट (10 डिग्री सेल्सियस) लें और आरटी में 5 मिनट के लिए ThT बफर, मिश्रित, और इनक्यूबेट के 490 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
      4. सेट उत्तेजना और उत्सर्जन भट्ठा चौड़ाई के रूप में 5 एनएम और 10 एनएम, क्रमशः, और 440 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन द्वारा ThT फ्लोरोसेंट उपाय 485 एनएम पर एक फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर.
    3. इन विट्रो गोजातीय इंसुलिन एमिलॉयड फाइब्रिल गठन:
      1. 1.5 एमएल ट्यूब में 637 डिग्री सेल्सियस प्रोटीन विलयन (250 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें। फिर, 13 डिग्री सेल्सियस ThT समाधान (1 mM) हिलाने के बाद जोड़ें.
      2. प्रोटीन समाधान (250 डिग्री सेल्सियस) के एक स्पष्ट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 20 डिग्री एम ThT युक्त alicots जोड़ें और क्रिस्टल स्पष्ट सील टेप के साथ थाली सील.
      3. प्लेट को एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर में लोड करें और आंदोलन के बिना 57 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      4. उपाय ThT फ्लोरोसेंट पर 30 मिनट के अंतराल पर, 440 एनएम पर उत्तेजना और 485 एनएम पर उत्सर्जन के साथ, 12 ज के लिए.
        नोट: प्रत्येक माप से पहले 5 s के लिए थाली हिलाओ.
    4. इन विट्रो HEWL एमिलॉयड फाइब्रिल गठन:
      1. प्रोटीन समाधान के alicots (200 $L) जोड़ें )1 m) एक स्पष्ट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 20 डिग्री सेल्सियस युक्त और क्रिस्टल स्पष्ट सील टेप के साथ थाली सील.
      2. प्लेट को एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर में लोड करें और आंदोलन के बिना 57 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      3. 2 एच अंतराल पर ThT फ्लोरोसेंट उपाय, 440 एनएम पर उत्तेजना और 485 एनएम पर उत्सर्जन के साथ, 4 दिनों के लिए।
        नोट: सभी तीन प्रोटीनों के लिए एमिलॉयड फाइब्रिल गठन की पुष्टि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा की जाती है (चित्र 2ख)।

6. एमिलॉयड फाइब्रिल्स, एमडीएच रिलीज परख, और आरओएस माप के साथ माइटोकोंड्रिया का उपचार

  1. एमिलॉयड फाइब्रिल्स के साथ पृथक माइटोकोंड्रिया की इन्क्यूबेशन
    1. अपकेंद्रित्र और गर्म पानी के स्नान को चालू करें और क्रमशः 4 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    2. IF का उपयोग करके, माइटोकोंड्रियाल समजोनेट को 1 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता में पतला करें।
    3. माइटोकोंड्रिल होमोगेनेट्स युक्त 1.5 एमएल ट्यूबों की दो श्रृंखला तैयार करें (MDH रिलीज परख के लिए एक श्रृंखला और एक अन्य mitochondrial ROS माप के लिए).
    4. जेड-साइन्यूक्लिइन, गोजातीय इंसुलिन, या HEWL के ताजा या एमिलॉयड फाइब्रिल्स जोड़ें (अंतिम सांद्रता में 5 $M, 10 $M, 20 $M, और 25 $M; PBS या ग्ली बफरसिन को एक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें) माइटोकोंड्रियाल होमोगेनेट (अंतिम मात्रा ] 200 डिग्री एल) (तालिका 1, तालिका 2 देखें) , और तालिका 3) धीरे एक पिपेट के साथ समाधान सरगर्मी द्वारा पीछा किया.
      नोट: MDH रिलीज परख के लिए, Triton X-100 का उपयोग करें (की एक अंतिम एकाग्रता पर 0.5% [v/v]) अधिकतम एंजाइम रिलीज के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में.
    5. गर्म पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए mitochondrial निलंबन युक्त इनक्यूबेट ट्यूब 30 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट।
    6. उपाय mitochondrial MDH रिलीज और ROS सामग्री के रूप में अनुभाग 6.2 और 6.3 में उल्लिखित.
  2. Mitochondrial MDH रिलीज परख
    1. 15 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर इनक्यूबेट्ड माइटोकोंड्रियाल होमोजेनेट्स को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर धारा 4 में वर्णित माइटोकोंड्रियाल एमडीएच की गतिविधि पर रोक के लिए परिणामी सुपरनेट्स को सावधानी से एकत्र करें।
    2. अधिकतम प्रभाव (Triton X-100) के एक अंश के रूप में MDH की रिहाई की गणना निम्नानुसार:

Equation 1

  1. माइटोकोंड्रिल आरओएस माप
    नोट: Mitochondrial ROS सामग्री ऑक्सीकरण संवेदनशील fluorogenic अग्रदूत dihydrodichlorocarboxyfluorescein diacetate (DCFDA)22के साथ निर्धारित किया जाता है.
    1. माइटोकोंड्रिल ROS माप के लिए समाधान तैयार करें। डीडब्ल्यू में भंग करके मेथनॉल (ताजा तैयारी) और 200 एमएम सक्सिनेट समाधान में घोल कर 50 डिग्री सेल्सियस डीसीएफडीए समाधान तैयार करें।
    2. पिपेटे 191 $L इनक्यूबेट्ड माइटोकोंड्रियाल होमोगेनेट के प्रत्येक कुएं में 96 अच्छी प्लेट में जोड़ दें और 50 डिग्री सेल्सियस डीसीएफडीए (1 डिग्री एम अंतिम सांद्रता) और 200 एमएम के 5 डिग्री एल (5 एमएम अंतिम सांद्रता) को जोड़ते हैं।
    3. धीरे-धीरे हिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट गर्म पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    4. एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर में प्लेट लोड और फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने, 485 एनएम पर उत्तेजना और 530 एनएम पर उत्सर्जन के साथ।

7. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. सभी प्रयोगों को कम से कम 2x या 3x triplicate assays के साथ प्रदर्शन और उचित सांख्यिकीय परीक्षण का संचालन. यहाँ, परिणाम मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं - एसडी, और एक छात्र की बनती टी-परीक्षण सांख्यिकीय महत्व की गणना करने के लिए उपयोग किया गया था. पी-मान 0.01 और 0.05 से कम सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माने जाते थे (*p और lt; 0.05; *p और lt; 0.01).

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Representative Results

प्रोटोकॉल एक इन विट्रो जैविक मॉडल के रूप में चूहे मस्तिष्क mitochondria के साथ एमिलॉयड फाइब्रिल की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल का वर्णन करता है. माइटोकोंड्रियाल तैयारी के लिए, 15% (v/v) घनत्व प्रवणता माध्यम का उपयोग मस्तिष्क के ऊतकों14के प्रमुख संदूषण के रूप में माइलिन को हटाने के लिए किया गया था। जैसा कि चित्र 1कमें दिखाया गया है, 30,700 x g पर अपकेंद्रण सामग्री के दो अलग-अलग बैंडों का उत्पादन किया, माइलिन (बैंड1 के प्रमुख घटक के रूप में) और बैंड 2, जिसमें समृद्ध माइटोकोंड्रियाल भिन्न होता है।

सिम्स और एंडरसन 14 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल को संशोधितकरके,एक माइटोकोंड्रियाल निलंबन जिसमें दोनों synaptic और गैर-synaptic mitochondria तैयार किया गया था. शुद्ध गैर synaptic mitochondria की तैयारी के लिए, सिम्स और एंडरसन पहले प्रोटोकॉल14विस्तृत . सेंट्रीफ्यूगेशन के अंतिम चरण में, 10 मिलीग्राम/एमएल फैटी एसिड-मुक्त बीएसए को एक फर्म माइटोकोंड्रियाल गोली प्राप्त करने के लिए जोड़ा गया था (चित्र 1क)। Mitochondrial झिल्ली अखंडता से पहले और झिल्ली व्यवधान और Triton X-100 द्वारा एंजाइम रिलीज के बाद अलग mitochondria में MDH गतिविधि को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में.

यह आम तौर पर पाया गया कि माइटोकोंड्रियाल की तैयारी लगभग 93% बरकरार थी (चित्र 1 बी) . एमिलॉयड फाइब्रिल्स के विकास की निगरानी के लिए एक ThT फ्लोरोसेंट परख किया गया था। जैसा कि चित्र 2कमें दिखाया गया है , तीन प्रोटीनों के एमिलॉयड फाइब्रिलेशन के वक्र ने एक विशिष्ट सिग्मोइडल पैटर्न दिखाया, जो इन प्रोटीनों के नाभिकन-निर्भर बहुलकीकरण मॉडलों के अनुरूप है जैसा कि पहले23,24 की सूचना दी गई थी ,25. जेड-साइनुक्लिइन, गोजातीय इंसुलिन, और HEWL के लिए उच्चतम ThT फ्लोरोसेंट उत्सर्जन 96 ज, 12 ज, और 96 एच के बाद मनाया गया, क्रमशः एमिलॉयड फाइब्रिल्स के गठन का सुझाव दिया गया (चित्र 2A)। यह आगे AFM माप द्वारा पुष्टि की गई थी.

जैसा कि चित्र 2खमें सचित्र में दिखाया गया है, एमिलॉयड परिस्थितियों में इनक्यूबेट किए गए तीन प्रोटीनों के लिए विशिष्ट एमिलॉयड आकृति विज्ञान के साथ सुपरिभाषित परिपक्व तंतुक पाए गए। एमिलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा माइटोकोंड्रिल झिल्ली के इंटरेक्शन और संभावित नुकसान और permeabilization की जांच की गई। यह mitochondrial MDH और mitochondrial ROS माप की रिहाई की निगरानी द्वारा पूरा किया गया था $-synuclein के अलावा पर, गोजातीय इंसुलिन, या HEWL एमिलॉयड फाइब्रिल्स mitochondrial निलंबन के लिए और बताए प्रक्रियाओं का पालन. प्रारंभिक प्रयोगों से पता चला है कि ThT की उपस्थिति (अप करने के लिए 3 डिग्री सेल्सियस) MDH रिलीज और mitochondrial ROS सामग्री (डेटा नहीं दिखाया गया) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा.

जैसा कि चित्र 3 में दर्शायागया है, एमडीएच की पर्याप्त रिलीज को एकाग्रता-निर्भर तरीके से माइटोकोंड्रिया में -synuclein एमिलॉयड फाइब्रिल्स के योग पर देखा गया था। यद्यपि गोजातीय इंसुलिन एमिलॉयड फाइब्रिल्स के अतिरिक्त मामूली रिलीज का पता लगाया गया था, एचईएल फाइब्रिल्स अप्रभावी पाए गए थे (चित्र 3)। जबकि mitochondrial ROS सामग्री में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि गोजातीय इंसुलिन या HEWL एमिलॉयड फाइब्रिल्स के अलावा पर मनाया गया था, जेड-synuclein फाइब्रिल्स के साथ उपचार मस्तिष्क mitochondria के ROS सामग्री में काफी वृद्धि करने के लिए नेतृत्व में एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके (चित्र 4)।

Figure 1
चित्रा 1: Mitochondrial अलगाव और झिल्ली अखंडता दृढ़ संकल्प. (ए) वाम: शीत 15% घनत्व प्रवणता मध्यम विलयन में गोली को पुन: ढालने के बाद अपकेंद्रण ट्यूब की विशिष्ट उपस्थिति। Myelin बैंड 1 का प्रमुख घटक है, जो शीर्ष पर जमा. बैंड 2 अत्यधिक समृद्ध mitochondrial अंश शामिल हैं. दाएँ: एक फर्म गोली 10 mg/mL फैटी-एसिड मुक्त बीएसए और 6900 x g. (बी) Mitochondrial झिल्ली अखंडता पर centrifugation के अलावा के बाद उत्पादन किया गया था पहले और बाद में पृथक mitochondria में MDH गतिविधि को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था Triton X-100 द्वारा झिल्ली व्यवधान. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र2: जेड-सिनुक्लिइन, गोजातीय इंसुलिन, और HEWL के एमिलॉयड फाइब्रिलेशन। (ए) एमिलॉयड फाइब्रिल गठन के काइनेटिक्स, जो 485 दउ पर थ्रसोसेंट की तीव्रता में वृद्धि करके इंगित किया जाता है। (बी)तीन प्रोटीनों की एएफएम छवियों को दिखाया गया है, जिन्हें नियमित समय के लिए एमिलॉयडोजेनिक परिस्थितियों के अंतर्गत इनक्यूबेट किया गया था। स्केल बार 500 एनएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Mitochondrial MDH मोनोमर और जेड-साइनुक्लिइन, गोजातीय इंसुलिन, और HEWL के एमिलॉयड फाइब्रिल के साथ बातचीत पर जारी. रिलीज 0.5% (v/v) Triton X-100 के साथ उपचार पर मनाया अधिकतम के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की है. प्रत्येक मान माध्य का प्रतिनिधित्व करता है - SD (n ] 3; *p और lt; 0.05, *p और lt; 0.01). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: Mitochondrial ROS सामग्री मोनोमर और एमिलॉयड फाइब्रिल के साथ बातचीत पर जेड-साइनुक्लिइन, गोजातीय इंसुलिन, और HEWL. आंकड़ों को नियंत्रण माइटोकोंड्रिया में मूल्यों के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। प्रत्येक मान माध्य का प्रतिनिधित्व करता है - SD (n ] 3; *p;lt; 0.05; *p और lt; 0.01). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

माइटोकोंड्रिल समजातीय (1 मिलीग्राम/ जेड-साइनुक्लिइन मोनोमर (200 डिग्री सेल्सियस) जेड-साइनुक्लिइन फाइब्रिल (200 डिग्री सेल्सियस) अलगाव बफर Pbs ट्राइटन एक्स-100 20% (v/
नियंत्रण 175 जेडएल 0 0 25 जेडएल 0 0
Pbs 175 जेडएल 0 0 0 25 जेडएल 0
मोनोमर 25 डिग्री मी. 175 जेडएल 25 जेडएल 0 0 0 0
फिब्रिल 5 डिग्री एम 175 जेडएल 0 5 $L 20 जेडएल 0 0
फिब्रिल 10 डिग्री मी 175 जेडएल 0 10 जेडएल 15 जेडएल 0 0
फिब्रिल 20 डिग्री मी 175 जेडएल 0 20 जेडएल 5 $L 0 0
फिब्रिल 25 डिग्री एम 175 जेडएल 0 25 जेडएल 0 0 0
सकारात्मक नियंत्रण 175 जेडएल 0 0 20 जेडएल 0 5 $L

तालिका 1: जेड-साइनुक्लिइन एमिलॉयड फाइब्रिल्स के विभिन्न सांद्रता के साथ माइटोकोंड्रिया का उपचार।

  माइटोकोंड्रिल समजातीय (1 मिलीग्राम/ बोवाइन इंसुलिन मोनोमर (250 डिग्री सेल्सियस) बोवाइन इंसुलिन फाइब्रिल (250 डिग्री सेल्सियस) अलगाव बफर ग्लाइसिन बफर ट्राइटन एक्स-100 20% (v/
नियंत्रण 175 जेडएल 0 0 25 जेडएल 0 0
ग्लाइसिन बफर 175 जेडएल 0 0 0 25 जेडएल 0
मोनोमर 25 डिग्री मी. 175 जेडएल 20 जेडएल 0 5 $L 0 0
फिब्रिल 5 डिग्री एम 175 जेडएल 0 4 $L 21 जेडएल 0 0
फिब्रिल 10 डिग्री मी 175 जेडएल 0 8 $L 17 जेडएल 0 0
फिब्रिल 20 डिग्री मी 175 जेडएल 0 16 जेडएल 9 $L 0 0
फिब्रिल 25 डिग्री एम 175 जेडएल 0 20 जेडएल 5 $L 0 0
सकारात्मक नियंत्रण 175 जेडएल 0 0 20 जेडएल 0 5 $L

तालिका 2: गोवंश इंसुलिन एमिलॉयड फाइब्रिल्स के विभिन्न सांद्रता के साथ माइटोकोंड्रिया का उपचार।

  माइटोकोंड्रिल समजातीय (1 मिलीग्राम/ HEWL मोनोमर (1 एमएम) HEWL फाइब्रिल (1 एमएम) अलगाव बफर ग्लाइसिन बफर ट्राइटन एक्स-100 20% (v/
नियंत्रण 175 जेडएल 0 0 25 जेडएल 0 0
ग्लाइसिन बफर 175 जेडएल 0 0 0 25 जेडएल 0
मोनोमर 25 डिग्री मी. 175 जेडएल 5 $L 0 20 जेडएल 0 0
फिब्रिल 5 डिग्री एम 175 जेडएल 0 1 $L 24 जेडएल 0 0
फिब्रिल 10 डिग्री मी 175 जेडएल 0 2 $L 23 जेडएल 0 0
फिब्रिल 20 डिग्री मी 175 जेडएल 0 4 $L 21 जेडएल 0 0
फिब्रिल 25 डिग्री एम 175 जेडएल 0 5 $L 20 जेडएल 0 0
सकारात्मक नियंत्रण 175 जेडएल 0 0 20 जेडएल 0 5 $L

तालिका 3: HEWL एमिलॉयड फाइब्रिल्स के विभिन्न सांद्रता के साथ माइटोकोंड्रिया का उपचार।

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Discussion

प्रायोगिक परिणामों का धन इस परिकल्पना का समर्थन करता है कि फाइब्रिलर समुच्चयों की साइटोटॉक्सिसिटी जैविक झिल्ली4,5के साथ बातचीत करने और उनके साथ सहभागिता करने की क्षमता के साथ महत्वपूर्ण रूप से जुड़ा हुआ है . हालांकि, डेटा के अधिकांश कृत्रिम लिपिड bilayers कि जरूरी जैविक झिल्ली, जो फॉस्फोलिपिड और प्रोटीन की एक विस्तृत विविधता के साथ विषम संरचनाओं रहे हैं के आंतरिक गुणों को प्रतिबिंबित नहीं पर आधारित हैं. यहाँ, एक इन विट्रो जैविक झिल्ली के रूप में मस्तिष्क mitochondria का उपयोग कर, झिल्ली के स्तर पर फाइब्रिलर समुच्चय cytotoxicity का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल का वर्णन किया गया है.

प्रयोग के दौरान, यह जल्दी से काम करते हैं और बर्फ पर सब कुछ रखने के लिए बरकरार झिल्ली के साथ कार्यात्मक सक्रिय mitochondria तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, mitochondrial एकाग्रता (कुल प्रोटीन माप के आधार पर) झिल्ली-एमिलॉयड तंतुक बातचीत को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक है; इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल भर में स्थिर रखना चाहिए. वर्तमान अध्ययन में, माइटोकोंड्रियाल की तैयारी में सिनाप्टिक और गैर-सिनैप्टिक माइटोकोंड्रिया दोनों शामिल हैं। शुद्ध गैर-synaptic mitochondrial तैयारी के लिए, 40%, 23%, और 15% (v/v) घनत्व ढाल माध्यम का उपयोग किया जाना चाहिए, के रूप में Sims और एंडरसन14द्वारा वर्णित . क्योंकि mitochondria एक अच्छी तरह से विशेषता झिल्ली के साथ एक organelle है, यह आणविक अध्ययन में एक अत्यंत उपयोगी जैविक मॉडल प्रणाली के रूप में काम कर सकते हैं झिल्ली स्तर पर एमिलॉयड साइटोटॉक्सिसिटी के तंत्र से संबंधित (विशेष रूप से संबंधित न्यूरोडिजेनेटिव रोग) इस प्रोटोकॉल विभिन्न डिब्बों में स्थित विभिन्न अणुओं और एंजाइमों की रिहाई में देख कर mitochondrial झिल्ली permeabilization की बातचीत और सीमा की जांच की अनुमति देता है (यानी, बाहरी और भीतर झिल्ली में एम्बेडेड उन और उन intermembrane अंतरिक्ष या mitochondrial मैट्रिक्स में स्थित है).

माइटोकोंड्रिल झिल्ली अखंडता की पुष्टि (चित्र 1बी) और एमिलॉयड फाइब्रिल गठन (चित्र 2), बातचीत, क्षति, और माइटोकोंड्रियाल झिल्ली के permeabilization के अलावा पर $-synuclein, गोजातीय इंसुलिन, और HEWL एमिलॉयड फाइब्रिल्स की जांच की गई थी। परिणामों में एमिलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा प्रेरित झिल्ली permeabilization और mitochondrial ROS वृद्धि की सीमा में स्पष्ट अंतर का प्रदर्शन किया (चित्र 3 और चित्र 4), विभिन्न एमिलॉयड फाइब्रिल की क्षमता में बदलाव का सुझाव माइटोकोंड्रियाल झिल्ली के साथ बातचीत करना और क्षति करना।

झिल्ली permeabilization दीक्षा के लिए, एमिलॉयड फाइब्रिल्स mitochondrial सतह तक पहुँचने चाहिए. यह दर्शाया गया है कि आवेशित झिल्ली में प्रोटीनों का संघन, स्थानीयकरण और प्रविष्टि गैर-विशिष्ट स्थिर वैद्युत अन्योन्यक्रियाओं तथा प्रोटीनों की हाइड्रोफोबिक प्रकृति26,27,28पर निर्भर करती है। एमिलॉयड विषाक्तता के संबंध में , सबूत के एक बढ़ते शरीर दृढ़ता से उनके cytotoxicity में प्रोटीन कुल सतह हाइड्रोफोबिकता की एक महत्वपूर्ण भूमिका implicates29,30. हालांकि HEWL पीएच स्तर की एक व्यापक रेंज पर एक शुद्ध सकारात्मक आरोप भालू और anionic और तटस्थ फॉस्फोलिपिड31 के लिए एक उच्च आत्मीयता है (उदाहरण के लिए, mitochondrial झिल्ली23),कोई mitochondrial झिल्ली permeabilization और ROS वृद्धि (चित्र3 और चित्र 4) का अवलोकन किया गया । इस अवलोकन के लिए एक स्पष्टीकरण पार्श्व फाइब्रिल-फाइब्रिल बातचीत के कारण HEWL फाइब्रिल्स की सतह हाइड्रोफोबिकता की कमी से संबंधित हो सकता है23,32,झिल्ली क्षति पैदा करने की क्षमता के नुकसान के लिए अग्रणी.

गोजातीय इंसुलिन के लिए, फाइब्रिल गठन22के दौरान हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों के एक महत्वपूर्ण जोखिम के बावजूद , एक मामूली एंजाइम रिलीज 25 डिग्री एम एमिलॉयड फाइब्रिल्स के अलावा पर मनाया गया (चित्र 3) पर महत्वपूर्ण प्रभाव के बिना माइटोकोंड्रिल ROS सामग्री (चित्र 4) के रूप में दोनों मस्तिष्क mitochondria और गोजातीय इंसुलिन फाइब्रिल्स उनकी सतहों पर एक नकारात्मक zeta क्षमता सहन24, यह सुझाव दिया है कि mitochondrial झिल्ली और गोजातीय इंसुलिन एमिलॉयड फाइब्रिल्स के बीच प्रतिकर्षण बलों के लिए उनकी असमर्थता के लिए खाते हो सकता है प्रभावी ढंग से के साथ बातचीत और mitochondrial झिल्ली24नुकसान . उच्चतम परिमीकरण तथा माइटोकोंड्रियाल आरओएस वृद्धि को जेड-साइनुक्लिइन फाइब्रिल्स के अतिरिक्त देखा गया(चित्र 3 और चित्र 4)।

इस प्रेक्षण को जैविक झिल्ली के साथ बातचीत करने के लिए -synuclein की उच्च क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जो नकारात्मक रूप से आवेशित सतहों33,34, जैसे माइटोकोंड्रिया के रूप में। इस संबंध में, कुछ अध्ययनों से पता चला है कि माइटोकोंड्रिया में -सिनयूक्लिइन का विशिष्ट बंधन और आयात किया गया है, जहां वे मुख्य रूप से आंतरिक झिल्ली35के साथ जुड़े हुए हैं। दिलचस्प है, Ghio एट अल की सूचना दी है कि बाध्यकारी, cardilipin द्वारा मध्यस्थता (एक फॉस्फोलिपिड विशिष्ट आंतरिक mitochondrial झिल्ली में समृद्ध), के $-synuclein के सहयोग और mitochondrial झिल्ली के विघटन के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र हो सकता है36.

दिलचस्प बात यह है कि एमिलॉयडेनिक पेप्टाइड्स और प्रोटीन सहित विभिन्न एमिलॉयडोजेनिक पेप्टाइड्स और प्रोटीन के बंधन और संचय के लिए स्पष्ट सबूत हैं, जिसमें एमिलॉयड जेड-पेप्टाइड, जेड-साइनुक्लिइन, हंटिंगटन, और एएलएस से जुड़े उत्परिवर्ती SOD1 को माइटोकोंड्रिया35,37, 38,39. इसके अलावा, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एमिलॉयड की एमिलॉयडिक असेंबली (25-35)15 और एसओडी 140 के साथ बातचीत करने की क्षमता है और माइटोकोंड्रिल झिल्ली permeabilization कारण. साहित्य के अनुसार, यह सुझाव दिया जाता है कि एमिलॉयड फाइब्रिल्स झिल्ली को पार करने के लिए बहुत बड़े हैं; इसलिए, औसत फाइब्रिल आकार गोजातीय इंसुलिन और HEWL एमिलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा प्रेरित प्रभाव की स्पष्ट कमी में एक कारक नहीं होना चाहिए। हालांकि आगे के अध्ययन के लिए शामिल विस्तृत तंत्र स्पष्ट करने की जरूरत है, यह प्रस्तावित है कि एमिलॉयड फाइब्रिल्स के जैवभौतिक विशेषताएं (यानी, सतह प्रभारी, हाइड्रोफोबिकिटी, और एक विशिष्ट अनुक्रम रखने-लक्ष्यित mitochondrial झिल्ली) उनके साथ बातचीत और जैविक झिल्ली को नुकसान करने की क्षमता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम को बुनियादी विज्ञान में उन्नत अध्ययन संस्थान की अनुसंधान परिषद (IASBS), ज़ंजन, ईरान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma 35845
Ammonium sulfate Merck 1012171000
Black 96-well plate Corning
Black Clear-bottomed 96-well plate Corning
Bovine insulin Sigma I6634
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A2153
BSA essentially fatty acid-free Sigma A6003
Centrifuge Sigma
Crystal clear sealing tape Corning
CuSO4 Sigma 451657
Dialysis bag (cut off 2 KDa) Sigma D2272
Dounce homogenizer Potter Elvehjem
EDTA Sigma E9884
Fluorescence plate reader BioTek
Fluorescence spectrophotometer Cary Eclipse VARIAN
Folin Merck F9252
Glycine Sigma G7126
Guillotine Made in Iran
HCl Merck H1758
Hen Egg White Lysozyme (HEWL) Sigma L6876
Na2CO3 Sigma S7795
NaH2PO4 Sigma S7907
NaOH Merck S8045
Oxaloacetate Sigma O4126
Percoll GE Healthcare
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma CS0030
PMSF Sigma P7626
Potassium sodium tartrate Sigma 217255
Quartz cuvette Sigma
Spectrophotometer analytik jena SPEKOL 2000 model
Succinate Sigma S2378
Sucrose Merck 1076871000
Thermomixer Eppendorph
Thioflavin T Sigma T3516
Tris-HCl Merck 1082191000
Triton X-100 Sigma T9284
Tryptone QUELAB
Water bath Memmert
Yeast Extract QUELAB
β-NADH Sigma N8129

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References

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जैव रसायन अंक 151 माइटोकोंड्रिया एमिलॉयड फाइब्रिल झिल्ली permeabilization विषाक्तता malate dehydrogenase प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों thioflavin टी परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जेड-synuclein गोजातीय इंसुलिन मुर्गी अंडे सफेद lysozyme
एमीलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा मस्तिष्क माइटोकोंड्रिया के साथ और झिल्ली permeabilization के साथ बातचीत
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Zadali, R., Ghareghozloo, E. R.,… More

Zadali, R., Ghareghozloo, E. R., Ramezani, M., Hassani, V., Rafiei, Y., Chiyaneh, S. M., Meratan, A. A. Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils. J. Vis. Exp. (151), e59883, doi:10.3791/59883 (2019).

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