Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

Published: September 28, 2019 doi: 10.3791/59883
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran
* These authors contributed equally

Summary

Forutsatt her er en protokoll for å undersøke samspillet mellom innfødte form, prefibrillar, og modne amyloid fibrils av ulike peptider og proteiner med mitokondrier isolert fra ulike vev og ulike områder av hjernen.

Abstract

En økende mengde bevis indikerer at membran permeabilization, inkludert interne membraner som mitokondrier, er en vanlig funksjon og primær mekanisme av amyloid aggregat-indusert toksisitet i nevrodegenerative sykdommer. Men de fleste rapporter som beskriver mekanismene for membran avbrudd er basert på fosfolipid modellsystemer, og studier direkte målretting hendelser forekommende på nivået av biologiske membraner er sjeldne. Beskrevet her er en modell for å studere mekanismene for amyloid toksisitet på membran nivå. For mitokondrie isolasjon brukes tetthet gradient medium for å oppnå forberedelser med minimal myelin forurensning. Etter mitokondrie membran integritet bekreftelse, er samspillet av amyloid fibrils som følge av α-synuclein, storfe insulin, og høne eggehvite lysozyme (HEWL) med rotte hjernen mitokondrier, som en in vitro biologisk modell, er undersøkt. Resultatene viser at behandling av hjernen mitokondrier med fibrillær forsamlinger kan føre til ulike grader av membran permeabilization og ROS innhold ekstrautstyr. Dette indikerer struktur avhengige interaksjoner mellom amyloid fibrils og mitokondrie membran. Det er antydet at Biofysiske egenskaper av amyloid fibrils og deres spesifikke binding til mitokondrie membraner kan gi forklaringer for noen av disse observasjonene.

Introduction

Amyloid-relaterte lidelser, kjent som amyloidoses, utgjør en stor gruppe sykdommer definert ved utseendet av uløselig protein avleiringer i ulike vev og organer1,2. Blant dem, nevrodegenerative lidelser er de hyppigst formene der protein aggregater vises i den sentrale eller perifere nervesystemet2. Selv om en rekke mekanismer har blitt foreslått å være involvert i toksisitet av amyloid aggregater3, en økende mengde bevis peker til celle membran avbrudd og permeabilization som den primære mekanismen for amyloid patologi4, fempå. I tillegg til plasma membran, kan indre organeller (dvs. mitokondrier) også bli påvirket.

Interessant, tyder nye bevis på at mitokondrie dysfunksjon spiller en avgjørende rolle i patogenesen av nevrodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers og Parkinsons sykdommer6,7. I samsvar med dette problemet har mange rapporter indikert binding og akkumulering av amyloid β-peptid, α-synuclein, Huntingtin og ALS-tilknyttede mutant SOD1 proteiner til mitokondrier8,9,10, 11. mekanismen av membran permeabilization av amyloid aggregater antas å forekomme enten gjennom dannelse av diskrete kanaler (porer) og/eller gjennom en uspesifisert vaskemiddel-lignende mekanisme5,12, 13 i år. Det er bemerkelsesverdig at de fleste av disse konklusjonene har vært basert på rapporter som involverer fosfolipid modellsystemer, og studier direkte rettet mot hendelser som forekommer i biologiske membraner er sjeldne. Åpenbart, disse kunstige lipid bilayers ikke nødvendigvis gjenspeiler de iboende egenskapene til biologiske membraner, inkludert de av mitokondrier, som er heterogene strukturer og sammensatt av et bredt utvalg av fosfolipider og proteiner.

I denne studien, mitokondrier isolert fra rotte hjerner brukes som en in vitro biologisk modell for å undersøke de destruktive virkningene av amyloid fibrils som følge av α-synuclein (som en amyloidogenic protein), storfe insulin (som en modell peptid viser betydelig strukturell homologi med humant insulin involvert i injeksjon-lokaliserte amyloidose), og høne eggehvite lysozyme (HEWL; som en felles modell protein for studie av amyloid aggregering). Interaksjoner og mulige skader av mitokondrie membraner indusert av amyloid fibrils blir deretter undersøkt ved å observere utgivelsen av mitokondrie Malate dehydrogenase (MDH) (ligger i mitokondrie matrise) og mitokondrier reaktive oksygen arter (ROS) ekstrautstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr eksperimenter ble utført i samsvar med institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Medical Sciences i Teheran universitetet. Maksimal innsats ble gjort for å minimere lidelse og skadelige effekter på rottene ved å skjerpe giljotinen kniver og bruke bestemt og raske bevegelser av bladet.

1. Brain homogenisering og mitokondrie isolasjon

Merk: alle reagenser for mitokondrie isolasjon ble klargjort i henhold til Sims og Anderson14.

  1. Tilberedning av buffere for mitokondrie isolering
    1. Forbered en 100 mM Tris-HCl-løsning: veie 0,605 g av Tris-HCl og oppløse den i ca. 40 mL deionisert vann (DW) i et beger. Overfør løsningen til en 50 mL volum kolbe og Øk det endelige volumet til 50 mL ved å legge til DW.
    2. Forbered en 10 mM EDTA-løsning: veie 0,202 g av EDTA og oppløse den i ca 40 mL av DW i et beger. Overfør løsningen til en 50 mL volum kolbe og Øk det endelige volumet til 50 mL ved å legge til DW.
      Merk: begge løsningene kan oppbevares ved 4 ° c i minst 4 uker.
    3. Forbered en Tris-HCl/EDTA/sukrose lagerløsning: tilsett 30 mL 100 mM Tris-HCl og 30 mL 10 mM EDTA i et beger. Veie 32,86 g av sukrose og legge den til begeret under omrøring med en magnetisk rører. Når sukrose er oppløst, overføre løsningen til en 100 mL volum kolbe og øke det endelige volumet til 100 mL ved å legge til DW.
      Merk: denne løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 3 dager.
    4. Klargjør en isolasjons buffer (IB): Tilsett 100 mL Tris-HCl/EDTA/sukrose lager til ca. 150 mL DW. Juster pH til 7,4 ved å legge til 0,1 M HCl. Øk det endelige volumet til 300 mL ved å legge til DW.
    5. Forbered 15% (v/v) tetthet gradient medium med IB ved å legge 1,5 mL tetthet gradient medium til 8,5 mL kaldt IB.
    6. Forbered 10 mg/mL serum albumin (BSA) oppløsning: veie 20 mg fett syre fri BSA og oppløse den i ca 1,5 mL DW i et 2 mL hetteglass. Øke det endelige volumet til 2 mL ved å legge til DW og lagre den på isen til bruk.
      Merk: ferske løsninger fra trinn 1.1.4 – 1.1.6 på dagen for mitokondrie isolering og oppbevar dem på is til bruk.
  2. Isolering av rotte hjernen
    Merk: halshogging og hjerne fjerning av hannrotter (150 – 200 g) ble utført i henhold til Sims og Anderson14.
    1. Sett et 30 mL beger i en is bøtte og tilsett 10 mL kaldt IB i begeret.
    2. Halshugge rotta med en liten dyr giljotinen og fjerne hjernen fra hodeskallen innen 1 min av halshogging å grense forverring av mitokondrie eiendom.
    3. Overfør hjernen raskt til begeret som inneholder kaldt IB.
  3. Brain homogenisering og utarbeidelse av mitokondrier
    Merk: mitokondrie fraksjoner ble isolert i henhold til protokollen som er beskrevet av Sims og Anderson14, med noen modifikasjoner som beskrevet tidligere15. Det er viktig å jobbe raskt og holde alt på isen gjennom prosedyren.
    1. Vask vevet 2x med 30 mL IB, Overfør til et beger som inneholder kalde IB, og skjær fint i hjernen med saks.
    2. Tilsett 10 bind med pre-avkjølt IB (ca. 10 mL IB per rotte hjerne).
    3. Overfør vevs fjæringen til en 20 mL kald Dounce-homogenisator.
    4. Homogenisere vevs bitene ved hjelp av ni opp-og-ned-strøk med en motorisert morter.
      Merk: La blandingen på isen i ca 30 s etter hvert sett med tre homogenisering slag for å sikre at homogenate forblir kaldt.
    5. Overfør homogenate til en pre-kjølt 10 mL sentrifuge slange og sentrifuge ved 1, 300x g og 4 ° c i 3 min.
    6. Forsiktig Dekanter supernatanten og overføre den til en pre-kjølt 10 mL sentrifugerør og sentrifuger ved 21, 000x g ved 4 ° c i 10 min.
    7. Kast supernatanten og resuspend pellet i en kald 15% tetthet gradient medium løsning (5 mL for hver hjerne) ved å forsiktig stirring blandingen med en pipette.
    8. Sentrifuger i en fast vinkel rotor ved 30, 700x g ved 4 ° c for 5 min bruker langsom akselerasjon (45 s fra 0 rpm til 500 RPM etterfulgt av normal akselerasjon) og retardasjon (ingen bremser). Dette bør produsere to forskjellige bånd av materiale (figur 1a, venstre).
    9. Bruke en Pasteur pipette, fjerne skarpe bånd av materiale akkumulert på toppen av gradient, som for det meste inneholder myelin. Deretter fjerner tettheten gradient medium løsning overliggende materialet (i band 2) så mye som mulig uten å miste noen av de beriket mitokondrie brøkdel i band 2.
      Merk: bandet 2 inneholder både Synaptic og ikke-Synaptic mitokondrier.
    10. Tilsett 8 mL IB i mitokondrie brøkdel mens du forsiktig rører blandingen med en pipette.
    11. Sentrifuger ved 16, 700x g ved 4 ° c i 10 min og fjern forsiktig supernatanten, slik at bunnen løsner pellet uforstyrret.
    12. Tilsett 1 mL 10 mg/mL fett syre fri BSA til sentrifuge røret mens du forsiktig rører blandingen med tuppen av en pipette. Øk det endelige volumet til 5 mL per hjerne ved å legge til IB.
    13. Sentrifuger ved 6, 900x g ved 4 ° c i 10 min, som skal produsere en fast pellet (figur 1a, høyre).
    14. Dekanter supernatanten og forsiktig resuspend mitokondrie pellet i IB, alikvot dem inn i 0,5 mL rør, og oppbevar i flytende nitrogen til bruk.

2. bestemmelse av protein konsentrasjon

Merk: protein konsentrasjonen måles ved hjelp av metoden til Lowry et al.16.

  1. Utarbeidelse av løsninger for Lowry analysen
    1. Forbered løsning A: veie 0,4 g av NaOH og 2 g av na2co3 og OPPLØSES i 80 ml DW, deretter overføre løsningen til en 100 ml volum kolbe og øke volumet til 100 ml ved å legge til DW.
    2. Forbered løsning B: veie 0,1 g av kalium natrium Tartrate og 0,05 g av CuSO4 og oppløses i 8 ml DW, og deretter overføre løsningen til en 10 ml volum kolbe og øke volumet til 10 ml ved å legge til DW.
      Merk: begge oppløsninger A og B kan holde seg stabile ved 4 ° c i opptil 6 måneder.
    3. Forbered løsning C: tilsett 0,5 mL folin oppløsning til 7,5 mL DW.
      Merk: Forbered løsning C friskt og hold unna lyset til bruk.
    4. Klargjør BSA-standardene med endelige konsentrasjoner på 0, 20, 40, 60, 80, 100 og 120 μg/mL ved å kombinere 0, 20, 40, 60, 80, 100 og 120 μL av henholdsvis 1 mg/mL BSA, med nok DW til å lage 1000 μL av oppløsning.
  2. Måling av protein konsentrasjon
    Merk: for større nøyaktighet, Kjør dette trinnet i tre eksemplarer.
    1. Tilsett 50 μL av standard løsninger og mitokondrie homogenate til hver brønn av en 96 brønn plate, etterfulgt av en tilsetning av 45 μL av oppløsning A. Deretter ruge platen i 10 min i et varmt vannbad satt til 50 ° c.
    2. Tilsett 5 μL av oppløsning B og ruge platen i 10 minutter i mørk ved romtemperatur (RT).
    3. Tilsett 150 μL av oppløsning C og ruge platen i 10 minutter i et varmt vannbad satt ved 50 ° c.
    4. Legg platen i en plate leser og Registrer absorbansen verdier for standarder og mitokondrie suspensjon ved 650 NM. Deretter beregner du proteininnholdet i mitokondrier ved hjelp av en kalibrerings kurve.

3. bestemmelse av mitokondrie membran integritet

Merk: mitokondrie membran integritet bekreftes ved å måle Malate dehydrogenase (MDH) aktivitet i isolerte mitokondrier før og etter membran avbrudd av Triton X-100.

  1. Fortynne mitokondrie homogenate til 1 mg/mL med kald IB og plassert i to 1,5 mL rør (typisk 195 μL av mitokondrier per rør).
  2. Tilsett 5 μL av 20% (v/v) Triton X-100 (fortynnet med DW) til ett rør (som en positiv kontroll for maksimal enzym aktivitet) og 5 μL av DW til et annet rør (for kontroll) etterfulgt av å blande med en rører.
  3. Ruge rørene i 10 minutter i et varmtvannsbad satt ved 30 ° c.
  4. Pellet mitokondrier av sentrifugering av rør i en fast vinkel rotor ved 16 000 x g og 4 ° c i 15 min.
  5. Nøye samle den resulterende supernatanter for assaying aktiviteten av mitokondrie MDH ved hjelp av en standard Spektrofotometriske analysen beskrevet i følgende avsnitt.
  6. Beregn integriteten til mitokondrie membran som følger:
    Equation 1

4. fastsettelse av MDH aktivitet

Merk: MDH aktivitet ble målt spektrofotometrisk som beskrevet av Sottocasa et al.17.

  1. Utarbeidelse av løsninger for MDH aktivitet analysen
    1. Forbered en 50 mM Tris-HCl-løsning (pH = 7,5): klargjør en 7,9 mg/mL oppløsning i DW ved hjelp av Tris-HCl, og Juster pH til 7,5 ved 25 ° c med 1,0 M NaOH.
    2. Forbered en 50 mM oxaloacetate løsning: klargjør en 6,6 mg/mL oppløsning ved hjelp av oxaloacetate i Tris-HCl.
      Merk: denne løsningen er ikke stabil en gang i løsningen og bør tilberedes umiddelbart før bruk.
    3. Forbered en 10 mM β-NADH løsning: Forbered en 7,81 mg/mL oppløsning ved hjelp av β-NADH i Tris-HCl.
  2. Bestemmelse av MDH-aktivitet
    Merk: endelige analyse konsentrasjoner i en 1,0 mL reaksjons blanding er 50 mM Tris-HCl, 5 mM oxaloacetate og 0,1 mM β-NADH.
    1. Still inn spektrofotometer til 25 ° c og 340 NM. Pipetter 890 μL Tris-HCl buffer, 100 μL av oxaloacetate oppløsning og 10 μL av NADH-løsning til en blank Cuvette og 880 μL Tris-HCl-buffer, 100 μL av oxaloacetate oppløsning og 10 μL av NADH-løsning i en prøve Cuvette.
    2. Ruge kyvetter i spektrofotometer for 3 – 4 min og referanse mot blank.
    3. Tilsett deretter 10 μL av mitokondrie homogenate (1 mg/mL) i prøve Cuvette, bland umiddelbart ved inversjon, og Registrer reduksjoner i absorbansen på grunn av NADH oksidasjon ved 340 NM i 1 min.

5. in vitro α-synuclein, storfe insulin og HEWL fibril formasjon

  1. Protein forberedelse
    1. α-synuclein:
      Merk: uttrykk og rensing av rekombinant α-synuclein utføres som beskrevet av Hoyer et al.18 med noen modifikasjoner, og renheten av α-synuclein BEKREFTES av SDS-Page.
      1. Dialyze renset α-synuclein over natten mot fosfat-bufret saltvann (PBS).
      2. Bestem protein konsentrasjonen ved hjelp av en utryddelse koeffisient på 5600 M-1 cm-1 ved 275 NM19.
      3. Alikvoter protein i 1,5 mL rør og oppbevares ved-80 ° c til bruk.
    2. Storfe insulin og HEWL:
      1. Gi både storfe insulin og HEWL.
      2. Løs opp hvert protein i 50 mM Glycine buffer (pH = 1,6; Juster pH med HCl).
      3. Bestem insulin og HEWL konsentrasjon ved hjelp av en utryddelse koeffisient på 1,0 og 2,63 for 1,0 mg/ml ved 276 NM og 280 NM, henholdsvis20,21.
  2. Amyloid atrieflimmer
    1. Utarbeidelse av løsninger for amyloid atrieflimmer:
      1. Forbered thioflavin T (ThT) buffer: veie 0,3 g av NaH2PO4 og oppløse den i 80 ml av DW, justere pH til 6,5, og øke volumet til 100 ml ved å legge til DW.
      2. Forbered ThT lagerløsning (5 mM): veie 1,6 mg av ThT og oppløse den i 1 mL av ThT buffer, passerer gjennom et 0,22 μm filter papir, og holde unna lys ved 4 ° c til bruk.
        Merk: denne løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 4 uker.
      3. Forbered ThT løsning (1 mM): tilsett 200 μL av ThT lagerløsning (5 mM) til 800 μL av ThT buffer.
        Merk: denne løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 1 uke.
    2. A-synuclein amyloid fibril dannelse i vitro:
      1. Tilsett alikvoter (294 μL) av protein oppløsning (200 μM) og 6 μL av ThT oppløsning (1 mM) til 1,5 mL rør etterfulgt av omrøring.
      2. Ruge rørene i en thermomixer ved 37 ° c under konstant omrøring ved 800 RPM i 4 dager.
      3. Ta alikvoter (10 μL) av inkubert prøver etter regelmessige tidsintervaller og tilsett 490 μL av ThT buffer, blandet grundig, og ruge i 5 min ved RT.
      4. Sett eksitasjon og utslipp slit bredder som 5 NM og 10 NM, henholdsvis, og måle ThT fluorescens ved eksitasjon ved 440 NM og utslipp på 485 NM ved hjelp av en fluorescens spektrofotometer.
    3. I vitro, fibril insulin amyloid dannelse:
      1. Tilsett 637 μL av protein oppløsning (250 μM) til 1,5 mL rør. Tilsett deretter 13 μL av ThT-løsning (1 mM) etterfulgt av omrøring.
      2. Tilsett alikvoter (200 μL) av protein oppløsning (250 μM) som inneholder 20 μM ThT til hver brønn av en klar bunn 96 brønn plate og forsegle platen med krystallklar tetnings tape.
      3. Legg platen i en fluorescens plate leser og ruge ved 57 ° c uten omrøring.
      4. Mål ThT fluorescens ved 30 min intervaller, med eksitasjon på 440 NM og utslipp på 485 NM, for 12 h.
        Merk: rist platen for 5 s før hver måling.
    4. In vitro HEWL amyloid fibril formasjon:
      1. Tilsett alikvoter (200 μL) av protein løsning) 1 mM) som inneholder 20 μM ThT til hver brønn av en klar bunn 96 brønn plate og forsegle platen med krystallklar tetnings tape.
      2. Legg platen i en fluorescens plate leser og ruge ved 57 ° c uten omrøring.
      3. Mål ThT fluorescens ved 2 h intervaller, med eksitasjon på 440 NM og utslipp på 485 NM, for 4 dager.
        Merk: for alle tre proteiner bekreftes amyloid fibril formasjon ved atomkraft mikroskopi (fig.2b).

6. behandling av mitokondrier med amyloid fibrils, MDH Release analysen, og ROS måling

  1. Inkubasjons av isolerte mitokondrier med amyloid fibrils
    1. Slå på sentrifuger og varmt vannbad og satt til 4 ° c og 30 ° c, henholdsvis.
    2. Ved bruk av IF, fortynne mitokondrie homogenate til en endelig konsentrasjon på 1 mg/mL.
    3. Forbered to serier av 1,5 mL rør som inneholder mitokondrie homogenater (en serie for MDH Release analysen og en annen for mitokondrie ROS måling).
    4. Tilsett alikvoter av fersk eller amyloid fibrils av α-synuclein, storfe insulin eller HEWL (ved endelige konsentrasjoner av 5 μM, 10 μM, 20 μM og 25 μM, bruk PBS eller Glycine buffer som en kontroll) til mitokondrie homogenate (endelig volum = 200 μL) (se tabell 1, tabell 2 og tabell 3) etterfulgt av forsiktig omrøring av løsningen med en pipette.
      Merk: for MDH Release-analysen, bruk Triton X-100 (ved en endelig konsentrasjon på 0,5% [v/v]) som en positiv kontroll for maksimal enzym utgivelse.
    5. Ruge rør som inneholder mitokondrie suspensjoner i 30 minutter i varmtvannsbad satt til 30 ° c.
    6. Mål mitokondrie MDH Release og ROS innhold som beskrevet i seksjoner 6,2 og 6,3.
  2. Mitokondrie MDH Release analysen
    1. Sentrifuger inkubert mitokondrie homogenater ved 16 000 x g i 15 min, deretter forsiktig samle den resulterende supernatanter for assaying aktiviteten til mitokondrie MDH som beskrevet i avsnitt 4.
    2. Beregn utgivelsen av MDH som en brøkdel av den maksimale effekten (Triton X-100) som følger:

Equation 1

  1. Mitokondrie ROS måling
    Merk: mitokondrie ROS innhold bestemmes med oksidasjon følsom fluorogenic forløper dihydrodichlorocarboxyfluorescein diacetate (DCFDA)22.
    1. Forbered løsninger for mitokondrie ROS måling. Forbered en 50 μM DCFDA-løsning ved å oppløse i metanol (forberede frisk) og en 200 mM succinate løsning ved å oppløse i DW.
    2. Pipetter 191 μL av inkubert mitokondrie homogenate til hver brønn på en 96 brønn plate og tilsett 4 μL av 50 μM DCFDA (1 μM endelig konsentrasjon) og 5 μL av 200 mM succinate (5 mM siste konsentrasjon).
    3. Ruge platen i 30 minutter i et varmt vannbad satt til 30 ° c mens du forsiktig rører.
    4. Legg platen i en fluorescens plate leser og mål fluorescens intensitet, med eksitasjon ved 485 NM og utslipp på 530 NM.

7. statistisk analyse

  1. Utfør alle eksperimenter minst 2x eller 3x med tre eksemplarer analyser og utfør egnede statistiske tester. Her blir resultatene presentert som gjennomsnittet ± SD, og en student ' s sammenkoblet t-test ble benyttet for å beregne statistisk betydning. P-verdier mindre enn 0,01 og 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant (* p < 0,05; * * p < 0,01).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen beskriver en modell for å studere interaksjoner av amyloid fibril med rotte hjernen mitokondrier som en in vitro biologiske modell. For mitokondrie forberedelser, 15% (v/v) tetthet gradient medium ble brukt til å fjerne myelin som stor forurensning av hjernevevet14. Som vist i figur 1a, sentrifugering på 30 700 x g produserte to forskjellige band av materiale, myelin (som hovedkomponenten i band 1) og band 2, som inneholder beriket mitokondrie brøkdel.

Ved å endre protokollen beskrevet av Sims og Anderson14, en mitokondrie suspensjon som inneholder både Synaptic og ikke-Synaptic mitokondrier ble utarbeidet. For utarbeidelse av rene ikke-Synaptic mitokondrier, har Sims og Anderson tidligere beskrevet protokollen14. I det siste trinnet av sentrifugering ble det tilsatt 10 mg/mL fett syre fri BSA for å få en fast mitokondrie pellet (figur 1a). Mitokondrie membran integritet ble vurdert ved å måle MDH aktivitet i isolerte mitokondrier før og etter membran avbrudd og enzym utgivelse av Triton X-100, som beskrevet i protokollen.

Det ble vanligvis funnet at mitokondrie preparater var ca 93% intakt (figur 1B). En ThT fluorescens analysen ble gjennomført for å overvåke veksten av amyloid fibrils. Som vist i figur 2a, viste kurven for amyloid-atrieflimmer av tre proteiner et typisk sigmoidal-mønster, som er i tråd med de kjerne avhengige polymerisering modeller av disse proteinene som rapportert tidligere23,24 ,25. Den høyeste ThT fluorescens utslipp for α-synuclein, storfe insulin, og HEWL ble observert etter 96 h, 12 h, og 96 h, henholdsvis antyder dannelse av amyloid fibrils (figur 2a). Dette ble ytterligere bekreftet av AFM måling.

Som illustrert i figur 2b, ble veldefinerte modne fibrils med typisk amyloid morfologi observert for tre proteiner inkubert under amyloidogenic forhold. Interaksjoner og mulige skader og permeabilization av mitokondrie membraner av amyloid fibrils ble undersøkt. Dette ble gjort ved å overvåke utgivelsen av mitokondrie MDH og mitokondrie ROS måling ved tilsetning av α-synuclein, storfe insulin, eller HEWL amyloid fibrils til mitokondrie suspensjoner og følge prosedyrene skissert. De foreløpige eksperimentene viste at tilstedeværelsen av ThT (opp til 3 μM) hadde ingen effekt på MDH utgivelse og mitokondrie ROS innhold (data ikke vist).

Som vist i Figur 3ble det observert betydelig FRIGIVELSE av MDH ved tilsetning av α-synuclein amyloid fibrils til mitokondrier på en konsentrasjonsavhengig måte. Selv om liten utgivelse ble oppdaget ved tilsetning av storfe insulin amyloid fibrils, HEWL fibrils ble funnet å være ineffektiv (Figur 3). Selv om ingen signifikant forbedring i mitokondrie ROS innhold ble observert ved tilsetning av storfe insulin eller HEWL amyloid fibrils, behandling med α-synuclein fibrils førte til en betydelig økning i ROS innhold av hjernen mitokondrier i en konsentrasjon-avhengig måte (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: bestemmelse av mitokondrie isolering og membran integritet. (A) Left: typisk utseende av en sentrifugerør etter blanding pellet i kaldt 15% tetthet gradient medium løsning følgende av sentrifugering. Myelin er den viktigste komponenten i band 1, som akkumuleres på toppen. Band 2 inneholder den svært beriket mitokondrie brøkdel. Høyre: en fast pellet ble produsert etter tilsetning av 10 mg/mL fett-syre-fri BSA og sentrifugering ved 6900 x g. (B) mitokondrie membran integritet ble bestemt ved å måle MDH aktivitet i isolerte mitokondrier før og etter membran avbrudd av Triton X-100. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: amyloid atrieflimmer av α-synuclein, storfe insulin og HEWL. (A) Kinetics av amyloid fibril formasjon indikert ved å øke fluorescens intensitet av ThT ved 485 NM. (B) AFM bilder av tre proteiner vises, som ble inkubert under amyloidogenic forhold for vanlige tider. Skala linjer representerer 500 NM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: MITOKONDRIE MDH utgivelse ved interaksjon med monomer og amyloid fibril av α-synuclein, storfe insulin og HEWL. Release uttrykkes som en prosentandel av den maksimale observerte ved behandling med 0,5% (v/v) Triton X-100. Hver verdi representerer gjennomsnittlig ± SD (n = 3; * p < 0,05, * * p < 0,01). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: MITOKONDRIE ros innhold ved interaksjon med monomer og amyloid fibril av α-synuclein, storfe insulin og HEWL. Dataene uttrykkes som prosentandelen av verdier i kontroll mitokondrier. Hver verdi representerer gjennomsnittet ± SD (n = 3; * p < 0,05; * * p < 0,01). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mitokondrie homogenate (1 mg/mL) α-synuclein monomer (200 μM) α-synuclein fibril (200 μM) Isolasjons buffer Pbs Triton x-100 20% (v/v)
Kontroll 175 μL 0 0 25 μL 0 0
Pbs 175 μL 0 0 0 25 μL 0
Monomer 25 μM 175 μL 25 μL 0 0 0 0
Fibril 5 μM 175 μL 0 5 μL 20 μL 0 0
Fibril 10 μM 175 μL 0 10 μL 15 μL 0 0
Fibril 20 μM 175 μL 0 20 μL 5 μL 0 0
Fibril 25 μM 175 μL 0 25 μL 0 0 0
Positiv kontroll 175 μL 0 0 20 μL 0 5 μL

Tabell 1: behandling av mitokondrier med ulike konsentrasjoner av α-synuclein amyloid fibrils.

  Mitokondrie homogenate (1 mg/mL) Storfe insulin monomer (250 μM) Storfe insulin fibril (250 μM) Isolasjons buffer Glycine buffer Triton x-100 20% (v/v)
Kontroll 175 μL 0 0 25 μL 0 0
Glycine buffer 175 μL 0 0 0 25 μL 0
Monomer 25 μM 175 μL 20 μL 0 5 μL 0 0
Fibril 5 μM 175 μL 0 4 μL 21 μL 0 0
Fibril 10 μM 175 μL 0 8 μL 17 μL 0 0
Fibril 20 μM 175 μL 0 16 μL 9 μL 0 0
Fibril 25 μM 175 μL 0 20 μL 5 μL 0 0
Positiv kontroll 175 μL 0 0 20 μL 0 5 μL

Tabell 2: behandling av mitokondrier med ulike konsentrasjoner av storfe insulin amyloid fibrils.

  Mitokondrie homogenate (1 mg/mL) HEWL monomer (1 mM) HEWL fibril (1 mM) Isolasjons buffer Glycine buffer Triton x-100 20% (v/v)
Kontroll 175 μL 0 0 25 μL 0 0
Glycine buffer 175 μL 0 0 0 25 μL 0
Monomer 25 μM 175 μL 5 μL 0 20 μL 0 0
Fibril 5 μM 175 μL 0 1 μL 24 μL 0 0
Fibril 10 μM 175 μL 0 2 μL 23 μL 0 0
Fibril 20 μM 175 μL 0 4 μL 21 μL 0 0
Fibril 25 μM 175 μL 0 5 μL 20 μL 0 0
Positiv kontroll 175 μL 0 0 20 μL 0 5 μL

Tabell 3: behandling av mitokondrier med ulike konsentrasjoner av HEWL amyloid fibrils.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et vell av eksperimentelle resultater støtter hypotesen om at cytotoksisitet av fibrillær aggregater er betydelig assosiert med deres evne til å samhandle med og permeabilize biologiske membraner4,5. Men de fleste av dataene er basert på kunstige lipid bilayers som ikke nødvendigvis reflekterer de iboende egenskapene til biologiske membraner, som er heterogene strukturer med et bredt utvalg av fosfolipider og proteiner. Her, ved hjelp av hjernen mitokondrier som en in vitro biologisk membran, er en modell for å studere fibrillær aggregater cytotoksisitet på membran nivå beskrevet.

Under eksperimentet er det viktig å jobbe raskt og holde alt på isen for å forberede funksjonelt aktive mitokondrier med intakte membraner. Videre er mitokondrie konsentrasjon (basert på total protein måling) en viktig faktor som påvirker membran-amyloid fibril interaksjon; Dermed må det holde konstant gjennom hele protokollen. I denne studien inneholdt mitokondrie preparater både Synaptic og ikke-Synaptic mitokondrier. For ren ikke-Synaptic mitokondrie forberedelse, 40%, 23% og 15% (v/v) tetthet gradient medium bør brukes, som beskrevet av Sims og Anderson14. Fordi mitokondrier er en organelle med et godt karakterisert membran, kan det tjene som en svært nyttig biologisk modell system i molekylær studier knyttet til mekanismer for amyloid cytotoksisitet på membran nivå (spesielt knyttet til nevrodegenerative sykdommer). Denne protokollen tillater gransking av interaksjoner og omfanget av mitokondrie membraner permeabilization ved å se inn i utgivelsen av ulike molekyler og enzymer som ligger i forskjellige rom (dvs. de som er innebygd i ytre og indre membraner og de som ligger i intermembrane plass eller mitokondrie matrise).

Etter mitokondrie membran integritet bekreftelse (figur 1B) og amyloid fibril formasjon (figur 2), samspillet, skader, og permeabilization av mitokondrie membraner ved tilsetning av α-synuclein, STORFE insulin, og HEWL amyloid fibrils ble undersøkt. Resultatene demonstrerte klare forskjeller i omfanget av membran permeabilization og mitokondrie ROS ekstrautstyr indusert av amyloid fibrils (Figur 3 og Figur 4), noe som tyder på variasjoner i evnen til ulike amyloid fibrils å samhandle med og skade mitokondrie membraner.

For membran permeabilization initiering, må amyloid fibrils nå mitokondrie overflate. Det har blitt vist at foreningen, lokalisering, og innsetting av proteiner til ladet membraner er avhengig av uspesifisert elektrostatisk samhandling og hydrofobe natur proteiner26,27,28. I forhold til amyloid toksisitet, en økende mengde bevis sterkt impliserer en nøkkelrolle protein samlet overflate hydrofobisiteten i sine cytotoksisitet29,30. Selv HEWL bærer en netto positiv ladning over et bredt spekter av pH-verdier og har en høy affinitet for anioniske og nøytral fosfolipider31 (f. eks, den mitokondrie membran23), ingen MITOKONDRIE membran permeabilization og ros ekstrautstyr ble observert (Figur 3 og Figur 4). En forklaring på denne observasjonen kan være relatert til en reduksjon av overflate hydrofobisiteten av HEWL fibrils på grunn av lateral fibril-fibril interaksjoner23,32, som fører til tap av evnen til å forårsake membran skade.

For storfe-insulin, til tross for en betydelig eksponering av hydrofobe regioner i løpet av fibril formasjon22, ble det observert en svak enzym utgivelse ved tilsetning av 25 μM amyloid fibrils (Figur 3) uten signifikante virkninger på mitokondrie ROS innhold (Figur 4). Som både hjernen mitokondrier og storfe insulin fibrils bære en negativ Zeta potensial på sine overflater24, er det antydet at frastøtende krefter mellom mitokondrie membran og storfe insulin amyloid fibrils kan gjøre rede for sin manglende evne til å effektivt samhandle med og skade mitokondrie membraner24. De høyeste permeabilization og mitokondrie ROS intervallene ble observert ved tilsetning av α-synuclein fibrils (Figur 3 og Figur 4).

Denne observasjonen kan tilskrives den høye kapasiteten til α-synuclein for samspill med biologiske membraner som har negativt ladet flater33,34, som mitokondrier. I denne forbindelse har noen studier vist spesifikk binding og innførsel av α-synuclein til mitokondrier, der de i hovedsak blir knyttet til den indre membran35. Interessant, Ghio et al. rapporterte at bindende, formidlet av cardiolipin (en fosfolipid unikt beriket i indre mitokondrie membran), av α-synuclein kan være en viktig mekanisme for forening og forstyrrelse av mitokondrie membraner36.

Interessant nok er det klare bevis for binding og akkumulering av ulike amyloidogenic peptider og proteiner, inkludert amyloid β-peptid, α-synuclein, Huntingtin og ALS-knyttet mutant SOD1 til mitokondrier35,37, 38,39. Videre har tidligere studier vist at amyloidogenic forsamlinger av amyloid β (25 – 35)15 og torv 140 har evnen til å samhandle med og forårsake mitokondrie membran permeabilization. Ifølge litteraturen, er det antydet at amyloid fibrils er for store til å krysse membranen; Derfor bør gjennomsnittlig fibril størrelse ikke være en faktor i den åpenbare mangelen på effekter indusert av storfe insulin og HEWL amyloid fibrils. Selv om videre studier er nødvendig for å belyse de detaljerte mekanismene som er involvert, er det foreslått at de Biofysiske funksjonene i amyloid fibrils (dvs. overflate ladning, hydrofobisiteten, og inneha en bestemt sekvens-målretting mitokondrie membran) kan spille en viktig rolle i deres evne til å samhandle med og skade biologiske membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Forskningsrådet for Institutt for avanserte studier i Basic Sciences (IASBS), Zanjan, Iran.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma 35845
Ammonium sulfate Merck 1012171000
Black 96-well plate Corning
Black Clear-bottomed 96-well plate Corning
Bovine insulin Sigma I6634
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A2153
BSA essentially fatty acid-free Sigma A6003
Centrifuge Sigma
Crystal clear sealing tape Corning
CuSO4 Sigma 451657
Dialysis bag (cut off 2 KDa) Sigma D2272
Dounce homogenizer Potter Elvehjem
EDTA Sigma E9884
Fluorescence plate reader BioTek
Fluorescence spectrophotometer Cary Eclipse VARIAN
Folin Merck F9252
Glycine Sigma G7126
Guillotine Made in Iran
HCl Merck H1758
Hen Egg White Lysozyme (HEWL) Sigma L6876
Na2CO3 Sigma S7795
NaH2PO4 Sigma S7907
NaOH Merck S8045
Oxaloacetate Sigma O4126
Percoll GE Healthcare
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma CS0030
PMSF Sigma P7626
Potassium sodium tartrate Sigma 217255
Quartz cuvette Sigma
Spectrophotometer analytik jena SPEKOL 2000 model
Succinate Sigma S2378
Sucrose Merck 1076871000
Thermomixer Eppendorph
Thioflavin T Sigma T3516
Tris-HCl Merck 1082191000
Triton X-100 Sigma T9284
Tryptone QUELAB
Water bath Memmert
Yeast Extract QUELAB
β-NADH Sigma N8129

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
  2. Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
  3. Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
  4. Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
  5. Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
  6. Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
  7. Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
  8. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  9. Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  10. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  11. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  12. Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
  13. Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
  14. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
  15. Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
  16. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
  17. Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
  18. Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
  19. Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
  20. Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
  21. Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
  22. Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
  23. Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
  24. Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
  25. Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
  26. Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
  27. Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
  28. Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
  29. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  30. Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
  31. Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
  32. Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
  33. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
  34. Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
  35. Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  36. Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
  37. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  38. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  39. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  40. Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).

Tags

Biokjemi mitokondrier amyloid fibril membran permeabilization toksisitet Malate dehydrogenase reaktive oksygen arter thioflavin T atomkraft mikroskopi α-synuclein storfe insulin høne eggehvite lysozyme
Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zadali, R., Ghareghozloo, E. R.,… More

Zadali, R., Ghareghozloo, E. R., Ramezani, M., Hassani, V., Rafiei, Y., Chiyaneh, S. M., Meratan, A. A. Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils. J. Vis. Exp. (151), e59883, doi:10.3791/59883 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter