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Biochemistry

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

Published: September 28, 2019 doi: 10.3791/59883
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran
* These authors contributed equally

Summary

Hier ist ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen nativer Form, Präfibrillar und reifen Amyloidfibrillen verschiedener Peptide und Proteine mit Mitochondrien aus verschiedenen Geweben und verschiedenen Bereichen des Gehirns isoliert.

Abstract

Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass Membranpermeabilisierung, einschließlich der inneren Membranen wie Mitochondrien, ist ein gemeinsames Merkmal und primärer Mechanismus der Amyloid-Aggregat-induzierte Toxizität bei neurodegenerativen Erkrankungen. Die meisten Berichte, die die Mechanismen der Membranstörung beschreiben, basieren jedoch auf Phospholipid-Modellsystemen, und Studien, die direkt auf Ereignisse abzielen, die auf der Ebene biologischer Membranen auftreten, sind selten. Beschrieben hier ist ein Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Amyloid-Toxizität auf Membranebene. Für die mitochondriale Isolierung wird ein Dichtegradientenmedium verwendet, um Präparate mit minimaler Myelinkontamination zu erhalten. Nach der Bestätigung der mitochondrialen Membranintegrität wird die Wechselwirkung von Amyloidfibrillen, die aus dem In-vitro-Biologischen Modell von Synuclein, Rinderinsulin und Hühnereiweißlysozym (HEWL) mit Rattenhirn-Mitochondrien als in vitro biologisches Modell entstehen, untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung von Hirnmitochondrien mit fibrillaren Baugruppen unterschiedliche Grade der Membranpermeabilisation und ROS-Gehaltsverbesserung verursachen kann. Dies deutet auf strukturabhängige Wechselwirkungen zwischen Amyloidfibrillen und mitochondrialer Membran hin. Es wird vermutet, dass biophysikalische Eigenschaften von Amyloidfibrillen und deren spezifische Bindung an mitochondriale Membranen Erklärungen für einige dieser Beobachtungen liefern können.

Introduction

Amyloid-bedingte Störungen, bekannt als Amyloidosen, stellen eine große Gruppe von Krankheiten dar, die durch das Auftreten unlöslicher Proteinablagerungen in verschiedenen Geweben und Organen definiert sind1,2. Unter ihnen sind neurodegenerative Erkrankungen die häufigsten Formen, in denen Proteinaggregate im zentralen oder peripheren Nervensystem auftreten2. Obwohl eine Reihe von Mechanismen vorgeschlagen wurden, um in die Toxizität von Amyloid-Aggregaten beteiligt werden3, eine wachsende Menge von Beweisen deutet auf Zellmembran-Störung und Permeabilisierung als primärer Mechanismus der Amyloidpathologie4, 5. Neben der Plasmamembran können auch innere Organellen (d.h. Mitochondrien) betroffen sein.

Interessanterweise deuten neue Erkenntnisse darauf hin, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen spielt, einschließlich Alzheimer und ParkinsonErkrankungen 6,7. In Übereinstimmung mit dieser Ausgabe haben zahlreiche Berichte auf eine Bindung und Akkumulation von Amyloid-Peptid, -synuclein, Huntingtin und ALS-verknüpften mutierten SOD1-Proteinen an Mitochondrien8,9,10 11. Der Mechanismus der Membranpermeabilisierung durch Amyloidaggregate wird entweder durch Bildung diskreter Kanäle (Poren) und/oder durch einen unspezifischen Waschmittel-ähnlichen Mechanismus5,12, 13. Bemerkenswert ist, dass die meisten dieser Schlussfolgerungen auf Berichten mit Phospholipid-Modellsystemen basieren, und Studien, die direkt auf die Ereignisse in biologischen Membranen abzielen, sind selten. Es ist klar, dass diese künstlichen Lipid-Doppelschichten nicht unbedingt die intrinsischen Eigenschaften biologischer Membranen widerspiegeln, einschließlich der mitochondrien, die heterogene Strukturen sind und aus einer Vielzahl von Phospholipiden und Proteinen bestehen.

In der vorliegenden Studie werden Von Rattenhirnen isolierte Mitochondrien als in vitro biologisches Modell verwendet, um die zerstörerischen Wirkungen von Amyloidfibrillen zu untersuchen, die aus dem signifikante strukturelle Homologie mit humanem Insulin, das an einer injektionslokalisierten Amyloidose beteiligt ist), und Hühnereiweißlysozym (HEWL; als gemeinsames Modellprotein zur Untersuchung der Amyloid-Aggregation). Die Wechselwirkungen und möglichen Schäden von mitochondrialen Membranen, die durch Amyloidfibrillen induziert werden, werden dann untersucht, indem die Freisetzung von mitochondrialer Malatdehydrogenase (MDH) (in der mitochondrialen Matrix) und mitochondrienem reaktiven Sauerstoff beobachtet wird. Arten (ROS) Verbesserung.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Medizinischen Wissenschaften der Universität Teheran durchgeführt. Es wurden maximale Anstrengungen unternommen, um Leiden und schädliche Auswirkungen auf die Ratten zu minimieren, indem die Guillotineklingen geschärft und entschlossene und schnelle Bewegungen der Klinge angewendet wurden.

1. Hirnhomogenisierung und mitochondriale Isolation

HINWEIS: Alle Reagenzien für die mitochondriale Isolierung wurden nach Sims und Anderson14hergestellt.

  1. Vorbereitung von Puffern für die mitochondriale Isolierung
    1. Bereiten Sie eine 100 mM Tris-HCl-Lösung vor: wiegen Sie 0,605 g Tris-HCl und lösen Sie sie in ca. 40 ml entionisiertem Wasser (DW) in einem Becher auf. Übertragen Sie die Lösung auf einen 50 ml Volumetkolben und erhöhen Sie das Endvolumen durch Hinzufügen von DW auf 50 ml.
    2. Bereiten Sie eine 10 mM EDTA-Lösung vor: wiegen Sie 0,202 g EDTA und lösen Sie sie in ca. 40 ml DW in einem Becher auf. Übertragen Sie die Lösung auf einen 50 ml Volumetkolben und erhöhen Sie das Endvolumen durch Hinzufügen von DW auf 50 ml.
      HINWEIS: Beide Lösungen können bei 4 °C für mindestens 4 Wochen gelagert werden.
    3. Bereiten Sie eine Tris-HCl/EDTA/Saccharose-Lagerlösung vor: 30 ml 100 ml Tris-HCl und 30 ml 10 mM EDTA in einem Becher hinzufügen. 32,86 g Saccharose wiegen und unter Rühren mit einem Magnetrührer in das Becherglas geben. Wenn die Saccharose gelöst ist, übertragen Sie die Lösung auf einen 100 ml Volumet-Kolben und erhöhen Sie das Endvolumen auf 100 ml durch Hinzufügen von DW.
      HINWEIS: Diese Lösung kann bei 4 °C für bis zu 3 Tage gelagert werden.
    4. Einen Isolationspuffer (IB) vorbereiten: 100 ml Tris-HCl/EDTA/Saccharosebestand zu ca. 150 ml DW hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie 0,1 M HCl hinzufügen. Erhöhen Sie das Endvolumen durch Hinzufügen von DW auf 300 ml.
    5. Bereiten Sie 15% (v/v) DichteGradientenmedium mit IB vor, indem Sie 1,5 ml Dichtegradienten mittlerer bis 8,5 ml kalter IB hinzufügen.
    6. 10 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) Lösung vorbereiten: 20 mg fettsäurefreie BSA wiegen und in ca. 1,5 ml DW in einer 2 ml Durchstechflasche auflösen. Erhöhen Sie das Endvolumen auf 2 ml, indem Sie DW hinzufügen und bis zur Verwendung auf Eis speichern.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Lösungen von den Schritten 1.1.4–1.1.6 am Tag der mitochondrialen Isolation frisch vor und lagern Sie sie bis zur Anwendung auf Eis.
  2. Isolation des Rattenhirns
    HINWEIS: Enthauptung und Hirnentfernung männlicher Ratten (150–200 g) wurden nach Sims und Anderson14durchgeführt.
    1. Legen Sie einen 30 ml Becher in einen Eiskübel und fügen Sie 10 ml kalte IB in das Becherglas.
    2. Enthaupten Sie die Ratte mit einer kleinen tierischen Guillotine und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel innerhalb von 1 min der Enthauptung, um die Verschlechterung der mitochondrialen Eigenschaften zu begrenzen.
    3. Übertragen Sie das Gehirn schnell auf das Becherglas, das kalte IB enthält.
  3. Hirnhomogenisierung und Zubereitung von Mitochondrien
    HINWEIS: Mitochondriale Brüche wurden gemäß dem von Sims und Anderson14beschriebenen Protokoll isoliert, mit einigen Modifikationen, wie zuvor beschrieben15. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und alles während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten.
    1. Waschen Sie das Gewebe 2x mit 30 ml IB, übertragen Sie es in einen Becher, der kalte IB enthält, und zerkleinern Sie das Gehirn mit einer Schere.
    2. Fügen Sie 10 Bände vorgekühlten IB (ca. 10 ml IB pro Rattenhirn) hinzu.
    3. Übertragen Sie die Gewebesuspension auf einen 20 ml kalten Dounce Homogenisator.
    4. Homogenisieren Sie die Gewebestücke mit neun Auf- und Abschlägen mit einem motorisierten Stößel.
      HINWEIS: Lassen Sie die Mischung nach jedem Satz von drei Homogenisierungsschlägen ca. 30 s auf Eis, um sicherzustellen, dass das Homogenat kalt bleibt.
    5. Das Homogenat bei 1.300x g und 4 °C für 3 min in ein vorgekühltes 10 ml Zentrifugenrohr und zentrifugieren.
    6. Den Überstand vorsichtig dekantieren und 10 min auf ein vorgekühltes 10 ml Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 21.000x g bei 4 °C übertragen.
    7. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einer kalten 15%igen Gradienten-Mittellösung (5 ml für jedes Gehirn) wieder auf, indem Sie die Mischung vorsichtig mit einer Pipette rühren.
    8. Zentrifuge in einem Festwinkelrotor bei 30.700x g bei 4 °C für 5 min mit langsamer Beschleunigung (45 s von 0 U/min bis 500 U/min, gefolgt von normaler Beschleunigung) und Verzögerung (keine Bremsen). Dadurch sollten zwei unterschiedliche Materialbänder entstehen(Abbildung 1A, links).
    9. Entfernen Sie mit einer Pasteur-Pipette das scharfe Materialband, das sich oben im Farbverlauf angesammelt hat und das meist Myelin enthält. Entfernen Sie dann die Dichtegradienten-Mittellösung, die das Material (in Band 2) überlagert, so weit wie möglich, ohne eine der angereicherten mitochondrialen Brüche in Band 2 zu verlieren.
      HINWEIS: Das Band 2 enthält sowohl die synaptische als auch die nicht-synaptische Mitochondrien.
    10. Fügen Sie der mitochondrialen Fraktion 8 ml hinzu, während Sie die Mischung vorsichtig mit einer Pipette rühren.
    11. Zentrifuge bei 16.700x g bei 4 °C für 10 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, so dass das untere lose Pellet ungestört bleibt.
    12. 1 ml 10 mg/ml fettsäurefreies BSA in das Zentrifugenrohr geben, während die Mischung vorsichtig mit der Spitze einer Pipette gerührt wird. Erhöhen Sie das Endvolumen auf 5 ml pro Gehirn, indem Sie IB hinzufügen.
    13. Zentrifuge bei 6.900x g bei 4 °C für 10 min, die ein festes Pellet produzieren sollte(Abbildung 1A, rechts).
    14. Den Überstand dekantieren und das mitochondriale Pellet in IB vorsichtig wieder aufsetzen, in 0,5 ml-Rohre auslagern und bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff lagern.

2. Proteinkonzentrationsbestimmung

HINWEIS: Die Proteinkonzentration wird mit der Methode von Lowry et al.16gemessen.

  1. Vorbereitung von Lösungen für Lowry Assay
    1. Lösung A vorbereiten: 0,4 g NaOH und 2 g Na2CO3 wiegen und in 80 ml DW auflösen, dann die Lösung in einen 100 ml Volumetkolben übertragen und das Volumen durch Zugabe von DW auf 100 ml erhöhen.
    2. Lösung B vorbereiten: 0,1 g Kaliumnatriumtartrat und 0,05 g CuSO4 wiegen und in 8 ml DW auflösen, dann die Lösung in einen 10 ml Volumetkolben übertragen und das Volumen durch Zugabe von DW auf 10 ml erhöhen.
      HINWEIS: Beide Lösungen A und B können bis zu 6 Monate stabil bei 4 °C bleiben.
    3. Lösung C vorbereiten: Fügen Sie 0,5 ml Folinlösung zu 7,5 ml DW hinzu.
      HINWEIS: Bereiten Sie Lösung C frisch vor und halten Sie sich bis zur Anwendung vom Licht fern.
    4. Bereiten Sie BSA-Standards mit Endkonzentrationen von 0, 20, 40, 60, 80, 100 und 120 g/ml vor, indem Sie 0, 20, 40, 60, 80, 100 und 120 l mit 1 mg/ml BSA kombinieren, mit genügend DW, um 1000 l Lösung zu machen.
  2. Proteinkonzentrationsmessung
    HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt für eine höhere Genauigkeit in dreifacher Ausführung aus.
    1. Fügen Sie jedem Bohrgut einer 96-Well-Platte 50 l Standardlösungen und mitochondriales Homogenat hinzu, gefolgt von der Zugabe von 45 l der Lösung A. Dann inkubieren Sie die Platte für 10 min in einem warmen Wasserbad bei 50 °C gesetzt.
    2. Fügen Sie die Platte bei Raumtemperatur (RT) für 10 min bei Dunkelheit (RT) 5 l der Lösung B hinzu und inkubieren Sie sie.
    3. Fügen Sie 150 l Der Lösung C hinzu und brüten Sie die Platte für 10 min in einem warmwasserbad bei 50 °C.
    4. Laden Sie die Platte in einen Plattenleser und erfassen Sie die Absorptionswerte für Normen und mitochondriale Aufhängung bei 650 nm. Berechnen Sie dann mithilfe einer Kalibrierkurve den Proteingehalt der Mitochondrien.

3. Mitochondriale Membranintegritätsbestimmung

HINWEIS: Die mitochondriale Membranintegrität wird durch Messung der Aktivität der Malatdehydrogenase (MDH) in isolierten Mitochondrien vor und nach einer Membranstörung durch Triton X-100 bestätigt.

  1. Mitochondriales Homogenat mit kaltem IB auf 1 mg/ml verdünnen und in zwei 1,5 ml-Röhren (typischerweise 195 l Mitochondrien pro Tube) geben.
  2. Fügen Sie Triton X-100 (mit DW verdünnt) 5 l von 20 % (v/v) zu einem Röhrchen (als Positivkontrolle für maximale Enzymaktivität) und 5 l DW zu einem anderen Rohr (zur Kontrolle) hinzu, gefolgt vom Mischen mit einem Rührer.
  3. Inkubieren Sie die Rohre für 10 min in einem warmen Wasserbad bei 30 °C.
  4. Pelletmitochondrien durch Zentrifugieren von Rohren in einem Festwinkelrotor bei 16.000 x g und 4 °C für 15 min.
  5. Sammeln Sie sorgfältig die resultierenden Überstandmittel, um die Aktivität von mitochondrialem MDH mithilfe eines im folgenden Abschnitt beschriebenen spektrophotometrischen Standard-Assays zu untersuchen.
  6. Berechnen Sie die Integrität der mitochondrialen Membran wie folgt:
    Equation 1

4. MDH-Aktivitätsbestimmung

HINWEIS: Die MDH-Aktivität wurde spektrophotometrisch gemessen, wie von Sottocasa et al.17beschrieben.

  1. Vorbereitung von Lösungen für Deninataum MDH
    1. 50 mM Tris-HCl-Lösung (pH = 7,5) vorbereiten: Eine 7,9 mg/ml Lösung in DW mit Tris-HCl vorbereiten und den pH-Wert bei 25 °C bei 1,0 M NaOH auf 7,5 einstellen.
    2. Bereiten Sie eine 50 mM Oxaloacetat-Lösung vor: Bereiten Sie eine 6,6 mg/ml-Lösung mit Oxaloacetat in Tris-HCl vor.
      HINWEIS: Diese Lösung ist nicht stabil einmal in der Lösung und sollte unmittelbar vor der Verwendung vorbereitet werden.
    3. Bereiten Sie eine 10 mM-NADH-Lösung vor: Bereiten Sie eine 7,81 mg/ml-Lösung mit der Verwendung von NADH in Tris-HCl vor.
  2. MDH-Aktivitätsbestimmung
    HINWEIS: Die Endkonzentrationen in einem 1,0 ml-Reaktionsgemisch sind 50 mM Tris-HCl, 5 mM Oxaloacetat und 0,1 mM NADH.
    1. Stellen Sie das Spektralphotometer auf 25 °C und 340 nm ein. Pipette 890 L Tris-HCl Puffer, 100 l Oxaloacetat-Lösung und 10 l NADH-Lösung für eine leere Küvette und 880 L Tris-HCl-Puffer, 100 l Oxaloacetat-Lösung und 10 l NADH-Lösung in eine Probenküvette.
    2. Inkubieren Sie Küvetten im Spektralphotometer für 3-4 min und Referenz gegen Leer.
    3. Dann 10 l mitochondriales Homogenat (1 mg/ml) in die Probenküvette geben, sofort durch Inversion mischen und Absorptionsabnahmen durch NADH-Oxidation bei 340 nm für 1 min aufzeichnen.

5. In-vitro-Synuclein, Rinderinsulin und HEWL-Fibrillenbildung

  1. Proteinzubereitung
    1. Synuclein:
      ANMERKUNG: Die Expression und Reinigung des rekombinanten Synucleins wird wie von Hoyer et al.18 mit einigen Modifikationen beschrieben durchgeführt, und die Reinheit von '-Synuclein wird durch SDS-PAGE bestätigt.
      1. Dialyse-gereinigtes Synuclein über Nacht gegen phosphatgepufferte Saline (PBS).
      2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Aussterbekoeffizienten von 5600 M-1 cm-1 bei 275 nm19.
      3. Aliquots Protein in 1,5 ml Tuben und lagern bei -80 °C bis zur Verwendung.
    2. Rinderinsulin und HEWL:
      1. Geben Sie sowohl Rinderinsulin als auch HEWL an.
      2. Lösen Sie jedes Protein in 50 mM Glycinpuffer (pH = 1,6; pH mit HCl einstellen).
      3. Bestimmen Sie die Rinderinsulin- und HEWL-Konzentration mit einem Aussterbekoeffizienten von 1,0 und 2,63 für 1,0 mg/ml bei 276 nm bzw. 280 nm bzw.20,21.
  2. Amyloid-Fibrillationsinduktion
    1. Vorbereitung von Lösungen für Amyloid-Fibrillation:
      1. Thioflavin T (ThT) Puffer vorbereiten: 0,3 g NaH2PO4 wiegen und in 80 ml DW auflösen, den pH-Wert auf 6,5 einstellen und das Volumen durch Zugabe von DW auf 100 ml erhöhen.
      2. ThT-Stammlösung (5 mM) vorbereiten: 1,6 mg ThT wiegen und in 1 ml ThT-Puffer auflösen, ein 0,22 m Filterpapier passieren und bis zum Gebrauch von Licht bei 4 °C fernhalten.
        HINWEIS: Diese Lösung kann bei 4 °C für bis zu 4 Wochen gelagert werden.
      3. ThT-Lösung (1 mM) vorbereiten: Fügen Sie 200 L ThT-Stammlösung (5 mM) zu 800 l ThT-Puffer hinzu.
        HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
    2. In-vitro-Synuclein-Amyloid-Fibrillenbildung:
      1. Fügen Sie Aliquots (294 l) Proteinlösung (200 m) und 6 l ThT-Lösung (1 mM) zu 1,5 ml-Röhren hinzu, gefolgt vom Rühren.
      2. Die Rohre in einem Thermomixer bei 37 °C unter ständigem Rühren bei 800 U/min 4 Tage bebrüten.
      3. Nehmen Sie nach regelmäßigen Zeitintervallen Aliquots (10 l) inkubierter Proben und fügen Sie 490 L ThT-Puffer hinzu, gründlich gemischt und 5 min bei RT inkubieren.
      4. Setzen Sie anregungs- und Emissionsschlitzbreiten auf 5 nm bzw. 10 nm, und messen Sie die ThT-Fluoreszenz durch Anregung bei 440 nm und die Emission mit einem Fluoreszenzspektrophotometer bei 485 nm.
    3. In-vitro-Rinderinsulin Amyloid-Fibrillenbildung:
      1. Fügen Sie 637 l Proteinlösung (250 m) zu 1,5 ml Röhre hinzu. Fügen Sie dann 13 l ThT-Lösung (1 mM) gefolgt von Rühren hinzu.
      2. Fügen Sie Aliquots (200 l) Proteinlösung (250 m) mit 20 M ThT zu jeder Bohrung einer klar bodengebundenen 96-Wellplatte hinzu und versiegeln Sie die Platte mit kristallklarem Dichtband.
      3. Die Platte in einen Fluoreszenzplattenleser laden und bei 57 °C ohne Rührung brüten.
      4. Messen Sie thT Fluoreszenz in 30 min Intervallen, mit Anregung bei 440 nm und Emission bei 485 nm, für 12 h.
        HINWEIS: Schütteln Sie die Platte vor jeder Messung 5 s lang.
    4. In-vitro-HEWL-Amyloid-Fibrillenbildung:
      1. Fügen Sie Aliquots (200 L) Proteinlösung )1 mM) mit 20 M ThT zu jeder Bohrung einer klar bodengebundenen 96-Wellplatte hinzu und versiegeln Sie die Platte mit kristallklarem Dichtband.
      2. Die Platte in einen Fluoreszenzplattenleser laden und bei 57 °C ohne Rührung brüten.
      3. Messen Sie die ThT-Fluoreszenz in 2-Stunden-Intervallen, mit Anregung bei 440 nm und Emission bei 485 nm, für 4 Tage.
        HINWEIS: Für alle drei Proteine wird die Amyloid-Fibrillenbildung durch Atomkraftmikroskopie bestätigt (Abbildung 2B).

6. Behandlung von Mitochondrien mit Amyloidfibrillen, MDH-Freisetzungstest und ROS-Messung

  1. Inkubation isolierter Mitochondrien mit Amyloidfibrillen
    1. Zentrifuge und Warmwasserbad einschalten und auf 4 °C bzw. 30 °C einstellen.
    2. Mit IF mitochondrialem Homogenat auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnen.
    3. Bereiten Sie zwei Reihen von 1,5 ml-Röhren vor, die mitochondriale Homogenate enthalten (eine Serie für MDH-Freisetzungstest und eine weitere für die mitochondriale ROS-Messung).
    4. Fügen Sie Aliquots von frischen oder amyloiden Fibrillen von ,-Synuclein, Rinderinsulin oder HEWL (bei Endkonzentrationen von 5 m, 10 m, 20 m und 25 m; verwenden Sie PBS oder Glycinpuffer als Kontrolle) zum mitochondrialen Homogenat (Endvolumen = 200 l) (siehe Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3) anschließend sanft mit einer Pipette rühren.
      HINWEIS: Für den MDH-Freisetzungstest verwenden Sie Triton X-100 (bei einer Endkonzentration von 0,5% [v/v]) als positive Kontrolle für die maximale Enzymfreisetzung.
    5. Inkubieren Sie Röhren mit mitochondrialen Suspensionen für 30 min im Warmwasserbad auf 30 °C eingestellt.
    6. Messen Sie die mitochondriale MDH-Freisetzung und den ROS-Inhalt gemäß den Abschnitten 6.2 und 6.3.
  2. Mitochondrial MDH Release Assay
    1. Zentrifugieren Sie die inkubierten mitochondrialen Homogenate bei 16.000 x g für 15 min, und sammeln Sie dann sorgfältig die resultierenden Überwälten, um die Aktivität der mitochondrialen MDH, wie in Abschnitt 4 beschrieben, zu bewerten.
    2. Berechnen Sie die Freisetzung von MDH als Bruchteil des maximalen Effekts (Triton X-100) wie folgt:

Equation 1

  1. Mitochondriale ROS-Messung
    HINWEIS: Der mitochondriale ROS-Gehalt wird mit dem oxidationsempfindlichen fluorogenen Vorläufer Dihydrodichlorocarboxyfluorescein-Diaacetat (DCFDA)22bestimmt.
    1. Bereiten Sie Lösungen für die mitochondriale ROS-Messung vor. Bereiten Sie eine 50 M DCFDA-Lösung vor, indem Sie sie in Methanol (frisch vorbereiten) und eine 200 mM-Succinatlösung auflösen, indem Sie sie in DW auflösen.
    2. Pipette 191 l inkubiertes mitochondriales Homogenat zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte und 4 l mit 50 M DCFDA (1 M Endkonzentration) und 5 l mit 200 mM Succinat (5 mM Endkonzentration) hinzufügen.
    3. Inkubieren Sie die Platte 30 min in einem warmen Wasserbad bei 30 °C unter sanftem Rühren.
    4. Laden Sie die Platte in einen Fluoreszenzplattenleser und messen Sie die Fluoreszenzintensität, mit Anregung bei 485 nm und Emission bei 530 nm.

7. Statistische Analyse

  1. Führen Sie alle Experimente mindestens 2x oder 3x mit dreifachen Assays durch und führen Sie entsprechende statistische Tests durch. Hier werden die Ergebnisse als mittelwertige SD dargestellt, und ein Student es paired t-testwurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu berechnen. P-Werte unter 0,01 und 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen (*p < 0,05; **p < 0,01).

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Representative Results

Das Protokoll beschreibt ein Modell zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Amyloidfibrillen mit Mitochondrien des Rattenhirns als in vitro biologisches Modell. Für die mitochondriale Präparation wurde 15% (v/v) Dichtegradientenmedium verwendet, um Myelin als größere Kontamination des Hirngewebes zu entfernen14. Wie in Abbildung 1Adargestellt, erzeugte die Zentrifugation bei 30.700 x g zwei unterschiedliche Materialbänder, Myelin (alsHauptbestandteil von Band 1) und Band 2, das eine angereicherte mitochondriale Fraktion enthält.

Durch Änderung des von Sims und Anderson14beschriebenen Protokolls wurde eine mitochondriale Suspension vorbereitet, die sowohl synaptische als auch nicht-synaptische Mitochondrien enthielt. Zur Vorbereitung reiner nicht-synaptischer Mitochondrien haben Sims und Anderson zuvor das Protokoll14detailliert beschrieben. Im letzten Schritt der Zentrifugation wurden 10 mg/ml fettsäurefreie BSA hinzugefügt, um ein festes mitochondriales Pellet zu erhalten (Abbildung 1A). Die mitochondriale Membranintegrität wurde durch Messung der MDH-Aktivität in isolierten Mitochondrien vor und nach Membranunterbrechung und Enzymfreisetzung durch Triton X-100, wie im Protokoll beschrieben, bewertet.

Es wurde in der Regel festgestellt, dass mitochondriale Präparate etwa 93% intakt waren (Abbildung 1B). Ein ThT-Fluoreszenztest wurde durchgeführt, um das Wachstum von Amyloidfibrillen zu überwachen. Wie in Abbildung 2Adargestellt, zeigte die Kurve für Amyloid-Fibrillation von drei Proteinen ein typisches Sigmoidalmuster, das mit den Nukleations-abhängigen Polymerisationsmodellen dieser Proteine im Einklang steht, wie zuvor berichtet23,24 ,25. Die höchste ThT-Fluoreszenzemission für Synuclein, Rinderinsulin und HEWL wurde nach 96 h, 12 h bzw. 96 h beobachtet, was auf die Bildung von Amyloidfibrillen hindeutet (Abbildung 2A). Dies wurde durch die AFM-Messung weiter bestätigt.

Wie in Abbildung 2Bdargestellt, wurden für drei Proteine, die unter amyloidogenen Bedingungen inkubiert wurden, gut definierte reife Fibrillen mit typischer Amyloidmorphologie beobachtet. Wechselwirkungen und mögliche Schäden und Permeabilisierung von mitochondrialen Membranen durch Amyloidfibrillen wurden untersucht. Dies wurde erreicht, indem die Freisetzung von mitochondrialen MDH- und mitochondrialen ROS-Messungen nach Zugabe von A-Synuclein, Rinderinsulin oder HEWL-Amyloidfibrillen zu mitochondrialen Suspensionen überwacht und die beschriebenen Verfahren befolgt wurden. Die vorläufigen Experimente zeigten, dass das Vorhandensein von ThT (bis zu 3 M) keinen Einfluss auf die MDH-Freisetzung und den mitochondrialen ROS-Gehalt hatte (Daten wurden nicht angezeigt).

Wie in Abbildung 3dargestellt, wurde eine erhebliche Freisetzung von MDH bei Zugabe von Amyloidfibrillen von S-Synuclein zu Mitochondrien in konzentrationsabhängiger Weise beobachtet. Obwohl bei Zugabe von Rinderinsulinamyloidfibrillen eine leichte Freisetzung festgestellt wurde, erwiesen sich HEWL-Fibrillen als ineffektiv (Abbildung 3). Während bei Zugabe von Rinderinsulin oder HEWL-Amyloidfibrillen keine signifikante Verbesserung des mitochondrialen ROS-Gehalts beobachtet wurde, führte die Behandlung mit konzentrationsabhängige Art und Weise (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1: Mitochondriale Isolation und Membranintegritätsbestimmung. (A) Links: typisches Auftreten eines Zentrifugenrohrs nach Wiederaussetzung des Pellets in kalter 15%iger Dichtegradientenmittlere Lösung nach Zentrifugation. Myelin ist die Hauptkomponente von Band 1, das sich an der Spitze ansammelt. Band 2 enthält die hoch angereicherte mitochondriale Fraktion. Rechts: ein festes Pellet wurde nach Zugabe von 10 mg/ml fettsäurefreiem BSA und Zentrifugation bei 6900 x g hergestellt (B) Die mitochondriale Membranintegrität wurde durch Messung der MDH-Aktivität in isolierten Mitochondrien vor und nach Membranstörung durch Triton X-100. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Amyloid-Fibrillation von Synuclein, Rinderinsulin und HEWL. (A) Kinetik der Amyloid-Fibrillenbildung, die durch eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität von ThT bei 485 nm angezeigt wird. (B) Gezeigt werden AFM-Bilder von drei Proteinen, die regelmäßig unter amyloidogenen Bedingungen inkubiert wurden. Skalenbalken stellen 500 nm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Mitochondriale MDH-Freisetzung bei Wechselwirkung mit Monomer und Amyloidfibrille von '-Synuclein, Rinderinsulin und HEWL. Die Freisetzung wird als Prozentsatz des bei der Behandlung beobachteten Höchstwerts mit 0,5% (v/v) Triton X-100 ausgedrückt. Jeder Wert steht für den Mittelwert sD (n = 3; *p < 0,05, **p < 0,01). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Mitochondrialer ROS-Gehalt bei Wechselwirkung mit Monomer und Amyloidfibrille n-Synuclein, Rinderinsulin und HEWL. Die Daten werden als Prozentsatz der Werte in Kontrollmitochondrien ausgedrückt. Jeder Wert steht für den Mittelwert SD (n = 3; *p < 0,05; **p < 0,01). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Mitochondriales Homogenat (1 mg/ml) •Synuclein-Monomer (200 m) •Synuclein-Fibrille (200 m) Isolationspuffer Pbs Triton x-100 20% (v/v)
Steuerung 175 l 0 0 25 l 0 0
Pbs 175 l 0 0 0 25 l 0
Monomer 25 m 175 l 25 l 0 0 0 0
Fibril 5 m 175 l 0 5 l 20 l 0 0
Fibril 10 m 175 l 0 10 l 15 l 0 0
Fibril 20 m 175 l 0 20 l 5 l 0 0
Fibril 25 m 175 l 0 25 l 0 0 0
Positive Kontrolle 175 l 0 0 20 l 0 5 l

Tabelle 1: Behandlung von Mitochondrien mit verschiedenen Konzentrationen von Amyloidfibrillen von A-Synuclein.

  Mitochondriales Homogenat (1 mg/ml) Rinderinsulinmonomer (250 m) Rinderinsulinfibrille (250 m) Isolationspuffer Glycinpuffer Triton x-100 20% (v/v)
Steuerung 175 l 0 0 25 l 0 0
Glycinpuffer 175 l 0 0 0 25 l 0
Monomer 25 m 175 l 20 l 0 5 l 0 0
Fibril 5 m 175 l 0 4 l 21 l 0 0
Fibril 10 m 175 l 0 8 l 17 l 0 0
Fibril 20 m 175 l 0 16 l 9 l 0 0
Fibril 25 m 175 l 0 20 l 5 l 0 0
Positive Kontrolle 175 l 0 0 20 l 0 5 l

Tabelle 2: Behandlung von Mitochondrien mit verschiedenen Konzentrationen von Rinderinsulin amyloidfibrillen.

  Mitochondriales Homogenat (1 mg/ml) HEWL Monomer (1 mM) HEWL fibril (1 mM) Isolationspuffer Glycinpuffer Triton x-100 20% (v/v)
Steuerung 175 l 0 0 25 l 0 0
Glycinpuffer 175 l 0 0 0 25 l 0
Monomer 25 m 175 l 5 l 0 20 l 0 0
Fibril 5 m 175 l 0 1 L 24 l 0 0
Fibril 10 m 175 l 0 2 l 23 l 0 0
Fibril 20 m 175 l 0 4 l 21 l 0 0
Fibril 25 m 175 l 0 5 l 20 l 0 0
Positive Kontrolle 175 l 0 0 20 l 0 5 l

Tabelle 3: Behandlung von Mitochondrien mit verschiedenen Konzentrationen von HEWL-Amyloidfibrillen.

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Discussion

Eine Fülle von experimentellen Ergebnissen stützt die Hypothese, dass die Zytotoxizität von fibrillaren Aggregaten signifikant mit ihrer Fähigkeit verbunden ist, mit biologischen Membranen zu interagieren und sie zu durchdringen4,5. Die meisten Daten basieren jedoch auf künstlichen Lipid-Doppelschichten, die nicht unbedingt die intrinsischen Eigenschaften biologischer Membranen widerspiegeln, die heterogene Strukturen mit einer Vielzahl von Phospholipiden und Proteinen sind. Hier wird unter Verwendung von Hirnmitochondrien als in vitro biologische Membran ein Modell zur Untersuchung der Zytotoxizität von fibrillaren Aggregaten auf Membranebene beschrieben.

Während des Experiments ist es wichtig, schnell zu arbeiten und alles auf Eis zu halten, um funktionell aktive Mitochondrien mit intakten Membranen vorzubereiten. Darüber hinaus ist die mitochondriale Konzentration (basierend auf der Gesamtproteinmessung) ein wichtiger Faktor, der die Membran-Amyloid-Fibrillen-Wechselwirkung beeinflusst; daher muss es während des gesamten Protokolls konstant bleiben. In der vorliegenden Studie enthielten mitochondriale Präparate sowohl synaptische als auch nicht-synaptische Mitochondrien. Für reine nicht-synaptische mitochondriale Präparation sollten 40%, 23% und 15% (v/v) Dichtegradientenmedium verwendet werden, wie von Sims und Anderson14beschrieben. Da die Mitochondrien eine Organelle mit einer gut charakterisierten Membran sind, kann sie als äußerst nützliches biologisches Modellsystem in molekularen Studien im Zusammenhang mit den Mechanismen der Amyloidzytotoxizität auf Membranebene (insbesondere in Bezug auf neurodegenerative Erkrankungen). Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungen und des Ausmaßes der perochondrialen Membranen durch Diemabilisierung, indem die Freisetzung verschiedener Moleküle und Enzyme untersucht wird, die sich in verschiedenen Kompartimenten befinden (d. h. solche, die in die äußeren und inneren Membranen eingebettet sind. und solche, die sich im Intermembranraum oder in der mitochondrialen Matrix befinden).

Nach der Bestätigung der mitochondrialen Membranintegrität (Abbildung 1B) und der Amyloid-Fibrillenbildung (Abbildung 2) wird die Wechselwirkung, Schädigung und Permeabilisierung der mitochondrialen Membranen nach Zugabe von Amyloidfibrillen untersucht. Die Ergebnisse zeigten deutliche Unterschiede im Ausmaß der Membranpermeabilisation und mitochondrialen ROS-Verbesserung, die durch Amyloidfibrillen induziert wurden (Abbildung 3 und Abbildung 4), was auf Variationen in der Fähigkeit verschiedener Amyloidfibrillen hindeutet. die mitochondrialen Membranen zu interagieren und zu beschädigen.

Für die Membranpermeabilisationseinleitung müssen Amyloidfibrillen die mitochondriale Oberfläche erreichen. Es hat sich gezeigt, dass die Assoziation, Lokalisierung und Insertion von Proteinen in geladene Membranen von unspezifischen elektrostatischen Wechselwirkungen und der hydrophoben Natur der Proteine26,27,28abhängt. In Bezug auf die Amyloid-Toxizität, eine wachsende Menge von Beweisen stark impliziert eine Schlüsselrolle der Protein-Aggregat-Oberflächenhydrophobie in ihrer Zytotoxizität29,30. Obwohl HEWL eine Netto-Positive-Ladung über eine breite Palette von pH-Werten trägt und eine hohe Affinität zu anionischen und neutralen Phospholipiden31 (z.B. die mitochondriale Membran23) hat, keine mitochondriale Membranpermeabilisierung und ROS-Verbesserung beobachtet wurden (Abbildung 3 und Abbildung 4). Eine Erklärung für diese Beobachtung kann mit einer Verringerung der Oberflächenhydrophobizität von HEWL-Fibrillen aufgrund der lateralen fibril-fibril Wechselwirkungen23,32zusammenhängen, was zu einem Verlust der Fähigkeit zur Verursachtheit von Membranschäden führt.

Bei Rinderinsulin wurde trotz einer signifikanten Exposition hydrophober Regionen im Verlauf der Fibrillenbildung22eine leichte Enzymfreisetzung bei Zugabe von 25 M Amyloidfibrillen (Abbildung 3) ohne signifikante mitochondrialen ROS-Inhalt (Abbildung 4). Da sowohl Hirnmitochondrien als auch Rinderinsulinfibrillen ein negatives Zeta-Potenzial an ihren Oberflächen tragen24, wird vermutet, dass abstoßende Kräfte zwischen mitochondrialer Membran und Rinderinsulinamyloidfibrillen für ihre Unfähigkeit, effektiv mit mitochondrialen Membranen interagieren und schädigen24. Die höchsten Permeabilisations- und mitochondrialen ROS-Inkremente wurden bei Zugabe von Fibrillen von S-Synuclein beobachtet (Abbildung 3 und Abbildung 4).

Diese Beobachtung kann auf die hohe Kapazität von '-Synuclein für die Interaktion mit biologischen Membranen, die negativ geladene Oberflächenhaben 33,34, wie Mitochondrien , zurückgeführt werden. Zu diesem Zweck haben einige Studien eine spezifische Bindung und Einfuhr von '-Synuclein in Mitochondrien gezeigt, wo sie überwiegend mit der inneren Membran assoziiert werden35. Interessanterweise berichteten Ghio et al., dass die Bindung, vermittelt durch Cardiolipin (ein Phospholipid, das in der inneren mitochondrialen Membran einzigartig angereichert ist), von '-Synuclein ein wichtiger Mechanismus für die Assoziation und Störung der mitochondrialen Membranen sein kann36.

Interessanterweise gibt es eindeutige Beweise für die Bindung und Ansammlung verschiedener amyloidogener Peptide und Proteine, einschließlich Amyloid-Peptid, -synuclein, Huntingtin und ALS-verknüpfter Mutant SOD1 an Mitochondrien35,37, 38,39. Darüber hinaus haben frühere Studien gezeigt, dass amyloidogene Baugruppen von Amyloid (25–35)15 und SOD 140 die Fähigkeit haben, mit der mitochondrialen Membranpermeabilisierung zu interagieren und diese zu verursachen. Nach der Literatur, Es wird vorgeschlagen, dass Amyloid-Fibrillen sind zu groß, um die Membran zu überqueren; Daher sollte die durchschnittliche Fibrillengröße kein Faktor für den offensichtlichen Mangel an Wirkungen sein, die durch Rinderinsulin und HEWL-Amyloidfibrillen induziert werden. Obwohl weitere Studien erforderlich sind, um die detaillierten Mechanismen zu klären, wird vorgeschlagen, dass die biophysikalischen Merkmale von Amyloidfibrillen (d. h. Oberflächenladung, Hydrophobie und das Besitzen einer spezifischen sequenz-targeting mitochondrialen Membran) kann eine wichtige Rolle in ihrer Fähigkeit spielen, mit biologischen Membranen zu interagieren und diese zu schädigen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Research Council des Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, Iran, unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma 35845
Ammonium sulfate Merck 1012171000
Black 96-well plate Corning
Black Clear-bottomed 96-well plate Corning
Bovine insulin Sigma I6634
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A2153
BSA essentially fatty acid-free Sigma A6003
Centrifuge Sigma
Crystal clear sealing tape Corning
CuSO4 Sigma 451657
Dialysis bag (cut off 2 KDa) Sigma D2272
Dounce homogenizer Potter Elvehjem
EDTA Sigma E9884
Fluorescence plate reader BioTek
Fluorescence spectrophotometer Cary Eclipse VARIAN
Folin Merck F9252
Glycine Sigma G7126
Guillotine Made in Iran
HCl Merck H1758
Hen Egg White Lysozyme (HEWL) Sigma L6876
Na2CO3 Sigma S7795
NaH2PO4 Sigma S7907
NaOH Merck S8045
Oxaloacetate Sigma O4126
Percoll GE Healthcare
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma CS0030
PMSF Sigma P7626
Potassium sodium tartrate Sigma 217255
Quartz cuvette Sigma
Spectrophotometer analytik jena SPEKOL 2000 model
Succinate Sigma S2378
Sucrose Merck 1076871000
Thermomixer Eppendorph
Thioflavin T Sigma T3516
Tris-HCl Merck 1082191000
Triton X-100 Sigma T9284
Tryptone QUELAB
Water bath Memmert
Yeast Extract QUELAB
β-NADH Sigma N8129

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References

  1. Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
  2. Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
  3. Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
  4. Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
  5. Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
  6. Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
  7. Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
  8. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  9. Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  10. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  11. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  12. Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
  13. Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
  14. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
  15. Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
  16. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
  17. Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
  18. Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
  19. Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
  20. Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
  21. Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
  22. Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
  23. Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
  24. Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
  25. Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
  26. Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
  27. Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
  28. Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
  29. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  30. Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
  31. Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
  32. Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
  33. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
  34. Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
  35. Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  36. Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
  37. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  38. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  39. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  40. Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).

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Zadali, R., Ghareghozloo, E. R., Ramezani, M., Hassani, V., Rafiei, Y., Chiyaneh, S. M., Meratan, A. A. Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils. J. Vis. Exp. (151), e59883, doi:10.3791/59883 (2019).

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