Her presenterer vi en MATLAB implementering av automatisert deteksjon og kvantitativ beskrivelse av lipid dråper i fluorescens mikroskopi bilder av fisjon og spirende gjærceller.
Lipid metabolisme og regulering er av interesse for både grunnleggende og anvendt biovitenskap og bioteknologi. I denne forbindelse er ulike gjær arter brukes som modeller i lipid metabolsk forskning eller for industriell lipid produksjon. Lipid dråper er svært dynamisk lagring organer og deres mobilnettet innhold representerer en praktisk avlesning av lipid metabolske tilstand. Fluorescens mikroskopi er en metode for valg for kvantitativ analyse av cellulære lipid dråper, som det er avhengig av allment tilgjengelig utstyr og tillater analyse av individuelle lipid dråper. Videre kan mikroskopisk bildeanalyse være automatisert, i stor grad øke samlet analyse gjennomstrømming. Her beskriver vi en eksperimentell og analytisk arbeidsflyt for automatisert deteksjon og kvantitativ beskrivelse av individuelle lipid dråper i tre forskjellige modell gjær arter: den fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe og Schizosaccharomyces japonicus, og den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. Lipid dråper er visualisere med BODIPY 493/503, og celle-ugjennomtrengelig fluorescerende dextran er lagt til kulturen Media for å identifisere celle grenser. Celler utsettes for 3D-epifluorescence mikroskopi i grønne og blå kanaler, og de resulterende z-stack-bildene behandles automatisk av en MATLAB-pipeline. Prosedyren utganger rike kvantitative data på mobilnettet lipid dråpe innhold og individuelle lipid dråpe egenskaper i tabellformat egnet for nedstrøms analyser i store regneark eller statistiske pakker. Vi gir eksempel analyser av lipid dråpe innhold under ulike forhold som påvirker mobilnettet lipid metabolisme.
Lipider spiller avgjørende roller i cellulær energi og karbon metabolisme, syntese av membran komponenter, og produksjon av bioaktive stoffer. Lipid metabolisme er finjustert i henhold til miljømessige forhold, næringsstoffer tilgjengelighet og celle-syklus fase1. Hos mennesker, lipid metabolisme har vært koblet til sykdommer, som fedme, type II diabetes og kreft2. I industrien, lipider produsert av mikroorganismer, slik som gjær, representerer en lovende kilde til fornybar diesel brensel3. Celler lagrer nøytrale lipider i såkalte lipid dråper (LDs). Disse evolutionarily bevarte organer er sammensatt av triacylglyceroler, steryl estere, en ytre fosfolipid monolag og tilhørende proteiner1. LDs opprinnelse i endoplasmatiske retikulum, utøve celle-syklus eller vekst-fase dynamikk, og er viktig for mobilnettet lipid homeostase1. LD-nummer og morfologi kan brukes som en praktisk proxy når assaying lipid metabolisme under ulike vekstforhold eller når screening et panel av mutanter. Gitt deres dynamiske natur, teknikker i stand til å analysere egenskapene til enkelte LDs er av spesiell interesse for studier av lipid metabolisme.
Ulike gjær arter har blitt brukt til å beskrive lipid-relaterte metabolske trasé og deres regulering, eller brukes i bioteknologi til å produsere interessante forbindelser eller brensel1. Videre, for modell gjær, slik som spirende gjær Saccharomyces cerevisiae eller fjernt relaterte fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe, Genova-Wide sletting belastning bibliotekene er tilgjengelige som kan brukes for høy gjennomstrømming skjermer4,5. Nylig ld sammensetning og dynamikk har blitt beskrevet i S. pombe6,7,8,9, og mutanter relatert til lipid metabolisme har blitt isolert i den nye modellen gjær Schizosaccharomyces japonicus10.
Det finnes mange teknikker for å studere LD-innhold og dynamikk. De fleste ansetter en slags farging av LDs med lipofile fargestoffer som Nile Red eller BODIPY 493/503. Sistnevnte viser mer smale eksitasjon og utslipp Spectra, og økt spesifisitet mot nøytrale lipider (LDs) i motsetning til fosfolipider (membraner)11. Fluorimetric og Flow-flowcytometri metoder har blitt brukt med hell i ulike fungal arter for å avdekke gener og vekstforhold som påvirker lagring lipid innhold12,13,14,15. Selv om disse metodene er egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømming, kan de ikke måle tallene og morfologi av individuelle LDs i celler, noe som kan variere dramatisk mellom vekstforhold og genotyper. Sammenhengende Raman spredning eller digital holografisk mikroskopi er Label-frie metoder som gir ld-nivå data, men krever spesialisert dyrt utstyr16,17,18. Fluorescens mikroskopi kan derimot gi detaljerte data om LD-innhold, samtidig som de bruker allment tilgjengelige instrumenter og verktøy for bildeanalyse. Det finnes flere analyse arbeidsflyter som har ulike grader av raffinement og automatisering i celle/ld-gjenkjenning fra bildedata, og er optimalisert for ulike celletyper, for eksempel metazoan-celler med stor LDs19,20 , 21, eller spirende gjær17,22,23. Noen av disse tilnærmingene fungerer bare i 2D (for eksempel på maks projeksjons bilder), som kan unnlate å beskrive det cellulære LD-innholdet på en pålitelig måte. Til vår kunnskap finnes det ingen verktøy for bestemmelse av LD-innhold og morfologi fra fisjon gjær mikroskopiske data. Utvikling av automatiserte og robuste LD-nivå analyser vil gi økt følsomhet og forbedret statistisk kraft, og gi rik informasjon om nøytralt lipid innhold, ideelt i flere gjær arter.
Vi har utviklet en arbeidsflyt for LD-innhold analyse fra 3D fluorescens mikroskopi bilder av gjærceller. Levende celler er farget med BODIPY 493/503 og Cascade Blue dextran å visualisere LDs og bestemme celle grenser, henholdsvis. Celler er immobilisert på glass lysbilder og utsatt for z-stack Imaging ved hjelp av et standard epifluorescence mikroskop. Bilder blir deretter behandlet av en automatisert rørledning implementert i MATLAB, en mye brukt (kommersiell) pakke for statistiske analyser. Rørledningen utfører forbehandling av bilder, segmentering (celler i forhold til bakgrunn, fjerning av døde celler) og LD-identifikasjon. Rike data på LD-nivå, for eksempel LD-størrelse og fluorescens intensitet, blir deretter gitt i tabellformat som er kompatible med viktige verktøy for regnearkprogrammer. Arbeidsflyten ble brukt med hell for å bestemme virkningen av nitrogen kilde tilgjengelighet på lipid metabolisme i S. pombe24. Vi viser nå funksjonaliteten til arbeidsflyten i s. pombe, s. japonicus og s. cerevisiae, ved hjelp av vekstforhold eller mutanter som påvirker mobilt ld-innhold.
Forståelsen av lipid metabolisme og dens regulering er viktig for både grunnleggende biologi, og kliniske og bioteknologisk applikasjoner. LD innhold representerer en praktisk avlesning av lipid metabolisme tilstand av cellen, med fluorescens mikroskopi være en av de viktigste metodene som brukes for LD innhold besluttsomhet. Den presenterte protokollen tillater automatisert oppdagelse og kvantitativ beskrivelse av individuelle LDs i tre forskjellige og morfologisk distinkte gjær arter. Til vår kunnskap, finnes det …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Charles University Grants PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 og SVV 260310. Vi takker Ondřej Šebesta for hjelp med mikroskopi og utvikling av bildet analyse rørledningen. Vi takker ReGenEx laboratoriet for s. cerevisiae stammer, og JapoNet og Hironori Niki ‘ s Lab for s. japonicus stammer. Den ppc1-88 stamme ble levert av gjær genetisk Resource Center Japan. Mikroskopi ble utført i laboratoriet for Konfokalmikroskopi og fluorescens mikroskopi co-finansiert av det europeiske Regional Development Fund og statsbudsjettet til den tsjekkiske republikk (Project no. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 og CZ. 2.16/3.1.00/21515).
12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
D-(+) – Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
standard office computer capable of running MATLAB | |||
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |