Summary
I virus dell'influenza A (IAV) sono patogeni respiratori contagiosi che causano epidemie annuali e pandemie occasionali. Qui, descriviamo un protocollo per monitorare le infezioni virali in vivo utilizzando una nuova luciferasi ricombinante e la fluorescenza-espressione bireporter IAV (BIRFLU). Questo approccio fornisce ai ricercatori un eccellente strumento per studiare IAV in vivo.
Abstract
I virus dell'influenza A (IAV) causano malattie respiratorie umane associate a conseguenze economiche e sanitarie significative. Come con altri virus, lo studio dello IAV richiede l'uso di laboriosi approcci secondari per rilevare la presenza del virus nelle cellule infette e/o nei modelli animali di infezione. Questa limitazione è stata recentemente aggirata con la generazione di IAV ricombinanti che esprimono proteine reporterstiche fluorescenti o bioluminescenti (luciferasi) facilmente tracciabili. Tuttavia, i ricercatori sono stati costretti a selezionare geni di reporter fluorescenti o luciferasi a causa della limitata capacità del genoma IAV per l'inclusione di sequenze estranee. Per superare questa limitazione, abbiamo generato un bireporter iav (BIRFLU) ricombinante che esprime stabilmente un gene di reporter fluorescente e luciferasi per tracciare facilmente le infezioni IAV in vitro e in vivo. A tal fine, i segmenti virali virali non strutturali (NS) ed emagglutinina (HA) dell'influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) sono stati modificati per codificare rispettivamente la Venere fluorescente e le proteine bioluminescenti Nanoluc luciferasi. Qui, descriviamo l'uso di BIRFLU in un modello murino di infezione da IAV e il rilevamento di entrambi i geni reporter utilizzando un sistema di imaging in vivo. In particolare, abbiamo osservato una buona correlazione tra le espressioni sia dei giornalisti che della replica virale. La combinazione di tecniche all'avanguardia in biologia molecolare, ricerca animale e tecnologie di imaging, fornisce ai ricercatori l'opportunità unica di utilizzare questo strumento per la ricerca influenzale, compreso lo studio delle interazioni virus-ospite e delle dinamiche di infezioni virali. È importante sottolineare che la fattibilità di modificare geneticamente il genoma virale per esprimere due geni estranei provenienti da diversi segmenti virali apre opportunità di utilizzare questo approccio per: (i) lo sviluppo di nuovi vaccini IAV, (ii) la generazione di IAV ricombinanti che possono essere utilizzati come vettori di vaccino per il trattamento di altre infezioni da patogeni umani.
Introduction
Influenza A virus (IAV) è un virus rna segmentato a senso negativo a singolo filamento avvolto della famiglia Orthomyxoviriridae 1,2,3. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) stima 3-5 milioni di casi annui di influenza e oltre 250.000 decessi da influenza in tutto il mondo4,5,6. I gruppi particolarmente vulnerabili all'influenza includono gli anziani, gli individui immunocompromessi e i bambini7,8,9,10,11. Sebbene i vaccini siano disponibili e rappresentino l'intervento più comune ed efficace contro l'infezione virale, lo IAV è in grado di evolvere rapidamente e sfuggire all'immunità preesistente3,12,13, 14 Del sistema , 15. Il riemergere di un ceppo pandemico H1N1 nel 2009 e l'emergere di iAV patogeni ribadisce la costante minaccia alla salute pubblica umana in tutto il mondo4,16.
Durante un'epidemia o una pandemia, è fondamentale determinare rapidamente la patogenicità e la trasmissibilità dei virus appena isolati. Attualmente disponibili tecniche per rilevare il virus sono lunghe e talvolta richiedono l'uso di approcci laboriosi, che possono ritardare il completamento di queste analisi17,18,19,20. Inoltre, gli attuali saggi virali sono difficili da scalare, il che potrebbe essere necessario in caso di epidemia. Infine, l'uso di modelli animali convalidati di infezione, come topi, porcellini d'India e furetti, è usato regolarmente e sono fondamentali per studiare le infezioni influenzali, le risposte immunitarie e l'efficacia di nuovi vaccini e/o antivirali. Tuttavia, questi modelli sono restrittivi a causa dell'incapacità di osservare le dinamiche virali in tempo reale; questo limita gli studi all'imaging statico delle infezioni virali21,22,23,24,25. Anche gli animali utilizzati in questi saggi sono eutanasia per determinare il carico virale, aumentando così il numero di animali necessari per completare questi studi26. Per aggirare tutte queste limitazioni, molti ricercatori si affidano all'uso di IAV ricombinanti, competenti e giornalistici, in grado di accelerare i saggi virologici e rilevare il carico virale e la diffusione in tempo reale26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. È importante sottolineare che questi IAV che esprimono i reporter sono in grado di replicarsi in modo simile agli IAV wild-type (WT) nella coltura cellulare e nei modelli animali di infezione33,42.
Le proteine fluorescenti e bioluminescenti sono due sistemi di reporter comunemente utilizzati dai ricercatori a causa della loro sensibilità, stabilità e facilità d'uso. Inoltre, c'è un enorme supporto e progresso nelle tecnologie di rilevamento delle proteine fluorescenti e bioluminescenti43,44,45,46,47,48 . Le proteine fluorescenti e le luciferasi hanno proprietà diverse che permettono loro di brillare, in particolare diverse per quanto vengono generati gli stati eccitati e come viene rilevata l'emettitore43,44,45, 46,47,48. Le proteine fluorescenti sono prima eccitate assorbendo energia, che viene successivamente rilasciata come luce a una diversa lunghezza d'onda come le molecole diminuiscono a uno stato di energia inferiore43. D'altra parte, la bioluminescenza è derivata da una reazione esotermica chimica che coinvolge un substrato, ossigeno, e talvolta ATP al fine di produrre luce45. A causa delle diverse proprietà di questi due tipi di proteine reporter, uno forse più vantaggioso dell'altro a seconda dello studio di interesse. Mentre le proteine fluorescenti sono ampiamente utilizzate per osservare la localizzazione cellulare28,41, i loro segnali in vivo hanno un'intensità inadeguata e sono spesso oscurati dall'autofluorescenza nei tessuti vivi49. Pertanto, i ricercatori si basano su luciferasi per valutare la dinamica virale negli organismi vivi, anche se le proteine fluorescenti possono essere preferite per gli studi ex vivo50,51,52,53. A differenza delle proteine fluorescenti, le luciferasi sono più convenienti per gli studi in vivo e più applicabili negli approcci non invasivi26,27,28,29,30 , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34 Mi lasa , 35 Mi lasa , 36 Mi lasa , 37 Mi lasa' di , 38 Mi lasa , 39 mila: l'altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 54.In ultima analisi, sulla base del tipo di studio, i ricercatori devono scegliere tra l'uso di una proteina fluorescente o lucidferasi come loro lettura, che sottopone il loro studio a un compromesso di funzionalità e sensibilità, e gravemente limita l'utilità dei virus del reporter ricombinante. Inoltre, vi sono preoccupazioni circa la correlazione tra l'espressione di diversi geni reporter utilizzando sistemi di fluorescenza o luciferasi e la replica o diffusione virale, che potrebbe compromettere l'interpretazione dei dati ottenuti con giornalisti che esprimono IAV.
Abbiamo superato questa limitazione generando una replica ricombinante-competente Bi-reporter IAV (BIRFLU) che codifica sia per una proteina fluorescente e una lucidferasi nello stesso genoma virale55 (Figura 1). Qui, NanoLuc luciferate (Nluc), una piccola e luminosa proteina bioluminescente48, è stata inserita a monte della sequenza di emagglutinina (HA) nel segmento HA virale dell'influenza A/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Inoltre, Venere, una proteina fluorescente monomerica di uso frequente, è stata inserita nel segmento virale non strutturale (NS)32,33,36,41,55. Poiché BIRFLU codifica per geni di reporter fluorescenti e luciferasi, il segnale proteico del reporter può essere utilizzato come lettura per determinare la replicazione virale e la diffusione in vitro o in vivo55. Ulteriori informazioni riguardanti la generazione e la caratterizzazione in vitro o in vivo di BIRFLU sono reperibili nella nostra recente pubblicazione55. BIRFLU può essere utilizzato per testare l'efficacia dei farmaci antivirali o neutralizzare gli anticorpi attraverso un nuovo test di microneutralizzazione fluorescente e bioluminescente55. Inoltre, BIRFLU può essere utilizzato anche per valutare la dinamica virale in un modello murino di infezione55. In questo manoscritto vengono descritte le procedure per caratterizzare BIRFLU55 in vitro e come studiare l'infezione da CANNAFLU nei topi utilizzando sistemi di imaging della luminescenza in vivo per l'individuazione di Nluc in vivo o di Venere ex vivo.
La combinazione di tecniche all'avanguardia in biologia molecolare, ricerca animale e tecnologie di imaging, offre ai ricercatori l'opportunità unica di utilizzare BIRFLU per la ricerca IAV, compreso lo studio delle interazioni virus-ospite, le dinamiche dell'infezione virale; lo sviluppo di nuovi approcci vaccinali per il trattamento terapeutico delle infezioni da IAV o il potenziale uso di IAV come vettore di vaccino per il trattamento di altre infezioni patogene.
Protocol
Tutti i protocolli che coinvolgono i topi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e dal Institutional Biosafety Committee (IBC) dell'Università di Rochester, della School of Medicine and Dentistry. Tutti gli esperimenti effettuati sugli animali seguono le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio Nazionale delle Ricerche58. Il Vivarium and Division of Laboratory Animal Medicine presso la School of Medicine and Dentistry dell'Università di Rochester è accreditato dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura animale di laboratorio (AALAC) internazionale e conformità alle leggi federali e statali e alla politica dei National Institutes of Health (NIH). Quando si lavora con i mouse, è necessaria una corretta attrezzatura per la protezione personale (PPE). Politiche e requisiti simili dovrebbero essere attuati quando si eseguono esperimenti delineati all'interno di questo manoscritto in ogni istituzione.
1. Uso di piccoli animali vertebrati
- Acquistare da cinque a sette settimane di topi femminili BALB/c e mantenerli nell'impianto di cura degli animali in condizioni specifiche prive di agenti patogeni. All'arrivo dei topi nelle strutture determinate, consentire il periodo di riposo per 4-5 giorni per consentire agli animali di abituarsi al nuovo ambiente.
- Seguendo i protocolli IACUC, posizionare un massimo di 5 topi per gabbia.
NOT: A conclusione dell'esperimento, al fine di garantire che l'animale sia morto, i topi sono stati eutanasia utilizzando due procedure approvate, tenendo conto che il secondo deve essere un metodo fisico. In questo studio, dopo l'infezione da topi da BIRFLU e l'imaging in vivo, gli animali sono eutanasiati con una dose letale di 2,2,2 tribromoetanolo (TBE), e tagliando la vena epatica come metodo secondario fisico come abbiamo precedentemente mostrato23.
2. Biosicurezza
NOT: In questo manoscritto, BIRFLU è stato generato nella spina dorsale dell'influenza A/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8), che è un laboratorio comune adattato al topo IAV ceppo IAV23,32,33,56. Il virus è stato generato utilizzando approcci di genetica inversa basati su plasmide descritte in precedenza e una descrizione completa della generazione, e la caratterizzazione in vitro e in vivo di BIRFLU può essere trovata nella nostra recente pubblicazione55. Tutte le procedure che comportano infezioni da IAV (in vitro o in vivo) sono state eseguite in un armadio di sicurezza biologica in condizioni di livello di biosicurezza (BSL)-2.
ATTENZIONE: Un adeguato livello di biosicurezza dovrebbe essere determinato in conformità con una valutazione del rischio di biosicurezza. Ulteriori informazioni sull'esecuzione di valutazioni del rischio di biosicurezza e sulla definizione di un efficace contenimento della biosicurezza dovrebbero essere consultate con l'istituzione in cui verranno effettuati gli esperimenti.
- Pulire gli armadi di biosicurezza con il 70% di disinfettante di biossido di etanolo o cloro prima e dopo aver eseguito tutte le procedure sperimentali. Per il lavoro sui topi, sterilizzare tutto il materiale di dissezione (forbici, pinze dissetanti, ecc.) e l'omogenizzatore Dounce prima e dopo il loro uso.
- Eliminare tutto il materiale biologico prodotto durante le procedure in base alle opportune linee guida IBC e IACUC.
3. Caratterizzazione in vitro di BIRFLU (Figura 2)
NOT: Fare riferimento alla tabella 1 per tutte le composizioni di buffer e multimediali.
- Analizzare l'espressione proteica per fluorescenza (Figura 2A) e immunofluorescenza indiretta (Figura 2B)
- Un giorno prima dell'infezione, seme 24-podi con cellule epiteliali Madin-Darby Canine Rene (MDCK) (1 x 105 cellule / bene, triplicati) nei mezzi di coltura dei tessuti e mantenere le piastre in un incubatore di 37 gradi centigradi con 5% di CO2. Preparare abbastanza pozzi per valutare tutti gli anticorpi scelti sia nelle cellule infette finte che in QUELLI infettate da BIRFLU.
NOT: Si consiglia di visualizzare le cellule al microscopio leggero per confermare un monostrato prima di iniziare l'infezione virale. Si raccomanda un mostratostratore di confluenza del 90% delle cellule MDCK al momento dell'infezione. - Preparare diluizioni di WT o BIRFLU IAv Nei mezzi di infezione e infettare le cellule MDCK semi con una molteplicità di infezione (MOI) di 0,1 unità di formazione di placca (PFU) per cellula in un volume finale di 0,25 mL/pozzetto di mezzi di infezione.
- Rimuovere il mezzo di coltura dei tessuti dal passaggio 3.1.1 e lavare due volte le cellule MDCK con 1x salina con buffer fosfato (PBS). Aggiungere le diluizioni del virus da 3.1.2 alle cellule MDCK e posizionare le piastre su una piattaforma a dondolo per 1 h a temperatura ambiente per consentire l'adsorbimento virale.
NOT: Le cellule infettate vengono incubate solo con mezzi di infezione in assenza di virus. - Dopo l'adsorbimento virale (passaggio 3.1.3), rimuovere l'inoculum virale per aspirazione e aggiungere 1 mL di supporti post-infezione contenenti 1 g/mL di prove trattate con TPCK ad ogni pozzo. Incubare le cellule per 18 h in un'incubatrice umidificata di CO2 del 5% a 33 gradi centigradi.
- Dopo 18 h di infezione, rimuovere la coltura dei tessuti supernatant dalle piastre 24-bene (3.1.4). Fissare e permeabilizzare le cellule con 0,25 mL/pozzetto di soluzione di fissazione/permeabilizzazione per 20 min a temperatura ambiente.
NOT: Preparare la soluzione di fissazione/permeabilizzazione in una cappa di fumi per prevenire l'esposizione alla formaldeide. - Rimuovere la soluzione di fissazione/permeabilizzazione dal passaggio 3.1.5, lavare le cellule due volte con 1x PBS e incubare le cellule con 0,25 mL/pozzetto di soluzione di blocco per 1 h a temperatura ambiente.
NOT: Procedere al passaggio successivo o conservare le celle in soluzione di blocco a 4 gradi centigradi durante la notte. - Rimuovere la soluzione di blocco (passaggio 3.1.6) e aggiungere 0,25 mL/pozze (1 g/mL) di un anticorpo monoclonale del topo (MAb) contro il nucleoproteina IAV, NP (HB-65) o una diluizione di 1:1,000 di un anticorpo policlonale del coniglio (pAb) contro NLuc (vedere la Tabella dei Materiali), entrambi diluiti in soluzione di diluizione anticorpale (1x PBS, 2,5% BSA) e incubano le cellule per 1 h a 37 .
- Rimuovere l'anticorpo primario dal passaggio 3.1.7, lavare le cellule tre volte con 1x PBS e incubarle con 0,25 mL/pozzetto di un anti-tono coniugato Texas Red o anti-coniglio anticorpi secondari (vedi Tabella dei materiali) diluito 1:200 nell'anticorpo soluzione di diluizione.
NOT: I nuclei cellulari possono essere macchiati allo stesso tempo aggiungendo 0,5 g/mL di 4',6'-diamidino-2-fenilondoma (DAPI) alla stessa soluzione anticorpale secondaria. Incubare le cellule per 1 h a 37 gradi centigradi al buio. Possono essere utilizzati altri anticorpi secondari coniugati con altri fluorofori. - Rimuovere l'anticorpo secondario e DAPI dal passaggio 3.1.8, lavare le cellule tre volte con 1x PBS. Dopo il lavaggio, lasciare le cellule in 0,25 mL/pozzetto di 1x PBS.
- Posizionare la piastra sullo stage di un microscopio a fluorescenza per rilevare l'espressione dei reporter di Venere e Nluc, e NP da cellule infette utilizzando i filtri fluorescenti appropriati. Acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza (ingrandimento 20x) e unirle utilizzando un software di modifica delle immagini (Figura 2A, B).
- Un giorno prima dell'infezione, seme 24-podi con cellule epiteliali Madin-Darby Canine Rene (MDCK) (1 x 105 cellule / bene, triplicati) nei mezzi di coltura dei tessuti e mantenere le piastre in un incubatore di 37 gradi centigradi con 5% di CO2. Preparare abbastanza pozzi per valutare tutti gli anticorpi scelti sia nelle cellule infette finte che in QUELLI infettate da BIRFLU.
- Analizzare l'attività di Nluc (Figura 2C) e la replica virale (Figura 2D).
- Un giorno prima dell'infezione, seme piastre di 12 pozze con cellule MDCK (2 x 105cellule / pozzo, triplicati) utilizzando mezzi di coltura tissutale in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per raggiungere circa il 90% di confluenza al momento dell'infezione.
NOT: Prima dell'infezione, controllare le cellule al microscopio per verificare un monostrato di cellule MDCK. - Il giorno dell'infezione prepara le diluizioni dei virus WT e BIRFLU nei media di infezione per infettare le cellule MDCK (passaggio 3.2.1.) in triplice con un MOI di 0,001 PFU in 0,5 mL/pozzo. Rimuovere il mezzo di coltura dei tessuti e lavare due volte le cellule MDCK con 1x PBS.
- Aggiungere le diluizioni del virus ai monostrati MDCK e consentire l'adsorbimento virale a temperatura ambiente per 1 h su una piattaforma a dondolo. Dopo l'adsorbimento virale, rimuovere l'inoculum del virus e aggiungere 1,5 mL di supporti post-infezione contenenti 1 g/mL di tripsina trattata t. , ad ogni pozzo. Incubare le cellule infette in un'incubatrice umidificata del 5% di CO2 a 33 gradi centigradi e raccogliere i supernatanti nei punti temporali indicati al punto 3.2.4.
- A 24, 48, 72 e 96 h dopo l'infezione (p.i.) raccogliere 150 -L di coltura tissutale da ogni pozzo e conservare i campioni in un tubo di microcentrifuga a -80 gradi centigradi per eseguire i saggi Nluc e titrazioni virali.
- Per eseguire il saggio di attività Nluc, seguire le indicazioni del produttore. In primo luogo, scongelare il supernatante della coltura tissutale immagazzinato a -80 gradi centigradi (passaggio 3.2.4) sul ghiaccio.
NOT: Fare riferimento alle raccomandazioni del produttore e ottimizzare il saggio, se necessario. - Preparare la soluzione di analisi luciferasi (si veda la Tabella deiMateriali) diluindo il substrato Nluc 1:50 con il buffer di diluizione. In una micropiastra bianca a 96 pozze per i saggi luciferali, mescolare 25 - L di soluzione di assaggio luciferase con da 10 a 25 l dei campioni supernatanti della coltura dei tessuti raccolti. Incubare il mix per 2-3 min prima di misurare la luminescenza utilizzando un luminometro (Figura 2C).
NOT: La presenza di particelle virali infettive nei supernatanti di coltura tissutale è determinata dall'analisi a fuoco fluorescenza immuno-focus (Venere) o dall'immunofluorescenza indiretta (colorazione dell'antigene virale) come descritto in precedenza23,32, 33,56. - Un giorno prima delle titrazioni virali, le cellule MDCK dei semi in una piastra di 96 pozzetti (2 x 104 cellule/pozzo, triplicati) con mezzi di coltura tissutale e permettono alle cellule di raggiungere il 90% di confluenza al momento dell'infezione in un'incubatrice impostata a 37 gradi centigradi con 5% di CO2.
- Utilizzare i campioni supernatanti della coltura dei tessuti che sono stati scongelati sul ghiaccio (passaggio 3.2.4.). Aggiungete 90 l di supporti di infezione a ciascuno dei pozze in una nuova piastra di 96 pozze, quindi aggiungete 10 l della coltura dei tessuti scongelati (passaggio 3.2.4) al primo pozzo (riga A). Utilizzare un pipet multicanale per mescolare e trasferire 10 l- dalla riga A alla riga B. Modificare le punte tra le diluizioni e mescolare bene.
NOT: Questa procedura deve essere ripetuta fino all'ultima riga (H). Si consiglia di eseguire titrations virali in triplicati per una misura accurata dei più urlatori virali. - Rimuovere il mezzo di coltura dei tessuti dalle cellule MDCK nelle piastre del pozzo 96 (passaggio 3.2.7) e lavare due volte con 1x PBS. Aggiungere 50 - L delle diluizioni supernatent della piastra replica 96-well contenente le diluizioni del virus (passaggio 3.2.8) a ogni pozzetto nella piastra di 96 pozze contenenti cellule MDCK.
- Incubare la piastra da 96 pozzetti su una piattaforma a dondolo per 1 h a temperatura ambiente per consentire l'adsordimento virale. Dopo l'adsorbimento virale, rimuovere l'inoculum e aggiungere 100 l/po di supporti post-infezione contenenti 1 g/mL di prove trattate con TPCK. Incubare le cellule infette per 12 h in un'incubatrice a 33 gradi centigradi con il 5% di CO2.
- Poiché BIRFLU esprime Venere, il numero di cellule infette può essere contato direttamente utilizzando un microscopio a fluorescenza. In alternativa, i titer virali possono essere determinati dall'immunofluorescenza indiretta come descritto in precedenza utilizzando un anticorpo contro una proteina virale23,56,57,59. Per quest'ultimo, procedere alla correzione/permeabilizzare le cellule e macchiare utilizzando il mAb HB-65 anti-NP come descritto nella sezione 4.4.
- Determinare i titori virali contando il numero di unità fluorescenti formanti (FFU)/mL utilizzando la formula: ((numero di FFU) x 20 x 1/diluizione (Figura 2D).
- Un giorno prima dell'infezione, seme piastre di 12 pozze con cellule MDCK (2 x 105cellule / pozzo, triplicati) utilizzando mezzi di coltura tissutale in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per raggiungere circa il 90% di confluenza al momento dell'infezione.
4. Caratterizzazione in vivo di BIRFLU (Figura 3 e Figura 4)
- Infezione del topo
NOTA: L'infezione intranasale dei topi è stata eseguita come descritto in precedenza23. Per un protocollo più dettagliato di infezione Da IAV in vivo utilizzando il modello murino di infezione, si consiglia di visualizzare il video associato alla precedente pubblicazione23. Questa sezione riepiloga solo i passaggi necessari per l'infezione da topo con BIRFLU.- Ispezionare i topi per valutare la loro salute e l'aspetto fisico generale. Preparare la diluizione di BIRFLU in 1x PBS per inoculare i topi con 1 x 106 PFU di BIRFLU in un volume totale di 30 l/topo. Mantenere il virus sul ghiaccio fino all'inoculazione del topo.
NOT: I topi infetti (1x PBS) saranno necessari come controllo interno per l'imaging. Collocare topi infetti in modo fittizio in una gabbia diversa rispetto agli animali infettati da BIRFLU. - Anestesizzare i topi BALB/c femminili di cinque-sette settimane intraperitonealmente con 240-250 mg/kg di tribromoetanolo (TBE) inserendo l'ago nel caudale 2/3 del lato destro dell'addome. Quindi, riportare il mouse alla gabbia e attendere circa 5 min. Verificare che il mouse sia anetizzato prima dell'inoculazione del virus in base all'assenza del riflesso del pizzico.
NOT: Si raccomandano sedativi iniettabili rispetto ai sedativi inalati per le infezioni influenzali in vivo, in quanto questi ultimi possono modificare il comportamento e l'assorbimento del virus mediante l'epitelio delle vie aeree. Inoltre, possono anche influenzare le risposte immunitarie locali del polmone e interferire con l'imaging in vivo dei topi infetti. Infine, i sedativi inalati hanno ridotto la durata dell'effetto, il che sarebbe un problema per l'imaging in vivo degli animali infetti. - Inoculare i topi intranasalmente con i 30 litri della diluizione BIRFLU preparata. Verificare che i topi respirino correttamente prima di restituirli alla gabbia.
- Ispezionare i topi per valutare la loro salute e l'aspetto fisico generale. Preparare la diluizione di BIRFLU in 1x PBS per inoculare i topi con 1 x 106 PFU di BIRFLU in un volume totale di 30 l/topo. Mantenere il virus sul ghiaccio fino all'inoculazione del topo.
- Monitoraggio della bioluminescenza dei topi infetti da BIRFLU (Figura 4A)
NOTA: In questo manoscritto espressione reporter di Nluc o Venere e la replica virale nei polmoni di topi infettati con BIRFLU sono determinati a 3 giorni dopo l'infezione. Tuttavia, la natura dell'imaging a bioluminescenza consente un monitoraggio ripetuto dell'espressione di Nluc nei singoli animali infettati da BIRFLU senza la necessità di eutanasia per ogni punto di tempo sperimentale. Per eseguire le procedure sperimentali descritte è necessario un sistema di imaging in vivo con anestesia isoflurana. Consultare la Tabella dei materiali per informazioni dettagliate sullo strumento di imaging e sul software di immagine utilizzato per l'acquisizione e l'analisi dei dati.- Rasare il torace dei topi per migliorare il segnale di bioluminescenza. Aprire il software di imaging e premere Initialize. Successivamente, impostare i parametri che verranno utilizzati, tra cui l'impostazione della modalità di imaging su bioluminescenza, salvataggio automatico, tempo di esposizione ad auto, filtro aperto, ecc.
- Una volta che la macchina è completamente inizializzata, attivare il sistema di anestesia isoflurane. Posizionare gli animali nella camera di anestesia. I topi sono contemporaneamente e leggermente anestesizzati con una miscela di gas di ossigeno e vaporizzati 1-2% isoflurane.
- Una volta che i topi sono anestesizzati, somministrare il substrato Nluc (vedi Tabella deiMateriali) diluito 1:10 in 1x PBS (volume finale 100 L/mouse) tramite percorso retroorbitale utilizzando una siringa con un ago da 22 G.
- Subito dopo la somministrazione del reagente di Nluc, posizionare gli animali nello strumento di imaging con il petto rivolto verso l'alto e muso all'interno del collettore per mantenere l'anestesizzata animale durante l'imaging. Subito dopo aver chiuso lo sportello dell'immagine, fare clic su Acquisisci nel programma software (Figura 4A, top).
- Dopo l'imaging, riportare i topi alle loro gabbie monitorandoli fino a quando non si sono completamente ripresi e spegnere il vaporizzatore dell'isoflurane. Quindi, procedere con l'imaging ex vivo dei polmoni topi per valutare l'espressione genica del reporter Venus (sezione 4.3).
- Utilizzare gli strumenti software di imaging per analizzare i dati di bioluminescenza acquisiti. Utilizzare lo strumento ROI (regione di interesse) per designare il segnale specifico ed eseguire misurazioni del flusso nella regione di interesse (di solito intorno al torace) (Figura 4A, fondo). Sebbene la forma del ROI sia irrilevante, i ROI più grandi sono generalmente preferiti per catturare l'intera area di diffusione del segnale.
- Fare clic su Misura. Valutare la bioluminescenza nei fotoni in quanto fornisce una misurazione assoluta dell'emissione di fotoni paragonabile alle misurazioni di output fornite da diversi parametri o strumenti di imaging.
- Analisi della fluorescenza nei topi infettati da BIRFLU (Figura 3 e Figura 4B)
- Raccogliere i polmoni del topo dopo l'imaging in vivo, come descritto in precedenza23.
- In breve, eutanasia topi con una dose letale di TBE (500 mg/kg). Disinfettare il sito di incisione con il 70% di etanolo. Con un bisturi, fare un'incisione dallo sterno alla base dell'addome e quindi tagliare dal fondo dell'incisione ai lati con le forbici. Successivamente, tagliare la vena epatica (secondo metodo di eutanasia fisica) per sanguinare l'animale.
NOT: Per evitare un segnale di fondo elevato durante l'imaging, è importante ridurre al minimo la quantità di sangue nei polmoni (vedi sotto).
- In breve, eutanasia topi con una dose letale di TBE (500 mg/kg). Disinfettare il sito di incisione con il 70% di etanolo. Con un bisturi, fare un'incisione dallo sterno alla base dell'addome e quindi tagliare dal fondo dell'incisione ai lati con le forbici. Successivamente, tagliare la vena epatica (secondo metodo di eutanasia fisica) per sanguinare l'animale.
- Posizionare il topo dorsale in recumbency, e utilizzare le forbici per tagliare la pleura e aprire la gabbia toracica. Successivamente, rimuovere i polmoni snipping l'estremità della trachea con le forbici tenendo delicatamente i polmoni con pinze.
- Mettere i polmoni in una piastra a sei pozze con 2 mL di 1x PBS e lavare i polmoni tre volte con 1x PBS.
NOT: Per evitare la contaminazione tra i campioni, pulire e disinfettare gli strumenti di dissezione tra ogni animale.
- Mettere i polmoni in una piastra a sei pozze con 2 mL di 1x PBS e lavare i polmoni tre volte con 1x PBS.
- Avviare il software di acquisizione delle immagini facendo clic su inizializza e impostare i parametri per l'imaging, tra cui l'impostazione della modalità di imaging per la fluorescenza, il salvataggio automatico, il tempo di esposizione ad auto, l'eccitazione (500 nm) e i filtri di emissione (540 nm).
- Quando la macchina viene inizializzata, posizionare i polmoni in un vassoio di sfondo nero, assicurandosi che i tessuti siano separati l'uno dall'altro, introdurre il vassoio nell'imager e fare clic su Acquisisci nel programma del sistema di imaging dopo aver chiuso la porta dell'imager ( Figura 4B, superiore).
- Dopo l'imaging, rimuovere immediatamente i tessuti e conservarli sul ghiaccio (4 gradi centigradi) se i campioni vengono elaborati lo stesso giorno; o su un tubo e ghiaccio secco per congelarli rapidamente, prima di conservarli a -80 gradi centigradi, se i campioni verranno elaborati in un secondo momento.
- Per l'elaborazione delle immagini, selezionare lo strumento ROI e disegnare roi intorno a ciascuno dei singoli polmoni. Fare clic su Misura. Quindi, utilizzando le misurazioni medie dell'efficienza radiante risultanti, sottrarre i valori dai topi infetti in modo fittizio (Figura 4B, in basso).
NOTA: Con BIRFLU, c'è una buona correlazione tra i livelli di espressione di Nluc e Venere e la distribuzione del segnale. Pertanto, è importante analizzare Nluc (topo intero) e Venere (polmoni accisati) espressione dallo stesso animale, e mantenere lo stesso orientamento.
- Raccogliere i polmoni del topo dopo l'imaging in vivo, come descritto in precedenza23.
- Valutazione della replica BIRFLU nei polmoni di topi (Figura 3 e Figura 4C)
- Omogeneizzare i polmoni topi per la titolazione virale con un saggio placca, come descritto in precedenza23.
- Collocare i polmoni in un omogeneizzatore Dounce con 1 mL di mezzi di infezione refrigerati. Omogeneizzare i polmoni con il pestello per 1 min a temperatura ambiente fino a quando non si è completamente disintegrato e conservare i campioni in un tubo sterile a 4 gradi centigradi.
- Centrifugare i campioni a 300 x g per 10 min e raccogliere il supernatante in un tubo sterile. Conservare i campioni sul ghiaccio se saranno utilizzati nello stesso giorno o congelarli a -80 gradi centigradi per valutare i dispositivi virali in un secondo momento.
NOT: Per ogni campione polmonare deve essere utilizzato un nuovo omogeneizzatore Dounce. - Per eseguire il saggio della placca, il giorno prima di eseguire la titolazione virale, semi a sei pozzetti con cellule MDCK (5 x 105 cellule / bene) nei media di coltura dei tessuti. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per raggiungere il 90% di confluenza il giorno successivo. Prima dell'infezione, verificare che le cellule formino un monostrato al microscopio leggero.
- Preparare 1:10 diluizioni seriali del super-natant dai campioni omogeneizzati (passaggio 4.4.1) nei mezzi di infezione. Preparare i tubi di microcentrifuga con 540 gradi l di supporti di infezione, aggiungere 60 -L dal campione polmonare omogeneizzato al primo tubo, mescolare convogliando su e giù, e quindi utilizzando una nuova punta, trasferire 60 gradi al tubo successivo. Ripetere questo processo di diluizione seriale fino all'ultima diluizione.
NOT: Nella nostra esperienza 7 diluizioni sono sufficienti per determinare i titers virali per saggio placca dai polmoni dei topi infetti. - Lavare due volte le cellule MDCK (passo 4.4.3) con 1x PBS e trasferire 500 l dei campioni diluiti in serie in ciascuno dei pozzi della piastra a sei pozze. Posizionare le piastre su una piattaforma a dondolo e consentire l'assorbimento virale per 1 h a temperatura ambiente.
- Dopo 1 h di assorbimento virale, rimuovere l'inoculo virale, aggiungere 2 mL/pozza di mezzo sovrapposto contenente 1 g/mL di prove tagorate TPCK, quindi incubare le cellule a 33 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 per 3 giorni.
- Fissare le cellule infette (passaggio 4.4.6) con 1 mL/pozzetto del 4% di formaldeide diluito in 1x PBS a temperatura ambiente per 2 h, quindi rimuovere con attenzione il mezzo di sovrapposizione e aggiungere 1 mL di 1x PBS ad ogni pozzo. Per la visualizzazione di Venere, immagini le piastre a sei pozze con un sistema di imaging per il rilevamento della fluorescenza.
NOT: Le placche virali possono essere colorate utilizzando un software di editing delle immagini (vedere la Tabella dei Materiali). - Per valutare l'espressione di Nluc, visualizzare le placche virali immunostaining utilizzando un anti-Nluc pAb. Per questo, rimuovere le celle 1x PBS, permeabilizzare utilizzando 0,5 mL/pozze di soluzione di permeabilizzazione per 15 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione, lavare le cellule tre volte con 1x PBS e bloccare con 0,5 mL/pozze di soluzione di blocco per 1 h a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di blocco dal passaggio 4.4.9 e incubare le cellule con 0,5 mL/pozzetto del pAb anti-Nluc diluito 1:1.000 in soluzione di diluizione per 1 h a 37 .
- Utilizzare il kit ABC Alkaline Phosphatase e DAB Peroxidase Substrate Kit seguendo le raccomandazioni del produttore per la visualizzazione di placche che esprimeNo Nluc.
- In breve, lavare le cellule da 4,4,10 tre volte con 1x PBS e incubarle con 0,5 mL/pozze di anticorpo secondario biotinylato anti-coniglio per 1 h a 37 gradi centigradi.
- Rimuovere l'anticorpo secondario, lavare le cellule tre volte con 1x PBS e incubare con la soluzione ABC per 1 h a 37 gradi centigradi. Lavare le cellule tre volte con 1x PBS e visualizzare le placche virali con il kit substrato DAB HRP. Scansiona le placche immunosinate utilizzando uno scanner convenzionale.
NOT: Potrebbero essere utilizzati altri kit simili per l'immunostaining.
- Macchiare le placche virali con soluzione viola di cristallo per 1 h a temperatura ambiente. Scartare il viola cristallo, lavare le piastre tre volte con acqua, lasciare che le piastre ad asciugare, e la scansione delle piastre di nuovo.
- Per determinare i feticidi virali, contare le placche rivelate dopo la colorazione viola di cristallo. Eseguire la scansione delle placche utilizzando uno scanner convenzionale. Calcolare il titro dei virus come unità di formazione di placche (PFU) per mL (PFU/mL).
- Per valutare la stabilità BIRFLU in vivo, calcolare la percentuale di virus che esprimono i reporter contando il numero di placche color viola cristallino (numero di virus infettivi, passo 4.4.12) e confrontarle con il numero di placche che esprime Venere e Nluc ( rispettivamente 4.4.7 e 4.4.11).
- Centrifugare i campioni a 300 x g per 10 min e raccogliere il supernatante in un tubo sterile. Conservare i campioni sul ghiaccio se saranno utilizzati nello stesso giorno o congelarli a -80 gradi centigradi per valutare i dispositivi virali in un secondo momento.
Representative Results
Generazione e caratterizzazione di BIRFLU in vitro (Figura 1 e Figura 2)
Un IAV ricombinante che esprime due diversi geni reporter (BIRFLU) è stato costruito utilizzando tecniche di biologia molecolare allo stato dell'arte e tecniche di genetica inversa basate sul plasmide (Figura 1). Qui, abbiamo scelto di utilizzare Nluc a causa di diversi vantaggi rispetto ad altre luciferasi, tra cui le sue piccole dimensioni, indipendenza ATP, maggiore intensità, e substrato ottimizzato48,60. Nluc è stato clonato nel segmento HA di IAV PR8 seguito dal sito di scissione porcine (PTV) 2A (2A) di fronte al telaio di lettura aperto (ORF) di HA (Figura1). L'ORF di HA includeva mutazioni silenziose per rimuovere i segnali di imballaggio originali ed evitare ogni possibile ricombinazione. Il segnale completo di imballaggio HA è stato aggiunto di fronte a Nluc per consentire una corretta incorporazione del segmento HA modificato nel virione e Nluc e l'espressione HA dallo stesso segmento di RNA virale (Figura 1). Inoltre, la proteina fluorescente Venere è stata clonata in un segmento IAV PR8 NS modificato che codifica le due proteine virali NS1 e NEP da una singola trascrizione32,36,41,54, 57. A tal fine, Venere è stata fusa al terminale C di NS1 e l'intero NEP ORF è stato clonato a valle del sito di scissione PTV 2A che è stato collocato tra le sequenze NS1-Venus e NEP (Figura 1). In definitiva, questi due costrutti di plasmide virali HA e NS modificati sono stati utilizzati in combinazione con il resto dei plasmidi di genetica inversa di IAV PR8 per generare BIRFLU (Figura 1). La caratterizzazione in vitro e in vivo di BIRFLU è stata descritta in precedenza55.
Nella Figura 2, abbiamo caratterizzato in vitro BIRFLU determinando i livelli di espressione di Venere, Nluc e NP utilizzando la fluorescenza e gli approcci di immunofluorescenza indiretta ( Figura2A, B). I monostrati confluenti delle cellule MDCK sono stati infettati o infetti (MOI 0.1) con virus WT o BIRFLU PR8 e, a 18 h dopo l'infezione, L'espressione di Venere è stata valutata direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza (Figura2A,B). L'espressione di Nluc (Figura 2A) e NP (Figura 2B) sono state visualizzate con immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi specifici per ogni proteina. Come previsto, l'espressione di Venere e Nluc è stata rilevata solo nelle cellule infettate da BIRFLU e non nelle cellule infettate dal virus WT PR8. Inoltre, la microscopia indiretta immunofluorescenza ha rivelato l'espressione NP nelle cellule infettate da WT e BIRFLU PR8. Nessuna espressione di Venere, Nluc o NP è stata rilevata, come previsto, in cellule infettate (Figura A,B).
Per valutare i livelli di espressione di Nluc in vitro, le cellule MDCK sono state infettate (MOI 0.001) con virus WT o BIRFLU PR8 e l'attività di Nluc nei supernatanti di coltura dei tessuti è stata valutata a 24, 48, 72 e 96 h dopo l'infezione (Figura 2C). Solo l'attività di Nluc è stata rilevata nella coltura tissutale dei supernatanti MDCK infettati da BIRFLU (Figura 2C). L'attività di Nluc nella coltura tissutale supernatanti è stata rilevata già 24 h dopo l'infezione con livelli di espressione superiore a 96 h dopo l'infezione, molto probabilmente perché l'effetto citopatico (CPE) indotto durante l'infezione virale rilascia la proteina Nluc conservata nella cellula. Per valutare l'idoneità del BIRFLU nelle cellule coltivate, è stata valutata anche la cinetica di crescita dei virus WT e BIRFLU PR8 (Figura 2D) e la presenza di virus infettivi nei supernatanti della coltura dei tessuti è stata determinata dal saggio di messa a fuoco immunitaria (Figura2D ). In particolare, la cinetica di replicazione BIRFLU era paragonabile a quella del virus WT PR8, anche se la replicazione BIRFLU è stata leggermente ritardata e non ha raggiunto gli stessi titoti virali del WT PR8. Tuttavia, BIRFLU è stato in grado di raggiungere i destinatari di 5 x 107 PFU/mL (Figura 2D), indicando che l'espressione di due geni reporter nel genoma virale non interferisce in modo significativo con la replicazione di BIRFLU nelle cellule MDCK.
Monitoraggio dell'infezione da BIRFLU nei topi (Figura 3 e Figura 4)
La figura 3 è un diagramma di flusso schematico per la valutazione delle dinamiche BIRFLU in un modello murino di infezione da IAV. I topi femminili BALB/C di cinque-sette settimane sono stati infettati con 1x PBS o infettati da 1 x 106 PFU di BIRFLU per intranasaalmente. A 3 giorni dopo l'infezione, i topi sono stati anestesizzati con isoflurane e poi iniettati con Nluc substrato retroorbitale. Tutti i topi sono stati immediatamente posizionati nello strumento IVIS e il segnale Nluc è stato valutato in vivo utilizzando l'IVIS. Successivamente, i topi sono stati eutanasia e i polmoni sono stati raccolti. I polmoni eccitati sono stati poi analizzati ex vivo usando l'imager in vivo per determinare l'intensità della fluorescenza attraverso l'espressione di Venere. Infine, i polmoni dei topi sono stati omogeneizzati, e i titori virali e la stabilità sono stati determinati dal saggio placca. Le placche sono state valutate dalla fluorescenza diretta di Venere, immunostando utilizzando anticorpi specifici per Nluc e dalla colorazione viola di cristallo.
Gli IAV che esprimono in precedenza la replicazione-competente esprimono un singolo gene reporter, il più delle volte una proteina fluorescente o bioluminescente, come surrogato dell'infezione virale e della replicazione. Tuttavia, BIRFLU, è in grado di esprimere entrambi i tipi di geni reporter in base all'infezione virale. Per valutare la correlazione tra bioluminescenza (imaging in vivo) e fluorescenza (imaging ex vivo) dopo l'infezione da BIRFLU, i topi femminili BALB/c di cinque-sette settimane sono stati infettati con 1x PBS o inoculati con BIRFLU (106 PFU) intranasaalmente . L'attività di Nluc (Figura 4A) è stata valutata dalla somministrazione del substrato Nluc iniettato retroorbitalmente a 3 giorni dopo l'infezione utilizzando uno strumento di imaging in vivo. Abbiamo scelto di valutare la bioluminescenza al giorno 3 perché studi precedenti hanno indicato che la replica IAV, tra cui PR8, picchi tra i giorni 2 e 4 post-infezione24,54. La bioluminescenza è stata monitorata (Figura 4A, in alto) e utilizzata per calcolare il flusso totale medio (Flusso (log10 p/s) (Figura 4A, in basso). Come previsto, i topi inoculati con BIRFLU mostravano un'elevata attività di bioluminescenza, ma non è stato rilevato alcun segnale nei topi infetti finti. Successivamente, i polmoni dei top infetti sono stati raccolti e l'espressione di Venere è stata valutata utilizzando l'imaging ex vivo (Figura 4B, superiore). Inoltre, è stata calcolata l'efficienza radiante media a fluorescenza (Figura4B, fondo). I polmoni di topi eccitati sono stati omogeneizzati anche per determinare i titer virali e la stabilità genetica di BIRFLU in vivo (Figura 4C, D). La stabilità genetica di BIRFLU è stata analizzata attraverso il test della placca usando i virus isolati dai polmoni dei topi e dalla microscopia fluorescente (Venere, in alto), dall'immunostaining (Nluc, al centro) e dalla colorazione viola di cristallo (in basso). LA BIRFLU recuperata dai polmoni nei topi è stata in grado di formare placche ed esprime stabilmente entrambi i geni dei reporter (Figura 4C). In particolare, abbiamo osservato una buona correlazione tra bioluminescenza e segnali di fluorescenza con replicazione virale.
Figura 1: Rappresentazione schematica della struttura e del genoma Di IAV PR8 WT e BIRFLU. IAV sono circondati da un bistrato lipidico contenente le due principali lecoproteine virali hemagglutinin (HA; nero) e neuraminidase (NA; blu). IAV contengono otto segmenti di RNA a filamento singolo, senso negativo, RNA (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M e NS). Ogni segmento virale contiene regioni non codificanti (NCR) alle estremità 3' e 5' (scatole nere). Inoltre, alla fine 3 e 5 ' della fine degli RNA virali (v) sono i segnali di imballaggio, responsabili dell'efficiente encapsidazione dei vRNA in virioni nascenti (scatole bianche). IAV PR8 HA e NS segmenti virali e prodotti sono indicati in nero. Le sequenze di Nluc, Venere e PTV 2A sono indicate rispettivamente in strisce rosse, verdi e a strisce. È indicata anche la rappresentazione schematica dei segmenti HA e NS modificati che esprimono rispettivamente Nluc e Venere in BIRFLU. Questa cifra è stata adattata da Nogales et al.55. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: caratterizzazione in vitro di BIRFLU. (A, B) Analisi dell'espressione proteica per fluorescenza diretta e immunofluorescenza. Le cellule MDCK sono state infettate o infettate (MOI 0.1) da virus PR8 WT o BIRFLU. Le cellule infette sono state fissate a 18 h dopo l'infezione per visualizzare direttamente l'espressione di Venere mediante microscopia fluorescente diretta e per visualizzare l'espressione di Nluc (A) e NP virale (B)utilizzando anticorpi specifici e immunofluorescenza indiretta. Nuclei sono stati macchiati con DAPI. Vengono visualizzate immagini rappresentative (20 volte l'ingrandimento). Barre della scala: 100 m. (C, D) Cinetica di crescita di PR8 WT e BIRFLU. L'attività di Nluc (C) e i titori virali (D) nei supernatanti della coltura tissutale provenienti da cellule MDCK infettate (MOI 0.001) con virus WT e BIRFLU PR8 sono stati valutati nei periodi di post-infezione. I dati rappresentano la media : SD dei triplicati. I titer virali sono stati determinati dal saggio di messa a fuoco immunitaria (FFU/mL). La linea punteggiata indica il limite di rilevamento (200 FFU/ml). Questa cifra è stata adattata da Nogales et al.55. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentazione schematica per lo studio della CANNAFLU nei topi. Espressione dei geni reporter di Nluc e Venere è stata valutata in topi infetti da 1 x 106 PFU di CANNAFLU utilizzando immagini in vivo o ex vivo. In breve, il giorno 1, 5 a 7 settimana-vecchie topi BALB / c femminili sono stati simulati infettati (1x PBS) o inoculati con 1 x 106 PFU di BIRFLU intranasaalmente. Al giorno 3 post-infezione, i topi erano leggermente anestesizzati usando isoflurane e il substrato Nluc veniva iniettato retroorbitalmente. Il segnale Nluc è stato valutato direttamente utilizzando l'imaging in vivo. Subito dopo l'imaging, i topi sono stati eutanasia e l'espressione di Venere in polmoni interi ascisi è stata analizzata utilizzando l'imaging ex vivo. I polmelli murini recuperati sono stati omogeneizzati per valutare la replicazione virale e la stabilità mediante test di placca. Le frecce indicano la correlazione tra fluorescenza (Venere), immunostaining (Nluc) e colorazione viola di cristallo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Espressione di bioluminescenza e fluorescenza in vivo. Le femmine di quattro-sette settimane di topi BALB/c sono state infettate in modo mock-infetto (1x PBS) o inoculate con 1 x 106 PFU di BIRFLU intranasaalmente. Al giorno 3 dopo l'infezione, è stata determinata l'attività nluc (A) in tutto il mouse. Immagini rappresentative di un singolo mouse che mostrano la scala di radianza (p/sec/cm2/sr). Sono stati quantificati i valori di radianza della bioluminescenza e viene mostrato il flusso totale medio (Flusso (Log10 p/s). Dopo l'imaging di Nluc, i polmoni sono stati raccolti per l'imaging ex vivo (B). Vengono mostrate immagini rappresentative da polmoni interi. Per quantificare l'espressione di Venere, sono stati calcolati i valori medi delle regioni di interesse (ROI) in base alla auto-fluorescenza polmonare da topi infettati in modo fittizio. Per analizzare la stabilità genetica di BIRFLU in vivo, i virus recuperati dai polmoni dei topi sono stati analizzati mediante analisi della placca utilizzando la microscopia fluorescente (Venere, in alto), l'immunostaining (Nluc, al centro) e la colorazione viola cristallina (in basso) (C). Vengono visualizzate le immagini rappresentative da un solo mouse. Per valutare la replicazione dei virus, i polmoni interi sono stati omogeneizzati dopo l'imaging e utilizzati per infettare le cellule MDCK e determinare i titoli virali con un assaggio di placca (PFU/mL) (D). Le frecce indicano la correlazione tra fluorescenza (Venere), immunostaining (Nluc) e colorazione viola di cristallo. Le barre rappresentano la media : SD di titer virus polmonari. Questa cifra è stata adattata da Logales et al.55. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Media e soluzioni per la cultura dei tessuti | composizione | deposito | usare |
| Media di coltura dei tessuti: Il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM), il 10 % Siero Bovino Fetale (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin-L-glutamine (PSG) (DMEM 10 % FBS 1% PSG). | 445 ml DMEM, 50 mL di FBS e 5 mL di 100x PSG. | 4 gradi centigradi | Manutenzione delle cellule MDCK |
| Supporti post-infezione: DMEM 0.3% Albumina Bovina (BA), 1% PSG(DMEM 0.3% BA 1% PSG). | 491 ml DMEM, 4,2 ml di 35 % BA e 5 ml di 100x PSG | 4 gradi centigradi | Manutenzione delle cellule MDCK dopo l'infezione virale |
| 10 volte la salina memorizzata nel buffer del fosfato (PBS) | 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 11,5 g di Na2HPO4.7H2O, 2 g di KH2PO4. Aggiungere gg2O fino a 1 L. Regolare il pH a 7,3 | temperatura ambiente | Per preparare 1x PBS |
| 1x PBS | Diluire 10x PBS con ddH2O | temperatura ambiente | Lavare le cellule |
| Supporti di infezione: 1x PBS, 0,3% BA, 1% Penicillina-Streptomycin (PS) (PBS/BA/PS). | 487 mL 1x PBS sterile, 4,2 mL di 35% BA e 5 ml di 100x 1% PS(100 U/mL) | 4 gradi centigradi | Infezioni virali |
| Soluzione di fissaggio/permeabilizzazione: 4% formaldeide, 0,5% triton X-100 diluito in 1x PBS. | 400 mL neutro buffered formalina 10%, 5 ml di Triton X-100 e 595 mL di 1x PBS | temperatura ambiente | Correzione e permeabilizzazione delle cellule MDCK. |
| Soluzione di blocco: 2,5% Bovine Serum Albumin (BSA) in 1x PBS. | 2,5 g di BSA in 97,5 mL di 1x PBS | 4 gradi centigradi | Soluzione di blocco per immunofluorescenza e saggi di placca. |
| Soluzione di diluizione anticorpale (1% BSA in 1x PBS) | 1 g di BSA in 99 mL di 1x PBS | 4 gradi centigradi | Diluizione di anticorpi primari e secondari. |
| Soluzione viola cristallo 0.1% | 1 g di cristallo viola in 400 mL di metanolo. Aggiungere 600 ml di ddH2O | temperatura ambiente | Colorazione delle cellule MDCK nei saggi di placca. |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl cloromemethyl chetone (TPCK) -trattato trypsin | Preparare una soluzione di stock 1.000x a 1 mg/mL in ddH2O | -20 gradi centigradi | Per infezioni virali. |
Tabella 1: Media e soluzioni per la cultura dei tessuti.
Discussion
I ricercatori si sono affidati a virus ricombinanti che esprimono i virus come strumenti molecolari vitali per comprendere ed espandere l'attuale comprensione della replicazione virale e della patogenesi26,27,28, 29 del 22 221 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34 Mi lasa , 35 Mi lasa , 36 Mi lasa , 37 Mi lasa' di , 38 Mi lasa , 39 mila: l'altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 54. I geni reporter più comunemente favoriti sono le luciferasi e le proteine fluorescenti, principalmente a causa dei progressi tecnologici nella loro identificazione, nello sviluppo di varianti migliorate e nel rilevamento da parte delle tecnologie di imaging43 , 44 (di sistema) , 45 anni , 46 per quanto , 47 o , 48. I virus dei reporter ricombinanti sono spesso utilizzati per accelerare i saggi virologici, studiare le dinamiche dei virus in vitro e in vivo, e per testare l'efficacia degli approcci terapeutici e di vaccino attualmente approvati o nuovi,26, 27 ,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Purtroppo, nel caso dello IAV, gli studi passati sono stati limitati all'espressione di un singolo gene reporter, che ostacola il tipo di studio che potrebbe essere condotto 26,27,28,29 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34 Mi lasa , 35 Mi lasa , 36 Mi lasa , 37 Mi lasa' di , 38 Mi lasa , 39 mila: l'altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 54. Per evitare questa limitazione, abbiamo generato un bireporter competente alla replica Che esprime una luciferasi Nluc e una proteina fluorescente di Venere (BIRFLU).
In questa relazione, descriviamo la caratterizzazione in vitro di BIRFLU e gli approcci sperimentali per utilizzare BIRFLU per monitorare l'infezione virale in vivo utilizzando un modello murino di infezione da IAV. L'espressione BIRFLU Nluc e Venere è correlata ai titer virali. Inoltre, BIRFLU è rimasta stabile e ha continuato ad esprimere entrambi i geni dei reporter dopo essere stata recuperata dai polmoni dei topi infetti. Questo approccio offre ai ricercatori un'ottima opportunità per studiare lo IAV in cellule coltivate e in modelli animali, compresa l'identificazione e lo sviluppo di nuove alternative terapeutiche per il trattamento delle infezioni da IAV.
Sebbene BIRFLU sia stato generato utilizzando la spina dorsale della PR8, altri IAV ricombinanti che utilizzano backbone di tipo, sottotipo o virale di tipo diverso potrebbero essere generati utilizzando lo stesso approccio sperimentale. Allo stesso modo, in questa relazione abbiamo descritto le procedure sperimentali per l'uso di BIRFLU in un modello murino di IAV. Tuttavia, BIRFLU potrebbe essere una tecnologia preziosa per valutare l'infezione da IAV in altri modelli animali.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca sul virus dell'influenza nel laboratorio LM-S è parzialmente finanziata dal New York Influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 2722014000055C), membro del contratto NIAID Centers of Excellence for Excellence Research and Surveillance (CEIRS) No. HHSN272201400005C (NYICE) e dal Dipartimento della Difesa (DoD) Peer Reviewed Medical Research Program (PRMRP) concedere W81XWh-18-1-0460.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4 ° C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
| Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| 5 to 7 week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
| IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
| Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
| Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Scanner | HP | ||
| Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |
References
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