Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En luciferase-fluorescerende reporter influensa virus for Live Imaging og kvantifisering av viral infeksjon

Published: August 14, 2019 doi: 10.3791/59890
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Division of Allergy/Immunology and Rheumatology, Department of Medicine, University of Rochester, 3Center for Animal Health Research, INIA-CISA

Summary

Influensa A virus (IAVs) er smittsom respiratoriske patogener som forårsaker årlige epidemier og sporadisk pandemier. Her beskriver vi en protokoll for å spore virale infeksjoner i vivo ved hjelp av en roman rekombinant luciferase og fluorescens-uttrykker bi-reporter IAV (BIRFLU). Denne tilnærmingen gir forskere et utmerket verktøy for å studere IAV in vivo.

Abstract

Influensa A virus (IAVs) forårsake menneskelige luftveissykdommer som er forbundet med betydelige helsemessige og økonomiske konsekvenser. Som med andre virus, studere IAV krever bruk av arbeidskrevende sekundære tilnærminger for å oppdage tilstedeværelsen av viruset i infiserte celler og/eller i dyremodeller av smitte. Denne begrensningen har nylig blitt omgås med generering av rekombinant IAVs uttrykke lett sporbare fluorescerende eller Puerto Mosquito (luciferase) reporter proteiner. Imidlertid, forskning ha blitt tvunget å velge fluorescerende eller luciferase reporteren gener på grunn av det innskrenket behandlingskapasitet av det IAV Genova for inkluderer utenlandsk sekvenser. For å overvinne denne begrensningen, har vi generert en rekombinant replikering-kompetente bi-reporter IAV (BIRFLU) stabilt uttrykker både et fluorescerende og en luciferase reporter genet å enkelt spore IAV infeksjoner in vitro og in vivo. For dette formål, viral ikke-strukturell (NS) og hemagglutinin (HA) viral segmenter av influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) ble modifisert til å kode fluorescerende Venus og Puerto Mosquito Nanoluc luciferase proteiner, henholdsvis. Her beskriver vi bruken av BIRFLU i en musemodell av IAV-smitte og påvisning av begge reporter gener ved hjelp av en in vivo Imaging system. Spesielt har vi observert en god sammenheng mellom uttrykk for både journalister og viral replikering. Kombinasjonen av cutting-edge teknikker i molekylærbiologi, dyr forskning og Imaging teknologi, gir forskerne en unik mulighet til å bruke dette verktøyet for influensa forskning, inkludert studiet av virus-vert interaksjoner og dynamikken i virusinfeksjoner. Viktigere, muligheten til genetisk endre viral Genova til å uttrykke to utenlandske gener fra ulike viral segmenter åpner opp muligheter til å bruke denne tilnærmingen for: (i) utviklingen av romanen IAV vaksiner, (II) generering av rekombinant IAVs som kan brukes som vaksine vektorer for behandling av andre menneskelige patogen infeksjoner.

Introduction

Influensa et virus (IAV) er en innhyllet enkelt-strandet negativ-Sense segmentert RNA virus av Orthomyxoviridae familien1,2,3. Verdenshelseorganisasjon (WHO) anslår 3-5 millioner årlige influensa tilfeller og over 250 000 dødsfall fra influensa Worldwide4,5,6. Grupper som er spesielt sårbare for influensa inkluderer eldre, immunsupprimerte individer, og barn7,8,9,10,11. Selv om vaksiner er tilgjengelige og representerer den mest vanlige og effektive intervensjon mot viral infeksjon, er IAV i stand til raskt å utvikle og unnslippe eksisterende immunitet3,12,13, 14 priser og priser , 15. re-fremveksten av en pandemi H1N1 belastning i 2009 og fremveksten av patogene IAV gjentar den konstante trusselen mot menneskelig folkehelse over hele verden4,16.

Under en epidemi eller pandemi, er det avgjørende å raskt bestemme patogenitet og transmissibility av nylig isolerte virus. For tiden tilgjengelige teknikker for å oppdage viruset er tidkrevende og noen ganger krever bruk av arbeidskrevende tilnærminger, som kan forsinke gjennomføringen av disse analysene17,18,19,20. Videre presenterer viral analyser er vanskelig å skalere opp, noe som kan være nødvendig i tilfelle av et utbrudd. Til slutt, bruken av godkjent dyr modeller av infeksjon, som mus, Guinea Pigs og oppspore er rutinemessig anvendt og er livsviktig inne studere influensa infeksjon, immun svar, og effekten av ny vaksiner og/eller antivirale midler. Men disse modellene er restriktive på grunn av manglende evne til å observere viral dynamikk i sanntid; Dette begrenser studiene til statisk bildebehandling av virusinfeksjoner21,22,23,24,25. Dyr som brukes i disse analysene er også euthanized for å fastslå viral belastning, og dermed øke antall dyr som kreves for å fullføre disse studiene26. For å omgå alle disse begrensningene, mange forskere stole på bruk av rekombinant replikering-kompetente, reporter-uttrykker IAVs, som er i stand til å akselerere virological analyser og oppdage viral belastning og formidling in vivo i sanntid26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Viktigere er disse reporter-uttrykker IAVs er i stand til å gjenskape på samme måte som ville-type (WT) IAVs i cellekultur og i dyremodeller av infeksjon33,42.

Fluorescerende og Puerto Mosquito proteiner er to reporter systemer som vanligvis brukes av forskere på grunn av deres følsomhet, stabilitet og brukervennlighet. I tillegg er det enorm støtte og avansement i fluorescerende og Puerto Mosquito protein deteksjon teknologier43,44,45,46,47,48 . Fluorescerende proteiner og luciferase har ulike egenskaper som tillater dem å gløde, spesielt forskjellige i hvordan glade stater er generert og hvordan utstråling oppdages43,44,45, 46,47,48. Fluorescerende proteiner er først begeistret av å absorbere energi, som senere frigjøres som lys på en annen bølgelengde når molekylene reduseres til en lavere energi tilstand43. På den annen side er bioluminesens avledet fra en kjemisk eksoterm reaksjon som involverer et substrat, oksygen, og noen ganger ATP for å produsere lys45. På grunn av de varierende egenskapene til disse to typer reporter proteiner, en kanskje mer fordelaktig enn de andre, avhengig av studiet av interesse. Mens fluorescerende proteiner er mye brukt til å observere mobilnettet lokalisering28,41, deres in vivo-signaler har utilstrekkelig intensitet og er ofte skjult av autofluorescence i live vev49. Derfor forskere stole på luciferases å evaluere viral dynamikk i levende organismer, selv om fluorescerende proteiner kan foretrekkes for ex vivo studier50,51,52,53. I motsetning til fluorescerende proteiner er luciferases mer praktisk for in vivo-studier og mer gjeldende i ikke-invasive tilnærminger26,27,28,29,30 , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , 34 for alle , 35 for alle , 36 for alle , 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 54. til syvende og sist, basert på type studier, må forskerne velge mellom bruk av enten et fluorescerende eller en luciferase reporter protein som sin avlesning, som fagene sine studier til en trade-off av funksjonalitet og følsomhet, og alvorlig begrenser nytten av rekombinant reporter virus. Videre er det bekymringer om sammenhengen mellom uttrykk for ulike reporter gener ved hjelp av fluorescens eller luciferase systemer og viral replikering eller formidling, som kan utgjøre en skade på tolkningen av data innhentet med reporter-uttrykker IAVs.

Vi har overvunnet denne begrensningen ved å generere en rekombinant replikering-kompetente bi-reporter IAV (BIRFLU) som koder for både et fluorescerende og en luciferase protein i samme viral Genova55 (figur 1). Her, NanoLuc luciferase (Nluc), en liten og lys Puerto Mosquito protein48, ble satt inn oppstrøms av hemagglutinin (ha) sekvensen i viral ha segmentet av influensa a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. I tillegg ble Venus, et hyppig brukt monomere fluorescerende protein, satt inn i den ikke-strukturelle (ns) viral segment32,33,36,41,55. Siden BIRFLU koder for både fluorescerende og luciferase reporter gener, kan enten reporter protein signal brukes som avlesning for å bestemme viral replikering og formidling in vitro eller in vivo55. Ytterligere informasjon om generering og in vitro eller in vivo karakterisering av BIRFLU finnes i vår siste utgivelse55. BIRFLU kan brukes til å teste effekten av antivirale medikamenter eller nøytralisere antistoffer via en roman fluorescerende-og Puerto Mosquito-basert microneutralization-analysen55. Videre kan BIRFLU også brukes til å evaluere viral dynamikk i en mus modell av infeksjon55. I dette manuskriptet beskriver vi prosedyrene for å karakterisere BIRFLU55 in vitro og hvordan man studerer BIRFLU-smitte hos mus med in vivo luminescence Imaging Systems for påvisning av Nluc in vivo eller Venus ex vivo.

Kombinasjonen av cutting-edge teknikker i molekylærbiologi, dyr forskning og Imaging teknologier, bringer forskere en unik mulighet til å bruke BIRFLU for IAV forskning, inkludert studiet av virus-vert interaksjoner, dynamikken i viral infeksjon; utviklingen av romanen vaksine tilnærminger for terapeutisk behandling av IAV infeksjoner eller den potensielle bruken av IAV som en vaksine vektor for behandling av andre patogen infeksjoner.

Protocol

Alle protokoller som involverer mus har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) og institusjonelle biosafety Committee (IBC) ved University of Rochester, School of Medicine og odontologi. Alle eksperimenter utført i dyr følger anbefalingene i guide for Stell og bruk av Laboratoriedyr i National Research Council58. Den vivarium og Division of Laboratory Animal Medicine fasiliteter ved School of Medicine og odontologi ved University of Rochester er akkreditert av foreningen for vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care (AALAC) International og i samsvar med føderale og statlige lover og National Institutes of Health (NIH) politikk. Riktig personlig verneutstyr (PPE) er nødvendig når du arbeider med mus. Lignende retningslinjer og krav bør gjennomføres når du utfører eksperimenter som er skissert i dette manuskriptet på hver institusjon.

1. Bruk av små virveldyr dyr

  1. Kjøp fem til sju uker gamle kvinnelige BALB/c mus og vedlikeholde dem i dyr omsorg anlegget under spesifikke patogen-frie forhold. Ved mus ankomst til bestemt anlegg, la hviletid for 4 – 5 dager for å tillate dyr acclimate til sitt nye miljø.
  2. Etter IACUC protokoller, plassere maksimalt 5 mus per bur.
    Merk: På eksperimentet konklusjon, for å sikre at dyret er død, mus ble euthanized ved hjelp av to godkjente prosedyrer, tatt i betraktning at det andre må være en fysisk metode. I denne studien, etter mus infeksjon med BIRFLU og in vivo Imaging, dyr er euthanized med en dødelig dose av 2, 2, 2-tribromoethanol (TBE), og ved å kutte hepatic venen som den fysiske sekundære metoden som vi tidligere har vist23.

2. biosafety

Merk: I dette manuskriptet ble BIRFLU generert i ryggraden i influensa A/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8), som er en vanlig mus-tilpasset laboratorium IAV belastning23,32,33,56. Viruset ble generert ved hjelp av tidligere beskrevet plasmider-baserte omvendt genetikk tilnærminger og en fullstendig beskrivelse av generasjonen, og in vitro og in vivo karakterisering av BIRFLU kan finnes i vår siste utgivelse55. Alle prosedyrer som involverer IAV infeksjoner (in vitro eller in vivo) ble utført i et biologisk sikkerhetskabinett under biosafety nivå (BSL)-2 forhold.

Forsiktig: Et passende biosafety nivå bør fastsettes i henhold til en biosafety risikovurdering. Ytterligere informasjon om utføring av biosafety risikovurderinger og etablering av effektiv biosafety oppsamling bør konsulteres med institusjonen der eksperimentene vil bli utført.

  1. Rengjør biosafety skap med 70% etanol eller klor karbondioksid desinfiserende før og etter å ha utført alle de eksperimentelle prosedyrer. For mus arbeid, sterilisere alt disseksjon materiale (saks, dissekere tang, etc.) og Dounce homogenisator før og etter deres bruk.
  2. Kast alt biologisk materiale som produseres under prosedyrene under riktige IBC-og IACUC-retningslinjer.

3. in vitro karakterisering av BIRFLU (figur 2)

Merk: Se tabell 1 for alle buffer-og medie komposisjoner.

  1. Analysere protein uttrykk ved fluorescens (figur 2a) og indirekte Immunofluorescence (figur 2b)
    1. En dag før infeksjon, frø 24-brønn plater med Madin-Darby canine nyre (MDCK) epitelceller (1 x 105 celler/brønn, triplicates) i vev kultur Media og vedlikeholde platene i en 37 ° c inkubator med 5% co2. Forbered nok brønner til å evaluere alle de valgte Antistoffene i både uekte-infiserte og BIRFLU-infiserte celler.
      Merk: Vi anbefaler at du visualiserer cellene under et lett mikroskop for å bekrefte en monolag før du starter virusinfeksjonen. En 90% confluency monolag av MDCK-celler ved infeksjons tidspunktet anbefales.
    2. Forbered fortynninger av WT eller BIRFLU IAVs i smitte Media og infisere seeded MDCK celler med et mangfold av infeksjon (MOI) av 0,1 plakk-forming enheter (PFU) per celle i et endelig volum på 0,25 mL/vel av smitte Media.
    3. Fjern vev kultur mediet fra trinn 3.1.1 og vask MDCK-cellene to ganger med 1x fosfat-bufret saltvann (PBS). Tilsett viruset fortynninger fra 3.1.2 til MDCK cellene og plasser platene på en rocking plattform for 1 t ved romtemperatur for å tillate viral absorpsjon.
      Merk: Mock-infiserte celler er inkubert bare med infeksjon Media i fravær av virus.
    4. Etter viral absorpsjon (trinn 3.1.3), Fjern viral inokulum ved aspirasjon og tilsett 1 mL av post-smitte medier som inneholder 1 μg/mL av TPCK-behandlet Trypsin til hver brønn. Ruge celler for 18 timer i en 5% CO2 fuktet inkubator ved 33 ° c.
    5. Etter 18 h av infeksjon, fjerne vev kulturen supernatanten fra 24-brønn plater (3.1.4). Fix og permeabilize cellene med 0,25 mL/brønn for fiksering/permeabilization løsning i 20 min ved romtemperatur.
      Merk: Forbered fiksering/permeabilization løsning i en avtrekks hette for å hindre formaldehyd eksponering.
    6. Fjern fiksering/permeabilization-oppløsningen fra trinn 3.1.5, vask cellene to ganger med 1x PBS, og ruge cellene med 0,25 mL/brønn for blokkerings løsning for 1 time ved romtemperatur.
      Merk: Fortsett til neste trinn eller lagre celler i blokkerings løsningen ved 4 ° c over natten.
    7. Fjern blokkerings løsningen (trinn 3.1.6) og tilsett 0,25 mL/brønn (1 μg/mL) av et mus monoklonale antistoff (MAb) mot IAV-nucleoprotein, NP (HB-65) eller en 1:1000-fortynning av en kanin polyklonale antistoff (pAb) mot NLuc (se tabell over materialer), både fortynnet i fortynning av antistoff oppløsning (1x PBS, 2,5% BSA), og ruge cellene i 1 time ved 37 ° c.
    8. Fjern det primære antistoff fra trinn 3.1.7, vask cellene tre ganger med 1x PBS og ruge dem med 0,25 mL/vel av en Texas rød-bøyd anti-mus eller anti-kanin sekundære antistoffer (se tabell over materialer) utvannet 1:200 i antistoff fortynnings løsning.
      Merk: Cellekjerner kan beiset samtidig ved å tilsette 0,5 μg/mL av 4 ', 6 '-diamidino-2-phenylindole (DAPI) til samme sekundære antistoff løsning. Ruge cellene i 1 time ved 37 ° c i mørket. Andre sekundære antistoffer som bøyes likt med andre fluorophores kan brukes.
    9. Fjern sekundær antistoff og DAPI fra trinn 3.1.8, vask cellene tre ganger med 1x PBS. Etter vask, la cellene i 0,25 mL/vel av 1x PBS.
    10. Plasser platen på scenen i et fluorescens mikroskop for å oppdage Venus og Nluc reporter uttrykk, og NP fra infiserte celler ved hjelp av riktig fluorescerende filtre. Ta bilder med et fluorescens mikroskop (20x forstørrelse) og slå dem sammen ved hjelp av et bilderedigeringsprogram (figur 2a, B).
  2. Analyser Nluc aktivitet (figur 2C) og viral replikering (figur 2D).
    1. En dag før infeksjon, frø 12-brønn plater med MDCK celler (2 x 105celler/brønn, triplicates) ved hjelp av vev kultur medier i en 37 ° c inkubator med 5% co2 å nå ca 90% confluency av tidspunktet for smitte.
      Merk: Før infeksjonen, sjekk cellene under et mikroskop for å verifisere en monolag av MDCK celler.
    2. Dagen for infeksjonen forberede fortynninger av WT og BIRFLU virus i smitte Media å infisere MDCK cellene (trinn 3.2.1.) i tre eksemplarer med en MOI av 0,001 PFU i 0,5 mL/well. Fjern vevet kultur medium og vask MDCK cellene to ganger med 1x PBS.
    3. Legg viruset fortynninger til MDCK monolagere og la viral absorpsjon ved romtemperatur for 1 time på en rocking plattform. Etter viral absorpsjon, Fjern viruset inokulum og tilsett 1,5 mL av post-infeksjon medier som inneholder 1 μg/mL av TPCK-behandlet Trypsin, til hver brønn. Ruge infiserte celler i en 5% CO2 fuktet inkubator ved 33 ° c og samle supernatanter på de angitte tids punktene indikert i trinn 3.2.4.
    4. Ved 24, 48, 72 og 96 h post infeksjon (p.i.) samler 150 μL av vev kultur supernatanten fra hver brønn og lagre prøvene i en mikrosentrifugen tube på-80 ° c for å utføre Nluc analyser og viral titreringer.
    5. For å utføre Nluc aktivitet analysen, følg produsentens indikasjoner. Først tine vevet kulturen supernatanten lagret ved-80 ° c (trinn 3.2.4) på isen.
      Merk: Se anbefalingene fra produsenten og optimalisere analysen hvis nødvendig.
    6. Forbered luciferase analysen løsning (se tabell over materialer) ved å fortynne Nluc substrat 1:50 med fortynning buffer. I en hvit flat bunn 96-brønn mikroplate for luciferase analyser, bland 25 μL av luciferase analyseløsning med 10 til 25 μL av de innsamlede vevs kultur supernatanten prøvene. Ruge blandingen for 2 – 3 min før måling av luminescence ved hjelp av en luminometeret (figur 2C).
      Merk: Tilstedeværelsen av smittsomme virus partikler i vev kulturen supernatanter bestemmes av fluorescens immun-Focus-analysen (Venus) eller indirekte immunofluorescence (viral antigen farging) som tidligere beskrevet23,32, 33,56.
    7. En dag før viral titreringer, frø MDCK celler i en 96-brønn plate (2 x 104 celler/Vel, triplicates) med vev kultur medier og tillate celler å nå 90% samløpet av tidspunktet for infeksjon i en inkubator satt til 37 ° c med 5% co2.
    8. Bruk vevs kulturen supernatanten prøvene som ble tint på is (trinn 3.2.4.). Tilsett 90 μL av infeksjon Media til hver av brønnene i en ny 96-brønn plate, legg deretter til 10 μL av tint vev kulturen supernatanten (trinn 3.2.4) til den første brønnen (rad A). Bruk en flerkanals Pipet til å mikse og overføre 10 μL fra rad A til rad B. endre tips mellom fortynninger og bland godt.
      Merk: Denne prosedyren bør gjentas til siste rad (H). Vi anbefaler å utføre viral titreringer i triplicates for nøyaktig måling av viral titers.
    9. Fjern vev kulturen medium fra MDCK cellene i 96-brønn plater (trinn 3.2.7) og vask to ganger med 1x PBS. Tilsett 50 μL av den supernatanten fortynninger av kopi 96-brønn platen som inneholder viruset fortynninger (trinn 3.2.8) til hver brønn i 96-brønn platen som inneholder MDCK-celler.
    10. Ruge den 96-brønn platen på en rocking plattform for 1 t ved romtemperatur for å tillate viral absorpsjon. Etter viral absorpsjon, Fjern inokulum og tilsett 100 μL/brønn av post-infeksjon-medier som inneholder 1 μg/mL TPCK-behandlet Trypsin. Ruge infiserte celler for 12 t i en 33 ° c inkubator med 5% CO2.
    11. Siden BIRFLU uttrykker Venus, kan antall infiserte celler telles direkte ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Alternativt kan viral titers bestemmes av indirekte immunofluorescence som tidligere beskrevet ved hjelp av et antistoff mot en viral protein23,56,57,59. For sistnevnte, Fortsett å fikse/permeabilize cellene og flekken ved hjelp av anti-NP mAb HB-65 som beskrevet i avsnitt 4,4.
    12. Bestem viral titers ved å telle antall fluorescerende-forming enheter (FFU)/mL ved hjelp av formelen: ((antall FFU) x 20 x 1/fortynning (figur 2D).

4. in vivo karakterisering av BIRFLU (Figur 3 og Figur 4)

  1. Mus infeksjon
    Merk:     intranasal infeksjon av mus ble gjort som tidligere beskrevet23. For en mer detaljert protokoll av IAV infeksjon i vivo ved hjelp av musemodell av infeksjon, anbefaler vi å se videoen knyttet til forrige utgivelse23. Denne delen oppsummerer bare trinnene som kreves for mus infeksjon med BIRFLU.
    1. Inspiser musene for å evaluere deres helse og generelle fysiske utseende. Klargjør fortynning av BIRFLU i 1x PBS til vaksinere mus med 1 x 106 PFU av BIRFLU i et total volum på 30 μL/mus. Opprettholde viruset på isen til musen inoculation.
      Merk: Mock-infiserte (1x PBS) mus vil være nødvendig som intern kontroll for Imaging. Sted uekte-infiserte mus i et annet bur enn BIRFLU-infiserte dyr.
    2. Bedøve fem-til-sju-ukers-gamle kvinnelige BALB/c mus intraperitonealt med 240 – 250 mg/kg av tribromoethanol (TBE) ved å sette nålen inn i caudal 2/3 på høyre side av magen. Så, retur musa å byrået og vente på i nærheten 5 min. Sjekk det musa er anesthetized tidligere virus inoculation av fraværet av det toe-hugge refleks.
      Merk: Injiserbare beroligende midler er anbefalt over inhalert beroligende midler for influensa infeksjoner i Vivo, som sistnevnte kan endre atferd og opptak av viruset ved luftveiene epitel. Videre kan de også påvirke lokale immunresponser i lungene og forstyrre in vivo Imaging av infiserte mus. Til slutt, inhalert beroligende midler har redusert varighet av effekt, noe som ville være et problem for in vivo Imaging av de infiserte dyrene.
    3. Vaksinere musene intranasalt med 30 μL av den tilberedte BIRFLU-fortynning. Kontroller at musene puster riktig før du returnerer dem til buret.
  2. Bioluminesens overvåking av mus infisert med BIRFLU (figur 4a)
    Merk:     i dette manuskriptet reporter uttrykk for Nluc eller Venus og viral replikering i lungene av mus smittet med BIRFLU er fastsatt til 3 dager etter infeksjon. Imidlertid, arten av bioluminesens tenkelig innrømmer gjentatt avlytting av Nluc gjengivelsen inne individ BIRFLU-infisert dyrene uten behovet å euthanize seg for hver eksperimentelle tid-punkt. En in vivo Imaging system med en isoflurane anestesi manifold er nødvendig for å utføre de beskrevne eksperimentelle prosedyrer. Se Material fortegnelsen for detaljer om bildebehandlings instrumentet og bilde programvaren som brukes til bildeinnhenting og dataanalyse.
    1. Barbere musene brystet for å forbedre bioluminesens signalet. Åpne bildebehandlingsprogrammet og trykk Initialiser. Deretter angir du parametrene som skal brukes, inkludert innstilling av bilde gjengivelsesmodus til bioluminesens, automatisk lagring, eksponeringstid for automatisk, åpent filter osv.
    2. Når maskinen er ferdig initialisert, slå på isoflurane anestesi system. Plasser dyr i anestesi kammeret. Mus er samtidig og lett anesthetized med en blanding av oksygen gass og fordampet 1 – 2% isoflurane.
    3. Når mus er anesthetized, administrere Nluc substrat (se tabell over materialer) fortynnet 1:10 i 1x PBS (endelig volum 100 μL/mus) via retro-orbital rute ved hjelp av en sprøyte med en 22 G nål.
    4. Umiddelbart etter Nluc reagens administrasjon, plasser dyrene i bilde instrumentet med sine kister vendt opp og snute inne i manifold kjegle for å holde dyret anesthetized under bildebehandling. Umiddelbart etter stenge imager døren, klikker du anskaffe i programmet (figur 4a, topp).
    5. Etter tenkelig, retur det mus å deres burene avlytting seg til de har fullt ut kommet til hektene og slukke det isoflurane fordamper. Fortsett deretter med ex vivo-bilde av mus lungene for å evaluere genuttrykk for Venus-reporter (del 4,3).
    6. Bruk programvare verktøyene for bildebehandling til å analysere de bioluminesens dataene som er ervervet. Bruk verktøyet ROI (region av interesse) for å utpeke den spesifikke signalet og utføre Flux målinger i regionen av interesse (vanligvis rundt brystet) (figur 4a, bunn). Selv om ROI formen er irrelevant, større ROIs er generelt foretrukket å fange opp hele signalet diffusjon området.
    7. Klikk mål. Vurdere bioluminesens i fotoner siden det gir en absolutt Foton utslipp måling som kan sammenlignes med output målinger gitt av ulike parametre eller tenkelig instrumenter.
  3. Fluorescens analyse hos mus infisert med BIRFLU (Figur 3 og figur 4b)
    1. Samle musen lungene etter in vivo Imaging, som tidligere beskrevet23.
      1. Kort, euthanize mus med en dødelig dose av TBE (500 mg/kg). Desinfisere snittet området med 70% etanol. Med en skalpell, gjør et snitt fra brystbenet til bunnen av magen og deretter kuttet fra bunnen av snittet til sidene med saks. Deretter kuttet hepatic vene (andre fysiske aktiv døds metode) for å blø dyret.
        Merk: For å unngå høy bakgrunns signal under bildebehandling, er det viktig å minimere mengden av blod i lungene (se nedenfor).
    2. Plasser musen i rygg recumbency, og bruk saksen til å klippe pleura og åpne ribbeinet buret. Deretter fjerner lungene ved å klippe enden av luftrøret med saks mens forsiktig holde lungene med tang.
      1. Plasser lungene i en seks-brønn plate med 2 mL 1x PBS og vask lungene tre ganger med 1x PBS.
        Merk: For å unngå kontaminering mellom prøvene, rengjør og desinfisere dissekere verktøy mellom hvert dyr.
    3. Starte avbildningen oppkjøpet programvare av falle i staver Initial og sette parametrene for tenkelig, inkluderer innfatning tenkelig måte å fluorescens, bilen bevarer, avsøring tid å bilen, eksitasjon (500 NM) og utstråling (540 NM) filterene.
    4. Når maskinen er initialisert, plasserer lungene i en svart bakgrunn skuff, slik at vevet er adskilt fra hverandre, innføre skuffen inn i imager, og klikk få på Imaging System programmet etter stenge bilde kameradøren ( Figur 4B, topp).
    5. Etter bildebehandling, Fjern vevet umiddelbart og oppbevar dem på is (4 ° c) hvis prøvene behandles samme dag; eller på et rør og tørr is for å fryse dem raskt, før du lagrer dem på-80 ° c, hvis prøvene vil bli behandlet senere på en annen dag.
    6. For bildebehandling velger du avkastnings verktøyet og tegner ROIs rundt hver av de enkelte lungene. Klikk mål. Deretter, ved hjelp av den resulterende gjennomsnittlige strålende effektivitets målinger, subtrahere verdiene fra uekte-infiserte mus (figur 4b, bunn).
      Merk: med BIRFLU, det er en god korrelasjon av nivåene av Nluc og Venus uttrykk, og signal distribusjon. Derfor er det viktig å analysere Nluc (hele musen) og Venus (excised lunger) uttrykk fra samme dyret, og opprettholde samme orientering.
  4. Evaluering av BIRFLU-replikering i mus lungene (Figur 3 og figur 4c)
    1. Homogenisere mus lunger for viral titrering av plakk analysen som tidligere beskrevet23.
  5. Plasser lungene i en Dounce-homogenisator med 1 mL kjølt smitte medium. Homogenisere lungene med morter i 1 min ved romtemperatur inntil den har fullt oppløst og oppbevar prøvene i et sterilt rør ved 4 ° c.
    1. Sentrifuger prøvene ved 300 x g i 10 min og samle supernatanten i et sterilt rør. Oppbevar prøvene på isen hvis de skal brukes på samme dag eller fryse dem ved-80 ° c for å evaluere viral titers på et senere tidspunkt.
      Merk: En ny Dounce homogenisator skal brukes for hver lunge prøve.
    2. For å utføre plakk analysen, dagen før du utfører viral titrering, frø seks-brønn plater med MDCK celler (5 x 105 celler/brønn) i vev kultur medier. Ruge cellene over natten ved 37 ° c med 5% CO2 for å nå 90% samløpet neste dag. Før infeksjonen, Bekreft at cellene danner en monolag under et lett mikroskop.
    3. Forbered 1:10 seriell fortynninger av supernatanten fra homogenisert prøvene (Step 4.4.1) i smitte medier. Klargjør mikrosentrifugen rør med 540 μL av smitte medier, tilsett 60 μL fra prøve homogenisert lungene til det første røret, bland ved pipettering opp og ned, og bruk deretter et nytt tips, Overfør 60 μL til neste rør. Gjenta denne serielle fortynnings prosessen til siste fortynning.
      Merk: I vår erfaring 7 fortynninger er tilstrekkelig til å bestemme viral titers av plakk analysen fra lungene av infiserte mus.
    4. Vask MDCK-cellene (trinn 4.4.3) to ganger med 1x PBS og Overfør 500 μL av de serielt fortynnede prøvene til hver brønn i de seks brønn platene. Plasser platene på en rocking plattform og la viral absorpsjon skje for 1 time ved romtemperatur.
    5. Etter 1 time av viral absorpsjon, fjerne viral inokulum, tilsett 2 mL/brønn av overlegg medium inneholder 1 μg/mL av TPCK-behandlet Trypsin, og deretter ruge cellene ved 33 ° c under 5% CO2 for 3 dager.
    6. Fix infiserte celler (trinn 4.4.6) med 1 mL/brønn av 4% formaldehyd fortynnet i 1x PBS ved romtemperatur i 2 timer, deretter forsiktig fjerne overlay medium og tilsett 1 mL 1x PBS til hver brønn. For visualisering av Venus, bilde de seks-brønn plater med et bildesystem for påvisning av fluorescens.
      Merk: Viral plaketter kan være farget ved hjelp av et bilderedigering programvare (se tabell over materialer).
    7. Hvis du vil evaluere Nluc uttrykk, visualiserer du virale plaketter ved å immunostaining ved hjelp av en anti-Nluc pAb. For dette, Fjern 1x PBS, permeabilize celler med 0,5 mL/brønn av permeabilization løsning i 15 min ved romtemperatur.
    8. Fjern den permeabilization løsningen, vask cellene tre ganger med 1x PBS og blokker med 0,5 mL/brønn for blokkerings løsning for 1 time ved romtemperatur.
    9. Fjern blokkerings løsningen fra trinn 4.4.9 og ruge cellene med 0,5 mL/vel av pAb anti-Nluc fortynnet 1:1000 i fortynnings løsning for 1 time ved 37 ° c.
    10. Bruk ABC alkalisk fosfatase Kit og DAB peroksidase substrat Kit følgende produsentens anbefaling for visualisering av Nluc-uttrykke plaketter.
      1. Kort, vask celler fra 4.4.10 tre ganger med 1x PBS og ruge dem med 0,5 mL/brønn av biotinylated anti-kanin sekundær antistoff for 1 t ved 37 ° c.
      2. Fjern det sekundære antistoff, vask cellene tre ganger med 1x PBS, og ruge med ABC-løsningen for 1 time ved 37 ° c. Vask cellene tre ganger med 1x PBS og visualisere viral plaketter med DAB HRP substrat Kit. Skann immunostained plaketter ved hjelp av en vanlig skanner.
        Merk: Andre lignende kits for immunostaining kan brukes.
    11. Stain viral plaketter med krystall fiolett løsning for 1 t ved romtemperatur. Kast krystall fiolett, vask platene tre ganger med vann, la platene tørke, og skanne platene igjen.
    12. For å bestemme viral titers, telle plaketter avslørt etter krystall fiolett farging. Skann plaketter ved hjelp av en vanlig skanner. Beregn virus titer som forming enheter (PFU) per mL (PFU/mL).
    13. For å vurdere BIRFLU stabilitet in vivo, beregne prosentandelen av reporter-uttrykker virus ved å telle antall krystall fiolett-farget plaketter (antall smittsomme virus, trinn 4.4.12) og sammenligne med antall Venus-og Nluc-uttrykker plaketter ( Trinn 4.4.7 og trinn 4.4.11, henholdsvis).

Representative Results

Generering og karakterisering av BIRFLU in vitro (figur 1 og figur 2)

En rekombinant replikering-kompetent IAV uttrykker to forskjellige reporter gener (BIRFLU) ble bygget ved hjelp av State of the art molekylærbiologi og plasmider omvendt genetikk teknikker (figur 1). Her valgte vi å bruke Nluc på grunn av flere fordeler fremfor andre luciferases, inkludert den lille størrelsen, ATP-uavhengighet, større intensitet, og optimalisert substrat48,60. Nluc ble klonet i HA segmentet av IAV PR8 etterfulgt av svin teschovirus (PTV) 2A kløft nettsted (2A) foran den åpne lese rammen (ORF) av HA (figur 1). Den ORF av HA inkludert tause mutasjoner å fjerne den opprinnelige pakking signaler og unngå mulige rekombinasjon. Den komplette HA emballasjen signalet ble lagt foran Nluc å tillate riktig innlemmelse av modifisert HA segmentet i virionet og Nluc og HA uttrykk fra samme viral RNA segmentet (figur 1). I tillegg ble det fluorescerende proteinet Venus klonet til en modifisert IAV PR8 NS segment som koder de to virale proteiner NS1 og NEP fra en enkelt transkripsjon32,36,41,54, i 57. For dette formål ble Venus smeltet til C-terminalen på NS1, og hele NEP ORF ble klonet nedstrøms for området PTV 2A kløft som ble plassert mellom NS1-Venus og NEP sekvenser (figur 1). Til syvende og sist, disse to modifiserte HA og NS viral plasmider konstruksjoner ble brukt i kombinasjon med resten av IAV PR8 Reverse genetikk plasmider å generere BIRFLU (figur 1). In vitro og in vivo karakterisering av BIRFLU har blitt beskrevet tidligere55.

I figur 2, karakterisert vi in vitro BIRFLU ved å fastsette Venus, Nluc, og np uttrykks nivåer ved hjelp av fluorescens og indirekte immunofluorescence tilnærminger (figur 2a, B). Confluent monolagere av MDCK-celler var enten uekte-infiserte eller infiserte (MOI 0,1) med WT eller BIRFLU PR8 virus, og ved 18 timer etter infeksjon ble Venus-uttrykket direkte evaluert ved hjelp av fluorescens mikroskopi (figur 2a, B). Nluc (figur 2a) og np-uttrykket (figur 2b) ble brukt av indirekte immunofluorescence ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for hvert protein. Som forventet, Venus og Nluc uttrykk ble oppdaget bare i celler infisert av BIRFLU og ikke i celler infisert av WT PR8 virus. I tillegg indirekte immunofluorescence mikroskopi avdekket NP uttrykk i både WT og BIRFLU PR8-infiserte celler. Ingen uttrykk for Venus, Nluc eller NP ble påvist, som forventet, i uekte-infiserte celler (Figur A, B).

For å evaluere Nluc uttrykks nivåer in vitro, var MDCK-celler smittet (MOI 0,001) med WT eller BIRFLU PR8 virus og Nluc aktivitet i vevs kultur supernatanter ble vurdert ved 24, 48, 72 og 96 h post-smitte (figur 2C). Bare Nluc aktivitet ble påvist i vev kultur supernatanter av MDCK celler infisert med BIRFLU (figur 2C). Nluc aktivitet i vevet kulturen supernatanter ble oppdaget så tidlig som 24 h post-smitte med høyere uttrykk nivåer på 96 h post-smitte, mest sannsynlig fordi Cytopathic effekt (CPE) indusert under viral infeksjon løslate Nluc protein beholdt inn i cellen. Å evaluere egnethet av BIRFLU i kulturperler celler, vekst Kinetics av WT og BIRFLU PR8 virus ble også evaluert (figur 2D) og tilstedeværelsen av smittsomme virus i vev kultur supernatanter ble bestemt av immun-fokus-analysen (figur 2D ). BIRFLU rep like Rings Kinetics var merkbart sammenlignbare med de av WT PR8 virus, men BIRFLU replikering ble litt forsinket og nådde ikke samme virale titers som WT PR8. Imidlertid, BIRFLU var kjøpedyktig rekkevidde titers av 5 x 107 PFU/ml (skikkelsen 2D), angir det gjengivelsen av to reporteren gener inne det viral Genova er ikke viktig blande inn BIRFLU replikering inne MDCK celler.

Sporing BIRFLU infeksjon i mus (Figur 3 og Figur 4)

Figur 3 er et skjematisk flytskjema for vurdering av BIRFLU dynamikk i en musemodell av IAV infeksjon. Fem-til-sju-ukers-gamle kvinnelige BALB/C mus var enten mock-smittet med 1x PBS eller infisert med 1 x 106 PFU av BIRFLU intranasalt. På 3 dager etter infeksjon, mus ble anesthetized med isoflurane og deretter injisert med Nluc substrat retro-orbitally. Alle mus ble umiddelbart plassert i IVIS instrumentet og Nluc signal ble vurdert i vivo ved hjelp av IVIS. Deretter ble mus euthanized og lungene ble høstet. Excised lungene ble deretter analysert ex vivo bruker in vivo imager å bestemme fluorescens intensitet via Venus uttrykk. Til slutt, mus lungene var homogenisert, og viral titers og stabilitet ble bestemt av plakk analysen. Plakk ble vurdert av den direkte fluorescens av Venus, ved immunostaining ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for Nluc og av krystall fiolett farging.

Tidligere beskrevet replikering-kompetent reporter-uttrykker IAVs uttrykke en enkelt reporter genet, oftest enten en fluorescerende eller en Puerto Mosquito protein, som surrogat for viral infeksjon og replikering. Men BIRFLU, er i stand til å uttrykke begge typer reporter gener ved viral infeksjon. For å vurdere sammenhengen mellom bioluminesens (in vivo Imaging) og fluorescens (ex vivo Imaging) etter BIRFLU infeksjon, var fem til syv uker gamle kvinnelige BALB/c-mus uekte-infisert med 1x PBS eller inokulert med BIRFLU (106 PFU) intranasalt . Nluc aktivitet (figur 4a) ble evaluert ved administrering av Nluc substrat injisert retro-orbitally på 3 dager etter infeksjon ved hjelp av en in vivo Imaging instrument. Vi valgte å evaluere bioluminesens på dag 3 fordi tidligere studier indikerte at IAV replikering, inkludert PR8, topper mellom dager 2 og 4 etter infeksjon24,54. Bioluminesens ble overvåket (figur 4a, topp) og brukes til å beregne gjennomsnittlig total Flux (Flux (Logg10 p/s) (figur 4a, bunn). Som spådd, mus inokulert med BIRFLU vist høy bioluminesens aktivitet, men ingen signal ble oppdaget i uekte-infiserte mus. Deretter ble lungene av infiserte mus høstet og Venus uttrykk ble vurdert ved hjelp av ex vivo Imaging (figur 4b, topp). Videre ble fluorescens gjennomsnittlige stråle effektivitet beregnet (figur 4b, bunn). De excised musene lungene ble også homogenisert for å bestemme viral titers og genetisk stabilitet av BIRFLU in vivo (figur 4c, D). Genetisk stabilitet av BIRFLU ble analysert gjennom plakk analysen ved hjelp av virus isolert fra mus lungene og fluorescerende mikroskopi (Venus, topp), immunostaining (Nluc, midten) og krystall fiolett farging (nederst). BIRFLU utvinnes fra mus lungene var i stand til å danne plaketter og stabilt uttrykker begge reporter gener (figur 4c). Spesielt observerte vi en god korrelasjon mellom bioluminesens og fluorescens signaler med viral replikering.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av IAV PR8 WT-og BIRFLU-virionet struktur og områder. IAV er omgitt av en lipid bilayer som inneholder de to store viral glykoproteiner hemagglutinin (HA; svart) og neuraminidase (NA; blå). IAV inneholder åtte enkelt-strandet, negativ-Sense, RNA segmenter (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, og NS). Hver viral segmentet inneholder ikke-koding regioner (NCR) på 3 ' og 5 ' ender (svart bokser). Også på 3 ' og 5 ' slutten av viral (v) RNAs er emballasjen signaler, ansvarlig for effektiv encapsidation av vRNAs til begynnende virions (hvite bokser). IAV PR8 HA og NS viral segmenter og produkter er angitt i svart. Sekvenser av Nluc, Venus, og PTV 2A er angitt i rødt, grønt og stripete bokser, henholdsvis. Den Skjematisk representasjon av endret HA og NS segmenter uttrykker Nluc og Venus, henholdsvis i BIRFLU er også indikert. Dette tallet er tilpasset fra Nogales et al.55. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: in vitro karakterisering av BIRFLU. (A, B) Analyse av protein uttrykk ved direkte fluorescens og immunofluorescence. MDCK celler var uekte-infiserte eller infiserte (MOI 0,1) med PR8 WT eller BIRFLU virus. Infiserte celler ble fast ved 18 h post-smitte å direkte visualisere Venus uttrykk ved direkte fluorescerende mikroskopi og å visualisere Nluc (A) og viral np (B) uttrykk ved hjelp av spesifikke antistoffer og indirekte immunofluorescence. Kjerner ble farget med DAPI. Representative bilder (20x forstørrelse) vises. Skala stolper = 100 μm. (C, D) Vekst Kinetics av PR8 WT og BIRFLU. Nluc aktivitet (C) og viral titers (D) i VEV kultur supernatanter fra MDCK celler smittet (Moi 0,001) med WT og BIRFLU PR8 virus ble vurdert på angitte tidspunkter etter infeksjon. Data representerer midlene ± SD av triplicates. Viral titers ble bestemt av immun-Focus-analysen (FFU/mL). Prikket linje angir grensen for påvisning (200 FFU/ml). Dette tallet er tilpasset fra Nogales et al.55. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skjematisk representasjon for studiet av BIRFLU i mus. Uttrykk for Nluc og Venus reporter gener ble evaluert hos mus infisert med 1 x 106 PFU av BIRFLU bruker in vivo eller ex vivo Imaging. Kort, på dag 1, 5 til 7 uke gamle kvinnelige BALB/c mus var uekte-smittet (1x PBS) eller inokulert med 1 x 106 PFU av BIRFLU intranasalt. Ved dag 3 post-smitte, mus var mildt anesthetized bruker isoflurane og Nluc substrat ble injisert retro-orbitally. Nluc signalet ble direkte vurdert ved hjelp av in vivo Imaging. Umiddelbart etter avbildning ble musene euthanized og uttrykk for Venus i hele excised lunger ble analysert ved hjelp av ex vivo Imaging. Gjenopprettede mus lungene var homogenisert å evaluere viral replikering og stabilitet ved plakk analysen. Piler indikerer korrelasjon mellom fluorescens (Venus), immunostaining (Nluc) og krystall fiolett farging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: in vivo bioluminesens og fluorescens uttrykk. Kvinner fem-til-sju-ukers-gamle BALB/c mus var uekte-infiserte (1x PBS) eller inokulert med 1 x 106 PFU av BIRFLU intranasalt. På dag 3 post-smitte, Nluc aktivitet (A) i hele musen ble bestemt. Representative bilder av en enkelt mus som viser stråleglans skala (p/sek/cm2/SR). Bioluminesens stråleglans verdier ble quantitated og den gjennomsnittlige totale Flux vises (Flux (log10 p/s). Etter Nluc avbildning ble lungene høstet for ex vivo Imaging (B). Representative bilder fra hele lungene vises. For å kvantifisere Venus uttrykk, gjennomsnittlig verdier av regioner av interesse (ROIs) ble normalisert til lunge Auto-fluorescens fra uekte-infiserte mus og fold endringer ble beregnet. Å analysere genetisk stabilitet av BIRFLU in vivo, virus utvinnes fra mus lungene ble analysert av plakk analysen ved hjelp av fluorescerende mikroskopi (Venus, topp), immunostaining (Nluc, midten) og krystall fiolett farging (nederst) (C). Representative bilder fra én mus vises. For å evaluere virus replikering, hele lungene var homogenisert etter tenkelig og brukes til å infisere MDCK celler og bestemme viral titers av plakk analysen (PFU/mL) (D). Piler angir korrelasjon mellom fluorescens (Venus), immunostaining (Nluc) og krystall fiolett farging. Barer representerer gjennomsnittlig ± SD av lunge virus titers. Dette tallet er tilpasset fra Logales et al.55. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Vev kultur Media og løsninger Sammensetning Lagring Bruke
Vev kultur medier: Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM), 10% fosterets storfe serum (FBS), 1% penicillin-Streptomycin-L-glutamin (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG). 445 ml DMEM, 50 mL FBS og 5 mL på 100% mer 4 ° c Vedlikehold av MDCK-celler
Post-infeksjon medier: DMEM 0,3% av storfe ALBUMIN (ba), 1% PSG (DMEM 0,3% ba 1% PSG). 491 ml DMEM, 4,2 ml på 35% BA og 5 ml med 100 prosent 4 ° c Vedlikehold av MDCK celler etter viral infeksjon
10x, fosfat bufret saltvann (PBS) 80 g av NaCl, 2 g av KCl, 11,5 g av na2HPO4. 7H2O, 2 g av KH2PO4. Legg til ddH2O opptil 1 L. Juster pH til 7,3 Romtemperatur Slik klargjør du 1x PBS
1x PBS Fortynne 10x PBS med ddH2O Romtemperatur Vask celler
Infeksjon Media: 1x PBS, 0,3% ba, 1% penicillin-STREPTOMYCIN (PS) (PBS/ba/PS). 487 mL 1x PBS steril, 4,2 mL på 35% BA og 5 ml 100 x 1% PS (100 U/mL) 4 ° c Virusinfeksjoner
Fiksering/permeabilization løsning: 4% formaldehyd, 0,5% Triton X-100 fortynnet i 1x PBS. 400 mL nøytral bufret formalin 10%, 5 ml Triton X-100 og 595 mL 1x PBS Romtemperatur Fix og permeabilization av MDCK celler.
Blokkering løsning: 2,5% storfe serum ALBUMIN (BSA) i 1x PBS. 2,5 g av BSA i 97,5 mL 1x PBS 4 ° c Blokkerings løsning for immunofluorescence og plakk analyser.
Fortynning av antistoff oppløsning (1% BSA i 1x PBS) 1 g BSA i 99 mL 1x PBS 4 ° c Fortynning av primære og sekundære antistoffer.
0,1% krystall fiolett oppløsning 1 g krystall fiolett i 400 mL av metanol. Tilsett 600 ml ddH2O Romtemperatur Farging av MDCK celler i plakk analyser.
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl keton (TPCK)-behandlet Trypsin Forbered en 1, 000x lagerløsning på 1 mg/mL i ddH2O -20 ° c For virusinfeksjoner.

Tabell 1: vevs kultur medier og løsninger.

Discussion

Forskere har basert på rekombinant reporter-uttrykker virus som Vital molekylær verktøy for å forstå og utvide på den nåværende forståelsen av viral replikering og patogenesen26,27,28, 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , 34 for alle , 35 for alle , 36 for alle , 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 54. de mest favoriserte reporter gener er luciferases og fluorescerende proteiner, hovedsakelig på grunn av den teknologiske fremskritt i deres identifisering, utvikling av forbedrede varianter, og deteksjon av imaging teknologier43 , 44 for alle , 45 for alle , 46 for alle , 47 for alle , 48. rekombinant reporter virus brukes ofte til å akselerere virological analyser, studere dynamikken i virus in vitro og in vivo, og for å teste effektiviteten av nå godkjent eller ny vaksine og terapeutiske tilnærminger26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40, 41,54. Dessverre, i tilfelle av IAV, var tidligere studier begrenset til uttrykk for et enkelt reporter gen, som hindrer den type studie som kan gjennomføres 26,27,28,29 , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , 34 for alle , 35 for alle , 36 for alle , 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 54. for å unngå denne begrensningen, har vi generert en replikering-kompetent bi-reporter IAV som uttrykker en Nluc luciferase og en Venus fluorescerende PROTEIN (BIRFLU).

I denne rapporten beskriver vi in vitro karakterisering av BIRFLU og de eksperimentelle tilnærminger for å bruke BIRFLU å spore viral infeksjon i vivo ved hjelp av en mus modell av IAV infeksjon. BIRFLU Nluc og Venus uttrykk korrelert med viral titers. I tillegg forble BIRFLU stabil og fortsatte å uttrykke begge reporter gener etter å ha blitt utvunnet fra lungene av infiserte mus. Denne tilnærmingen gir forskere en utmerket mulighet til å studere IAV i kulturperler celler og i dyremodeller, inkludert identifisering og utvikle nye terapeutiske alternativer for behandling av IAV infeksjoner.

Selv om BIRFLU har blitt generert ved hjelp av ryggraden i PR8, andre rekombinant IAV bruke annen type, under type eller viral belastning infrastruktur kan bli generert ved hjelp av samme eksperimentelle tilnærming. På samme måte, i denne rapporten beskrev vi de eksperimentelle prosedyrene for bruk av BIRFLU i en musemodell av IAV. Imidlertid kan BIRFLU være en verdifull teknologi for å evaluere IAV-smitte i andre dyremodeller.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskning på influensa virus i LM-S laboratorium er delvis finansiert av The New York influensa Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), et medlem av NIAID Centers of Excellence for influensa forskning og overvåkning (CEIRS) kontrakt nr. HHSN272201400005C (NYICE) og ved Department of Defense (DoD) peer anmeldt Medical Research program (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 665102
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Adobe Photoshop CS4 Adobe This software is used in 3.1.10 and 4.4.7
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 ° C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell Culture dishes 100mm Greiner Bio-one 664-160
ChemiDoc MP Imaging System BioRad This instrument is used in 4.4.7
Crystal Violet Thermo Fisher Scientific C581-100 Store at Room temperature
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
5 to 7 week-old female BALB/c mice National Cancer Institute (NCI) 555
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at Room temperature
IVIS Spectrum PerkinElmer 124262 This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)
IX81 Motorized Inverted Microscope Olympus Olympus IX81
Living Image 4.7.2 software PerkinElmer This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)
Lumicount Packard This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATCC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Retiga 20000R Fast1394 Camera Qimaging Retiga 2000R
Scanner HP
Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies Jackson 715-075-150 Store at -20 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. , 5th edition, Lippincott Williams and WIlkins. (2007).
  2. Martinez-Sobrido, L., Peersen, O., Nogales, A. Temperature Sensitive Mutations in Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complex Responsible for the Attenuation of the Live Attenuated Influenza Vaccine. Viruses. 10 (10), (2018).
  3. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), (2016).
  4. Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
  5. Louie, J. K., et al. A review of adult mortality due to 2009 pandemic (H1N1) influenza A in California. PLoS One. 6 (4), e18221 (2011).
  6. Barr, I. G., et al. Epidemiological, antigenic and genetic characteristics of seasonal influenza A(H1N1), A(H3N2) and B influenza viruses: basis for the WHO recommendation on the composition of influenza vaccines for use in the 2009-2010 Northern Hemisphere season. Vaccine. 28 (5), 1156-1167 (2010).
  7. Simonsen, L., et al. Impact of influenza vaccination on seasonal mortality in the US elderly population. A.M.A. archives of internal medicine. 165 (3), 265-272 (2005).
  8. McLean, H. Q., Peterson, S. H., King, J. P., Meece, J. K., Belongia, E. A. School absenteeism among school-aged children with medically attended acute viral respiratory illness during three influenza seasons, 2012-2013 through 2014-2015. Influenza and Other Respiratory Viruses. 11 (3), 220-229 (2017).
  9. Principi, N., Esposito, S. Protection of children against influenza: Emerging problems. Human Vaccines and Immunotherapeutics. , 1-8 (2017).
  10. Falsey, A. R., Treanor, J. J., Tornieporth, N., Capellan, J., Randomized Gorse, G. J. double-blind controlled phase 3 trial comparing the immunogenicity of high-dose and standard-dose influenza vaccine in adults 65 years of age and older. Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 172-180 (2009).
  11. Fuller, J. D., et al. Influenza vaccination of human immunodeficiency virus (HIV)-infected adults: impact on plasma levels of HIV type 1 RNA and determinants of antibody response. Clinical Infectious Diseases. 28 (3), 541-547 (1999).
  12. Carrat, F., Flahault, A. Influenza vaccine: the challenge of antigenic drift. Vaccine. 25 (39-40), 6852-6862 (2007).
  13. Doherty, P. C., Kelso, A. Toward a broadly protective influenza vaccine. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3273-3275 (2008).
  14. Fiore, A. E., et al. Prevention and control of influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP), 2010. MMWR Recommendations and Reports. 59 (RR-8), 1-62 (2010).
  15. Pica, N., Palese, P. Toward a universal influenza virus vaccine: prospects and challenges. Annual Review of Medicine. 64, 189-202 (2013).
  16. To, K. K., Chan, J. F., Chen, H., Li, L., Yuen, K. Y. The emergence of influenza A H7N9 in human beings 16 years after influenza A H5N1: a tale of two cities. Lancet Infectious Diseases. 13 (9), 809-821 (2013).
  17. Baker, S. F., Nogales, A., Santiago, F. W., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Competitive detection of influenza neutralizing antibodies using a novel bivalent fluorescence-based microneutralization assay (BiFMA). Vaccine. 33 (30), 3562-3570 (2015).
  18. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
  19. Kayali, G., et al. Testing human sera for antibodies against avian influenza viruses: horse RBC hemagglutination inhibition vs. microneutralization assays. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 73-78 (2008).
  20. Stephenson, I., et al. Reproducibility of serologic assays for influenza virus A (H5N1). Emerging Infectious Diseases. 15 (8), 1252-1259 (2009).
  21. Maher, J. A., DeStefano, J. The ferret: an animal model to study influenza virus. Lab Animal (NY). 33 (9), 50-53 (2004).
  22. Webster, R. G., Cox, N., Stoehr, K. WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev. 1. , (2002).
  23. Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  24. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. Journal of Virology. 89 (6), 3421-3426 (2015).
  25. Steel, J., Lowen, A. C., Mubareka, S., Palese, P. Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N. PLoS Pathogens. 5 (1), e1000252 (2009).
  26. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  27. Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nature Communications. 6, 6600 (2015).
  28. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  29. Perez, J. T., Garcia-Sastre, A., Manicassamy, B. Insertion of a GFP reporter gene in influenza virus. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15G 14 (2013).
  30. Reuther, P., et al. Generation of a variety of stable Influenza A reporter viruses by genetic engineering of the NS gene segment. Scientific Reports. 5, 11346 (2015).
  31. Tran, V., et al. Multi-Modal Imaging with a Toolbox of Influenza A Reporter Viruses. Viruses. 7 (10), 5319-5327 (2015).
  32. Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Perez, D. R., Martinez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A and B Viruses Expressing a Fluorescent Dynamic Timer Protein for In Vitro and In Vivo Studies. PLoS One. 11 (1), e0147723 (2016).
  33. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. , 206-216 (2014).
  34. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2015).
  35. Avilov, S. V., et al. Replication-competent influenza A virus that encodes a split-green fluorescent protein-tagged PB2 polymerase subunit allows live-cell imaging of the virus life cycle. Journal of Virology. 86 (3), 1433-1448 (2012).
  36. Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A Viruses Expressing Reporter Genes. Viruses. 8 (7), (2016).
  37. Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PLoS One. 9 (5), e97695 (2014).
  38. Karlsson, E. A., et al. Visualizing real-time influenza virus infection, transmission and protection in ferrets. Nature Communications. 6, 6378 (2015).
  39. Czako, R., et al. In Vivo Imaging of Influenza Virus Infection in Immunized Mice. MBio. 8 (3), (2017).
  40. Harding, A. T., Heaton, B. E., Dumm, R. E., Heaton, N. S. Rationally Designed Influenza Virus Vaccines That Are Antigenically Stable during Growth in Eggs. MBio. 8 (3), (2017).
  41. DiPiazza, A., et al. Pandemic 2009 H1N1 Influenza Venus reporter virus reveals broad diversity of MHC class II-positive antigen-bearing cells following infection in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 10857 (2017).
  42. Yan, D., et al. Replication-Competent Influenza Virus and Respiratory Syncytial Virus Luciferase Reporter Strains Engineered for Co-Infections Identify Antiviral Compounds in Combination Screens. Biochemistry. 54 (36), 5589-5604 (2015).
  43. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (Pt 24), 4247-4260 (2007).
  44. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  45. Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 592-600 (2012).
  46. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  47. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  48. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
  49. Vintersten, K., et al. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
  50. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
  51. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  52. Pan, W., et al. Visualizing influenza virus infection in living mice. Nat Commun. 4, 2369 (2013).
  53. Heaton, N. S., et al. In vivo bioluminescent imaging of influenza a virus infection and characterization of novel cross-protective monoclonal antibodies. J Virol. 87 (15), 8272-8281 (2013).
  54. Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476, 206-216 (2015).
  55. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent Bi-Reporter influenza A virus (BIRFLU) to evaluate viral infections. Journal of Virology. , (2019).
  56. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. Journal of Virology. 88 (18), 10525-10540 (2014).
  57. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. Journal of Virology. 90 (14), 6291-6302 (2016).
  58. National Research Council (U.S.). Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th edn, National Academies Press. (2011).
  59. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Chiem, K., Topham, D. J., DeDiego, M. L. Functional Evolution of the 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus NS1 and PA in Humans. Journal of Virology. 92 (19), (2018).
  60. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).

Tags

Immunologi og infeksjon influensa virus fluorescens bioluminesens replikering-kompetente virus reporter virus NanoLuc Nluc Venus fluorescerende protein viral infeksjon in vivo Imaging system IVIS mus
En luciferase-fluorescerende reporter influensa virus for Live Imaging og kvantifisering av viral infeksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiem, K., Rangel-Moreno, J.,… More

Chiem, K., Rangel-Moreno, J., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection. J. Vis. Exp. (150), e59890, doi:10.3791/59890 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter