Summary
Este artigo detalha o uso de um kit de preparação de biblioteca com base em reação em cadeia do polymerase multiplex seguido de sequenciamento de próxima geração para avaliar as fusões de genes oncogênicos em amostras de tumores sólidos clínicos. As etapas de análise de dados e de bancada úmida são descritas.
Abstract
As fusões do gene contribuem freqüentemente ao phenotype oncogênico de muitos tipos diferentes de cancro. Adicionalmente, a presença de certas fusões em amostras de pacientes oncológicos muitas vezes influencia diretamente o diagnóstico, o prognóstico e/ou a seleção da terapia. Em conseqüência, a deteção exata de fusões do gene transformou-se um componente crítico da gerência clínica para muitos tipos da doença. Até recentemente, a deteção clínica da fusão do gene foi realizada predominante com o uso de ensaios do único-gene. No entanto, a lista cada vez maior de fusões de genes com significância clínica criou uma necessidade de avaliar o status de fusão de múltiplos gene simultaneamente. Os testes baseados em sequenciamento da próxima geração (NGS) atenderam a essa demanda através da capacidade de sequenciar o ácido nucleico de forma massivamente paralela. Várias abordagens baseadas em NGS que empregam diferentes estratégias para o enriquecimento de alvos de genes estão agora disponíveis para uso em diagnósticos moleculares clínicos, cada um com seus próprios pontos fortes e fracos. Este artigo descreve o uso do enriquecimento do alvo do multiplex da PCR (ampère)-baseado ancorado e da preparação da biblioteca seguidos por NGS para avaliar para fusões do gene em espécimes contínuos clínicos do tumor. O AMP é único entre abordagens de enriquecimento baseadas em amplicon, pois identifica fusões genéticas, independentemente da identidade do parceiro de fusão. Detalhado aqui estão as etapas da análise do molhado-banco e de dados que asseguram a deteção exata da fusão de gene das amostras clínicas.
Introduction
A fusão de dois ou mais genes em uma única entidade transcricional pode ocorrer como o resultado de variações cromossomáticas da grande escala que incluem deleções, duplicações, inserções, Inversions, e translocations. Por meio do controle transcricional alterado e/ou das propriedades funcionais alteradas do produto genético expresso, esses genes de fusão podem conferir propriedades oncogênicas a células cancerosas1. Em muitos casos, os genes da fusão são sabidos para actuar como excitadores oncogênico preliminares ativando diretamente a proliferação celular e as vias de sobrevivência.
A relevância clínica de fusões do gene para pacientes de cancro tornou-se primeiramente aparente com a descoberta do cromossoma de Philadelphfia e do gene correspondente da fusão BCR-ABL1 na leucemia Myelogenous crônica (CML)2. O mesylate pequeno do imatinib do inibidor da molécula foi desenvolvido para alvejar especificamente este gene da fusão e demonstrou a eficácia notável em pacientes BCR-ABL1-positivos de CML3. A segmentação terapêutica de fusões genéticas oncogênicas também tem sido bem-sucedida em tumores sólidos, com inibição de genes de fusão ALK e ROS1 em câncer de pulmão de células não pequenas servindo como exemplos primários4,5. Recentemente, o inibidor de NTRK larotrectinib foi aprovado pela FDA para tumores sólidos NTRK1/2/3 Fusion-positive, independentemente do local da doença6. Além da seleção da terapia, a deteção da fusão de gene igualmente tem papéis no diagnóstico e no prognóstico da doença. Isto é particularmente prevalente em vários sarcoma e subtipos de malignidade hematológica que são diagnosticticamente definidos pela presença de fusões específicas e/ou para que a presença de uma fusão informa diretamente o prognóstico7,8 , 9 anos de , 10 de , 11. These são mas alguns dos exemplos da aplicação clínica da deteção da fusão genética para pacientes de cancro.
Devido ao papel crítico na tomada de decisão clínica, a deteção exata da fusão de gene das amostras clínicas é da importância vital. As técnicas numerosas foram aplicadas em laboratórios clínicos para a fusão ou a análise cromossomática do rearranjo que incluem: Técnicas citogénicas, reacção em cadeia reversa da polimerase da transcrição (RT-PCR), hibridação in situ da fluorescência (peixes), imunohistoquímica (IHC) e análise de desequilíbrio de expressão 5 '/3 ' (entre outros)12,13,14,15. Presentemente, a lista ràpida de expansão de fusões de gene acionáveis no cancro conduziu à necessidade de avaliar simultaneamente o status da fusão de genes múltiplos. Conseqüentemente, algumas técnicas tradicionais que só podem consultar um ou alguns genes de cada vez estão se tornando abordagens ineficientes, especialmente quando se considera que as amostras de tumores clínicos são muitas vezes muito finitas e não são amáveis para serem divididas entre vários ensaios. O sequenciamento da próxima geração (NGS), no entanto, é uma plataforma de análise que é bem adequada para testes de múltiplos genes, e os ensaios baseados em NGS tornaram-se comuns em laboratórios clínicos de diagnóstico molecular.
Os ensaios de NGS usados atualmente para a detecção de fusão/rearranjo variam em relação ao material de entrada utilizado, às químicas empregadas para preparação da biblioteca e ao enriquecimento alvo, e ao número de genes consultados dentro de um ensaio. Os ensaios de NGS podem ser baseados em RNA ou DNA (ou ambos) extraídos da amostra. Embora a análise RNA-baseada seja dificultada pela tendência de amostras clínicas para conter o RNA altamente degradado, contorna a necessidade de sequenciar os íntrons grandes e frequentemente repetitivos que são os alvos do teste DNA-baseado da fusão mas provaram ser difíceis para NGS análise de dados16. Estratégias de enriquecimento alvo para ensaios de NGS baseados em RNA podem ser amplamente divididas em abordagens de captura híbrida ou mediadas por amplicon. Embora ambas as estratégias tenham sido utilizadas com sucesso para a detecção de fusão, cada uma delas contém vantagens sobre os outros17,18. Os ensaios de captura híbrida geralmente resultam em bibliotecas mais complexas e reduziram o abandono alélico, enquanto os ensaios baseados em amplicon geralmente exigem uma entrada mais baixa e resultam em menos seqüenciamento fora do alvo19. No entanto, talvez a principal limitação do enriquecimento tradicional baseado em amplicon seja a necessidade de primers para todos os parceiros de fusão conhecidos. Isto é problemático, uma vez que muitos genes clinicamente importantes são conhecidos por fundir-se com dezenas de parceiros diferentes, e mesmo se o design da cartilha permitiu a detecção de todos os parceiros conhecidos, novos eventos de fusão permaneceria sem ser detectado. Uma técnica recentemente descrita denominada PCR multiplex ancorada (ou AMP para abreviação) aborda essa limitação20. No AMP, um adaptador NGS ' semifuncional ' é ligado a fragmentos de cDNA que são derivados do RNA de entrada. O enriquecimento do alvo é conseguido pela amplificação entre primers específicos do gene e uma primeira demão ao adaptador. Como resultado, todas as fusões de genes de interesse, mesmo que um novo parceiro de fusão esteja envolvida, devem ser detectadas (ver Figura 1). Este artigo descreve o uso do kit ArcherDx FusionPlex Solid tumor, um ensaio baseado em NGS que emprega AMP para o enriquecimento alvo e preparação da biblioteca, para a detecção de fusões de genes oncogênicos em amostras de tumores sólidos (ver tabela complementar 1 para lista completa de genes). O protocolo de bancada úmida e as etapas de análise de dados foram rigorosamente validadas em um laboratório com certificação de alterações clínicas de melhoramento laboratorial (CLIA).
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Protocol
1. preparação e sequenciamento de bibliotecas
- Considerações gerais sobre o ensaio e etapas de pré-ensaio
- As funcionamentos do ensaio consistem tipicamente em sete amostras clínicas e em um controle positivo (embora o número de amostras por a execução da preparação da biblioteca possa ser ajustado como necessário). Use um controle positivo que contenha pelo menos diversas fusões genéticas (que os alvos do ensaio) que foram confirmados por um fabricante e/ou tenham sido confirmados por uma metodologia ortogonal. Um controle não-modelo (NTC) deve ser incluído como uma amostra adicional em cada ensaio executado, mas só é realizado através de síntese de cDNA segunda vertente e pré-sequenciamento controle de qualidade (pre-Seq QC; para garantir nenhuma síntese de cDNA). Use diluente de amostra (10 mM Tris HCl pH 8,0) para o NTC.
- Realize a extração do ácido nucleico total (TNA) do tecido de parafina-encaixado formalin-fixado (FFPE).
- Quantificar o componente RNA da TNA usando um ensaio fluorométrico.
Nota: impeça a degradação do RNA nas amostras limitando ciclos freeze-thaw, mantendo o ácido nucleico descongelado na baixa temperatura (bloco, gelo, ou alternativa refrigerados), e impedindo a contaminação do RNase (luvas desgastando, usando um pulverizador do decontaminador de RNase).
- Priming aleatório
Nota: a entrada desejada para o ensaio é de 200 ng RNA (baseado na quantificação fluorométrica do TNA). As entradas mais baixas podem ser usadas se 200 ng não pode ser conseguido. Se a amostra falha pós-sequenciamento QC, repetindo com entrada mais alta pode resultar em métricas aceitáveis de QC.- Diluir TNA em 10 mM Tris HCl pH 8,0 para atingir a concentração de RNA desejada. Para cada amostra, transfira 20 μL da diluição para os tubos de tira de reagente de escorva aleatória (colocados no bloco de alumínio pré-refrigerado) e misture pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes. Gire momentaneamente para baixo e transfira o volume inteiro a uma placa do PCR do poço 96 e sele-o com película do RT.
- Introduza a placa no bloco do termociclador, cubra com almofada de compressão, e feche a tampa. Incubar a 65 ° c durante 5 min (tampa aquecida).
- Remova a placa do termociclador e coloc no gelo por 2 minutos.
- Síntese do cDNA da primeira vertente
- Transfira todo o volume do produto de escorvamento aleatório para os primeiros tubos de tira de reagente da vertente (colocados no bloco de alumínio pré-refrigerado). Misturar pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes. Gire momentaneamente para baixo, transfira o volume inteiro a uma placa do PCR do poço 96 e sele-o com película do RT.
- Introduza a placa no bloco do termociclador, cubra com almofada de compressão, e feche a tampa. Programa do termociclador do funcionamento: 25 ° c 10 minutos, 42 ° c 30 minutos, 80 ° c 20 minutos, preensão de 4 ° c (tampa aquecida).
- Síntese do cDNA da segunda vertente
- Em um novo conjunto de tubos de tiras de PCR, crie uma diluição 1:10 do primeiro produto da vertente adicionando 1 μL de produto da primeira vertente a 9 μL de água livre de nuclease. Defina a diluição de lado para ser utilizada no ensaio pre-Seq QC.
- Adicionar 21 μL de água livre de nuclease ao produto remanescente da primeira vertente. Transferir 40 μL do primeiro produto da vertente e da água nuclease livre para o tubo de tira de reagente da segunda vertente (colocado no bloco de alumínio pré-refrigerado). Misturar pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes. Gire para baixo, transfira o volume inteiro a uma placa do PCR do poço 96 e sele-o com película do RT.
- Introduza a placa no bloco do termociclador, cubra com almofada de compressão, e feche a tampa. Programa do termociclador do funcionamento: 16 ° c 60 minuto, 75 ° c 20 minutos, preensão de 4 ° c (tampa heated).
Nota: Este é um ponto de paragem aceitável. A placa pode ser armazenada a-20 ° c.
- Pre-Seq QC
Nota: Este ensaio de controle de qualidade (QC) é usado principalmente para verificação de nenhuma síntese de cDNA do NTC. No entanto, os dados também podem ser informativos na solução de problemas de ensaio. Por exemplo, se uma amostra tem um bom valor pre-Seq QC mas as métricas de ensaio pobres (veja abaixo), então pode ser uma indicação de um problema na execução do ensaio, necessitando de uma repetição.- Execute cada amostra e o NTC em duplicado. Também incluem no pre-Seq QC executar uma reação NTC, que é nuclease água livre (também executado em duplicado). Para cada poço aplicável de uma placa óptica 96 bem adicionar 5 μL da mistura mestre de ensaio, 1 μL de primer VCP 10x, e 4 μL da diluição 1:10 do primeiro produto vertente que foi criado no passo 1.4.1.
- Sele a placa com película do RT, gire para baixo, e carregue-a em um instrumento quantitativo do PCR (qPCR). Executar o programa: pre-amp: 1 ciclo 95 ° c 20 s, amp: 35 ciclos 95 ° c 3 s (4,4 ° c/s taxa de rampa) − 60 ° c 30 s (2,2 ° c/s taxa de rampa).
- Confirme a falta de um valor do limiar do ciclo (CT) para o NTC do ensaio e a reação NTC.
Nota: se não houver TC observada no ensaio NTC, este não será mais transportado para o ensaio. A observação de um valor do CT na reação NTC necessita uma repetição do ensaio pre-Seq do QC. A observação de um CT no ensaio NTC sugere a contaminação da amostra em algum ponto prévio no ensaio, exigindo assim que o ensaio inteiro (todas as amostras) seja começado sobre. O valor de pre-Seq QC CT para uma amostra de qualidade adequada deve ser inferior a 30 (valores de CT inferiores correlacionam com mais produto e, portanto, maior qualidade de RNA). Valores acima de 30 não são indicadores absolutos de falha e essas amostras devem ser continuadas no ensaio. Entretanto, todos os dados derivados de tais amostras devem ser revistos com cuidado, particular nos casos para que nenhuma fusão é chamada.
- Reparo da extremidade e purificação do grânulo
- Transferir 40 μL do segundo produto da vertente para o tubo de tira do reagente de reparação final (colocado no bloco de alumínio pré-refrigerado). Misture com pipetagem para cima e para baixo 6 − 8 vezes, gire para baixo e coloque em bloco termociclocador (mantendo a tampa aquecida aberta) e execute o programa termociclador: 25 ° c 30 min, 4 ° c Hold.
- Retire os grânulos de purificação de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. Compo o suficiente 70% etanol para durar ao longo de toda a preparação da biblioteca. O Vortex Perla bem antes do uso e o Pipet 100 μL no número apropriado de poços de uma placa do U-fundo.
Nota: para cada 8 amostras que são executadas, serão necessários 20 mL de etanol a 70%. - Adicione o volume inteiro do produto final do reparo aos grânulos. Pipet acima e para baixo 6 − 8 vezes para misturar e incubar na temperatura ambiente por 5 minutos, seguido por uma incubação de 5 minutos no ímã.
- Remover e descartar o sobrenadante e realizar 2 200 μL 70% lavagens de etanol com 30-s incubações. Após a lavagem final remover todos os 70% etanol e deixe secar ao ar por 5 min.
- Retire do íman e Resuspenda os grânulos em 22 μL de 10 mM de Tris HCl pH 8,0. Incubar o íman durante 3 min seguido de uma incubação de 2 min no íman. Proceder imediatamente ao passo de ligadura 1.
- Etapa 1 da ligadura e purificação do grânulo
- Transfira 20 μL da placa da purificação do grânulo do reparo da extremidade (que toma o cuidado para não perturbar a pelota do grânulo) nos tubos de tira da etapa 1 da ligadura (coloc no bloco de alumínio pre-refrigerado). Misture pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes, gire para baixo e transfira o volume inteiro em uma placa do PCR do poço 96.
- Introduza a placa no bloco do termociclador, cubra com almofada de compressão e feche a tampa. Execute o programa do termociclador: 37 ° c 15 minutos, preensão de 4 ° c (tampa aquecida).
- Retire os grânulos de purificação de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. O Vortex Perla bem antes do uso e o Pipet 50 μL no número apropriado de poços de uma placa do U-fundo.
- Adicionar todo o volume de ligadura passo 1 produto para as contas. Pipet acima e para baixo 6 − 8 vezes para misturar e incubar na temperatura ambiente por 5 minutos, seguido por uma incubação de 5 minutos no ímã.
- Remover e descartar o sobrenadante e realizar 2 200 μL 70% lavagens de etanol com 30-s incubações. Após a lavagem final remover todos os 70% etanol e deixe secar ao ar por 5 min.
- Retire do íman e Resuspenda os grânulos em 42 μL de 10 mM de Tris HCl pH 8,0. Incubar o íman durante 3 min seguido de uma incubação de 2 min no íman. Proceder imediatamente ao passo 2 da ligadura.
- Etapa 2 da ligadura e purificação do grânulo
- Remova os reagentes do tubo de tira do adaptador de código de barras molecular (MBC) do armazenamento de 4 ° c. A numeração adequada da faixa do adaptador MBC é extremamente importante, pois os índices específicos de amostra são adicionados neste momento. Posicione os tubos horizontalmente com as dobradiças para trás e use um marcador permanente para rotular os tubos 1, 2, 3... da esquerda para a direita. Também é crítico para registrar os índices específicos de amostra para fins de sequenciamento (eles devem ser inseridos na planilha seqüenciador).
- Transferir 40 μL da placa de purificação do talão da etapa 1 da ligadura (tomando cuidado para não perturbar a pelota do grânulo) para os tubos de tira do adaptador MBC (colocados no bloco de alumínio pré-refrigerado). Misturar pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes.
- Gire para baixo e transfira o volume inteiro aos tubos de tira do reagente da etapa 2 da ligadura (igualmente coloc no bloco de alumínio pre-refrigerado). Misture pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes, gire para baixo e coloque no bloco termociclocador. Com a tampa aquecida fora funcione o programa do termociclador: 22 ° c 5 minutos, preensão de 4 ° c.
Nota: Este é um ponto de paragem seguro e as amostras podem ser armazenadas a-20 ° c. - Remova as contas de limpeza de ligadura do armazenamento de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. Prepare 1 mL de NaOH fresco de 5 mM.
- Vortex as contas de limpeza de ligadura e adicione 50 μL a um novo conjunto de tubos de tiras de PCR. Incubar no íman durante 1 min. Após o 1-min incubação remover e descartar sobrenadante. Remova os tubos de tira do ímã e Resuspenda em 50 μL do tampão da limpeza da ligadura introduzindo com pipetas acima e para baixo 6 − 8 vezes.
- Transfira o volume inteiro do produto da etapa 2 da ligadura nos tubos da tira do grânulo da limpeza da ligadura. Misture as amostras por vortexing e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Novamente, misture amostras por vortexing e incubar à temperatura ambiente por mais 5 min. Após a segunda incubação de 5 min, misture as amostras por vortexing, gire para baixo brevemente e incubar no ímã por 1 minuto.
- Remova e descarte o sobrenadante. Adicione 200 μL de tampão de limpeza de ligadura e Vortex para resuspender. Realize uma rotação rápida e coloque no íman durante 1 min. realize uma segunda lavagem com o tampão de limpeza de ligadura novamente.
- Depois que as duas lavagens com o tampão da limpeza da ligadura executam uma lavagem idêntica usando a água ultrapura. Após a lavagem de água ultrapura, re-suspender os grânulos em 20 μL de NaOH de 5 mM e transferir para uma placa de PCR 96 bem. Coloc a placa no bloco do termociclador com uma almofada de compressão e funcione o programa do termociclador: 75 ° c 10 minutos, preensão de 4 ° c (tampa aquecida).
- Gire para baixo a placa do PCR uma vez que as amostras esfriaram a 4 ° c. Coloque a placa no íman durante pelo menos 3 min e proceda imediatamente à primeira PCR.
- Primeiro PCR e purificação do grânulo
- Retire os primeiros tubos de reagente de PCR de 4 ° c armazenamento e coloque em um bloco de alumínio pré-refrigerado. Além disso, retire os primers GSP1 de-20 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente.
- Adicionar 2 μL dos primers GSP1 a cada poço dos primeiros tubos de reagente de PCR. Transfira 18 μL do produto de limpeza da ligadura 2 para os primeiros tubos de tira de reagente PCR e misture com pipetagem para cima e para baixo 6 − 8 vezes.
- Gire para baixo e transfira a uma placa do PCR do poço 96. Coloc a placa no bloco do termociclador com uma almofada de compressão e funcione o programa do termociclador: 95 ° c 3 minuto, 15 ciclos 95 ° c 30 s − 65 ° c 5 minuto (taxa da rampa 100%), 72 ° c 3 minuto, preensão de 4 ° c (tampa aquecida).
Nota: Este é um ponto de paragem seguro e as amostras podem ser armazenadas a 4 ° c durante a noite ou a-20 ° c para armazenamento a longo prazo. - Retire os grânulos de purificação de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. O Vortex Perla bem antes do uso e o Pipet 24 μL no número apropriado de poços de uma placa do U-fundo.
- Transfira 20 μL do primeiro produto de PCR para os 24 μL de grânulos. Pipet acima e para baixo 6 − 8 vezes para misturar e incubar na temperatura ambiente por 5 minutos, seguido por uma incubação de 2 minutos no ímã.
- Remover e descartar o sobrenadante e realizar 2 200 μL 70% lavagens de etanol com 30-s incubações. Após a lavagem final remover todos os 70% etanol e deixe secar ao ar por 2 min.
- Retire do íman e Resuspenda os grânulos em 24 μL de 10 mM de Tris HCl pH 8,0. Incubar o íman durante 3 min seguido de uma incubação de 2 min no íman. Prossiga imediatamente para a segunda PCR.
- Segundo PCR e purificação do grânulo
- Remova os tubos de tira do reagente do segundo PCR de 4 ° c e coloc em um bloco de alumínio pre-refrigerado. A numeração apropriada dos segundos tubos da tira do PCR é crìtica importante porque os índices amostra-específicos são adicionados neste momento. Posicione os tubos horizontalmente com as dobradiças para trás e use um marcador permanente para rotular os tubos 1, 2, 3... da esquerda para a direita. Além disso, retire os primers GSP2 de-20 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente.
Observação: também é crítico para registrar os índices específicos de amostra para fins de sequenciamento (eles devem ser inseridos na planilha seqüenciador). - Adicionar 2 μL dos primers GSP2 a cada poço dos segundos tubos de reagente de PCR. Transfira 18 μL do primeiro produto da limpeza do PCR aos segundos tubos de tira do reagente do PCR e misture pipetando acima e para baixo 6 − 8 vezes.
- Gire para baixo e transfira a uma placa do PCR do poço 96. Coloc a placa no bloco do termociclador com uma almofada de compressão e funcione o programa do termociclador: 95 ° c 3 minutos, 18 ciclos 95 ° c 30 s − 65 ° c 5 minuto (taxa da rampa 100%), 72 ° c 3 minuto, preensão de 4 ° c (tampa aquecida).
Nota: Este é um ponto de paragem seguro e as amostras podem ser armazenadas a 4 ° c durante a noite ou a-20 ° c para armazenamento a longo prazo. - Retire os grânulos de purificação de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. O Vortex Perla bem antes do uso e o Pipet 24 μL no número apropriado de poços de uma placa do U-fundo.
- Transfira 20 μL do segundo produto do PCR aos grânulos. Pipet acima e para baixo 6 − 8 vezes para misturar e incubar na temperatura ambiente por 5 minutos, seguido por uma incubação de 2 minutos no ímã.
- Remover e descartar o sobrenadante e realizar 2 200 μL 70% lavagens de etanol com 30-s incubações. Após a lavagem final remover todos os 70% etanol e deixe secar ao ar por 2 min.
- Retire do íman e Resuspenda os grânulos em 24 μL de 10 mM de Tris HCl pH 8,0. Incubar o íman durante 3 min seguido de uma incubação de 2 min no íman. Transfira 20 μL do segundo produto da limpeza do PCR a uma placa nova do PCR de 96 poços.
Nota: Este é um ponto de parada seguro e as bibliotecas podem ser armazenadas em-20 ° c para o armazenamento a longo prazo ou proceder imediatamente à quantificação da biblioteca.
- Remova os tubos de tira do reagente do segundo PCR de 4 ° c e coloc em um bloco de alumínio pre-refrigerado. A numeração apropriada dos segundos tubos da tira do PCR é crìtica importante porque os índices amostra-específicos são adicionados neste momento. Posicione os tubos horizontalmente com as dobradiças para trás e use um marcador permanente para rotular os tubos 1, 2, 3... da esquerda para a direita. Além disso, retire os primers GSP2 de-20 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente.
- Quantificação da biblioteca
- Remova a mistura mestre de quantificação da biblioteca e os padrões do armazenamento de-20 ° c e deixe-o equilibrar à temperatura ambiente.
- Executar 1:5 diluição de todas as bibliotecas (segundo produto PCR) usando 10 mM Tris HCl pH 8,0 seguido por uma diluição serial de 1:199, 1:199 e 20:80 usando 10 mM Tris HCl pH 8,0 0, 5% Polissorbato. As duas diluições finais de 1:200000 e 1:1000000, respectivamente, serão executadas em triplicado.
- Adicione 6 μL de mistura mestra a cada poço de uma placa óptica 96 bem seguida de 4 μL de diluição ou padrão apropriado. Gire para baixo a placa e carregue-a no instrumento de qPCR. Utilize as seguintes condições de ciclismo: 1 ciclo 95 ° c 5 min, 35 ciclos 95 ° c 30 s (4,4 ° c/s taxa de rampa) − 60 ° c 45 s (2,2 ° c/s taxa de rampa).
- Depois que a quantificação da biblioteca é completa e as concentrações da biblioteca são determinadas (com a média de ambas as diluições testadas), normalizar todas as bibliotecas a 2 nanômetro usando o pH 8,0 de 10 milímetros Tris HCl. Faça o pool da biblioteca combinando 10 μL de cada biblioteca normalizada em um micro tubo de centrifugação de 1,5 mL.
- Sequenciamento de bibliotecas
- Remova o cartucho de reagente do sequenciador de-20 ° c de armazenamento e coloque em água deionizada (DI) até a linha de enchimento por pelo menos 1 h. Além disso, remova o kit de reagentes do sequenciador de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. O número máximo de bibliotecas que podem ser seqüenciadas nesta plataforma de sequenciamento é 8 (um dos quais deve ser o controle positivo).
- Faça o pool de biblioteca de amplicon (DAL) desnaturado combinando 10 μL do pool de biblioteca com 10 μL de NaOH 0,2 N e incubar por 5 minutos na temperatura ambiente. Após a incubação de 5 min, adicione 10 μL de 200 mM de Tris HCl pH 7,0, seguido de 970 μL de tampão de hibridação HT1.
- Faça o tubo de carga final combinando 300 μL de HT1 μL de 20 pM PhiX e 675 μL do pool DAL. Vortex e gire para baixo o tubo de carga. Adicionar todo o volume do tubo de carga para o poço de amostra do cartucho de reagente Sequencer e cartucho de carga para o sequenciador executando 2 x 151 BP lê com 2 x 8 leituras de índice.
2. análise de dados
- Tratamento e análise de dados de sequenciamento
- Baixe métricas de sequenciamento do instrumento NGS.
- Assegure-se de que os dados de sequenciamento se enquadra nos intervalos abaixo (específicos para o kit usado neste exemplo). Densidade do aglomerado (densidade [K/mm2]): 945 – 1600 k; % de leituras passando filtro (clusters PF [%]): > 90%; escores de qualidade (% ≥ p30): > 85%; Alinhamento de PhiX (alinhado%): 1.5 − 6.0%; Taxa de erro de PhiX (taxa de erro [%]): < 1,0%; lê o filtro de passagem (lê PF [M]): > 22 milhões.
Observação: seqüenciamento execuções não atender a essas métricas estão sujeitas a repetição. - Revise o% de leituras atribuídas a cada amostra (ou seja, cada índice específico da amostra). Para uma corrida típica em que o pico PhiX-in foi de ~ 5% e 8 amostras foram sequenciadas, cada amostra deve idealmente respondem por aproximadamente 11,9% das leituras. O intervalo aceitável para cada amostra é de 5 − 25%. Se quaisquer amostras não couberam dentro deste intervalo, repita a quantificação e sequenciamento da biblioteca.
- Envio de dados brutos de sequência para o algoritmo de análise
Nota: a versão 4.1.1.7 da análise ArcherDx é descrita aqui. Neste exemplo, o software de análise é implantado como uma ' máquina virtual ' executada em um servidor interno. Uma unidade de processamento central (CPU) e 12 GB de memória de acesso aleatório (RAM) são necessárias para cada amostra a ser analisada simultaneamente (normalmente 8 amostras são processadas simultaneamente exigindo 8 CPU e 96 GB de RAM). O processamento toma tipicamente 3 − 8 h.- Use as configurações de análise padrão dentro do sistema de análise, com exceção de MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (isso é alterado de 10 para 20) e READ_DEPTH_NORMALIZATION (isso é definido como 0 para evitar a amostragem).
- Para iniciar um trabalho de análise, clique em executar análise na interface do usuário, envie um nome para o trabalho e, em seguida, selecione os arquivos fastq necessários (garantindo que ambas as leituras [R1 e R2] sejam selecionadas para cada amostra).
- Selecione a fusão do RNA para tipos da análise do RNA, Illumina (emparelhado) para a plataforma, e o painel contínuo do tumor de fusionplex para a região do alvo. Em seguida, clique em submeter análise.
- Interpretação dos dados do ensaio
- Abra a interface do usuário do sistema de análise e selecione o trabalho desejado. Selecione a amostra de controle positivo. Certifique-se de que todas as fusões esperadas e isoformas oncogênicas foram detectadas e listadas na guia evidência forte .
Nota: se qualquer uma das fusões controladas no controle positivo não for detectada para uma determinada execução do ensaio, pode ser uma indicação de um problema nessa execução, o que requer uma repetição (do início do ensaio). - Examine as estatísticas de leitura para cada amostra clínica na execução clicando na guia ler estatísticas . Cada amostra deve ser representada por pelo menos 1 milhão fragmentos totais. Se menos de 1 milhão, re-Sequence a biblioteca com considerações para o re-quantificação para assegurar-se de que a quantificação inicial não fosse aberrantemente elevada.
Nota: as amostras da boa qualidade exibirão geralmente no alvo% > 85%, e os escaninhos MOLECULARS do RNA devem ser > 20000 e compreendem > 30% das leituras. No entanto, a falha ao atender a essas métricas não aciona automaticamente a falha de exemplo. - Inspecione a média de sites de início exclusivo por GSP2 valor de controle .
Nota: este valor é uma medida de sequenciamento de complexidade de primers para quatro genes de limpeza. Esta métrica é um determinante crítico da qualidade do RNA na amostra (se o sequenciamento de genes esperados para ser expresso na amostra é pobre, então a confiança na capacidade de detectar uma fusão genética expressa é baixa). O corte para esta métrica é 20. Se qualquer exemplo exibe um valor menor que 20, em seguida, os resultados para o exemplo devem ser relatados como não informativo se nenhuma fusão de alta confiança for encontrada. O status dessa métrica também pode ser determinado na página de resumo da execução (o status será listado como Fusion QC: Pass ou Fusion QC: número de sites de início de controle de RNA GSP2 exclusivo baixo dependendo se o valor é maior ou menor que 20). Uma fusão elevada da confiança em uma amostra que não passe esta métrica do QC pode ainda ser relatada se é determinada ser real (veja abaixo). Geralmente, maiores escores de CQ utilizando essa métrica correlacionam-se com escores inferiores de PreSeq CT, como esperado (Figura 2).
- Abra a interface do usuário do sistema de análise e selecione o trabalho desejado. Selecione a amostra de controle positivo. Certifique-se de que todas as fusões esperadas e isoformas oncogênicas foram detectadas e listadas na guia evidência forte .
- Interpretação de chamadas de fusão
- Examine cuidadosamente cada fusão chamada a guia de evidências fortes (a maioria das fusões de evidências fortes chamadas pelo sistema são artifactuais). Também Escaneie o escaninho fraco da fusão da evidência, embora a presença de uma fusão não-Artifactual neste escaninho seja um evento extremamente raro. Para avaliar a validade de uma fusão, primeiro anote as leituras (#/%) e iniciar métricas de sites .
Nota: geralmente, a confiança em uma fusão chamada aumenta a maior essas métricas são. As fusões que são suportadas por menos de 5 locais do começo e por menos de 10% das leituras da primeira demão de apoio devem ser consideradas como altamente suspeitas como sendo Artifactual. - Anote os ícones exibidos na coluna filtros .
Nota: diversos destes ícones alertam o usuário de uma fonte potencial de uma chamada vesícula. Freqüente entre estes (e encontrado primeiramente no escaninho fraco das evidências de fusões chamadas) são os exemplos onde os sócios são de conhecidos ou mostram a semelhança entre si na seqüência (indicando o alinhamento mal provável ou incorreto do mis-priming). Uma outra fonte comum de ligações vesícula da fusão ocorre quando as leituras que apoiam a fusão contêm uma taxa de erro elevada que seja indicativa do mapeamento pobre ao genoma da referência, e esta é associada com um ícone distinto. Os eventos de readthrough de transcriptional são identificados através de um outro ícone. Estes são comuns e geralmente são ignorados. Vários outros ícones também são usados na interface do usuário, mas uma descrição completa de todos está além do escopo deste artigo. Artefatos comuns que geralmente podem ser ignorados sem mais investigações incluem: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-Axl, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, rela-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8, e FCGR2C-Mast. - Visualize as leituras de suporte para cada fusão potencial clicando no link Visualizar na interface do usuário, que leva o usuário a uma exibição jbrowse baseada na Web de pileups de leituras de suporte de fusão individuais. Confirme que as leituras são geralmente livres da má combinação (embora algum ruído deva ser esperado), que uma proporção significativa (idealmente > 30 bases) das leituras alinha ao sócio da fusão, e que as seqüências imediatamente adjacentes ao ponto de interrupção entre os genes e os sítios de encadernação de primer estão livres de inserções ou eliminações. Confirme que a sequência alinhada inclui a porção 3 ' das sequências de encadernação de primer para primers que suportam as leituras de fusão (se 3 ' porções não estão incluídas, pode ser uma indicação de mis-escorva).
- Se as sequências de codificação de ambos os genes estiverem envolvidas na fusão, assegure-se de que o parceiro 3 ' permaneça no quadro. Estale sobre a ligação da tradução na relação (que dará um status verdadeiro ou falso para cada combinação da seqüência de referência) e igualmente confirma manualmente que o Fusion está no quadro com a inspeção dos pontos de interrupção chamados em um navegador do genoma. Os pontos de interrupção chamados podem ser determinados por pairando o mouse sobre os pontos vermelhos no esquema de fusão.
Nota: uma vez que a maioria (mas não todos) pontos de interrupção genômica para fusões legítimas ocorrem em regiões intrônicas e resultam em splicing em conjunto de exons inteiros, fusões em que os limites de exon compreendem os pontos de interrupção para ambos os parceiros são geralmente vistos com um grau maior de confiança. No entanto, uma vez que existem muitos exemplos publicados de pontos de interrupção mid-exonic em fusões, isso não deve ser usado como critérios absolutos na interpretação de uma fusão. - Para cada fusão, certifique-se manualmente de que as sequências adjacentes ao ponto de interrupção não sejam homologosas para as próximas bases contíguas esperadas para cada parceiro. Inspecione todos os exons contíguos possíveis em um navegador do genoma.
Nota: uma fonte comum da fusão vesícula é desalinhamento ou mis-escorva devido à homologia entre dois sócios do gene, e este não é chamado sempre pelo sistema através dos ícones descritos acima.
- Examine cuidadosamente cada fusão chamada a guia de evidências fortes (a maioria das fusões de evidências fortes chamadas pelo sistema são artifactuais). Também Escaneie o escaninho fraco da fusão da evidência, embora a presença de uma fusão não-Artifactual neste escaninho seja um evento extremamente raro. Para avaliar a validade de uma fusão, primeiro anote as leituras (#/%) e iniciar métricas de sites .
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Representative Results
Mostrado na Figura 3, figura 4 e Figura 5 são capturas de tela da interface de usuário de análise demonstrando resultados de uma amostra de adenocarcinoma de pulmão. Na Figura 3, o resumo da amostra é mostrado (superior) que lista as fusões de evidência fortes chamadas, bem como o status de QC (circulado em vermelho). A fusão de ADCK4-numbl (de que 3 isoformas é alistada) é ignorada imediatamente porque é um evento transcricional persistente do readthrough (anotado pelos ícones quebrados do círculo ao lado das listas). A parte inferior da Figura 3 é uma captura de tela da página ler estatísticas. As métricas particularmente informativas estão circulando em verde. A métrica de QC crítica que determina a natureza de passagem/reprovação da amostra é destacada em vermelho (esta é a métrica que dita o status de passagem/falha no resumo acima). Se este valor for inferior a 20, um resultado negativo de fusão é considerado "não informativo". A Figura 4 e a Figura 5 são capturas de tela dos esquemas de fusão (superior) e das visualizações jbrowse de leituras de suporte de fusão (inferior) para as duas fusões que justificou investigações adicionais. A fusão KIF5B-RET (Figura 4) demonstra um número elevado de leituras de apoio, um% elevado das leituras do primer que suporta a fusão, e um número elevado de locais do começo. Adicionalmente, diversos exons contíguos do sócio da fusão (KIF5B) são incluídos no alinhamento, a fusão foi verificada para estar no quadro, e as leituras que apoiam a fusão são geralmente livres da má combinação. Por estas razões, a fusão é considerada real e reportable. A fusão LOC101927681-PDGFRB (Figura 5) demonstra menores métricas de suporte. Além disso, a parcela do mapeamento das leituras ao sócio é relativamente curta e contem uma taxa de erro elevada, que sugira fortemente o desalinhamento e uma chamada vesícula da fusão. Finalmente, a sequência intrônica do Pdgfrb está incluída, sugerindo ainda um artefato (a maioria, mas não todas, as fusões legítimas são compostas unicamente de sequência que mapeia para codificar regiões de ambos os genes). Por estas razões, esta fusão é considerada um artefato e não reportable.
Figura 1: representação esquemática da abordagem amp. As abordagens tradicionais mediadas pelo amplicon para o enriquecimento alvo são limitadas pelo fato de que os primers são necessários para todos os parceiros de fusão. Assim, os sócios novos da fusão não serão detectados. No AMP, a cartilha oposta é específica para o adaptador, portanto, novos parceiros são detectados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: correlação entre o escore QC do PreSeq e o QC pós-sequenciamento. O PreSeq CT e os locais originais médios do começo por GSP2 valores do controle foram correlacionados para uma série de 100 amostras. Geralmente, como esperado, as contagens baixas de PreSeq correlacionam com valores mais elevados de SS/GSP2 (ambos são indicadores do RNA da boa qualidade). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exemplo de resumo da amostra e exibições de estatística de leitura. Parte superior: vista de um Sumário da amostra na interface de usuário com as fusões fortes da evidência alistadas. Bottom: visualização da página de estatísticas de leitura na interface do usuário. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: exemplo de uma chamada de fusão legítima. Parte superior: vista do esquema de fusão na interface do usuário. Fundo: JBrowse vista de leituras individuais apoiando a fusão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: exemplo de uma chamada de fusão vesícula. Parte superior: vista do esquema de fusão na interface do usuário. Fundo: JBrowse vista de leituras individuais apoiando a fusão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| AKT3 | EWSR1 | NOTCH1 | O PRKCA |
| Alk | FGFR1 | NOTCH2 | O PRKCB |
| ARHGAP26 | FGFR2 | NRG1 | RAF1 |
| Axl | FGFR3 | NTRK1 | RELA |
| Braf | FGR | NTRK2 | Ret |
| BRD3 | INSR | NTRK3 | ROS1 |
| BRD4 | MAML2 | O NUMBL | RSPO2 |
| EGFR | MAST1 | NUTM1 | RSPO3 |
| Erg | MAST2 | PDGFRA | Terc |
| ESR1 | Conheci | DO | TFE3 |
| ETV1 | DAS | PIK3CA | TFEB |
| ETV4 | Musk | PKN1 | THADA |
| ETV5 | MYB | PPARG | TMPRSS2 |
| ETV6 | |||
| O ensaio inclui primers específicos do gene para vários exons (e alguns introns) nos genes acima de 53. | |||
Tabela complementar 1: lista dos genes para que os primers gene-específicos estão incluídos no ensaio (a vários exons e introns).
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Discussion
O enriquecimento de alvo baseado em PCR multiplex e a preparação da biblioteca seguidos por sequenciamento de próxima geração são adequados para a avaliação de fusão genética multiplexada em amostras de tumores clínicos. Focalizando na entrada do RNA um pouco do que o ADN genomic, a necessidade de sequenciar íntrons grandes e repetitivos é evitada. Adicionalmente, desde que esta aproximação amplifica fusões do gene não obstante a identidade do sócio da fusão, as fusões novas são detectadas. Esta é uma vantagem crítica no Reino clínico, e houve muitos exemplos de fusões novas acionáveis do gene identificadas com o ampère relatado na literatura21,22,23,24, a 25.
Uma vez que o ensaio é baseado em RNA, é fundamental preservar a qualidade do RNA em amostras durante o processamento. É igualmente crítico determinar que amostras produziram o sequenciamento do RNA que é demasiado pobre confiar resultados negativos da fusão. Isto é conseguido pela avaliação de dados de sequenciamento de primers para quatro genes de limpeza. Se arranjar em seqüência destes genes é pobre, a seguir os resultados negativos da fusão são considerados uninformativa. Além disso, dada a complexidade e a multiplicidade de degraus de bancada úmida no ensaio, é importante incluir um controle de fusão positiva em cada ensaio. Ao fazer isso, as execuções de ensaios comprometidas tornam-se evidentes através da análise de eventos de fusão esperados no controle.
Como com todas as abordagens baseadas em amplicon, o AMP é altamente dependente do desempenho de primer individual. Ao avaliar vários exons de múltiplos genes, é inevitável que alguns primers não se realizem, assim como outros. Conseqüentemente, é crítico para que os usuários saibam onde o ensaio underrealize devido à ineficiência da primeira demão. Adicionalmente, os ensaios baseados em NGS requerem uma análise complexa de dados bioinformaticos. Se os algoritmos empregados não são pensativamente projetados, falso-negativo e falso-positivos resultados são prováveis. É muito importante que todas as fusões de genes chamadas por algoritmos de análise sejam inspecionadas manualmente pelo usuário.
Com uma lista cada vez maior de fusões de genes acionáveis que devem ser avaliadas em espécimes clínicos de tumores, o uso de ensaios multiplexados como AMP continuará aumentando nos laboratórios clínicos. As aplicações futuras da técnica incidirá provavelmente em combinar a fusão e a avaliação da mutação dentro de um único ensaio. Independentemente da abordagem do ensaio molecular, os usuários devem estar sempre cientes das limitações do ensaio e devem sempre estabelecer métricas de controle de qualidade para orientar a interpretação dos dados.
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Disclosures
D.L.A. recebeu honorários de consultoria da Bayer Oncology, Genentech, AbbVie, e Bristol Myers Squibb. O K. D. D recebeu viagens patrocinadas da ArcherDx.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo recurso compartilhado de patologia molecular da Universidade do Colorado (National Cancer Institute Cancer Center support Grant no. P30-CA046934) e pelo centro Colorado para a medicina personalizada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
References
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