Summary
Denne artikkelen detaljer bruk av en forankret multiplex polymerase kjede reaksjon-basert bibliotek forberedelse Kit etterfulgt av neste generasjons sekvensering å vurdere for kreftfremkallende gen fusjoner i kliniske solide tumor prøver. Fremgangsmåten for både våt benk og dataanalyse beskrives.
Abstract
Gene fusjoner ofte bidra til kreftfremkallende fenotype av mange ulike typer kreft. I tillegg, tilstedeværelsen av visse fusjoner i prøver fra kreftpasienter ofte direkte påvirker diagnose, prognose, og/eller terapi valg. Som følge av det har den nøyaktige oppdagelsen av gen fusjoner blitt en kritisk komponent i klinisk ledelse for mange sykdomstyper. Inntil nylig, klinisk gen fusjon deteksjon ble overveiende gjennomført gjennom bruk av enkelt-genet analyser. Den stadig voksende listen av gen-fusjoner med klinisk betydning har imidlertid skapt et behov for å vurdere fusjons status for flere gener samtidig. Neste generasjons sekvensering (NGS)-basert testing har møtt denne etterspørselen gjennom evnen til å sekvens nukleinsyre syre i massivt parallell måte. Flere NGS-baserte tilnærminger som benytter ulike strategier for gen mål berikelse er nå tilgjengelig for bruk i klinisk molekylær diagnostikk, hver med sine egne styrker og svakheter. Denne artikkelen beskriver bruken av forankret multiplex PCR (AMP)-basert mål berikelse og bibliotek forberedelse etterfulgt av NGS å vurdere for gen fusjoner i kliniske solide tumor prøver. AMP er unik blant amplicon-baserte berikelse tilnærminger i at den identifiserer genet fusjoner uavhengig av identiteten til Fusion partner. Detaljert her er både våt-benk og dataanalyse trinn som sikrer nøyaktig gen fusjon deteksjon fra kliniske prøver.
Introduction
Fusjonen av to eller flere gener i en enkelt transcriptional enhet kan forekomme som et resultat av stor skala kromosom variasjoner inkludert slettinger, duplikasjoner, innsettinger, inversions, og translokasjoner. Gjennom endrede transcriptional kontroll og/eller endrede funksjonelle egenskaper ved det uttrykte genet, kan disse fusjons genene tildele kreftfremkallende egenskaper til kreftceller1. I mange tilfeller er fusjons gener kjent for å fungere som primær kreftfremkallende sjåfører ved direkte aktivering av mobilnettet spredning og overlevelse trasé.
Den kliniske relevansen av gen fusjoner for kreftpasienter ble først klart med oppdagelsen av Philadelphia-kromosom og det korresponderende ABL1 Fusion- genet i Kronisk myelogen-LEUKEMI (KML)2. Den lille molekyl hemmer Imatinib mesylate ble utviklet for å spesifikt målrette dette fusjons genet og demonstrerte bemerkelsesverdig effekt i BCR-ABL1-positive KML-pasienter3. Terapeutisk målretting av kreftfremkallende Gene fusjoner har også vært vellykket i solide svulster, med hemming av ALK og ROS1 Fusion gener i ikke-liten celle lungekreft som primære eksempler4,5. Nylig var NTRK inhibitor larotrectinib FDA godkjent for NTRK1/2/3 Fusion-positive solide svulster, uavhengig av sykdom site6. Utover terapi valg, gen Fusion deteksjon har også roller i sykdoms diagnose og prognose. Dette er særlig utbredt i ulike sarkom og Hematologic kreft undergrupper som er diagnostisk definert av tilstedeværelsen av spesifikke fusjoner og/eller som tilstedeværelsen av en fusjon direkte informerer prognose7,8 , 9 andre priser , 10 andre , 11. Dette er bare noen eksempler på klinisk anvendelse av gen fusjon deteksjon for kreftpasienter.
På grunn av den kritiske rollen i klinisk beslutningstaking er nøyaktig gen fusjon deteksjon fra kliniske prøver av vital betydning. Tallrike teknikker har blitt brukt i kliniske laboratorier for fusjon eller kromosom omorganisering analyse inkludert: cytogenetisk teknikker, omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR), fluorescens in situ hybridisering (FISH), immunhistokjemi (IHC), og 5 '/3 ' uttrykk ubalanse analyse (blant andre)12,13,14,15. For tiden har den raskt voksende liste over nyttige gen fusjoner i kreft resulterte i behovet for å vurdere Fusion status for flere gener samtidig. Følgelig, noen tradisjonelle teknikker som bare kan søke en eller noen gener om gangen blir ineffektiv tilnærminger, spesielt når de vurderer at kliniske tumor prøver er ofte svært begrenset og ikke mottagelig for å bli delt mellom flere analyser. Neste generasjons sekvensering (NGS) er imidlertid en analyseplattform som egner seg godt til testing av flere gener, og NGS-baserte analyser har blitt vanlig i kliniske molekylær diagnostiske laboratorier.
For tiden brukes NGS analyser for fusjon/omorganisering deteksjon varierer i forhold til input materialet som brukes, kjemikalier ansatt for biblioteket forberedelse og målet berikelse, og antall gener spørres i en analyse. NGS-analyser kan baseres på RNA eller DNA (eller begge) som utvinnes fra prøven. Selv om RNA-basert analyse er hemmet av tendensen til kliniske prøver til å inneholde svært degradert RNA, omgår det behovet for å sekvens store og ofte repeterende introns som er målene for DNA-basert fusjons testing, men har vist seg å være vanskelig for NGS dataanalyse16. Mål berikelse strategier for RNA-baserte NGS analyser kan i stor grad deles inn i hybrid fangst eller amplicon-mediert tilnærminger. Mens begge strategiene har blitt utnyttet for fusjon deteksjon, inneholder hver fordeler over den andre17,18. Hybrid fangst analyser generelt resultere i mer komplekse biblioteker og redusert allel frafall, mens amplicon-baserte analyser generelt krever lavere input og resultere i mindre off-mål sekvensering19. Men kanskje den primære begrensningen av tradisjonell amplicon berikelse er behovet for grunning til alle kjente Fusion partnere. Dette er problematisk siden mange klinisk viktige gener er kjent for å fusjonere med dusinvis av forskjellige partnere, og selv om primer design tillatt for påvisning av alle kjente partnere, ville romanen Fusion hendelser forbli uoppdaget. En nylig beskrevet teknikk betegnes forankret multiplex PCR (eller AMP for kort) adresser denne begrensningen20. I AMP er en "halv funksjonell" NGS-adapter ligaturer til cDNA-fragmenter som er avledet fra inn data RNA. Mål berikelse oppnås ved forsterkning mellom gen spesifikke primere og en primer til adapteren. Som et resultat, alle fusjoner til gener av interesse, selv om en roman Fusion partner er involvert, bør oppdages (se figur 1). Denne artikkelen beskriver bruken av ArcherDx FusionPlex solid tumor Kit, en NGS-basert analysen som sysselsetter AMP for målet berikelse og bibliotek forberedelse, for påvisning av kreftfremkallende gen fusjoner i solide tumor prøver (se supplerende tabell 1 for fullstendig gen liste). Den våte-benk protokoll og dataanalyse trinnene har blitt grundig validert i et klinisk laboratorium Improvement endringer (CLIA)-sertifisert laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. biblioteks forberedelser og sekvenser
- Generelle analysen betraktninger og pre-analysen trinn
- Analysen går vanligvis består av syv kliniske prøver og en positiv kontroll (selv om antall prøver per bibliotek forberedelse kjøre kan justeres etter behov). Bruk en positiv kontroll som inneholder minst flere gen fusjoner (som analysen mål) som har blitt bekreftet av en produsent og/eller har blitt bekreftet av en ortogonale metodikk. En ikke-mal kontroll (NTC) må inkluderes som en ekstra prøve i hver analysen kjøre, men er bare gjennomføres gjennom andre strand cDNA syntese og pre-sekvensering kvalitetskontroll (pre-SEQ QC; for å sikre at ingen cDNA syntese). Bruk prøve fortynningsmiddel (10 mM Tris HCl pH 8,0) for NTC.
- Utføre total nukleinsyre syre (TNA) ekstraksjon av formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vev.
- Kvantifisere RNA komponenten av TNA ved hjelp av en fluorometric analysen.
Merk: forhindre RNA degradering i prøvene ved å begrense fryse-tine sykluser, holde tint nukleinsyre acid ved lav temperatur (kjølt blokk, is, eller alternativ), og forebygge RNase forurensning (iført hansker, ved hjelp av en RNase vannbasert spray).
- Tilfeldig grunning
Merk: ønsket inngang for analysen er 200 ng RNA (basert på fluorometric kvantifisering av TNA). Lavere innganger kan brukes hvis 200 ng ikke kan oppnås. Hvis prøven mislykkes post-sekvensering QC, gjenta med høyere input kan resultere i akseptable QC-beregninger.- Fortynne TNA i 10 mM Tris HCl pH 8,0 for å oppnå ønsket RNA-konsentrasjon. For hver prøve overfører du 20 μL av fortynning i de tilfeldige reagens strimmel rørene (plassert i pre kjølt aluminiumsblokk) og blandes med pipettering opp og ned 6 − 8 ganger. Snurr kort ned og Overfør hele volumet til en 96 brønn PCR-plate og forsegle med RT-film.
- Sett inn plate i thermocycler blokk, dekk med kompresjons pute, og tett lokk. Ruge ved 65 ° c i 5 min (oppvarmet lokk).
- Fjern platen fra thermocycler og plasser på isen i 2 min.
- Første strand cDNA syntese
- Overfør hele volumet av det tilfeldige priming produktet til den første tråden reagens strimmelen rør (plassert i pre-kjølt aluminium blokk). Bland med pipettering opp og ned 6 − 8 ganger. Snurr kort ned, overføre hele volumet til en 96 brønn PCR plate og forsegle med RT film.
- Sett inn plate i thermocycler blokk, dekk med kompresjons pute, og tett lokk. Run thermocycler program: 25 ° c 10 min, 42 ° c 30 min, 80 ° c 20 min, 4 ° c hold (oppvarmet lokk).
- Andre strand cDNA syntese
- I et nytt sett med PCR-rør oppretter du en 1:10 fortynning av det første tråd produktet ved å tilsette 1 μL av første tråd produkt til 9 μL nuklease fritt vann. Angi fortynning til side for å bli brukt i pre-SEQ QC-analysen.
- Tilsett 21 μL av nuklease fritt vann til det resterende første tråd produktet. Transfer 40 μL av det første tråd produktet og nuklease fritt vann til den andre tråden reagens strimmel røret (plassert i pre kjølt aluminiumsblokk). Bland med pipettering opp og ned 6 − 8 ganger. Spinn ned, Overfør hele volumet til en 96 brønn PCR-plate og forsegle med RT-film.
- Sett inn plate i thermocycler blokk, dekk med kompresjons pute, og tett lokk. Run thermocycler program: 16 ° c 60 min, 75 ° c 20 min, 4 ° c hold (oppvarmet lokk).
Merk: Dette er et akseptabelt stoppested. Platen kan oppbevares ved-20 ° c.
- Forhånds-SEQ QC
Merk: denne kvalitetskontroll (QC) analysen brukes primært for verifisering av ingen cDNA syntese fra NTC. Imidlertid kan dataene også være informative i analysen feilsøking. For eksempel, hvis en prøve har en fint pre-SEQ QC salgsverdi bortsett fra fattig analysen Metrisk (se neden) så den kunne være en angivelse av en problem inne analysen løpe, nødvendiggjør en gjentagelse.- Kjør hver prøve og NTC i duplikat. Også inkludere i pre-SEQ QC kjøre en reaksjon NTC, som er nuklease gratis vann (også kjøre i duplikat). Til hver gjeldende brønn av en optisk 96 brønn plate tilsett 5 μL av analysen Master mix, 1 μL av 10x VCP primer, og 4 μL av 1:10 fortynning av første tråd produktet som ble opprettet i trinn 1.4.1.
- Forsegle platen med RT film, spinne ned, og laste inn et kvantitativ PCR (qPCR) instrument. Kjør programmet: pre-amp: 1 syklus 95 ° c 20 s, amp: 35 sykluser 95 ° c 3 s (4,4 ° c/s rampe hastighet) − 60 ° c 30 s (2,2 ° c/s rampe hastighet).
- Bekreft mangel på en syklus terskel (CT) verdi for både analysen NTC og reaksjon NTC.
Merk: Hvis det ikke er CT observert i analysen NTC vil det ikke lenger bli ført videre i analysen. Observasjon av en CT-verdi i reaksjonen NTC nødvendiggjør en gjentakelse av pre-SEQ QC-analysen. Observasjon av en CT i analysen NTC antyder sample forurensning på et tidspunkt før i analysen, og dermed krever at hele analysen (alle prøvene) startes over. Det pre-SEQ QC CT verdi for en adekvat kvalitet prøven skal være under 30 (lavere CT verdier samsvarer med mer produkt og dermed høyere kvalitet RNA). Verdier over 30 er ikke absolutte indikatorer for svikt og disse prøven bør videreføres i analysen. Men alle data avledet fra slike prøver bør gjennomgås nøye, spesielt i tilfeller der ingen fusjon kalles.
- Slutt reparasjon og perle rensing
- Overfør 40 μL av det andre tråd produktet inn i ende reparasjons reagens strimmel røret (plassert i pre kjølt aluminiumsblokk). Bland med pipettering opp og ned 6 − 8 ganger, spinn ned og plasser i thermocycler blokk (hold det oppvarmede lokket åpent) og Kjør thermocycler programmet: 25 ° c 30 min, 4 ° c hold.
- Fjern rensing perler fra 4 ° c og la det likevekt til romtemperatur. Utgjør nok 70% etanol til siste gjennom hele biblioteket forberedelse. Vortex perler godt før bruk og Pipet 100 μL i riktig antall brønner av en U-bunnplate.
Merk: for hver 8 prøver som er kjørt, vil 20 mL 70% etanol være nødvendig. - Legg hele volumet av slutt reparasjon produktet til perlene. Pipet opp og ned 6 − 8 ganger for å blande og ruge ved romtemperatur i 5 minutter, etterfulgt av en 5-min inkubasjons på magneten.
- Fjern og kast supernatanten og utfør 2 200 μL 70% etanol vasker med 30-s incubations. Etter siste vask fjerne alle 70% etanol og la luften tørke i 5 min.
- Fjern fra magneten og re-suspendere perler i 22 μL av 10 mM Tris HCl pH 8,0. Ruge av magneten i 3 min etterfulgt av en 2-min inkubasjons på magneten. Fortsett umiddelbart til ligation trinn 1.
- Ligation trinn 1 og perle rensing
- Overføring 20 μL fra slutten reparasjon perle rensing plate (pass på å ikke forstyrre perle pellet) i ligation trinn 1 stripe rør (plassert i pre kjølt aluminium blokk). Bland med pipettering opp og ned 6 − 8 ganger, spinn ned og Overfør hele volumet til en 96 brønn PCR-plate.
- Sett inn plate i thermocycler blokk, dekk med kompresjons pute og tett lokk. Run thermocycler program: 37 ° c 15 min, 4 ° c hold (oppvarmet lokk).
- Fjern rensing perler fra 4 ° c og la det likevekt til romtemperatur. Vortex perler godt før bruk og Pipet 50 μL i riktig antall brønner av en U-bunnplate.
- Legg hele volumet av ligation trinn 1 produkt til perlene. Pipet opp og ned 6 − 8 ganger for å blande og ruge ved romtemperatur i 5 minutter, etterfulgt av en 5-min inkubasjons på magneten.
- Fjern og kast supernatanten og utfør 2 200 μL 70% etanol vasker med 30-s incubations. Etter siste vask fjerne alle 70% etanol og la luften tørke i 5 min.
- Fjern fra magnet og re-suspendere perler i 42 μL av 10 mM Tris HCl pH 8,0. Ruge av magneten i 3 min etterfulgt av en 2-min inkubasjons på magneten. Fortsett umiddelbart til ligation trinn 2.
- Ligation trinn 2 og perle rensing
- Fjern molekyl strekkode (MBC) adapter bånd rør reagenser fra 4 ° c-lagring. Riktig nummerering av MBC adapter stri pen er kritisk viktig ettersom utvalgs spesifikke indekser legges til nå. Plasser rørene horisontalt med hengslene til baksiden og bruk en permanent markør for å merke rørene 1, 2, 3... fra venstre til høyre. Det er også viktig å registrere eksempel spesifikke indekser for sekvensering formål (de må angis i Sequencer regnearket).
- Overfør 40 fra ligation trinn 1 perle renseplate (pass på at du ikke forstyrrer perle pellet) til MBC adapter strimmel rørene (plassert i pre kjølt aluminiumsblokk). Bland med pipettering opp og ned 6 − 8 ganger.
- Spinn ned og Overfør hele volumet til ligation trinn 2 reagens strimmel rør (også plassert i pre kjølt aluminium blokk). Bland med pipettering opp og ned 6 − 8 ganger, spinn ned og plasser i thermocycler blokk. Med det oppvarmede lokket av Kjør thermocycler programmet: 22 ° c 5 min, 4 ° c hold.
Merk: Dette er et trygt stoppe punkt, og prøvene kan oppbevares ved-20 ° c. - Fjern ligation opprydding perler fra 4 ° c lagring og la likevekt til romtemperatur. Forbered 1 mL fersk 5 mM NaOH.
- Vortex ligation opprydding perler og tilsett 50 μL til et nytt sett av PCR stripe rør. Ruge på magneten i 1 min. Etter 1-min inkubasjons fjerne og forkaste supernatanten. Fjern bånd rørene fra magnet og re-suspendere i 50 μL av ligation opprydding buffer ved pipettering opp og ned 6 − 8 ganger.
- Overfør hele volumet av det ligation trinn 2 produktet inn i ligation opprydding perle strimmelen rør. Bland prøvene ved virvlingen og ruge ved romtemperatur i 5 min. Igjen, bland prøver av virvlingen og ruge ved romtemperatur i ytterligere 5 min. Etter de andre 5-min inkubasjons, bland prøvene ved virvlingen, snurr ned en kort stund og ruge på magneten i 1 min.
- Fjern og kast supernatanten. Tilsett 200 μL av ligation opprydding buffer og Vortex å re-suspendere. Utfør en rask spinn og plasser på magneten i 1 min. Utfør en ekstra vask ved hjelp av ligation opprydding buffer igjen.
- Etter de to vasker med ligation opprydding buffer utføre en identisk vask med ultrarent vann. Etter den ultrarent vann vasken, må du suspendere perlene i 20 μL 5 mM NaOH og overføre til en 96 brønn PCR-plate. Plasser platen i thermocycler blokk med en kompresjons pute og Kjør thermocycler programmet: 75 ° c 10 min, 4 ° c hold (oppvarmet lokk).
- Snurr ned PCR-platen når prøvene er avkjølt til 4 ° c. Plasser platen på magneten i minst 3 min og Fortsett umiddelbart til første PCR.
- Første PCR og perle rensing
- Fjerne de første PCR reagens rørene fra 4 ° c lagring og plasser i en pre kjølt aluminiumsblokk. Fjern også GSP1-primere fra-20 ° c og la den likevekt til romtemperatur.
- Tilsett 2 μL av GSP1-primere i hver brønn av de første PCR reagens strimmel rørene. Overfør 18 μL av ligation 2 rengjøringsprodukt til de første PCR reagens rørene og bland med pipettering opp og ned 6 − 8 ganger.
- Spinn ned og Overfør til en 96 brønn PCR-plate. Plasser platen i thermocycler blokk med en kompresjons pute og Kjør thermocycler programmet: 95 ° c 3 min, 15 sykluser 95 ° c 30 s − 65 ° c 5 min (100% rampe hastighet), 72 ° c 3 min, 4 ° c (oppvarmet lokk).
Merk: Dette er et trygt stoppe punkt, og prøvene kan oppbevares ved 4 ° c over natten eller ved-20 ° c for langtidslagring. - Fjern rensing perler fra 4 ° c og la det likevekt til romtemperatur. Vortex perler godt før bruk og Pipet 24 μL i riktig antall brønner av en U-bunnplate.
- Overfør 20 μL av det første PCR-produktet til 24 μL av perler. Pipet opp og ned 6 − 8 ganger for å blande og ruge ved romtemperatur i 5 minutter, etterfulgt av en 2-min inkubasjons på magneten.
- Fjern og kast supernatanten og utfør 2 200 μL 70% etanol vasker med 30-s incubations. Etter siste vask fjerne alle 70% etanol og la luften tørke i 2 min.
- Fjern fra magneten og re-suspendere perlene i 24 μL av 10 mM Tris HCl pH 8,0. Ruge av magneten i 3 min etterfulgt av en 2-min inkubasjons på magneten. Fortsett umiddelbart til andre PCR.
- Andre PCR og perle rensing
- Fjern andre PCR reagens strimmel rør fra 4 ° c og plasser i en pre kjølt aluminiumsblokk. Riktig nummerering av andre PCR-rør er kritisk viktig ettersom utvalgs spesifikke indekser legges til nå. Plasser rørene horisontalt med hengslene til baksiden og bruk en permanent markør for å merke rørene 1, 2, 3... fra venstre til høyre. Fjern også GSP2-primere fra-20 ° c og la den likevekt til romtemperatur.
Merk: det er også viktig å registrere utvalgs spesifikke indekser for sekvensering formål (de må angis i Sequencer regnearket). - Tilsett 2 μL av GSP2-primere i hver brønn i andre PCR reagens strimmel rør. Overfør 18 μL av det første PCR rengjøringsproduktet til andre PCR reagens strimmel rør og bland ved pipettering opp og ned 6 − 8 ganger.
- Spinn ned og Overfør til en 96 brønn PCR-plate. Plasser platen i thermocycler blokk med en kompresjons pute og Kjør thermocycler-programmet: 95 ° c 3 min, 18 sykluser 95 ° c 30 s − 65 ° c 5 min (100% rampe hastighet), 72 ° c 3 min, 4 ° c hold (oppvarmet lokk).
Merk: Dette er et trygt stoppe punkt, og prøvene kan oppbevares ved 4 ° c over natten eller ved-20 ° c for langtidslagring. - Fjern rensing perler fra 4 ° c og la det likevekt til romtemperatur. Vortex perler godt før bruk og Pipet 24 μL i riktig antall brønner av en U-bunnplate.
- Overfør 20 μL av andre PCR-produkt til perlene. Pipet opp og ned 6 − 8 ganger for å blande og ruge ved romtemperatur i 5 minutter, etterfulgt av en 2-min inkubasjons på magneten.
- Fjern og kast supernatanten og utfør 2 200 μL 70% etanol vasker med 30-s incubations. Etter siste vask fjerne alle 70% etanol og la luften tørke i 2 min.
- Fjern fra magneten og re-suspendere perlene i 24 μL av 10 mM Tris HCl pH 8,0. Ruge av magneten i 3 min etterfulgt av en 2-min inkubasjons på magneten. Overfør 20 μL av det andre PCR-rengjøringsproduktet til en ny 96 brønn PCR-plate.
Merk: Dette er et trygt stoppested og biblioteker kan lagres ved-20 ° c for langtidslagring eller gå umiddelbart til biblioteket kvantifisering.
- Fjern andre PCR reagens strimmel rør fra 4 ° c og plasser i en pre kjølt aluminiumsblokk. Riktig nummerering av andre PCR-rør er kritisk viktig ettersom utvalgs spesifikke indekser legges til nå. Plasser rørene horisontalt med hengslene til baksiden og bruk en permanent markør for å merke rørene 1, 2, 3... fra venstre til høyre. Fjern også GSP2-primere fra-20 ° c og la den likevekt til romtemperatur.
- Bibliotek kvantifisering
- Fjern biblioteket kvantifisering Master mix og standarder fra-20 ° c lagring og la likevekt til romtemperatur.
- Utfør 1:5 fortynning av alle biblioteker (andre PCR-produkter) med 10 mM Tris HCl pH 8,0 etterfulgt av en seriell fortynning av 1:199, 1:199 og 20:80 med 10 mM Tris HCl pH 8,0 0,05% polysorbat. De to siste fortynninger på 1:200000 og 1:1000000 vil bli kjørt i tre eksemplarer.
- Tilsett 6 μL av Master mix i hver brønn av en optisk 96 brønn plate etterfulgt av 4 μL av passende fortynning eller standard. Spinn ned platen og legg den på qPCR-instrumentet. Bruk følgende sykkelforhold: 1 syklus 95 ° c 5 min, 35 sykluser 95 ° c 30 s (4,4 ° c/s rampe hastighet) − 60 ° c 45 s (2,2 ° c/s rampe hastighet).
- Når biblioteket kvantifisering er fullført og biblioteket konsentrasjoner bestemmes (gjennom gjennomsnitt begge testet fortynninger), normalisere alle bibliotekene til 2 nM ved hjelp av 10 mM Tris HCl pH 8,0. Gjør bibliotek utvalget ved å kombinere 10 μL av hvert normalisert bibliotek i ett 1,5 mL mikro sentrifugerør.
- Sekvenser av biblioteker
- Fjern Sequencer reagens patron fra-20 ° c lagring og plasser i deionisert (DI) vann opp til Påfyllings linjen i minst 1 time. Fjern også Sequencer reagenssett fra 4 ° c og la det likevekt til romtemperatur i minst 1 time. Maksimalt antall biblioteker som kan være sekvensert på denne sekvensering plattformen er 8 (hvorav en må være positiv kontroll).
- Gjør denaturert amplicon biblioteket (DAL) basseng ved å kombinere 10 μL av biblioteket bassenget med 10 μL av 0,2 N NaOH og ruge i 5 min ved romtemperatur. Etter 5-min inkubasjons tilsett 10 μL av 200 mM Tris HCl pH 7,0, etterfulgt av 970 μL av HT1 hybridisering buffer.
- Gjør det endelige laste røret ved å kombinere 300 μL av HT1 μL av 20 pM PhiX og 675 μL av DAL bassenget. Vortex og snurre laste røret. Legg hele volumet av lasten røret til prøven godt av Sequencer reagens patronen og Last kassetten i Sequencer kjører 2 x 151 BP leser med 2 x 8 indeksen leser.
2. data analyse
- Databehandling og analyse av sekvensering
- Last ned sekvensering beregninger fra NGS instrumentet.
- Sørg for at sekvensering data faller inn under områdene (spesifikke for settet brukes i dette eksempelet). Klynge tetthet (tetthet [K/mm2]): 945 – 1600 K; % av leser passerer filter (klynger PF [%]): > 90%; kvalitetspoeng (% ≥ Q30): > 85%; PhiX-justering (justert%): 1.5 − 6.0%; PhiX feil frekvens (feil frekvens [%]): < 1,0%; leser bestått filter (leser PF [M]): > 22 millioner.
Merk: sekvensering kjører ikke oppfyller disse beregningene er underlagt gjenta. - Gjennomgå% av leser tilskrives hver prøve (dvs. hver prøve-spesifikk indeks). For en typisk kjøre der PhiX Spike-in var ~ 5% og 8 prøvene var sekvensielt, bør hver prøve ideelt utgjør ca 11,9% av leser. Det akseptable området for hver prøve er 5 − 25%. Hvis noen prøver ikke passer innenfor dette området, gjentar du biblioteks kvantifisering og sekvenser.
- Innlevering av rå sekvens data til analysen algoritmen
Merk: versjon 4.1.1.7 av ArcherDx analyse er beskrevet her. I dette eksempelet distribueres analyseprogramvaren som en virtuell maskin som kjøres på en intern server. En prosessorenhet (CPU) og 12 GB RAM (Random Access Memory) kreves for hver prøve som skal analyseres samtidig (vanligvis 8 prøver behandles samtidig som krever 8 CPU og 96 GB RAM). Behandling tar vanligvis 3 − 8 timer.- Bruk standard analyse innstillinger i analyse systemet, med unntak av MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (dette endres fra 10 til 20) og READ_DEPTH_NORMALIZATION (dette er satt til 0 for å hindre ned-prøvetaking).
- For å starte en analyse jobb, klikk på Utfør analyse i brukergrensesnittet, Send inn et navn for jobben, og velg deretter de nødvendige FASTQ-filene (slik at begge leser [R1 og R2] er valgt for hvert utvalg).
- Velg RNA Fusion for RNA analysetyper, Illumina (sammenkoblet) for plattform, og FusionPlex solid tumor panel for målregion. Deretter klikker du på Send analyse.
- Analysedata tolkning
- Åpne brukergrensesnittet for analyse systemet, og velg ønsket jobb. Velg eksempel på positiv kontroll. Kontroller at alle forventede fusjoner og kreftfremkallende isoformene har blitt oppdaget og er oppført i den sterke bevis kategorien.
Merk: Hvis noen av de sporede fusjoner i den positive kontrollen ikke oppdages for en gitt kjøring av analysen, kan det være en indikasjon på et problem i denne kjøringen, noe som nødvendiggjør en gjentakelse (fra begynnelsen av analysen). - Undersøk lese statistikken for hvert klinisk eksempel i oppkjøringen ved å klikke på Les statistikk -fanen. Hver prøve bør være representert med minst 1 000 000 totalt fragmenter. Hvis mindre enn 1 000 000, re-orden biblioteket med hensyn til re-kvantifisering for å sikre den første kvantifisering var ikke aberrantly høy.
Merk: gode kvalitets prøver vil vanligvis vises på mål-% > 85%, og RNA Molecular-hyllene bør være > 20000 og omfatter > 30% av leser. Hvis du imidlertid ikke oppfyller disse målingene, utløser ikke prøve feil automatisk. - Inspiser gjennomsnittlig unike Start områder per GSP2 kontroll verdi.
Merk: denne verdien er et mål på sekvensering kompleksitet fra grunning til fire housekeeping gener. Denne målingen er en avgjørende faktor for RNA-kvalitet i prøven (hvis gener som forventes å uttrykkes i prøven er dårlig, er det lav tillit til evnen til å oppdage en uttrykt gen fusjon. Grensen for denne målingen er 20. Hvis et utvalg viser en verdi som er mindre enn 20, må resultatene for prøven rapporteres som uninformative hvis det ikke blir funnet høy selvtillit fusjon. Statusen for denne målingen kan også fastslås i sammendragssiden for kjøringen (statusen vil bli oppført som Fusion QC: Pass eller Fusion QC: antall unike RNA GSP2-kontroll Start områder , avhengig av om verdien er større enn eller mindre enn 20). En høy tillit fusjon i en prøve som ikke bestod denne QC-beregningen kan fortsatt rapporteres hvis det er fast bestemt på å være ekte (se nedenfor). Vanligvis høyere QC score bruker denne beregningen samsvarer med lavere PreSeq CT score, som forventet (figur 2).
- Åpne brukergrensesnittet for analyse systemet, og velg ønsket jobb. Velg eksempel på positiv kontroll. Kontroller at alle forventede fusjoner og kreftfremkallende isoformene har blitt oppdaget og er oppført i den sterke bevis kategorien.
- Tolkning av Fusion-samtale
- Nøye granske hver kalles fusjon under sterke Evidence kategorien (flertallet av sterke bevis fusjoner kalt av systemet er artifactual). Også skanne svake bevis Fusion bin, selv om tilstedeværelsen av en ikke-artifactual fusjon i denne bin er en ekstremt sjelden hendelse. Å vurdere gyldigheten av en fusjon, først oppmerksom på leser (#/%) og starte nettsteder Metrics.
Merk: vanligvis øker tilliten i en kalt fusjon høyere disse beregningene er. Fusjoner som støttes av mindre enn 5 Start nettsteder og med mindre enn 10% av de leser fra støtte primer bør betraktes som svært mistenksom som artifactual. - Noter ikonene som vises i filter -kolonnen.
Merk: flere av disse ikonene varsler brukeren om en potensiell kilde for et artifactual kall. Hyppige blant disse (og primært funnet i den svake bevis bin kalt fusjoner) er tilfeller der partnerne er kjent paralogs eller vise likhet med hverandre i rekkefølge (indikerer sannsynlig mis-priming eller feilaktig justering). En annen vanlig kilde til artifactual fusjon samtaler oppstår når leser støtter fusjon inneholder en høy feil rate som er tegn på dårlig kartlegging til referansen Genova, og dette er forbundet med en distinkt ikon. Transcriptional readthrough hendelser identifiseres via et annet ikon. Disse er vanlige og er generelt ignorert. Flere andre ikoner er også brukt i brukergrensesnittet, men en fullstendig beskrivelse av alt er utenfor omfanget av denne artikkelen. Vanlige artefakter som kan generelt ignoreres uten videre undersøkelser inkluderer: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-Axl, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-ret, ALK-TFEB, NOTCH1-ret, forholdet-ret, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8, og FCGR2C-mast. - Visualiser støtte leser for hver potensielle fusjon ved å klikke på Visualiser linken i brukergrensesnittet, som tar brukeren til en Web-basert JBrowse syn på pileups av individuelle fusjon-støtte leser. Bekreft at leser er generelt uten samsvar (selv om noe støy er å forvente), at en betydelig andel (ideelt sett > 30 baser) av leser align til Fusion partner, og at sekvenser umiddelbart ved siden av Avbruddspunktet mellom genene og primer bindende områder er fri for innsettinger eller slettinger. Bekreft at justert sekvensen inkluderer 3 ' del av primer bindende sekvenser for grunning som støtter Fusion leser (hvis 3 ' deler er ikke inkludert, kan det være en indikasjon på mis-priming).
- Hvis koding sekvenser av begge genene er involvert i fusjon, sørge for at de 3 ' partner forblir i-ramme. Klikk på oversettelsen linken i grensesnittet (som vil gi en sann eller Usann status for hver referanse sekvens kombinasjon) og også manuelt bekrefte at fusjonen er i rammen gjennom inspeksjon av de kalte avbruddspunkter i en Genova nettleser. De kalte avbruddspunktene kan bestemmes ved å holde musepekeren over de røde prikkene i fusjons-skjematisk.
Merk: siden de fleste (men ikke alle) genomisk avbruddspunkter for legitime fusjoner forekommer i intronic områder og fører til skjøting sammen av hele exoner, fusjoner der ekson grensene utgjør avbruddspunktene for begge partnerne generelt sett med en høyere grad av tillit. Men siden det er mange publiserte eksempler på mid-exonic avbruddspunkter i fusjoner, dette bør ikke brukes som absolutte kriterier i tolkningen av en fusjon. - For hver fusjon må du manuelt kontrollere at sekvenser ved siden av Avbruddspunktet ikke homologe til neste forventede sammenhengende grunnlag for hver partner. Inspisere alle mulige sammenhengende exoner i en Genova nettleser.
Merk: en felles kilde til artifactual fusjon er forskyvning eller mis-grunning på grunn av homologi mellom to genet partnere, og dette er ikke alltid kalles av systemet via ikonene som er beskrevet ovenfor.
- Nøye granske hver kalles fusjon under sterke Evidence kategorien (flertallet av sterke bevis fusjoner kalt av systemet er artifactual). Også skanne svake bevis Fusion bin, selv om tilstedeværelsen av en ikke-artifactual fusjon i denne bin er en ekstremt sjelden hendelse. Å vurdere gyldigheten av en fusjon, først oppmerksom på leser (#/%) og starte nettsteder Metrics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vist i Figur 3, Figur 4 og figur 5 er screenshots fra analysen brukergrensesnittet demonstrere resultater fra en lunge adenokarsinom prøve. I Figur 3vises eksempel sammendraget (øverst) som viser de kalte sterke bevis fusjoner, i tillegg til QC-statusen (sirkel i rødt). Den ADCK4-NUMBL Fusion (hvorav 3 isoformene er oppført) er umiddelbart ignorert fordi det er en vedvarende transcriptional readthrough hendelse (bemerket av den ødelagte sirkelen ikonene ved siden av oppføringene). Bunnen av Figur 3 er et skjermbilde av Les statistikk-siden. Spesielt informative beregninger er omgitt av grønt. Den kritiske QC-beregningen som fastsetter bestått/ikke bestått-karakteren til prøven, utheves i rødt (dette er målingen som dikterer bestått/ikke bestått-statusen i sammendraget ovenfor). Hvis denne verdien er under 20, vil et negativt fusjons resultat anses som "uninformative". Figur 4 og figur 5 er skjermbilder av Fusion skjematisk (øverst) og JBrowse visninger av Fusion støtte leser (nederst) for de to fusjoner som garantert videre etterforskning. Den KIF5B-ret fusjon (Figur 4) demonstrerer et høyt antall støtter leser, en høy% av leser fra primer støtter fusjon, og et høyt antall Start nettsteder. I tillegg er flere sammenhengende exoner av Fusion partner (KIF5B) inkludert i justeringen, ble Fusion bekreftet å være i rammen, og de leser som støtter fusjon er generelt fri for manglende samsvar. For disse grunner, er fusjonen anses ekte og rapporteringspliktig. Den LOC101927681-PDGFRB Fusion (figur 5) demonstrerer lavere bærende beregninger. Videre er den delen av leser kartlegging til partneren relativt kort og inneholder en høy feil rate, som sterkt antyder forskyvning og en artifactual fusjon samtale. Til slutt, intronic sekvensen av PDGFRB er inkludert, ytterligere antyder en gjenstand (de fleste, men ikke alle, legitime fusjoner består utelukkende av sekvensen som kart til koding regioner av begge genene). For disse grunner, er dette fusjon anses en gjenstand og ikke rapporteringspliktig.
Figur 1: skjematisk fremstilling av amp-tilnærming. Tradisjonelle amplicon-mediert tilnærminger for mål berikelse er begrenset av det faktum at grunning er nødvendig for alle Fusion partnere. Dermed vil romanen Fusion partnere ikke bli oppdaget. I AMP er motstanderens primer spesifikk for adapteren, og dermed oppdages nye partnere. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: korrelasjon mellom PRESEQ QC score og post-SEKVENSERING QC. Den PreSeq CT og gjennomsnittlig unike Start nettsteder per GSP2 Control verdier ble korrelert for en rekke 100 prøver. Vanligvis, som forventet, lav PreSeq score samsvarer med høyere SS/GSP2 verdier (begge er indikatorer på god kvalitet RNA). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: eksempel Sammendrag og lese statistikk visninger. Topp: visning av et eksempel Sammendrag i brukergrensesnittet med sterke bevis fusjoner oppført. Nederst: visning av lese statistikken siden i brukergrensesnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: eksempel på et legitimt fusjons kall. Topp: visning av Fusion skjematisk i brukergrensesnittet. Bunn: JBrowse syn på individuelle leser støtter fusjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: eksempel på et artifactual fusjons anrop. Topp: visning av Fusion skjematisk i brukergrensesnittet. Bunn: JBrowse syn på individuelle leser støtter fusjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| AKT3 | EWSR1 | NOTCH1 | PRKCA |
| Alk | FGFR1 | NOTCH2 | PRKCB |
| ARHGAP26 | FGFR2 | NRG1 | RAF1 |
| Axl | FGFR3 | NTRK1 | FORHOLDET |
| BRAF | FGR | NTRK2 | Pensjonert |
| BRD3 | INSR | NTRK3 | ROS1 |
| BRD4 | MAML2 | NUMBL | RSPO2 |
| EGFR | MAST1 | NUTM1 | RSPO3 |
| ERG | MAST2 | Pdgfra | TERT |
| ESR1 | Møtte | PDGFRB | TFE3 |
| ETV1 | MSMB | PIK3CA | TFEB |
| ETV4 | Moskus | PKN1 | THADA |
| ETV5 | MYB | PPARG | TMPRSS2 |
| ETV6 | |||
| Analysen inkluderer gen-spesifikke primere til ulike exoner (og noen introns) i ovennevnte 53 gener. | |||
Supplerende tabell 1: liste over gener som Gen-spesifikke primere er inkludert i analysen (til ulike exoner og introns).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forankret multiplex PCR-basert mål berikelse og bibliotek forberedelse etterfulgt av neste generasjons sekvensering er godt egnet for multiplekset gen fusjon vurdering i kliniske tumor prøver. Ved å fokusere på RNA-input i stedet for genomisk DNA, unngås behovet for å sekvens store og repeterende introns. I tillegg, siden denne tilnærmingen forsterker genet fusjoner uavhengig av identiteten til Fusion partner, er romanen fusjoner oppdaget. Dette er en kritisk fordel i den kliniske riket, og det har vært mange eksempler på praktisk romanen Gene fusjoner identifisert gjennom amp rapportert i litteraturen21,22,23,24, 25på.
Siden analysen er RNA-basert, er det avgjørende å bevare RNA-kvaliteten i prøver under behandlingen. Det er også avgjørende å bestemme hvilke prøver produsert RNA sekvensering som er for dårlig til å stole på negative fusjon resultater. Dette oppnås ved vurdering av sekvensering data fra grunning til fire housekeeping gener. Hvis sekvensering av disse genene er dårlig, så negative fusjon resultatene anses uninformative. I tillegg, gitt kompleksiteten og mangfoldet av våte-benk trinn i analysen, er det viktig å inkludere en fusjon-positiv kontroll i hver analysen kjøres. Ved å gjøre dette, kompromittert analysen går bli tydelig gjennom analyse av forventet fusjon hendelser i kontrollen.
Som med alle amplicon tilnærminger, er AMP svært avhengig av individuell primer ytelse. Ved vurdering av flere exoner av flere gener, er det uunngåelig at noen primere ikke vil utføre så vel som andre. Derfor er det avgjørende for brukerne å vite hvor analysen gir dårlige resultater grunn av primer ineffektivitet. I tillegg krever NGS-baserte analyser komplekse Bioinformatic dataanalyser. Hvis algoritmene som brukes, ikke er nøye utformet, er det sannsynlig at falske negative og falske positive resultater. Det er svært viktig at alle gen fusjoner som kalles av analyse algoritmer, inspiseres manuelt av brukeren.
Med en stadig voksende liste over nyttige gen fusjoner som bør vurderes i kliniske tumor prøver, vil bruk av multiplekset analyser som AMP fortsette å øke i kliniske laboratorier. Fremtidige anvendelser av teknikken vil trolig fokusere på å kombinere fusjon og mutasjon vurdering innenfor en enkelt analysen. Uavhengig av molekyl analysen tilnærming, må brukerne alltid være klar over analysen begrensninger og bør alltid etablere kvalitetskontroll beregninger for å veilede data tolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.A. har mottatt konsulent avgifter fra Bayer onkologi, Genentech, AbbVie, og Bristol Myers Squibb. KD har mottatt sponset reise fra ArcherDx.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av molekylær patologi delt ressurs ved University of Colorado (National Cancer Institute kreft Center support Grant no. P30-CA046934) og av Colorado Center for personlig medisin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
References
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
